一種制備非線性梯度色譜法及其純化的產物的制作方法

專利名稱：一種制備非線性梯度色譜法及其純化的產物的制作方法
技術領域：
本發明公開了一種通過離子交換/反相色譜介質的制備色譜純化蛋白質的方法。 本發明一般涉及色譜法，以及更具體地，涉及非線性梯度制備色譜分離目標和副產物材料的方法，該方法提供更好的分離度用于分離從而獲得更高純度的目標化合物。另外，也公開了一種通過使用非線性梯度洗脫的RPHPLC純化胰島素類似物或衍生物的方法。
背景技術：
從不斷發展的生物技術產業新興的生物蛋白質產物對通過色譜純化處理存在新的挑戰。通常，這些產物很大并且不穩定，具有分子量的范圍為IO4至IO6道爾頓。這類產物從常常包含數百種污染物種(包括細胞碎片、各種溶質、營養成分、DNA和其他雜質)的混合物中純化。蛋白質產物在收獲液(harvest liquor)中的濃度有時低達lmg/1，但通常是大約100mg/l。存在于加工溶液(process liquor)中的蛋白酶和它們不穩定的性質常常要求盡可能快地進行純化。色譜是動態的分離方法，依賴于待分離的組分在兩相(固定(或結合)相床和流動(或載體)相)之間的分布。流動相載著待分離的組分通過填充固定相的柱子。色譜技術包括基于離子交換、疏水相互作用等的分離。在反相色譜(RPC)中，溶液中的分子結合到色譜樹脂的疏水表面或疏水配體。可應用一些不同的色譜程序以獲得關于純度和產率的期望的最終結果。反相色譜是采用的利用疏水相互作用作為主要分離原理的純化中的最有效的方法之一。反相液相色譜(“RP-LC”)和反相高效液相色譜(“RP-HPLC”)通常用于純化分子，例如通過合成或重組方法生產的肽和蛋白質。RP-LC和RP-HPLC方法可以有效地分離緊密相關的雜質，并已用于純化許多不同的分子(Lee 等人，“Pr印arative HPLC，” 8thBiotechnology Symposium, Pt. 1,593-610(1988))。另外，RP-LC和RP-HPLC已成功地用于純化分子，特別是，工業規模的蛋白質(Olsen 等人，1994，J. Chromatog. A，675，101)。根據離子交換樹脂上配體的電荷，離子交換色譜原理包括兩種不同的途徑陰離子交換和陽離子交換。傳統的IEC純化方法通常由一個或多個階段(sections)組成平衡階段、施加或負載階段(application or loading sections)、沖洗階段、洗脫階段，和再生階段(參考 Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed. , Mack Publishing Co. , Easton, Pa. , 1990,或 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版 (1995))。US 6，451，987公開了一種用于從包含肽和相關雜質的混合物中純化肽的離子交換色譜方法。US 7，276，590公開了一種用于從包含肽和相關雜質的混合物中純化肽的離子交換色譜方法。制備系統的成本已大大升級。此外，在這些高壓下運行的這種系統在日常的生產環境中使用，這可能是嚴重的危害。因此，該產業處于必須在緩慢并且具有有限的純化能力的低壓、低成本的系統，或明顯更昂貴并且對健康構成危害的高壓、高效的系統之間選擇的位置。此外，當在制備溶液中時，熱的或由于蛋白酶等的存在，生物制品可以及時降解，所以非常期望迅速分離。使用用于生物大分子的液相色譜分離方法獲得的生產效率可以用術語產品量/美元(amoimt-of-product/dollar)描述。為了獲得最佳的生產，目前沒有很好滿足的生產速度和能力是重要的考慮因素。因此，在色譜領域需要不憑借高壓和相關的危害和高成本而能高效的系統。當該方法可以盡可能重復色譜方法的產率、純度、產量和操作條件時，就滿足了該需要，其中洗脫由選擇的溶劑體系、PH范圍和其他相關因素控制(conduct)。操作程序可以有利地用于商業分離。已作出努力創制通過更高的分離度來表征分離的離子交換/HPLC系統。因此，當單獨使用或與標準提取和色譜技術組合使用時，本發明的提取方法允許本發明利用比傳統方法所需更少的步驟以高產率和高純度來分離分子。因此，本發明的目的是提供一種用于高效分離和純化的制備色譜系統，該系統具有小規模和低成本，沒有傳統的分離和純化系統的弊端。更具體地，本發明涉及控制非常高效率的色譜分離方法，S卩，通過每單位體積色譜基質的高分離度和高產量表征的色譜技術。更具體地，本發明涉及特別是制備色譜，以及在迄今尚未實現的效率下控制色譜分離的方法。本發明另外的目標、優勢和新特征，連同從下面在并入本文作為參考并形成本文的組成部分的附圖
