專利名稱：用于高水平生產二十碳五烯酸的改善的優化的解脂耶氏酵母菌株的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域。更具體地講，本發明涉及工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株，該菌株能夠有效地生產高濃度的二十碳五烯酸一一種《_3多不飽和脂肪酸[“PUFA”]。
背景技術：
二十碳五烯酸[“EPA” ；順式-5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸；w-3]在臨床上和制藥上的價值是眾所周知的(美國專利申請公布2009-0093543-A1)。類似地，相對于從天然的微生物源或通過分離從魚油和海洋浮游生物生產EPA，利用重組方法在微生物中生產EPA的優點也是被充分認可的。盡管文獻報道了負責EPA的生產的《-3/ -6多不飽和脂肪酸[“PUFA”]生物合成途徑的多個部分在其中被引入植物和非含油酵母的許多最近的實例，申請人的受讓人的主要努力聚焦在含油酵母解脂耶氏酵母(美國專利7，238，482;美國專利申請公布2006-0115881-A1 ;美國專利申請公布2009-0093543-A1)上。將含油酵母定義為那些天然能夠合成并積聚油的酵母，其中積聚的油為細胞干重的至少25 %。更具體地講，美國專利申請公布2006-0115881-A1展示了通過表達下列基因在重組解脂耶氏酵母菌株中占總脂肪酸9%的EPA的生產而無Y-亞麻酸[“GLA”；《-6]的共合成A 9延伸酶、A 8去飽和酶、A 5去飽和酶、A 17去飽和酶、A 12去飽和酶和C16/18延伸酶。美國專利申請公布2009-0093543-A1描述了用于生產EPA的優化的重組解脂耶氏酵母菌株，并展示了通過在其天然的過氧化物酶體生物合成因子10蛋白(PEXlO)中包含破壞的宿主細胞中表達下列基因，在重組解脂耶氏酵母菌株中占總脂肪酸55. 6%的EPA的生產△ 9延伸酶、A 8去飽和酶、A 5去飽和酶、A 17去飽和酶、A 12去飽和酶、C16718延伸酶和二酰基甘油膽堿磷酸轉移酶。盡管有以上引用的公開，除高的總脂質含量外，還允許占總脂肪酸的高重量％的EPA生產，同時使中間體脂肪酸如亞油酸[“LA”；《-6]的生產和最終的油產物中的副產物脂肪酸最小化的EPA商業生產，但是菌株的改善依然是必要的。通過工程化改善的優化的解脂耶氏酵母菌株，申請人已解決了上述問題，其中所述改善允許下列中的至少一種總油級分中61. 8% EPA的生產，按干細胞重量的百分比計39. 6%的總脂肪酸的生產，或具有6. I的EPA對LA比值的脂質的生產。發明概沭在第一個實施方案中，本發明涉及生產油的重組耶氏酵母屬宿主細胞，所述油包含
(a)按總脂肪酸的重量百分比計至少50%的二十碳五烯酸；并且(b)所述油按總脂肪酸的重量百分比計的二十碳五烯酸與按總脂肪酸的重量百分比計的亞油酸的比值為至少3. I。在第二個實施方案中，本發明涉及權利要求I的重組耶氏酵母屬宿主細胞，其中所述宿主細胞包含(a)至少一種包含多肽的復合酶，所述多肽具有連接到至少一種A8去飽和酶的至少一種A9延伸酶；(b)至少一種其表達被下調的過氧化物酶體生物合成因子蛋白；和(C)至少一種重組構建體，所述構建體包含至少一種編碼酶的核苷酸序列，所述酶
選自丙二酰-輔酶A合成酶和酰基-輔酶A溶血磷脂酰基轉移酶。優選地，所述丙二酰-輔酶A合成酶基本上由以下序列組成，所述序列選自SEQ IDNO 40 和 SEQ ID NO :42。優選地，所述酰基-輔酶A溶血磷脂酰基轉移酶基本上由以下序列組成，所述序列選自 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 31 和 SEQID NO :32。優選地，所述復合酶連接子選自SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7。優選地，所述復合酶基本上由以下序列組成，所述序列選自SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 11 和 SEQ ID NO :13。在第三個實施方案中，本發明涉及用于制備包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括a)培養任何本發明的宿主細胞，其中包含二十碳五烯酸的微生物油被生產；以及，b)任選地回收步驟(a)的微生物油。