專利名稱：蛋白質糖基化的控制及其相關組合物和方法
蛋白質糖基化的控制及其相關組合物和方法相關申請的交叉引用本申請要求于2009年4月20日提交的美國臨時專利申請第61/170，897號的優先權，其整體援引加入本文。
背景技術：
本發明涉及用于控制蛋白質糖基化的方法及其相關組合物和方法。本發明進一步涉及減少糖蛋白的糖基化和/或聚糖位點占據率(occupancy)從而影響它們的生物學特征和/或功能的方法。本發明還涉及利用本發明的方法以控制糖基化而制備的組合物及其用途。蛋白質和多肽已成為越來越重要的治療劑。在大多數情況下，這些蛋白質和多肽在細胞培養中產生，來自被改造和/或選擇以產生異常高水平的所關注的特定蛋白質或多肽的細胞。細胞培養條件的控制和優化對于成功的蛋白質和多肽的商業化生產是極為重要的。許多在細胞培養中產生的蛋白質和多肽為糖蛋白，其含有包括寡糖鏈在內的共價連接的糖結構。這些寡糖鏈在內質網和高爾基體中通過N-鍵或0-鍵連接至蛋白質。寡糖鏈可以包含糖蛋白質量的顯著部分。寡糖鏈被認為在糖蛋白的功能中起著關鍵作用，包括促進糖蛋白的正確折疊，介導蛋白-蛋白相互作用，賦予穩定性，賦予有利的藥效和/或藥物動力學特性，抑制蛋白質水解消化，將糖蛋白靶向適當的分泌途徑以及將糖蛋白靶向特定器官或多個器官。—般,在內質網腔中將N-連接寡糖鏈添加至新生的易位蛋白(參見Alberts etal. , 1994, In Molecular Biology of the Cell,其援引加入本文)。寡糖被添加至在革巴共有序列Asn-X-Ser/Thr內含有的天冬酰胺殘基的側鏈上的氨基，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。通常在內質網中通過的特異性糖苷酶修剪初始寡糖鏈，導致由2個N-乙酰葡糖胺和3個甘露糖殘基組成的短的分枝核心寡糖。在內質網中的初始加工之后，糖蛋白通過小泡穿梭至高爾基體，在這里寡糖鏈進行進一步加工，然后分泌至細胞表面。可以通過添加幾個甘露糖殘基來修飾修剪的N-連接寡糖鏈，導致高甘露糖寡糖。可選地，可以將一個或多個單糖單位的N-乙酰葡糖胺添加至核心甘露糖亞基以形成復雜寡糖(complex oligosaccharide)。可以將半乳糖添加至N-乙酰葡糖胺亞基，并且可以將唾液酸亞基添加至半乳糖亞基，導致以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺殘基終止的鏈。此外，可以將巖藻糖殘基添加至核心寡糖的N-乙酰葡糖胺殘基。通過特異性糖基轉移酶催化這些添加中的每一種。除了通過N-連接糖基化途徑修飾糖蛋白，當它們在高爾基體中加工時還可以通過將0-連接寡糖鏈添加至特定絲氨酸或蘇氨酸殘基來修飾糖蛋白。一次添加一個0-連接寡糖殘基，并且通過特異性酶催化每個殘基的添加。與N-連接糖基化相比，0-連接糖基化的共有氨基酸序列較少明確定義。據證實，蛋白質特別是免疫球蛋白的糖基化對其生物學功能具有顯著影響。例如，對于免疫球蛋白，已證實糖基化影響效應子功能、結構穩定性和抗體產生細胞的分泌率(Leatherbarrow et al.，1985, Mol. Immunol. 22 :407)。負責這些特性的糖基一般連接至抗體的恒定(C)區。例如，IgG激活補體依賴性細胞溶解的經典途徑的完全能力需要在Ch2結構域中的天冬酰胺297處的IgG的糖基化(Tao and Morrison, 1989, J. Immunol. 143 2595)。在Ch3結構域中的天冬酰胺402處的IgM的糖基化是抗體的正確裝配和細胞溶解活性所必需的(Muraoka and Shulman, 1989, J. Immunol. 142 :695)。去除諸如 IgA 抗體的ChI和Ch3結構域中的位置162和419的糖基化位點導致胞內降解和抑制至少90%的分泌(Taylor and Wall, 1988，Mol. Cell. Biol. 8 :4197)。還觀察到在包含抗原結合位點的可變(V)區中的免疫球蛋白的糖基化。Sox和Hood(1970,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66 :975)報道約20%的人抗體在V區中是糖基化的。據信V結構域的糖基化是由V區序列中N-連接糖基化信號Asn-Xaa-Ser/Thr的偶然出現所引起的，并且本領域不認為其在免疫球蛋白功能中發揮重要作用。最近，已證實a -(1-6)葡聚糖特異性小鼠抗體的抗原結合位點中在重鏈的⑶R2處的糖基化增加其對葡聚糖的親和力(ffallick et al. , 1988, J. Exp. Med. 168 :1099 ；and
Wright et al.，1991，EMBO J. 10 :2717)。還已證實去除抗CD33抗體的抗原結合位點內的糖基化位點的突變，更具體地，抗體M195的V結構域的框架區內的N-連接糖基化位點的去除增強抗體與抗原結合(Co等人的美國專利第6，350，861號)。然而，未去除存在于抗體的Fe部分中的N-連接糖基化位點，并且優選將其糖基化以維持分子的效應子功能。此外，已將糖酵解抑制物質加入細胞培養基以減少代謝廢物乳酸的積累，從而增加細胞活力和抗體的蛋白質生產。參見，例如，國際專利申請第PCT/US2007/083473號，其現在公開為2008年5月8日的W02008/055260 (將糖酵解抑制化合物加入細胞培養物會減少乳酸濃度并增加生長分化因子8 (GDF-8)特異性抗體的產生)。雖然糖酵解抑制還可以影響蛋白質糖基化的水平，但是未評價甚至討論抑制劑對蛋白質糖基化的影響。而且，細胞培養所產生的抗GDF-8抗體在抗原結合位點中不包含任何潛在的糖基化位點(參見WO2008/055260第49頁第170段，引用Veldman等，美國專利公開第2004/0142382號，描述抗⑶F-8抗體Myo22、Myo28和Myo29)。因此，即使假設在重鏈恒定結構域的抗⑶F-8抗體的糖基化在所公開的培養條件下被影響，無法評價抗原結合位點的改變的糖基化的影響，因為看來所產生的抗體在抗原結合區(例如，V結構域)缺少潛在的糖基化位點。蛋白治療劑的主要問題是對配體或抗原的降低的親和力或低親和力。喪失或降低的親和力是高度不期望的，并且需要將更多的治療性蛋白質注射入患者，成本更高并且副作用的風險更大。甚至更嚴重地，親和力降低的蛋白質可能具有降低的生物學功能，如補體溶解、抗體依賴性細胞毒性和病毒中和。此外，與企圖抑制其相互作用的內源性配體或結合伙伴相比減少的抗原或結合伙伴與治療性蛋白質之間的競爭使得所述蛋白質可能具有降低的拮抗物功能。例如，在部分人源化抗體HUVHCAMP中親和力的喪失可以導致其喪失所有介導補體溶解的能力(參見，Riechmann et al. , 1988, Nature, 332, 323-327,表 I)。此外，考慮到蛋白質構象的不可預測性，甚至單個氨基酸的突變，特別是在蛋白質的抗原結合位點或配體結合位點的單個氨基酸的突變可以對潛在的治療性蛋白質的生物學活性具有劇烈影響。因此，本領域需要治療性蛋白質，其具有改變的對配體的親和力，或者在抗體的情況下，其具有改變的對抗原的親和力，特別是對抗原或配體的增加的親和力和/或增加的特異性，以及期望的潛在的由天然存在的恒定區糖基化所賦予的較低的免疫原性和提高的效應子功能。可選地，需要治療性蛋白質，特別是包含免疫球蛋白恒定區的抗體或Fe融合蛋白，或者其部分，其具有提高的對抗原或配體的結合親和力和/或特異性，但是存在于抗體重鏈恒定區中的糖基化位點的糖基化所介導的效應子功能下降或者沒有效應子功能。還需要抑制或去除治療性蛋白質的抗原或配體結合位點的糖基化，而不需要將任何突變引入所述抗原或配體結合位點的氨基酸序列。因此，本領域需要增加效力以及減少免疫球蛋白和其他治療重要性蛋白質所需的劑量的方法，并且需要通過這樣的方法所產生的治療性蛋白質，本發明滿足這些需要而不要求將任何突變引入抗體的抗原結合位點或治療性蛋白質的配體結合位點。盡管存在治療性糖蛋白的重要性和細胞培養方法的進步，對于在可以控制配體結合位點的糖基化的條件下產生這樣的蛋白質而不要求將氨基酸突變引入這樣重要的蛋白質部分的新方法仍有未滿足的需要。本發明滿足這種需要。發明概述本發明包括用于降低蛋白質的糖基化水平的方法。所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制劑的情況下，在生長于培養物中的宿主細胞中表達包含至少一個糖基化位點的蛋白質，其中與在不存在所述抑制劑的情況下在其他方面相同的條件下生長的其他方面相同的宿主細胞中產生的其他方面相同的蛋白質相比，所述蛋白質包含較低水平的糖基化，從而控制所述蛋白質的糖基化水平。在一方面,所述糖基化位點在配體結合位點或抗原結合位點中。在另一方面，所述糖基化水平選自在所述糖基化位點處的聚糖位點占據率和在所述糖基化位點處的糖基化的程度。在另一方面，所述糖基化位點選自0-連接糖基化位點和N-連接糖基化位點。在另一方面，所述糖基化位點為N-連接糖基化位點，并且進一步地，其中所述糖基化位點包含氨基酸序列天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X為除脯氨酸之外的任何氨基酸。