中所示的對本發明的描述中貢獻的另外的特征和獲得的優勢，對本發明技術人員將是顯而易見的。本發明的目標和優勢可以用在隨附的權利要求中特別指出的手段和組合來實現和獲得。

發明內容
因此，本發明涉及一種用于從包含至少一種相關雜質的混合物中純化多肽的制備色譜方法，所述方法包括步驟a)將多肽混合物經過色譜處理(chromatographic process)，其中樹脂在略酸性pH的緩沖液和有機改性劑中沖洗和平衡，b)通過由緩沖液濃度在0. OlM至IM范圍內進行(running)具有從0至⑴范圍的陡度系數的陡度的凸形或凹形非線性梯度來洗脫；和c)目標雜質去除至少50%而回收多肽；根據上述方法純化的 IN-105具有至少95%的純度；一種從包含至少一種相關雜質的混合物中純化胰島素和類似物的方法，所述方法包括步驟a)將混合物經過用有機改性劑沖洗和平衡的RPHPLC柱，b) 通過由緩沖液濃度在0. OlM至IM的范圍內進行(running)具有從0至⑴范圍的陡度系數的陡度的凸形/凹形非線性梯度來洗脫，和c)目標雜質去除至少50%而回收胰島素和類似物；根據上述任何方法純化的胰島素甲酯(Insulin methyl ester)具有至少85%的純度；根據上述任何方法純化的胰島素甲酯具有至少90%的純度；根據上述任何方法純化的甘精胰島素(glargine)具有至少90%的純度；根據上述任何方法純化的甘精胰島素具有至少95%的純度；根據上述任何方法純化的門冬胰島素(aspart)具有至少80%的純度； 根據上述任何方法純化的門冬胰島素具有至少84%的純度；以及根據上述任何方法純化的門冬胰島素具有至少88%的純度。
具體實施例方式本發明涉及一種用于從包含至少一種相關雜質的混合物純化多肽的制備色譜方法，所述方法包括步驟(a)將多肽混合物經過色譜處理，其中樹脂在略帶酸性pH的緩沖液和有機改性劑中沖洗和平衡；(b)通過緩沖液濃度在0. OlM至IM范圍內進行具有從0到⑴范圍的陡度系數的陡度的凸形或凹形非線形梯度來洗脫；和(c)目標雜質去除至少50%而回收多肽。在本發明實施方式中，色譜處理選自包括離子交換色譜或反相HPLC或其組合的組。在本發明的另一個實施方式中，步驟a)中的樹脂是離子交換樹脂或C4至C18硅膠樹脂。在本發明的又一個實施方式中，使用的緩沖液是醋酸鹽緩沖液。在本發明的又一個實施方式中，pH范圍是約2至約5。在本發明的又一個實施方式中，多肽是胰島素、胰島素類似物或其衍生物。在本發明的又一個實施方式中，胰島素衍生物是IN 105。在本發明的又一個實施方式中，胰島素類似物是甘精胰島素、門冬胰島素、賴脯胰島素(Iispro)、賴谷胰島素(glulisine)或胰島素甲酯(Insulin methyl ester) 0在本發明的又一個實施方式中，目標雜質是去八肽(des-Octa)雜質、去蘇氨酸 (des thero)雜質、去八肽門冬胰島素雜質(des octa aspart impurity)或側翼(flank) 和單糖基化門冬胰島素(monoglycosylated aspart)或其任何組合。在本發明的又一個實施方式中，多肽與樹脂的比例按重量體積比(weight by volume ratio)的范圍是 0. 1 至 50g/l。在本發明的又一個實施方式中，多肽與樹脂的比例按重量體積比的范圍更優選1 至 25g/l。在本發明的又一個實施方式中，回收的多肽具有至少95%的純度。本發明涉及根據任何前述實施方式具有至少95%的純度的純化的IN-105。本發明涉及一種從包含至少一種相關雜質的混合物純化胰島素和類似物的方法， 所述方法包括步驟(a)將混合物經過用有機改性劑沖洗和平衡的RPHPLC柱；(b)通過緩沖液濃度在0. OlM至IM范圍內進行具有從0至⑴范圍的陡度系數的陡度的凸形/凹形非線形梯度來洗脫；和(c)目標雜質去除至少50%而回收胰島素和類似物。在本發明的一個實施方式中，RPHPLC以約2至約5范圍的pH沖洗和平衡。在本發明的另一個實施方式中，回收的胰島素類似物具有至少97%的純度。本發明涉及根據任何前述實施方式具有至少85%至90%的純度的純化的胰島素甲酯。本發明進一步涉及根據任何前述實施方式具有至少90%至95%的純度的純化的甘精胰島素。