在第四個實施方案中，本發明涉及進一步加工通過本發明的方法制備的油。在第五個實施方案中，本發明涉及用于生產包含按總脂肪酸的重量百分比計至少50%的二十碳五烯酸的油的重組宿主細胞，所述宿主細胞選自具有ATCC名稱ATCCPTA-10025的解脂耶氏酵母Y8406 ;具有ATCC名稱ATCC PTA-10026的解脂耶氏酵母Y8412 ；和，具有ATCC名稱ATCCPTA-10027的解脂耶氏酵母Y8259。牛物保藏下列生物材料保藏于美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209),并且具有
下列名稱、保藏號和保藏日期。
權利要求
1.生產油的重組耶氏酵母屬(Yarrowiasp)宿主細胞,所述油包含 (a)按總脂肪酸的重量百分比計至少50%的二十碳五烯酸；并且， (b)所述油按總脂肪酸的重量百分比計的二十碳五烯酸與按總脂肪酸的重量百分比計的亞油酸的比值為至少3. I。
2.權利要求I的重組耶氏酵母屬宿主細胞，其中所述宿主細胞包含 (a)至少一種包含多肽的復合酶，所述多肽具有連接到至少一種AS去飽和酶的至少一種A9延伸酶； (b)至少一種其表達被下調的過氧化物酶體生物合成因子蛋白；和， (c)至少一種重組構建體，所述構建體包含至少一種編碼酶的核苷酸序列，所述酶選自丙二酰-輔酶A合成酶和酰基-輔酶A溶血磷脂酰基轉移酶。
3.權利要求2的重組宿主細胞，其中所述丙二酰-輔酶A合成酶基本上由選自SEQIDNO 40和SEQ ID NO 42的序列組成。
4.權利要求2的重組宿主細胞，其中所述酰基-輔酶A溶血磷脂酰基轉移酶基本上由以下序列組成，所述序列選自 SEQ ID NO 15,SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO :32。
5.權利要求2的重組宿主細胞，其中所述復合酶連接子選自SEQID NO=USEQ ID NO2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7。
6.權利要求2的重組宿主細胞，其中所述復合酶基本上由以下序列組成，所述序列選自 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO :13。
7.用于制備包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括 a)培養權利要求1-5中任一項的宿主細胞，其中包含二十碳五烯酸的微生物油被生產；以及， b)任選地回收步驟(a)的微生物油。
8.權利要求7的方法，其中步驟(b)的回收的油被進一步加工。
9.用于生產油的重組宿主細胞，所述油包含按總脂肪酸的重量百分比計至少50%的二十碳五烯酸，所述宿主細胞選自具有ATCC名稱ATCC PTA-10025的解脂耶氏酵母Y8406 ;具有ATCC名稱ATCCPTA-10026的解脂耶氏酵母Y8412 ;和，具有ATCC名稱ATCCPTA-10027的解脂耶氏酵母Y8259。
全文摘要
本發明描述了含油酵母解脂耶氏酵母的工程化的菌株，所述菌株能夠生產包含按總脂肪酸的重量百分比計的[“％TFA”]高于50重量％的二十碳五烯酸[“EPA”](一種ω-3多不飽和脂肪酸)，并且具有至少3.1的EPA％TFA對亞油酸比值(以％TFA測量)的油。這些菌株除其他異源的Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶、Δ12去飽和酶、C16/18延伸酶外，還過表達至少一種Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶復合酶，并任選地過表達二酰基甘油膽堿磷酸轉移酶、丙二酰-輔酶A合成酶和/或酰基-輔酶A溶血磷脂酰基轉移酶。至少一種過氧化物酶體生物合成因子蛋白的表達被下調。主張了在所述宿主細胞中生產EPA的方法、從所述細胞獲得的油、和由此生產的產品。
文檔編號C07K14/195GK102803289SQ201080026332
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月14日 優先權日2009年6月16日
發明者S-P·洪, P·L·夏普, Z·薛, N·S·亞達夫, Q·朱 申請人:納幕爾杜邦公司