在另一方面，所述糖基化抑制劑為選自以下抑制劑中的至少一種衣霉素、衣霉素(tunicaymycin)同系物、鏈病毒菌素、殺枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、桿菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素(duimycin)、I-脫氧甘露糖野尻霉素(l-deoxymannonojirimycin)、脫氧野尻霉素、N-甲基_1_脫氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖類似物、甘露糖類似物、2-脫氧-D-葡萄糖、2-脫氧葡萄糖、D-(+)_甘露糖、D_(+)半乳糖、2-脫氧-2-氟-D-匍萄糖、1,4-雙脫氧-1,4-亞氨基-D-甘露糖醇(DIM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脫氧葡萄糖、GDP-2-脫氧葡萄糖、甲羥戊二酸單酰-CoA還原酶抑制劑、25-羥基膽留醇、羥基膽留醇、苦馬豆素、放線酮、嘌呤霉素、放線菌素D、莫能菌素、擬基氰化物間氯苯腙(m-Chlorocarbonyl-cyanide phenylhydrazone, CCCP)、密實菌素、多職長醇-磷酰基-2-脫氧葡萄糖(dolichyl-phosphoryl-2-deoxyglucose)、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黃嘌呤(hygoxanthine)、胸苷、膽固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代環己烯四醇(bromoconduritol)、環己烯四醇環氧化物(conduritol epoxide)、環己烯四醇衍生物、糖基甲基對硝基苯三氮烯(glycosylmethyl-p-nitrophenyltriazene)、
羥基正纈氨酸、蘇型￠-氟代天冬酰胺、D-(+)_葡糖酸S-內酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-( 二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化銨、碘乙酸酯和氟乙酸酯。在另一方面，所述糖基化抑制劑為2-脫氧-D-葡萄糖。在另一方面，所述糖基化抑制量的范圍為約0. 5g/L_3g/L。在另一方面，所述方法還包括將所述培養物中的葡萄糖濃度維持在范圍為約
0.05g/L-10g/L 的量。在另一方面，所述宿主細胞選自酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。在另一方面，所述哺乳動物宿主細胞選自CHO細胞、NSO細胞、NS0/l、Sp2/0、人細胞、HEK 293、BHK、COS、Hep G2、PER. C6、C0S-7、TM4、CVl、VER0-76、MDCK、BRL 3A.W138.MMT060562、TRl、MRC5 和 FS4。在另一方面，所述宿主細胞為CHO細胞。在另一方面，所述糖基化位點為包含選自天冬酰胺-異亮氨酸-蘇氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-絲氨酸(NGS)、天冬酰胺-絲氨酸-蘇氨酸(NST)和天冬酰胺-蘇氨酸-絲氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一種糖基化位點。本發明涵蓋根據用于降低蛋白質的糖基化水平的方法所產生的蛋白質，其中所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制劑的情況下，在生長于培養物中的宿主細胞中表達包含至少一個糖基化位點的蛋白質，其中與在不存在所述抑制劑的情況下在其他方面相同的條件下生長的其他方面相同的宿主細胞中產生的其他方面相同的蛋白質相比，所述蛋白質包含較低水平的糖基化，從而控制所述蛋白質的糖基化水平，其中所述糖基化位點為配體結合位點或抗原結合位點，其中所述糖基化水平選自在所述糖基化位點處的聚糖占據率和在所述糖基化位點處的糖基化的程度，其中所述糖基化位點選自0-連接糖基化位點和N-連接糖基化位點，其中所述糖基化位點為包含選自天冬酰胺-異亮氨酸-蘇氨酸(NIT)的氨基酸序列的至少一種糖基化位點，其中所述糖基化抑制劑為2-脫氧-D-葡萄糖，所述糖基化抑制量的范圍為約0. 5g/L-3g/L，所述方法包括將所述培養物中的葡萄糖濃度維持在范圍為約0. 05g/L-10g/L的量，其中所述宿主細胞選自酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。在一方面，所述哺乳動物細胞為CHO細胞，并且天冬酰胺-甘氨酸-絲氨酸(NGS)、天冬酰胺-絲氨酸-蘇氨酸(NST)和天冬酰胺-蘇氨酸-絲氨酸(NTS)。在另一方面，所述蛋白質為抗體或其抗原結合部分，并且進一步地，其中所述抗體為抗人IgE抗體。在另一方面，所述抗體為人抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列，所述輕鏈可變區具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列。在另一方面，與在不存在所述糖基化抑制劑的情況下產生的其他方面相同的抗體相比，所述抗體包含至少一個以下所述的N-連接糖基化位點,所述位點未被占據和/或少包含至少一個糖部分，其中所述位點選自重鏈相對于SEQ ID NO :8的氨基酸序列的天冬酰胺73(N73)處的糖基化位點和天冬酰胺301 (N301)處的糖基化位點。在另一方面，所述抗體包含未被占據的在天冬酰胺73處的N-連接糖基化位點。在另一方面，所述蛋白質包含晚期糖基化終產物受體(RAGE)的配體結合位點(LBS)，所述配體結合位點包含選自SEQ ID NO 13,SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:15的氨基酸序列。在另一方面，所述蛋白質為RAGE融合蛋白，其包含沒有信號序列的SEQ ID NO 1的氨基酸序列，所述信號序列包含氨基酸殘基I至氨基酸殘基23號，其中所述融合蛋白缺少末端賴氨酸殘基(Lys438)。在另一方面，與在不存在所述糖基化抑制劑的情況下產生的其他方面相同的RAGE融合蛋白相比，所述RAGE融合蛋白包含至少一個以下所述的N-連接糖基化位點，所述位點未被占據和/或少包含至少一個糖部分，其中所述位點為選自在2號氨基酸殘基(N2)處的天冬酰胺、在58號氨基酸殘基(N58)處的天冬酰胺和在288號氨基酸殘基(N288)處的天冬酰胺的至少一個位點，全部相對于沒有信號序列(氨基酸I至23)的SEQ ID NO: I的氨基酸序列。在一方面，所述蛋白質包含至少兩個以下所述的N-連接糖基化位點，所述位點未被占據和/或少包含至少一個糖部分。在另一方面，所述蛋白質包含三個N-連接糖基化位點，其中至少一個未被占據和/或少包含至少一個糖部分。在另一方面，與在不存在所述抑制劑的情況下產生的其他方面相同的蛋白質相t匕，所述蛋白質表現出增加的與抗原的結合。在另一方面，與在不存在所述抑制劑的情況下產生的其他方面相同的蛋白質相t匕，所述蛋白質表現出增加的與RAGE配體的結合。在一方面，所述方法還包括從范圍為約34°C -39°C的溫度至范圍為約28V -33°C的溫度的溫度轉換。在另一方面，所述方法包括從范圍為約34 °C -37 °C的溫度至范圍為約30. 5°C -31. 5°C的溫度的溫度轉換。本發明涉及一種藥物組合物，其包含根據用于降低蛋白質的糖基化水平的方法所產生的蛋白質，其中所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制劑的情況下，在生長于培養物中的宿主細胞中表達包含至少一個糖基化位點的蛋白質，其中與在不存在所述抑制劑的情況下在其他方面相同的條件下生長的其他方面相同的宿主細胞中產生的其他方面相同的蛋白質相比，所述蛋白質包含較低水平的糖基化，從而控制所述蛋白質的糖基化水平，其中所述糖基化位點在配體結合位點或抗原結合位點中，其中所述糖基化水平選自在所述糖基化位點處的聚糖位點占據率和在所述糖基化位點處的糖基化的程度，其中所述糖基化位點為包含氨基酸序列天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸的N-連接糖基化位點，其中X為除脯氨酸之外的任何氨基酸，其中所述糖基化抑制劑為2-脫氧-D-葡萄糖，其中所述糖基化抑制量的范圍為約0. 5g/L-3g/L，并且所述方法還包括將所述培養物中的葡萄糖濃度維持在范圍為約0. 05g/L-10g/L的量，并且其中所述宿主細胞為CHO細胞。在另一方面，所述糖基化位點為包含選自天冬酰胺-異亮氨酸-蘇氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-絲氨酸(NGS)、天冬酰胺-絲氨酸-蘇氨酸(NST)和天冬酰胺-蘇氨酸-絲氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一種糖基化位點。