本發明涉及根據任何前述實施方式具有至少80%至88%的純度的純化的門冬胰島素。提供一種用離子交換和/或反相制備色譜法純化包含IN-105的不純制劑 (preparation)的方法。在例示性實施方式中，色譜柱負載固定相，典型地是基于陶瓷的樹脂(ceramic based resin)。典型的方法包括將粗制IN-105溶液供料至色譜柱，向色譜柱提供流動相，以及從色譜柱回收IN-105洗脫液。但是，每個分離的包含目標化合物的洗脫液已經有足夠的回收率和純度。一種用于從包含至少一種相關雜質的混合物中純化多肽的制備色譜方法，所述方法包括步驟(a)將多肽混合物施加于在略微酸性pH的緩沖液中沖洗和平衡的離子交換樹脂。(b)采用緩沖液濃度在0. 0IM至IM范圍內進行從0至⑴范圍的陡度的凸形/凹形非線形梯度來洗脫。(c)目標雜質去除至少50%而回收多肽。更具體地，本發明重點涉及采用緩沖液濃度在0. OlM至IM范圍內進行從0至⑴范圍的陡度的凸形/凹形非線性梯度洗脫，導致目標雜質減少的范圍為60-95%。因此，該方法使目標化合物的純度在至少80% -97%的范圍。一種通過RP HPLC純化包含胰島素和類似物的不純制劑的方法，其中所述方法包括a)先用適當比例的有機改性劑平衡RPHPLC柱。b)在過載柱條件下將蛋白質樣品注入到該柱上。c)用一定比例的有機改性劑沖洗該柱以去除任何未結合的蛋白質。d)接著在非線性條件下進行梯度洗脫。e)分流(fractionated)并分析樣品以評價總純度。f)將滿足要求純度的流分(fraction)匯集在一起從而形成洗脫匯集物，然后將該柱再生以去除任何可能被緊緊結合的蛋白質。雖然本發明已參考其具體實施方案進行描述，本領域技術人員應該了解，在不背離本發明真正的精神和范圍的情況下可以進行各種變化和替代等同物。在此說明書中首先公開了制備色譜所需運行參數的性質和理論基礎，接著是在色譜方法(色譜處理)優化中對具體實例有用的方程原理、在這種色譜的實踐中有用的具體材料的公開，和這種程序的具體實施例。普通技術人員在開發本文所述的方法和系統中應該不需要額外的解釋，但是仍然可以通過研究相關領域的標準參考著作在這些方法和系統的制備中找到一些有用的指導。例如，普通技術人員可以選擇瀏覽L.R. Snyder，“Gradient Elution”，出自 High Performance Liquid Chromatography, Cs. Horvath(ed. ), Academic Press,1980, pp. 207-316禾口M. A. Stadalius,H. S. Gold and L. R. Snyder, J. Chromatography, 296 (1984)， 31-59,Cazes,J. ,2005,"Encyclopedia of Chromatography" (pp 718). Marcel Dekker,% 2版，卷1，其全部公開內容以引用的方式并入本文中。術語的定義術語“離子交換”和“離子交換色譜”是指色譜方法(色譜處理)，其中混合物中感興趣的溶質(如蛋白)與連接(如通過共價連接)到固相離子交換材料的帶電化合物相互作用，使得感興趣的溶質與帶電化合物的非特異性相互作用比混合物中的溶質雜質或污染物的大或小。混合物中的污染溶質從離子交換材料的柱中洗脫比感興趣的溶質更快或更慢，或者相對于感興趣的溶質結合到樹脂上或被樹脂排出。“離子交換色譜”尤其包括陽離子交換、陰離子交換和混合模式色譜。術語“制備色譜分離”是指一種用于分開或分離化學混合物組分(例如，期望的組分)的色譜分離。制備色譜分離可以包括通過制備柱洗脫一種或多種組分。制備色譜分離可以由制備色譜參數表征和/或影響。詞語“色譜梯度模式”本文是指隨時間的函數變化的流動溶劑組成 (composition)，通常反應用戶定義的分布。溶劑具有的組成可以是，例如，兩種溶液的混合物，本文是指作為流動相緩沖液A和流動相緩沖液B。在優選的方面，該柱是強陰離子或強陽離子交換柱，這意味著該柱吸附劑的離子交換性能不會隨著該柱的工作PH范圍改變。梯度色譜系統使用與等度系統(isocratic system)相同的通用組分，主要區別是在溶劑輸送中，它必須輸送其組分隨著時間的函數不斷變化的液體混合物。該梯度技術通常用于分離可能在等度模式中洗脫靠近在一起并需要在洗脫條件下微小變化來實現微分分離的峰。通過改變在色譜運行期間從弱到強的洗脫液來進行梯度洗脫。在梯度洗脫中，洗脫方法(洗脫處理)從低置換能力的洗脫液開始，隨著時間的推移用置換能力較強的洗脫液。這可以通過改變洗脫液的濃度和/或組成來實現。用于所描述的系統的流速是典型的用于離子色譜。梯度洗脫被定義為通過改變在運行期間從弱到強的洗脫液進行的洗脫。這種洗脫液被稱為梯度洗脫液。合適的梯度洗脫液的例子在Rocklin，R.D.等人(Journal of Chromatography 411(1987) 107.)禾口 Ion Chromatography,Smal1, H. (Plenum Press 1989) PP. 187,213中說明。它們包括洗脫液強度隨著時間的函數呈線性形狀、凹形、凸形、臺階形、 保持階段線性和這些函數的組合增長。陽離子交換色譜有助于基于它們的電荷差異從它的雜質中分離蛋白質。在大多數 CIEX運行中，洗脫在始終具有相同濃度的緩沖液的等度梯度模式中進行。因為緩沖液的濃度隨著時間逐漸改變，在洗脫過程中應用非線性梯度有助于緊密相關的雜質的分離。此外， 非線性梯度的應用導致濃度急劇增加隨后濃度逐漸上升，或濃度逐漸增加隨后濃度急劇上升。這種非線性變化有助于提高緊密洗脫雜質的分離。通過將初始緩沖液與不同濃度的第二緩沖液不斷混合，同時增加的第二緩沖液的比重直到混合物達到期望的濃度從而生成外梯度(external gradient)。形成緩沖溶液的每個濃度梯度可以由相同的緩沖組分或不同的緩沖組分組成。這樣，該梯度可以是“線性梯度”、“凸形梯度”、“凹形梯度”或“不連續梯度”，或本領域技術人員知道的任何其他合適的形式。“凸形梯度”是指這樣的梯度，其中緩沖液濃度變化逐漸超過初始相后急劇上升。“凹形梯度”是指這樣的梯度，其中緩沖液濃度在最初斜率急劇增加后逐漸上升。“分離度(Resolution) ”是系統可以達到的純化程度的度量。這個變量是由在處理溶液中溶質的性質和色譜介質的相互作用表面的化學性能來控制，也由影響流體動力學、 擴散和吸附動力學的特征來控制。
術語“多肽”、“蛋白質”、“肽”是指氨基酸的聚合物，并且不涉及該產物的具體長度；因而，肽、寡肽和蛋白質包括在多肽定義的范圍內。該術語也不涉及或排除多肽的表達后修飾，但這些多肽的化學修飾或表達后修飾可作為具體實施方式
被包括或排除。因此，例如，術語多肽明顯包括對多肽的修飾，這些修飾包括糖基基團、乙酰基基團、磷酸酯基團、月旨質基團等的共價連接。另外，帶有這些修飾的多肽可指定為本發明包括或排除的單個種類。 在一個實施方式中，該分子是多肽或它們的相關類似物或其衍生物。術語從包括蛋白質和一種或多種污染物的組合物中“純化”蛋白質，從而通過減少蛋白質組合物中至少一種污染物的含量來增大組合物中蛋白質的純度。“雜質”是與期望的多肽產物或感興趣的蛋白質不同的材料。針對使用非線性梯度的陽離子交換色譜的主要雜質是去八肽IN-105。在酶促反應中，胰蛋白酶通過切割前導序列和連接子序列將胰島素前體轉換成胰島素。在這個反應中，生成的雜質之一是去八肽 IN-105,其中胰蛋白酶作用發生在遠離B鏈的C末端的8個氨基酸。該雜質在十八烷基陶瓷柱上相對于產物的保留值的相對保留值為0. 84。因此描述的該雜質被稱為“目標雜質”。術語“胰島素類似物”是為了包含上述定義的任何形式的“胰島素”，其中多肽鏈中的一種或多種氨基酸已被另一種替代氨基酸代替和/或其中一種或多種氨基酸已被缺失 (刪除)或其中一種或多種額外的氨基酸已被添加到多肽鏈上。胰島素類似物選自包括門冬胰島素、甘精胰島素和胰島素甲酯的組。“IN-105”是在胰島素B鏈似9位置的ε -氨基酸賴氨酸處與兩親性寡聚體(結構式CH3O-(C4H2O)3-CH2-CH2-COOH)結合的胰島素分子。該分子可以在Α1、Β1和B^處單結合 (monoconjugated)，在 Α1、Β1 和似9 的多種組合處二結合(di-conjugated)，或者在 Al、Bl 和B29的多種組合處三結合(triconjugated)。針對使用非線性梯度的RPHPLC用于胰島素和類似物的主要雜質包括去蘇氨酸胰島素(Des-Threo Insulin)-在酶促反應中，胰蛋白酶通過切割前導序列和連接子序列將胰島素前體轉換成胰島素。在這個反應中，生成的雜質之一是去蘇氨酸， 其中胰蛋白酶作用發生在B鏈的第四氨基酸。該雜質在十八烷基硅膠柱上相對于產物保留值的相對保留值為0. 98。去八肽門冬胰島素-在酶促反應中，胰蛋白酶通過切割前導序列和連接子序列將門冬胰島素前體轉換成門冬胰島素。