本發明涉及包含一定量的融合蛋白的組合物，其中所述融合蛋白包含連接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽，其中所述RAGE多肽包含人RAGE(SEQ ID NO 3)的片段，其中所述人RAGE的片段包含配體結合位點和至少一個可以被糖基化的氨基酸殘基，其中所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的Ch2結構域或部分Ch2結構域以及免疫球蛋白的Ch3結構域，并且其中所述免疫球蛋白多肽的N端殘基連接至所述RAGE多肽的C端殘基；并且其中所述融合蛋白的量的至少0. 5%是非糖基化的(aglycosylated)。在一方面，所述融合蛋白的總量的至少30%是非糖基化的。在另一方面，完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于所有非完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率。在另一方面，所述融合蛋白包含至少三個可以糖基化的氨基酸殘基，其中糖基化的第一潛在位點是所述RAGE配體結合位點的氨基酸殘基，糖基化的第二潛在位點是所述RAGE多肽的氨基酸殘基，而糖基化的第三潛在位點是所述免疫球蛋白多肽的氨基酸殘基。本發明涉及一種組合物，其包含一種蛋白質，所述蛋白質包含至少一個潛在的糖
基化位點，其中完全糖基化的蛋白質的量少于糖基化低于完全糖基化的蛋白質的量，并且還包含藥學可接受的載體。在一方面，所述蛋白質包含兩個潛在的糖基化位點，并且其中完全糖基化的蛋白質的量少于包含一個未被糖基化和/或較低水平糖基化的位點的蛋白質的加和量和包含兩個未被糖基化和/或較低水平糖基化的位點的蛋白質的量。下文描述了本發明的可選實施方案，如采用各種培養條件、糖蛋白以及涉及不同糖基化抑制劑的實施方案。
當結合附圖閱讀時會較好地理解上文的發明概述以及下文的發明詳述。為了說明本發明的目的，圖中示出了目前優選的實施方案。然而，應當理解本發明不限于示出的具體安排和工具。圖中圖I為示出sRAGE-Ig融合蛋白的構建的圖。示出了晚期糖基化終產物受體(RAGE)與它的三個胞外結構域(V、C1和C2)、跨膜結構域和推測負責RAGE信號傳遞的胞內結構域。術語“可溶性RAGE”和“sRAGE”所涵蓋的可溶性或分泌形式的RAGE顯示為缺少跨膜和胞內結構域。sRAGE可以作為誘餌受體，并且在圖中其顯示為僅RAGE胞外結構域。示出了全長人重鏈IgGl分子，顯示可變結合結構域(Vh)與第一恒定結構域ChI —起形成抗體結合片段(Fab)，其通過柔性鉸鏈區連接至IgGl分子的第二和第三恒定結構域(Ch2和Ch3)。該圖還示出了通過將人RAGE的V和Cl結構域連接至IgGl分子的Ch2和CH3結構域來構建的有或沒有(示出)免疫球蛋白鉸鏈區的sRAGE-Ig融合蛋白。圖2，包括圖2A和2B，示出了本發明的sRAGE_Ig融合蛋白的氨基酸和核酸序列。圖2A示出了本發明的sRAGE-Ig融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)0 sRAGE-Ig蛋白序列包含461個氨基酸，其包括23個氨基酸的信號肽/前導序列，在某些情況下可以為22個氨基酸，在表達期間被切割以產生438個氨基酸的成熟蛋白(或者在N端賴氨酸被剪掉時為437個氨基酸)。為了這個實例的目的，氨基酸殘基的編號不包括23個氨基酸的前導序列，從而sRAGE-Ig融合蛋白序列具有在氨基酸I(Ql)處的谷氨酰胺，其可以環化以形成在氨基酸I處的焦谷氨酸(pE) (pEl)。人RAGE序列來源于GenBank登錄號NM_001136。在位置N2、N58和N288處的三個下劃線的天冬酰胺(N)表示N-連接糖基化的潛在位點。RAGE的V結構域跨越I號氨基酸殘基至氨基酸殘基E109。RAGE的Cl結構域與V結構域的C端序列重疊約10個氨基酸，并且跨越約氨基酸G99至E220。從氨基酸殘基195至氨基酸殘基198的下劃線的氨基酸RALR表示弗林蛋白酶切割的共有序列。在sRAGE的C2結構域的N端的約8個氨基酸殘基(PEGGAVAP)與Cl結構域的C端序列重疊，從而C1/C2連接處跨越約氨基酸L212至P228。IgGl Fe的CH2和CH3結構域顯示為涵蓋約P229至K438，其中末端賴氣fe (K)未被到掉。在不出的實施方案中，所述融合蛋白不包含完整的人IgGl絞鏈結構域。在另一實施方案中，所述融合蛋白可以包含鉸鏈或其任何部分，包括其中鉸鏈如果存在時可以被修飾，以便例如改變與未修飾的鉸鏈區相關的任何效應子功能。圖2B示出了編碼包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的sRAGE-Ig融合蛋白的核酸序列(SEQ ID NO :2)。以粗體突出的編碼序列1-753編碼RAGE N端蛋白序列，而序列754-1386編碼無鉸鏈區的人IgG Fe ( y I)蛋白序列。圖3為sRAGE-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析的圖，其證實用PNGaseF和弗林蛋白
酶消化的效果。通過mabselect純化在搖瓶培養中生長的細胞中表達的sRAGE_Ig融合蛋白，并且用PNGaseF或弗林蛋白酶進行消化，然后在還原4-12%梯度Bis-Tris凝膠上分析。每條泳道含有2. 7 yg的蛋白質。以Kd表示的分子量在左側示出。泳道I和6含有未處理的融合蛋白。泳道2含有單獨與PNGaseF消化緩沖液孵育的融合蛋白。泳道3含有用PNGaseF消化的融合蛋白。泳道4含有單獨與弗林蛋白酶消化緩沖液孵育的融合蛋白。泳道5含有用弗林蛋白酶消化的融合蛋白。FLM=全長單體。圖4示出了通過尺寸排阻層析(SEC)分析sRAGE-Ig融合蛋白的結果。在流動相(350mM朽1檬酸鹽,pH 6.0)中將純化的sRAGE-Ig融合蛋白稀釋至3mg/mL,并且通過尺寸排阻層析(SEC)分析，利用Superdex 20010/300GL柱、環境溫度、0. 75mL/分鐘流速、20 y L注射體積和40分鐘運行時間，在280nm監測。SEC使得能夠用左上角的插圖所示出的峰結果相對定量同源二聚體、異源二聚體、Fe 二聚體和高分子量類型(species)。圖5示出了反相-HPLC的結果，其示出了 sRAGE-Ig融合蛋白的聚糖位點占據譜。疊加的層析譜為sRAGE-Ig融合蛋白(SI)和分級樣品(S1F1、S1F2和S1F3)的FLM。級分S1F3的濃度非常低，因此其未被包括在隨后的ELISA結合測定中。右上角的插圖示出了每種聚糖的大約含量，為每個樣品/級分的百分率。圖6為示出圖5所示的峰SlFl和S1F2通過質譜分析法的峰性質確認的圖。質譜數據鑒定峰SlFl為3-聚糖類型，而S1F2為2-聚糖類型。圖7為示出從sRAGE-Ig融合釋放的N-連接聚糖的正相HPLC分析與層析譜上所示的峰的鑒定圖。各種類型的相對豐度如表I所示。圖8為示出sRAGE-Ig的胰蛋白酶消化的反相分離結果的圖。插圖示出了 N-連接胰蛋白酶消化肽段洗脫的區域。圖9示出了含有共有N-連接糖基化位點的胰蛋白酶消化肽段的鑒定與理論單一同位素分子量。該圖示出了來自用胰蛋白酶消化的sRAGE-Ig融合蛋白的三種預測的胰蛋白酶消化糖肽的氨基酸序列，并且示出了每種胰蛋白酶消化物(digest)的理論單一同位素分子量。所述胰蛋白酶消化糖肽如下具有約638. 36Da質量的TlpE(pENITAR);具有約 2241. 22Da 分子量的 TlO (VLPNGSLFLPAVGIQDEGIFR)；以及具有約 1188. 50Da 分子量的T31 (EEQYNSTYR)。
圖10為示出反相-HPLC的圖，其示出了在存在衣霉素的情況下表達的sRAGE-Ig融合蛋白的聚糖位點占據譜。疊加的層析譜為來自衣霉素處理的細胞的sRAGE-Ig融合蛋白(S2)和三個級分樣品(S2F1、S2F1和S2F3)。右上角的插圖示出了每個樣品或其級分中每種聚糖的相對百分率。圖11為示出圖10所示的峰S2F1、S2F2和S2F3通過質譜分析法的峰鑒定的確認圖。質譜數據鑒定峰S2F1為3-聚糖類型，S2F2為2-聚糖類型，而S2F3為0-聚糖類型。圖12為示出典型存在于免疫球蛋白重鏈恒定區中的示例性二觸角糖形的圖。根據本發明，“G0”指其中不存在末端唾液酸(NeuAc)或Gal的二觸角結構，“G1”指具有一個Gal而無NeuAc的二觸角結構，并且“G2”指具有兩個末端Gal而無NeuAc的二觸角結構。圖13，包括圖13A至13D，示出了抗IgE抗體5. 948. I的重鏈和輕鏈的序列。圖13A示出了 mAb 5. 948. I重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。可變結構域以小寫字母顯示，