在這個反應中，生成的雜質之一是去八肽，其中胰蛋白酶在遠離B鏈的C末端的8個氨基酸處切割。這種雜質在十八烷基硅膠柱上相對于產物保留值的相對保留值為0.9。側翼(Flank)在門冬胰島素中這也是看到的主要雜質之一。在酶促反應中，胰蛋白酶通過切割前導序列和連接子序列將門冬胰島素前體轉換成門冬胰島素。在這個反應中，生成的雜質之一是側翼，它在C肽(連接肽)不完全切割時發生。這種雜質在十八烷基硅膠柱上相對于產物保留值的相對保留值為0. 96。糖基化門冬胰島素已知宿主是進行翻譯后修飾導致甘露糖基(marmosyl)添加至前體。相應產生的雜質是產物的糖基化形式，也被稱為糖基化雜質。這種雜質在十八烷基硅膠柱上相對于產物保留值的相對保留值為0. 91。陡度系數是指相對于時間的濃度曲線的斜率。本發明的一些實施方式可以采用非線性溶劑強度梯度(例如，分段線性溶劑強度梯度、凹形梯度形狀或凸形梯度形狀)用于分析和制備色譜分離。本發明的一些實施方式可以包括首先優化或改善分析色譜分離的一些方面(例如，通過選擇適當的分析梯度陡度參數的值)，之后使用制備色譜分離優化和/或改善所需的組分的分離。臺階梯度用于連續流操作通常是有效的。用于分離和純化本發明蛋白質的方法的典型實例包括以下步驟i.用約IOmM的醋酸鹽緩沖液平衡的基于陶瓷的樹脂填充離子交換柱。 以約彡100-400cm/hr的流速將包含至少一種相關雜質的肽組合物負載在該柱上。iii.采用緩沖液濃度在0. OlM至IM范圍內進行從0至⑴范圍的陡度的凸形/凹形梯度進行非線形梯度從該柱洗脫純化的產物。洗脫緩沖液的pH可以約2至約9，可替換地為約3至約8，約4至約8左右，或約5 至約8，但用于洗脫的pH或pH范圍將根據感興趣的期望蛋白質和實際的色譜類型來確定。 用于負載、沖洗或洗脫緩沖液的適宜的PH范圍很容易通過標準方法來確定，使得感興趣的蛋白質以活性形式回收。在本申請公開的一個實施方式中，水性緩沖液系統選自醋酸鈉緩沖液系統。在另一方面，醋酸水性緩沖液系統也可以與一種或多種醋酸銨鹽/離子交換化合物配對。在另一方面，氫氧化鈉可以可選地用于調整PH或鈉離子濃度。在優選的方面，在流動相的離子交換緩沖液/緩沖液鹽離子交換化合物為醋酸銨/醋酸鈉緩沖液系統。本發明另一個實施方式涉及分離梯度公式，方程式(i)和(ii)可用于非線性梯度的計算。如果溶劑濃度隨時間的變化是線性的，梯度將是線性的。非線性梯度可以通過下列公式計算。如果θ是在任何時間t的溶劑分數，C是當時的溶劑濃度，Cl是梯度開始時的濃度，C2是梯度結束時的濃度，以及tg是梯度的總時間，然后⑴凹形梯度-θ= (t/tg) "η ；C = (C2-C1)* θ +Cl(ii)凸形梯度-θ = l-(l-t/tg) "η ；C = (C2-C1)* θ +Cl其中，η是陡度系數(N = O至⑴)。在另一方面，本發明特征為一種純化蛋白質的方法，該方法包括以下步驟經過包含至少一種相關雜質的蛋白質混合物，其包括將蛋白質混合物負載到包含陶瓷樹脂離子交換的離子交換柱上，用略酸性PH的合適的緩沖液平衡，隨后采用從緩沖液濃度在0. OlM至 IM范圍內進行0至⑴范圍的陡度的凸形/凹形梯度來洗脫，導致目標雜質減少60-75%的范圍。洗脫的蛋白質可以進一步經過高效液相色譜作進一步處理。在另一方面，本發明特征為一種通過進行RP HPLC純化胰島素和類似物的方法。該方法包括用合適比例的有機改性劑平衡RP HPLC柱，此后在過載柱的條件下將樣品注入到該柱上，然后用一定比例的有機改性劑沖洗該柱以去除任何未結合的蛋白質，接著是在目前的實施例中的非線性條件下進行梯度洗脫。此外，分流并分析該樣品以評價整體的純度， 并將滿足所需的純度規格的流分匯集在一起從而形成洗脫匯集物。根據本發明的一個方面，純化的蛋白質產物沒有或包含極少量的目標雜質。根據本發明的一個方面，純化的蛋白質產物的純度至少為95%，根據本發明的另一個方面，純化的蛋白質產物的純度至少為97%，根據本發明的又一個方面，純化的蛋白質產物的純度至少為98%，根據本發明的又一個方面，純化的蛋白質產物的純度至少為99%，根據本發明
10的又一個方面，純化的蛋白質產物的純度為100%。根據本發明的另一方面，純化的胰島素和類似物沒有或包含極少量的目標雜質。 根據本發明的一個方面，純化的胰島素及類似物的純度至少為80%，根據本發明的另一個方面，純化的胰島素及類似物的純度至少為85%，根據本發明的另一個方面，純化的胰島素及類似物的純度至少為90%，根據本發明的又一個方面，純化的胰島素及類似物的純度為 97%。本發明的另一個方面涉及通過使用非線性梯度進行反相色譜與離子交換色譜結合實現有效的提高蛋白質的純度(> 95% )。在閱讀本文提供的公開內容和權利要求的基礎上，本發明這些和其他非限制的實施方式容易被本領域普通技術人員所了解。應了解，本發明不限于描述的特定的方法和過程，當然可以改變所需的蛋白質/多肽產物和方法。也應了解，本文所使用的術語只為描述特定的實施方式的目的，并不起到限制的作用。應了解，使用如在實施例中描述的舉例說明的純化的方法以獲取高分離度分離 (與用于分離的組分配合)，使得以特別簡單、方便和價廉的方式獲得期望的肽特別高效。本發明的上述具體實施方式
的描述用于說明和描述的目的。不是排除性的或將本發明限制于所公開的確切形式中。按照上述教導內容，可以進行多種修改和改變。此外，可以作出許多修改使特定情況、材料、物質的組合物、工藝、工序或步驟適應本發明的目的、精神和范圍。所有這些修改的目的都將在本文所附的權利要求的范圍內。借助于下面的實施例來進一步詳述本申請的技術。然而，這些實施例不應當解釋為限制本發明的范圍。實施例實施例1粗制訊-105用5倍的水稀釋，并將？!1調整至3.5。將此負載在填充陶瓷Hyper-D S陽離子交換樹脂的鋼柱上。用pH 3. 5的IOmM醋酸銨緩沖液進行平衡和沖洗。負載純度 (load purity)為46. 22%，包含5. 6%的去八肽雜質。當采用陡度0. 3的凸形梯度以10 柱體積、濃度緩沖液為0. 2M至0. 64M的醋酸銨進行時，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為 59%，去八肽水平僅為4. 4%，表明去八肽雜質水平近似減少50%。實施例2粗制IN-105用5倍的水稀釋，并將pH調整至3. 5。將此負載在填充陶瓷Hyper-D S陽離子交換樹脂的鋼柱上。用pH 3. 5的IOmM醋酸銨緩沖液進行平衡和沖洗。負載純度為52. 57%，包含9. 的去八肽雜質。當采用陡度0. 15的凹形梯度以10柱體積、緩沖液濃度為0. 38M至0. 64M的醋酸銨進行時，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為63. 31%，去八肽水平僅為5. 14%，表明去八肽雜質水平近似減少71%。實施例3粗訊_105用5倍的水稀釋，并將？!1調整至3.5。將此負載在填充陶瓷Hyper-D S 陽離子交換樹脂的鋼柱上。用PH 3. 5的IOmM醋酸銨緩沖液進行平衡和沖洗。負載純度為 55. 46%，包含8. 18%的去八肽雜質。當采用陡度0. 15的凹形梯度以10柱體積、緩沖液濃度為0. 2M至0. 64M的醋酸銨進行時，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為67. 37%，去八肽水平僅為5. 35%，表明去八肽雜質水平近似減少61%。
實施例4粗訊_105用5倍的水稀釋，并將？!1調整至3.5。將此負載在填充陶瓷Hyper-D S 陽離子交換樹脂的鋼柱上。用PH 3. 5的IOmM醋酸銨緩沖液進行平衡和沖洗。負載純度為 55. 80%，包含7. 71%的去八肽雜質。當采用陡度0. 15的凸形梯度以10柱體積、緩沖液濃度為0. 38M至0. 64M的醋酸銨進行時，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為70%，去八肽水平僅為3. 85%，表明去八肽雜質水平近似減少75%。實施例5粗訊_105用5倍的水稀釋，并將？!1調整至3.5。將此負載在填充陶瓷Hyper-D S 陽離子交換樹脂的鋼柱上。用PH 3. 5的IOmM醋酸銨緩沖液進行平衡和沖洗。負載純度為 55. 99%，包含8. 15%的去八肽雜質。當采用陡度0. 15的凸形梯度以20柱體積、緩沖液濃度為0. 38M至0. 64M的醋酸銨進行時，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為70. 32%，去八肽水平僅為3. 91%，表明去八肽雜質水平近似減少74%。實施例6粗訊_105用5倍的水稀釋，并將？!1調整至3.5。將此負載在填充陶瓷Hyper-D S 陽離子交換樹脂的鋼柱上。用PH 3. 5的IOmM醋酸銨緩沖液進行平衡和沖洗。