而恒定結構域以大寫字母顯示。互補決定區(CDR)有下劃線，并且重鏈可變區中在框架3的天冬酰胺73處的潛在N-連接糖基化位點以大寫字母顯示(“NTS”)。在重鏈恒定結構域中的N-連接糖基化位點(“NST”)Asn301有下劃線。圖13B示出了編碼mAb 5. 948. I的重鏈的核酸序列(SEQ ID NO 9)。圖13C示出了 mAb 5. 948. I輕鏈的氨基酸序列(SEQ IDN0:10)。可變結構域以小寫字母顯示，而恒定結構域以大寫字母顯示。互補決定區(OTR)有下劃線。圖13D示出了編碼mAb 5.948. I的輕鏈的核酸序列(SEQ ID N0:11)。圖14為示出抗體5. 948. I的重鏈的4種可能的聚糖位點占據變體的圖。從左至右，該圖示出了在Asn73或Asn301不包含聚糖的0-聚糖占據變體；僅在Asn301包含一個聚糖的I-聚糖占據變體；僅在Asn73包含一個聚糖的I-聚糖占據變體；以及在Asn73和Asn301均包含聚糖的完全占據的2-聚糖占據位點變體。圖15為示出抗體5. 948的聚糖譜的圖。重鏈被解析為3個峰，顯示2_聚糖和I-聚糖變體。未檢測到0-聚糖占據變體。可以將I-聚糖占據峰進一步解析以鑒定在Fe區中糖基化的變體(更普遍)和在抗體重鏈的Fab區中糖基化的變體。數據顯示完全糖基化的2-聚糖占據重鏈包含在對照培養條件下產生的總重鏈的約98 %，而I-聚糖占據重鏈包含在對照培養條件下產生的總重鏈的約2 %。圖16為示出單克隆抗體5. 948. l(mAb 5.948. I)與用乙二醇_N_聚糖酶去糖基化的5. 948. I抗體的樣品和利用SDS和BME變性的樣品一起的聚糖譜的圖。如先前所見到的(圖15，見上文)，天然5. 948. I抗體的重鏈解析為3個主峰，顯示2-聚糖和I-聚糖變體。未檢測到0-聚糖占據變體。可以將I-聚糖占據峰進一步解析以鑒定在Fe區中糖基化的變體和在抗體重鏈的Fab區中糖基化的變體。天然去糖基化的5. 948. I抗體的重鏈顯示出主要含有I-聚糖類型與一些0-聚糖類型的譜。變性去糖基化的5. 948. I抗體的重鏈顯示出主要含有0-聚糖類型的譜。圖17為示出在對照條件下(即，在不存在糖基化抑制劑的情況下)產生的抗體5. 948. I的聚糖譜的圖，其中在第14天從培養物采集樣品(樣品7 ；S7)。重鏈被解析為3個峰，顯示2-聚糖和I-聚糖變體。未檢測到0-聚糖占據變體。可以將I-聚糖占據峰進一步解析以鑒定在Fe區中糖基化的變體(更普遍)和在抗體重鏈的Fab區中糖基化的變體。數據顯示完全糖基化的2-聚糖占據重鏈包含在對照培養條件下產生的總重鏈的約98%，而I-聚糖占據重鏈包含在對照培養條件下產生的總重鏈的約2%。
圖18為示出在存在糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖的情況下產生的抗體5.948. I的聚糖譜的圖，其中在第14天從培養物采集樣品(樣品11 ;S11)。重鏈被解析為3個峰，顯示2-聚糖和I-聚糖。很容易檢測到0-聚糖占據變體。可以將I-聚糖占據峰進一步解析以鑒定在Fe區中糖基化的變體(更普遍)和在抗體重鏈的Fab區中糖基化的變體。圖19為譜疊加的圖，其比較在對照條件下(在不存在糖基化抑制劑的情況下)產生的mAb 5.948. I的聚糖譜和在糖基化控制條件下(即，在存在糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖的情況下)產生的mAb 5. 948. I的聚糖譜，其中在第14天從每種培養物采集樣品(分別為S7和S11)。重鏈被解析為4個峰，顯示2-聚糖、I-聚糖和0-聚糖變體。僅在Sll中很容易檢測到0-聚糖占據變體。可以將I-聚糖占據峰進一步解析以鑒定在Fe區中糖基化的變體(更普遍)和在抗體重鏈的Fab區中糖基化的變體。數據顯示與其中I-聚糖變體主要由Fe變體組成的對照樣品(S7)相比，在2-脫氧-D-葡萄糖樣品(Sll)中
I-聚糖Fab變體重鏈相對于I-聚糖Fe變體大大增加。圖20，包括圖20A和20B，為詳細的譜比較圖，其比較在存在和不存在糖基化抑制劑的情況下產生的抗體5. 948. I的聚糖譜。圖20A為示出在對照條件下(在糖基化抑制劑不存在的情況下)產生的mAb 5.948. I的聚糖譜的圖，其中在第14天從培養物采集樣品
(S7)。圖20B為示出在存在2-脫氧-D-葡萄糖的情況下產生的mAb 5. 948. I的聚糖譜的圖，其中在第14天從培養物采集樣品(Sll)。圖20A和圖20B的比較顯示僅在Sll中很容易檢測到0-聚糖占據變體。可以將I-聚糖占據峰進一步解析以鑒定在Fe區中糖基化的變體(更普遍)和在抗體重鏈的Fab區中糖基化的變體。數據顯示與其中I-聚糖變體主要由Fe變體組成的對照樣品(S7 ;圖20A)相比，在2-脫氧-D-葡萄糖樣品(Sll ;圖20B)中I-聚糖Fab變體重鏈相對于I-聚糖Fe變體大大增加。圖21為示出在對照條件下(即，在不存在糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖的情況下)產生的mAb 5. 948. I在該方法的時間進程中的聚糖譜的圖。該圖示出了 3條曲線，顯示在培養的第7天(S5)、第12天(S6)和第14天(S7)采集的樣品的聚糖譜。數據顯示與在Fab位點(Asn73)糖基化的1_聚糖重鏈的量相比，在該蛋白質的Fe區(Asn301)糖基化的I-聚糖重鏈的相對量隨時間增加。數據還證實在任何時間采集的任何樣品中未檢測到0-聚糖重鏈。圖22為示出在存在糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖的情況下產生的mAb5. 948. I在該方法的時間進程中的聚糖譜的圖。該圖示出了 3條曲線，顯示在培養的第7天
(S9)、第12天(SlO)和第14天(Sll)采集的樣品的聚糖譜。數據顯示與2-聚糖重鏈蛋白的量相比，I-聚糖重鏈蛋白的相對量隨時間增加。此外，數據顯示與在Fe位點(Asn301)糖基化的I-聚糖重鏈的量相比，在該蛋白質的Fab區(Asn73)糖基化的1_聚糖重鏈蛋白隨時間增加。這與在對照樣品中觀察到的相反，對照樣品中在培養期間Fe I-聚糖相對于FabI-聚糖增加。數據還證實在糖基化抑制條件下0-聚糖重鏈的產生隨時間增加。圖23為示出在對照條件下(即，在不存在糖基化抑制劑的情況下)產生的天然抗體5. 948. I (mAb 5. 948. I)與等量的用乙二醇-N-聚糖酶去糖基化的5. 948. I抗體樣品和利用SDS和BME變性的樣品一起的聚糖譜的圖，其中在培養的第14天采集樣品(S7)。如先前所見到的，天然5. 948. I抗體的重鏈解析為3個主峰，顯示2-聚糖和I-聚糖變體。在糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖不存在的情況下，未檢測到這個樣品的O-聚糖占據變體。圖24為示出與等量的用乙二醇-N-聚糖酶去糖基化的5.948. I抗體樣品(一 一)和利用SDS和BME變性的樣品()相比的在存在糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖的情況下產生的天然抗體5. 948. I (mAb 5. 948. I)(實線)的聚糖譜的圖，其中在培養的第14天采集樣品(S7)。天然5. 948. I抗體的重鏈解析為4個峰，顯示2-聚糖、I-聚糖和0-聚糖變體。很容易檢測到這個樣品的0-聚糖占據變體，并且進一步證實了在糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖存在的情況下0-聚糖重鏈的產生。發明詳述除非本文另有定義，用于本發明的科學和技術術語應當具有本領域普通技術人員通常理解的意思。此外，除非上下文另有要求，單數術語應當包括復數，并且復數術語應當包括單數。一般，本文所述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質和核酸化學和雜交所用的命名及其技術是本領域眾所周知和常用的。除非另有說明，一般根據本領域眾所周知的方法并如本說明書所引用和討論的各種普遍和更具體的參考文獻所述進行本發明的方法和技術。這類參考文獻包括，例如，Sambrook and Russell，2001， In Molecular Cloning， A Laboratory Approach， ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY ；Ausubel et al. , 2002, In CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY JBHarlow and Lane，1990，In Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor, NY，其援引加入本文。如本領域通常所完成的或如本文所述，根據制造商的說明書進行酶促反應和純化技術。本文所述的分析化學、有機合成化學、細胞和分子生物學、免疫學以及醫藥化學所用的命名及其實驗室方法和技術是本領域眾所周知和常用的。標準技術用于化學合成、化學分析、藥物制備、制劑和遞送以及患者的治療。定義如本文所用，在這個部分中以下術語中的每個具有與其相關的意思。在本文中冠詞“一個(a)”和“一個(an)”用于指一個或超過一個(即，至少一個)的該冠詞的語法對象。例如，“一個元素”表示一個元素或超過一個元素。如本文所用，20個常規氨基酸及其縮寫按照常規用法。參見Immunology--ASynthesis(2nd Edition, E. S.Golub and D. R.Gren, Eds. , Sinauer Associates,Sunderland, Mass. (1991))，其援引加入本文。如本文所用，通過其全名、其相應的三字母代碼或其相應的單字母代碼來表示氨基酸，如下表所示全名三字母代碼單字母代碼
天冬氨酸AspD
谷氨酸GluE
賴氨酸LysK
精氨酸ArgR
組氨酸HisH
酪氨酸TyrY
半胱氨酸CysC
天冬酰胺AsnN
谷氨酰胺GlnQ
絲氨酸SerS
蘇氨酸ThrT
甘氨酸GlyG
丙氨酸AlaA
纈氨酸ValV
亮氨酸LeuL
異亮氨酸IleI
甲硫氨酸MetM
脯氨酸ProP
苯丙氨酸PheF
色氨酸TrpW“保守性氨基酸取代”是這樣的取代，其中氨基酸殘基被具有化學特性(例如，電荷或疏水性)相似的側鏈R基團的另一氨基酸殘基取代。一般來說，保守性氨基酸取代基本上不會改變蛋白質的功能特性。在兩個或兩個以上氨基酸序列互相的不同之處在于保守性取代的情況下，可以將序列相同性百分比或相似性程度上調以校正該取代的保守性。進行這種調整的方法為本領域技術人員眾所周知。參見,例如，Pearson, 1994，Methods Mol.Biol. 243 :307-31)。具有化學特性相似的側鏈的氨基酸組的實例包括1)脂肪族側鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含有酰胺的側鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香側鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側鏈天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含有硫的側鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守性氨基酸取代組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可選地，保守性置換是在Gonnet et al.，1992，Science 256 :1443-1445 (其援引加入本文)所公開的PAM2501og-似然矩陣中具有正值的任何變化。“中度保守”置換是在PAM2501og-似然矩陣中具有非負值的任何變化。優選的氨基酸取代為這樣的取代(I)減少對蛋白質水解的敏感性，(2)減少對氧化的敏感性，(3)改變形成蛋白質復合物的結合親和力，以及(4)賦予或修飾這樣的類似物的其他物理化學和功能特性。包含取代、缺失、和/或插入的類似物可以包括具有除特定肽序列之外的序列的各種突變蛋白質。例如，可以在特定序列中(優選在形成分子間接觸的結構域之外的多肽的部分中，例如，在CDR之外)產生單個或多個氨基酸取代(優選保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代應當基本上不改變親本序列的結構特征(例如，置換氨基酸不應當傾向于打開存在于親本序列中的螺旋，或者破壞表征親本序列的其他類型的二級
結構)。本領域公知的多肽二級和三級結構的實例如Proteins, Structures and MolecularPrinciples(Creighton, Ed. ,ff. H. Freeman and Company,New York (1984)) ； Introductionto Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York,N. Y. (1991));和 Thornton et al.，1991，Nature 354 :105)所述，各自援引加入本文。通常利用序列分析軟件測量多肽的序列相似性。蛋白質分析軟件利用相似性的測量來匹配相似序列，所述相似性測量歸因于各種取代、缺失和其他修飾，包括保守性氨基酸取代。例如，Genetics Computer Group (可從 Genetics Computer Group, Inc.獲得的GCG),也被稱為Wisconsin Package,是超過130個程序的集成軟件包,用于訪問、分析和操作核苷酸和蛋白質序列。GCG含有諸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可以用于用缺省參數確定密切相關的多肽之間或者野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列相似性、同源性和/或序列相同性，所述密切相關的多肽如來自生物的不同物種的同源蛋白質。參見，例如，GCG版本6. I、版本7. O、版本9. I和版本10. O。還可以利用GCG中的程序FASTA比較多肽序列，利用缺省或推薦參數。FASTA (例如，FASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區域的比對和序列相同性百分比(Pearson,1990，Methods EnzymoI. 183 :63-98 ；Pearson,2000, Methods Mol. Biol. 132 185-219)。當本發明的序列與含有大量來自不同生物的序列的數據庫進行比較時，另一優選算法為計算機程序BLAST,特別是blastp或tblastn,利用缺省參數。參見，例如，Altschul et al. ,1990,J. Mol. Biol. 215 :403-410 ；Altschul et al. ,1997,Nucleic AcidsRes. 25 :3389-402 ;其援引加入本文。本文使用常規表示法描述多肽序列多肽序列的左端為氨基端；多肽序列的右端
為羧基端。完整“抗體”包含通過二硫鍵互相連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。一般參見，Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, ff. ,1989,ed. ,2nd ed. Raven Press, N. Y.)(為了所有目的其整體援引加入本文)。每條重鏈由重鏈可變區(HCVR*Vh)和重鏈恒定區(Ch)組成。重鏈恒定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(LCVR或')和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域Q組成。可以將V1^P'區進一步細分為高變區，其被稱為互補決定區(CDR)，散布在更保守的、被稱為框架區(FR)的區域中。每個
Vl由3個⑶R和4個FR組成，按照以下順序從氨基端至羧基端排列FRl』DRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4。按照Kabat, 1987and 1991, In !Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,MD)或Chothia&Lesk,1987, J. Mol.Biol. 196 :901-917 ；Chothia et al.，1989，Nature 342 :878-883 的界定將氨基酸分配至每個結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。在輕鏈和重鏈內，通過約12個或更多個氨基酸的“J”區連接可變區和恒定區，而重鏈還包括約10個或更多個氨基酸的“D”區。一般參見，Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul,ff. , ed. , 2nd ed. Raven Press,N. Y. (1989))。本文所用的術語“配體結合位點”指與另一分子特異性結合的多肽或蛋白質的部分，或者其片段，所述另一分子也被稱為結合伙伴或關聯配體(cognate ligand)。優選地，配體結合位點(“LBS”)可以但不必須包含至少一個聚糖位點(在本文中也被稱為“潛在的糖基化位點”)，所述聚糖位點可以但不必須被糖部分占據。配體結合位點的實例為RAGE的配體結合位點，其在2號氨基酸殘基天冬酰胺(Asn2或N2)處包含聚糖位點，并且在N58處還包含第二聚糖位點，其中LBS與RAGE配體特異性結合，所述RAGE配體包括但不限于淀粉狀蛋白P (AP)、血清淀粉狀蛋白A(SAA)、S100、羧甲基賴氨酸(CML)、兩性蛋白和⑶IIb/