負載純度為 53. 51%，包含9.的去八肽雜質。當采用陡度0. 15的凸形梯度以20柱體積、緩沖液濃度為0. 38M至0. 64M的醋酸銨進行時，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為68. 41%，去八肽水平僅為4. 79%，表明去八肽雜質水平近似減少75%。實施例7將粗IN-105負載在填充陶瓷Hyper-D S陽離子交換樹脂的鋼柱上，并進行(rim) 凸形梯度(洗脫)。將從陽離子交換獲得的洗脫匯集物稀釋并負載在包含10%的溶劑的硅膠C8樹脂上。使用的流動相為0.25M的檸檬酸(緩沖液A)和乙腈(緩沖液B)。用10% 的B進行平衡并用15%的B沖洗。負載純度為78. 26%。用以20柱體積、15%的B至23% 的B的線性梯度進行洗脫，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為96. 33%。實施例8將粗IN-105負載在填充陶瓷Hyper-D S陽離子交換樹脂的鋼柱上，并進行凸形梯度(洗脫)。將從陽離子交換獲得的洗脫匯集物稀釋并負載在包含10%的溶劑的硅膠C8 樹脂上。使用的流動相為0. IM的Tris和0.02M的MgCl2 (緩沖液A)和乙腈(緩沖液B)。 用10%的B進行平衡和沖洗。負載純度為65. 06%。用以20柱體積、25%的B至32%的B 的線性梯度進行洗脫，由此得到的洗脫匯集物顯示純度為92. 87%。實施例9將TP (處理)后(Post TP)胰島素甲酯(IME)晶體溶解在0. 5N醋酸(HOAc)、50mM 醋酸鈉(Na-HOAc)和15%甲醇(MeOH)中使負載的濃度為1. 5gpl。然后過濾并以20gpl (即每升樹脂20克的IME)負載在基于C8硅膠樹脂的RP柱上。負載純度為74. 51%，包含約 9%的作為主要雜質的去蘇氨酸人類胰島素。使用醋酸鈉緩沖液(緩沖液A)和甲醇(緩沖液B)進行RP HPLC。使用陡度為3的50-65%的B的凸形梯度，并且由此得到的產物包含 0%的去蘇氨酸人類胰島素并且具有95. 95%的總純度。實施例IOa)將酶促反應后的甘精胰島素晶體溶解在2M HOAc和10 %乙腈中使負載的濃度在0. 8至0. 95gpl。然后過濾該負載并在5. 4gpl (即每升樹脂5. 4克的甘精胰島素)的負載容量下負載在基于C18硅膠樹脂的RP柱上。負載純度為35% -40%，包含幾種不同的雜質。 使用250mM的檸檬酸(緩沖液A)和IP(緩沖液B)作為有機改性劑進行洗脫。隨著不同的雜質的分離，最終EP純度為96. 02%。對于80. 97%的總純度，階段產率增加至86. 7%。使用陡度為0. 5的10-20%的B的凸形梯度。實施例IOb)將酶促反應后的甘精胰島素晶體溶解在2M HOAc和10 %乙腈中使負載的濃度在 0. 8至0. 95gpl。然后過濾該負載并在5. 4gpl (即每升樹脂5. 4克的甘精胰島素)的負載容量下負載在基于C18硅膠樹脂的RP柱上。負載純度為35% -40%，包含幾種不同的雜質。 使用250mM的檸檬酸(緩沖液A)和IPA(緩沖液B)作為有機改性劑進行洗脫。隨著不同的雜質的分離，最終EP純度為96. 02%。對于80. 97%的總純度，階段產率增加至86. 7%。 使用陡度為0. 5的10-20%的B的凹形梯度。實施例11將門冬胰島素的酶促最終材料用乙酸和乙腈稀釋使負載濃度高達0.8gpl。然后過濾該負載并在IOgpl (即每升樹脂10克的門冬胰島素)的負載容量下負載在基于C4硅膠的RP柱上。負載純度為71. 03%，包含幾種不同的緊密相關的雜質，諸如去八肽門冬胰島素、側翼、單糖基化門冬胰島素等。使用250mM的pH4. 0的醋酸鈉(緩沖液A)和乙腈(緩沖液B)進行洗脫。使用陡度為0. 5的15-30%的B的凹形梯度，并且由此得到的產物具有 88. %的總純度。使用非線性梯度的主要優點是減少諸如側翼(減少97%)和去八肽門冬胰島素(減少70%)的雜質。本發明的優選的實施方式已公開。然而，本領域普通技術人員應認識到一些修改將包括在本發明的教導內容內。因此，應研究下列權利要求以確定本發明的真正的范圍和內容。
權利要求