CD18。在本文中可互換使用的術語“抗原結合位點”或“抗原結合部分”指抗體的一個或多個片段，其保留特異性結合至抗原(例如，IgE)的能力。據證實抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的片段進行。涵蓋在術語抗體的“抗原結合位點”之內的結合片段的實例包括⑴Fab片段，由Vh、(^和ChI結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通過在鉸鏈區的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和ChI結構域組成的Fd片段;(iv)由抗體單臂的Vl和Vh結構域組成的Fv片段；(V) dAb片段(Ward et al.，1989,Nature 341 :544-546)，其由Vh結構域組成；以及(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域\和Vh由不同基因編碼，但是可以利用重組方法通過合成接頭將它們連接，所述合成接頭使它們能夠作為單個蛋白鏈，其中\和Vh配對以形成單價分子(稱為單鏈 Fv(scFv));參見，例如，Bird et al.，1988，Science 242 :423-426 ;和 Hustonet al.，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883。這樣的單鏈抗體也涵蓋在術語抗體的“抗原結合部分”之內。諸如雙抗體(diabody)的其他形式的單鏈抗體也涵蓋在內。雙抗體為二價、雙特異性抗體，其中在單個多肽鏈上表達Vh和\結構域，但是利用接頭，所述接頭太短而不允許同一條鏈上的兩個結構域之間配對，從而強迫所述結構域與另一條鏈上的互補結構域配對并產生兩個抗原結合位點(參見，例如，Holliger et al. , 1993, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ；Poljak et al.，1994，Structure 2 :1121-1123)。此外，抗體或其抗原結合部分可以是較大的免疫粘附分子的部分，所述免疫粘附分子是通過抗體或抗體部分與一個或多個其他蛋白質或肽共價或非共價連接來形成的。這類免疫粘附分子的實例包括用鏈霉親和素核心區產生四聚體scFv分子(Kipriyanov etal. , 1995, Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及用半胱氨酸殘基、標記物肽和C端多聚組氨酸標簽產生二價和生物素化scFv分子(Kipriyanov et al. , 1994,Mol.Immunol. 31 :1047-1058)。其他實例包括其中將來自一個抗體的一個或多個⑶R共價或非共價并入分子以使其成為特異性結合至諸如IgE的所關注的抗原的免疫粘附素。在這樣的實施方案中，CDR可以作為較大的多肽鏈的部分并入，可以共價連接至另一多肽鏈，或者可以非共價并入。可以利用常規技術從整個抗體制備諸如Fab和F(ab' )2片段的抗體部分，例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化整個抗體。此外，如本文所述，可以利用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。當在本文中提到關于本發明的“抗體”時，應當理解還可以使用其抗原結合部分。抗原結合部分與完整抗體競爭特異性結合。一般參見，Paul. ff. ,ed.，1989，In fundamentalImmunology,Ch. 7 (2nd ed. ,Raven Press,N. Y.)(為了所有目的其整體援引加入本文)。可以通過重組DNA技術或者通過完整抗體的酶促或化學切割來產生抗原結合部分。在一些實施方案中，“抗原結合部分”包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fd、Fv、dAb以及互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體和多肽，所述多肽至少含有抗體的部分，其足以賦予該多肽特異性抗原結合。在具有一個或多個結合位點的實施方案中，所述結合位點可以互相相同或者可以不同。本文所用的術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一分子成分的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和力。如本文所用，術語“人抗體”或“全人抗體”包括具有可變區的抗體，在所述可變區中框架和CDR區均來源于人種系(germline)免疫球蛋白序列。而且,如果所述抗體含有恒定區，該恒定區也來源于人種系免疫球蛋白序列。本公開的人抗體或其抗原結合部分可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或者通過體內體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所用，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，其中來源于諸如小鼠的另一哺乳動物物種的種系的CDR序列被移植至人框架序列。術語“人單克隆抗體”或“全人單克隆抗體”指表現出單一結合特異性的抗體，其具有可變區，在所述可變區中框架和CDR區均來源于人種系免疫球蛋白序列。在一實施方案中，通過雜交瘤產生人單克隆抗體，所述雜交瘤包括獲得自諸如轉基因小鼠的轉基因非人動物的B細胞，其具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組，其中將所述B細胞融合至永生化細胞。如本文所用，術語“重組人抗體”包括所有通過重組方法制備、表達、產生或分離的人抗體，如(a)從人免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體(transchromosomal)的動物(例如，小鼠)或由此制備的雜交瘤(下文進一步描述)分離的抗體；(b)從轉化以表達人抗體的宿主細胞分離的抗體，例如從轉染瘤分離；(c)從重組、組合人抗體文庫分離的抗體；以及(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產生或分離的抗體。這類重組人抗體具有可變區，在所述可變區中框架和CDR區均來源于人種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施方案中，可以使這類重組人抗體進行體外誘變(或者，當使用人Ig序列轉基因的動物時，體內體細胞誘變)，因此重組抗體的Vh和\區的氨基酸序列雖然來源于人種系Vh和 '序列并與之相關，但是可以在體內人抗體種系庫(repertoire)內不天然存在。如本文所用，“同種型”或“種類”指重鏈恒定區基因所編碼的抗體種類(例如，IgM或IgG)。雖然抗體的恒定結構域不涉及結合至抗原，但是其表現出各種效應子功能。根據重鏈恒定區的氨基酸序列，可以將給定人抗體或免疫球蛋白分至五大類免疫球蛋白中的一類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。不同種類的免疫球蛋白的結構和三維構型為眾所周知。在各種人免疫球蛋白種類中，已知僅人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和IgM激活補體。已知人IgGl和IgG3在人中介導ADCC。如本文所用，“亞類”指重鏈恒定區基因的同種型內的進一步劃分，例如，IgG同種型內的 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 亞類。短語“識別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”在本文中與術語“特異性結合抗原的抗體”可互換使用。術語“抗體依賴性細胞毒性”或“ADCC”指細胞介導的反應，其中非特異性細胞毒性細胞(例如，NK細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞等)識別結合在靶細胞上的抗體，隨后引起靶細胞的裂解。介導ADCC的這類細胞毒性細胞一般表達Fe受體(FcR)。介導ADCC的初級細胞(NK 細胞)表達 Fe ￥1 111，而單核細胞表達？(^1 1、？(^1 11、？(^1 111 和 / 或 Fe yRIV。在造血細胞上表達的 FcR如 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92(1991)所總結。為了評價分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，如美國專利第5，500, 362號或第5，821，337號所述。對這類測定有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷
(NK)細胞。可選地或額外地，可以在體內評價所關注的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，如 Clynes et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)95 :652-656(1998)所公開的動物模型。術語“Fe受體”或“FcR”用于描述結合至抗體的Fe區的受體，其中Fe區包含重鏈的鉸鏈區以及(^和^^結構域。例如，FcR可以是天然序列人FcR。FcR可以是結合IgG抗體的受體(Y受體)，并且包括Fe Y RI、Fe Y RH、Fe y RIII和Fe y RIV亞類的受體,包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fe Y RIIA( “激活受體”)和Fe y RIIB ( “抑制受體”)，這兩個受體具有相似的氨基酸序列，不同之處主要在于其胞質結構域。激活受體Fe y RIIA在其胞質結構域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質結構域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見，Daeron, 1997, Annu. Rev. TmmunoI 15 :203_234)。在 Ravetch and Kinet,1991, Annu.Rev.Immunol. 9 :457-92 ； Cape I et al. , 1994, Immunomethods 4 :25-34 ;和 de Haas et al.,1995，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-341 中綜述了 FcR。在本文中術語“FcR” 涵蓋其他 FcR，包括那些在未來鑒定的FcR。該術語還包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer et al. ,1976, Tmmuno1. 117 587)和 Kim et al. ,1994, J. Tmmuno1. 24 249)。免疫球蛋白Fe片段上的主要FcR結合位點位于ChI和Ch2之間的鉸鏈區中。這個鉸鏈區與各種白細胞上的FcRl-3相互作用，并且觸發這些細胞攻擊靶標。(Wines et al. ,2000,J. Immunol. 164 :5313-5318)。鉸鏈區包括但不限于美國專利第6，165，476號所述的序列。術語“能夠誘導抗體依賴性細胞毒性”指通過本領域技術人員已知的測定法所測量的物質(諸如抗體)的引起ADCC的能力。這種活性的特征一般在于Fe區與各種FcR的結合。不受任何特定機制的限制，本領域技術人員會認識到抗體引起ADCC的能力可以例如，依靠其亞類(如IgGl或IgG3)，通過引入Fe區的突變，或者依靠對抗體的Fe區中的糖型的修飾。這樣的修飾如美國專利公開第2007/0092521號所述。術語“人抗體衍生物”指人抗體的任何修飾形式，例如，抗體與另一物質或抗體的
綴合物。術語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中來源于諸如小鼠的另一哺乳動物物種的種系的CDR序列已被移植至人框架序列。可以在人框架序列內進行額外的框架區修飾。
如本文所用，短語“特異性結合”表示化合物，例如蛋白質、核酸、抗體等，其識別并結合特定分子，但是基本上不識別或結合樣品中的其他分子。例如，抗體或肽抑制劑，其識別并結合樣品中的關聯(cognate)配體(例如，與其關聯抗原IgE結合的抗IgE抗體)，但是基本上不識別或結合該樣品中的其他分子。因此，在指定的測定條件下，特定的結合部分(例如，抗體或其抗原結合部分)優選結合至特定靶分子，例如IgE，并且不以顯著量結合至測試樣品中存在的其他組分。各種測定形式可以用于選擇特異性結合所關注的分子的抗體。例如，在可以用于鑒定與IgE特異性反應的抗體的許多測定中有固相ELISA免疫測定、免疫沉淀、BIAcore, FACS和蛋白質印跡分析。典型地，特異性或選擇性反應會是背景信號或噪聲的至少2倍，并且更典型地是背景的超過10倍，甚至更具體地，當平衡解離常數(Kd)為彡I PM，優選彡IOOnM并且最優選彡IOnM時，認為抗體“特異性結合”抗原。如本文所用，術語“k ”指特定抗體-抗原或受體-配體相互作用的結合速率(on-rate)或結合速率(association rate),而如本文所用，術語“k。^”指特定抗體-抗原/受體-配體相互作用的解離速率(off-rate)或解離速率(dissociation rate)。如本文所用，術語“KD”指解離常數，其獲得自U與km的比值(即，U/kJ，并且表示為摩爾濃度
(M)。可以利用本領域已建立的方法測定抗體或其它結合伙伴的Kd值。用于測定Kd的一種方法是通過利用表面等離子共振，通常利用生物傳感器系統，如Biacore 系統。本文所用的術語“嵌合抗體”表示包含來自兩個或兩個以上不同抗體的區域的抗體。在某些實施方案中，“嵌合抗體”包含來源于一個物種的可變區序列和來源于另一個物種的恒定區序列，如一種抗體，其中可變區序列來源于小鼠抗體，而恒定區序列來源于人抗體。在一實施方案中，CDR中的一個或多個來源于小鼠抗人IgE抗體。在另一實施方案中，所有CDR均來源于小鼠抗人IgE抗體。在另一實施方案中，將來自不止一種小鼠抗人IgE抗體的CDR在嵌合人抗體中組合。例如，嵌合抗體可以包含來自第一小鼠抗IgE抗體的輕鏈的⑶R1、來自第二小鼠抗人IgE抗體的輕鏈的⑶R2以及⑶R3，并且⑶R3來自第三小鼠抗人IgE抗體的輕鏈，而且來自重鏈的⑶R可以來源于一種或多種其他抗IgE抗體。此外，框架區可以來源于相同小鼠抗人IgE抗體中的一種或者來源于一種或多種不同小鼠。此外，如本文前面所討論的，嵌合抗體包括這樣的抗體，其包含來源于不止一個物種的種系序列的部分。本發明的糖部分會參考用于描述寡糖的常用命名法來描述。使用這種命名法的糖化學的綜述在 Hubbard and Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50 :555-583 中找到。這種命名法包括，例如，Man，其代表甘露糖；GicNAc，其代表2-N-乙酰葡糖胺；Gal，其代表半乳糖；Fuc，為巖藻糖；以及Glc，其代表葡萄糖。唾液酸通過簡化符號描述如下=NeuNAc為5-N-乙酰神經氨酸，而NeuNGc為5-輕乙酰神經氨酸(IUB-IUPAC Joint Commissionon Biochemical Nomenclature,1982, J.Biol. Chem. 257 :3347-3351 ； (1982)J. Biol.Chem. 257 :3352)。本發明的糖結構出現在作為N-連接寡糖表達的蛋白質上。“N-連接糖基化”指糖部分通過GlcNAc連接至多肽鏈中的天冬酰胺殘基。N-連接糖全部含有共同的Man1-6 (Manl-3)Man^ 1_4G1cNAcP l_4GlcNAc P-R核心結構。因此，在所述核心結構中，R代表產生的糖蛋白的天冬酰胺殘基。所產生的蛋白質的序列會含有天冬酰胺-X-絲氨酸、天冬酰胺-X-蘇氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X為除脯氨酸之外的任何氨基酸(Asn-Xaa-Ser/Thr)。相比之下,“0-連接”糖的特征在于共同核心結構,其為連接至蘇氨酸或絲氨酸的羥基的GalNAc，但是不需要共有序列。N-連接糖中最重要的是“復雜” N-連接糖，，如本文所述的“二觸角”結構。技術人員會認識到糖蛋白免疫球蛋白G(IgG)與含有0個、I個或2個半乳糖殘基的三種類型的復雜二觸角結構相關(Wormland et al. ,1997, Biochemistry 36:1370-1380)，通常分別稱為GO、Gl和G2。關于IgG類的人抗體分子，每種具有連接在Asn297的酰胺側鏈的N-連接寡糖，Asn 297位于Fe區的CH2結構域的內表面的P-4轉角(Beale and Feinstein,1976，Q. Rev. Biophys. 9 :253-259 ；Jefferis et al. ,1995,Immunol. Letts. 44 :111-117)。連接在IgG CH2結構域的Asn 297的寡糖部分是復雜二觸角類型的，其具有經鑒定的多聚己糖核心結構和可變的外部糖殘基(參見JefTeris et al.， 1997, supra ；ffyss and Wagner, 1996, Current Opinions in Biotech. 7 :409-416)。核心結構(GIcNAc2Man3GICNAC)為典型的二觸角寡糖，并且可以如以下示意圖所代表
權利要求
1.一種用于降低蛋白質的糖基化水平的方法，所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制劑的情況下，在生長于培養物中的宿主細胞中表達包含至少一個糖基化位點的蛋白質，其中與在不存在所述抑制劑的情況下在其他方面相同的條件下生長的其他方面相同的宿主細胞中產生的其他方面相同的蛋白質相比，所述蛋白質包含較低水平的糖基化，從而控制所述蛋白質的糖基化水平。
2.權利要求I的方法，其中所述糖基化位點在配體結合位點或抗原結合位點中。
3.權利要求2的方法，其中所述糖基化水平選自在所述糖基化位點的聚糖位點占據率和在所述糖基化位點的糖基化程度。
4.權利要求3的方法，其中所述糖基化位點選自O-連接糖基化位點和N-連接糖基化位點。
5.權利要求4的方法，其中所述糖基化位點為N-連接糖基化位點，并且進一步地，其中所述糖基化位點包含氨基酸序列天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X為除脯氨酸之外的任何氨基酸。