1.一種用于從包含至少一種相關雜質的混合物中純化多肽的制備色譜方法，所述方法包括步驟(a)將多肽混合物經過色譜處理，其中樹脂在略酸性pH的緩沖液和有機改性劑中沖洗和平衡；(b)通過由緩沖液濃度在0.OlM至IM范圍內進行具有從0到⑴范圍的陡度系數的陡度的凸形或凹形非線形梯度來洗脫；和(c)目標雜質去除至少50%而回收多肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述色譜處理選自包括離子交換色譜或反相 HPLC或其組合的組。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟a)中的所述樹脂是離子交換樹脂或C4至 C18硅膠樹脂。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，使用的所述緩沖液是醋酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PH范圍為約2至約5。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述多肽是胰島素、胰島素類似物或其衍生物。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，胰島素衍生物是IN105。
8.根據權利要求6所述的方法，其中，胰島素類似物是甘精胰島素、門冬胰島素、賴脯胰島素、賴谷胰島素或胰島素甲酯。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述目標雜質是去八肽雜質、去蘇氨酸雜質、去八肽門冬胰島素雜質或側翼和單糖基化門冬胰島素或其任何組合。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述多肽與樹脂的比例按重量體積比的范圍為 0. 1 至 50g/l。
11.根據權利要求1所述的方法，其中，所述多肽與樹脂的比例按重量體積比的范圍更優選1至25g/l。
12.根據權利要求1至11所述的方法，其中，回收的所述多肽具有至少95%的純度。
13.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少95%的純度的IN-105。
14.一種從包含至少一種相關雜質的混合物中純化胰島素和類似物的方法，所述方法包括步驟(a)將混合物經過用有機改性劑沖洗和平衡的RPHPLC柱；(b)通過由緩沖液濃度在0.OlM至IM范圍內進行具有從0至⑴范圍的陡度系數的陡度的凸形/凹形非線形梯度來洗脫；和(c)目標雜質去除至少50%而回收胰島素和類似物。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述RPHPLC以從約2至約5范圍的pH沖洗和平衡。
16.根據權利要求14所述的方法，其中，回收的所述胰島素類似物具有至少97%的純度。
17.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少85%的純度的胰島素甲酯。
18.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少90%的純度的胰島素甲酯。
19.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少90%的純度的甘精胰島素。
20.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少95%的純度的甘精胰島素。
21.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少80%的純度的門冬胰島素。
22.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少84%的純度的門冬胰島素。
23.根據前述權利要求中任一項純化的具有至少88%的純度的門冬胰島素。
全文摘要
本公開提供了一種用于通過色譜技術純化多肽的方法。提出的方法將幫助解決與純化來自不斷發展的生物技術產業新興的生物蛋白質產物相關的問題。
文檔編號C07K14/62GK102471367SQ201080030652
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月8日 優先權日2009年7月9日
發明者克里薩納海坦亞·古拉, 哈里什·耶爾, 尼特斯·戴夫, 德夫什·拉德哈克里什南, 蘇恩達雷什·尚卡爾 申請人:拜康有限公司