6.權利要求5的方法，其中所述糖基化抑制劑為選自以下抑制劑的至少一種衣霉素、衣霉素同系物、鏈病毒菌素、殺枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、桿菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素、I-脫氧甘露糖野尻霉素、脫氧野尻霉素、N-甲基-I-脫氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖類似物、甘露糖類似物、2-脫氧_D_匍萄糖、2-脫氧匍萄糖、D- (+)-甘露糖、D- (+)半乳糖、2-脫氧-2-氟-D-匍萄糖、1,4-雙脫氧-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇(DM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脫氧葡萄糖、GDP-2-脫氧葡萄糖、甲羥戊二酸單酰-CoA還原酶抑制劑、25-羥基膽留醇、羥基膽甾醇、苦馬豆素、放線酮、嘌呤霉素、放線菌素D、莫能菌素、羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)、密實菌素、多萜長醇-磷酰基-2-脫氧葡萄糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黃嘌呤、胸苷、膽固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代環己烯四醇、環己烯四醇環氧化物、環己烯四醇衍生物、糖基甲基對硝基苯三氮烯、羥基正纈氨酸、蘇型氟代天冬酰胺、D-(+)_葡糖酸I內酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-( 二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化銨、碘乙酸酯和氟乙酸酯。
7.權利要求6的方法，其中所述糖基化抑制劑為2-脫氧-D-葡萄糖。
8.權利要求7的方法，其中所述糖基化抑制量的范圍為約O.5g/L-3g/L。
9.權利要求8的方法，所述方法還包括將所述培養物中的葡萄糖濃度維持在范圍為約O.05g/L-10g/L 的量。
10.權利要求8的方法，其中所述宿主細胞選自酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
11.權利要求10的方法，其中所述哺乳動物宿主細胞選自CHO細胞、NSO細胞、NS0/1、Sp2/0、人細胞、HEK 293、BHK、COS、Hep G2、PER. C6、COS-7, TM4、CVU VER0-76、MDCK, BRL3A.W138.MMT 060562、TRl、MRC5 和 FS4。
12.權利要求11的方法，其中所述宿主細胞為CHO細胞。
13.權利要求12的方法，其中所述糖基化位點為包含選自天冬酰胺-異亮氨酸-蘇氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-絲氨酸(NGS)、天冬酰胺-絲氨酸-蘇氨酸(NST)和天冬酰胺-蘇氨酸-絲氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一個糖基化位點。
14.根據權利要求10的方法產生的蛋白質。
15.根據權利要求13的方法產生的蛋白質。
16.權利要求15的蛋白質，其中所述蛋白質為抗體或其抗原結合部分，并且進一步地，其中所述抗體為抗人IgE抗體。
17.權利要求16的蛋白質，其中所述抗體為人抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，所述輕鏈可變區具有SEQ ID N0:10的氨基酸序列。
18.權利要求17的蛋白質，其中與在不存在所述糖基化抑制劑的情況下產生的所述其他方面相同的抗體相比，所述抗體包含至少一個以下所述的N-連接糖基化位點，所述位點未被占據和/或少包含至少一個糖部分，其中所述位點選自重鏈中相應于SEQ ID NO 8的氨基酸序列的天冬酰胺73 (N73)處的糖基化位點和天冬酰胺301 (N301)處的糖基化位點。
19.權利要求18的蛋白質，其中所述抗體包含未被占據的在天冬酰胺73處的N-連接糖基化位點。
20.權利要求15的蛋白質，其中所述蛋白質包含晚期糖基化終產物受體(RAGE)的配體結合位點(LBS)，所述配體結合位點包含選自SEQ ID NO 13,SEQ ID N0:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
21.權利要求20的蛋白質，其中所述蛋白質為RAGE融合蛋白，其包含沒有信號序列的SEQ ID NO :1的氨基酸序列，所述信號序列包含氨基酸殘基I至23號氨基酸殘基，其中所述融合蛋白缺少末端賴氨酸殘基(Lys438)。
22.權利要求21的蛋白質，與在不存在所述糖基化抑制劑的情況下產生的其他方面相同的RAGE融合蛋白相比，所述RAGE融合蛋白包含至少一個以下所述的N-連接糖基化位點，所述位點未被占據和/或少包含至少一個糖部分，其中所述位點為選自在2號氨基酸殘基(N2)處的天冬酰胺、在58號氨基酸殘基(N58)處的天冬酰胺和在288號氨基酸殘基(N288)處的天冬酰胺的至少一個位點，全部相應于沒有信號序列(氨基酸I至23)的SEQID NO 1的氨基酸序列。
23.權利要求22的蛋白質，其中所述蛋白質包含至少兩個以下所述的N-連接糖基化位點，所述位點未被占據和/或少包含至少一個糖部分。
24.權利要求22的蛋白質，其中所述蛋白質包含三個N-連接糖基化位點，其中至少一個未被占據和/或少包含至少一個糖部分。
25.權利要求18的蛋白質，其中與在不存在所述抑制劑的情況下產生的所述其他方面相同的蛋白質相比，所述蛋白質表現出增加的與抗原的結合。
26.權利要求22的蛋白質，其中與在不存在所述抑制劑的情況下產生的所述其他方面相同的蛋白質相比，所述蛋白質表現出增加的與RAGE配體的結合。
27.權利要求11的方法，所述方法還包括從范圍為約34°C_39°C的溫度至范圍為約28 V -33 0C的溫度的溫度轉換。
28.權利要求27的方法，所述方法包括從范圍為約34°C_37°C的溫度至范圍為約30. 5°C -31. 5°C的溫度的溫度轉換。
29.—種藥物組合物，其包含權利要求14的蛋白質和藥學可接受的載體。
30.一種藥物組合物，其包含權利要求15的蛋白質和藥學可接受的載體。
31.包含一定量的融合蛋白的組合物，其中所述融合蛋白包含連接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽， a)其中所述RAGE多肽包含人RAGE(SEQ ID NO :3)的片段，其中所述人RAGE的片段包含配體結合位點和至少一個可以被糖基化的氨基酸殘基， b)其中所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的Ch2結構域或部分Ch2結構域和免疫球蛋白的Ch3結構域，以及 c)其中所述免疫球蛋白多肽的N端殘基連接至所述RAGE多肽的C端殘基；以及 其中所述融合蛋白的量的至少O. 5%是非糖基化的。
32.權利要求31的組合物，其中所述融合蛋白的總量的至少30%是非糖基化的。
33.權利要求31的組合物，其中完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于所有非完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率。
34.權利要求31的組合物，其中所述融合蛋白包含至少三個可以被糖基化的氨基酸殘基，其中糖基化的第一潛在位點是所述RAGE配體結合位點的氨基酸殘基，糖基化的第二潛在位點是所述RAGE多肽的氨基酸殘基，糖基化的第三潛在位點是所述免疫球蛋白多肽的氣基酸殘基。
35.一種組合物，其包含一種蛋白質，所述蛋白質包含至少一個潛在的糖基化位點，其中完全糖基化的蛋白質的量少于糖基化低于完全糖基化的蛋白質的量，并且還包含藥學可接受的載體。
36.權利要求35的組合物，其中所述蛋白質包含兩個潛在的糖基化位點，并且其中完全糖基化的蛋白質的量少于包含一個未被糖基化和/或較低水平糖基化的位點的蛋白質的加和量與包含兩個未被糖基化和/或較低水平糖基化的位點的蛋白質的量。
全文摘要
本發明涉及用于控制蛋白質的糖基化的新方法和由此產生的蛋白質。本發明的示例性方法包括通過在糖基化抑制劑存在的情況下培養表達所述蛋白質的宿主細胞來產生包含降低的糖基化水平的蛋白質，例如，所述蛋白質在糖基化位點包含較少聚糖或較少糖。在本發明的示例性方法中，降低的糖基化水平改變所述蛋白質的生物學特征，例如，改變了所述蛋白質與其靶配體的結合。
文檔編號C07K14/705GK102803292SQ201080027386
公開日2012年11月28日 申請日期2010年4月15日 優先權日2009年4月20日
發明者R·G·庫姆斯, S·羅, D·L·魯布爾 申請人:輝瑞公司