專利名稱：利用可穿透細胞的重編程轉錄因子建立誘導性多能干細胞用于個性化干細胞療法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重編程轉錄因子重組蛋白質，其中大分子轉導結構域(MTD)被融合至重編程轉錄因子從而獲得細胞穿透性。本發明還涉及編碼所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質的多肽以及所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質的表達載體。 所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質可以在體細胞中有效地增強重編程的能力， 因此可用于建立誘導性多能干細胞(iPS細胞)。
背景技術：
胚胎干細胞(ES細胞)是來自囊胚期胚胎的內細胞團(ICM)的“多能干細胞”。它們可分化成三種原胚層，即，內胚層、中胚層和外胚層，這些原胚層發育成人體。內胚層導致產生甲狀腺細胞、肺細胞和胰腺細胞；中胚層發育成心肌細胞、肌細胞、腎細胞和血細胞； 外胚層不僅導致產生皮膚細胞、神經細胞和色素細胞，而且產生生殖細胞，即，卵子和精子。 因為胚胎干細胞可分化成如此多類型的細胞，所以它們被預期在作為治療絕癥的手段中起重要作用。胚胎干細胞可通過使用來自冷凍人胚胎的細胞而建立，或通過體細胞核移植技術而建立，在體細胞核移植技術中，體細胞的細胞核被移植到去核的卵細胞中。但是，這兩種方法因為使用來自人胚胎的細胞以及需要大量的人卵子而遭遇倫理問題。另外，核移植的低效率以及由克隆導致的致命遺傳缺陷的潛在危險也是成問題的。另一種不使用人胚胎和卵子而建立胚胎干細胞的方法是利用重編程轉錄因子重編程人類體細胞。關于這點，據報導，已選擇了與胚胎干細胞的維持有關的M個候選基因， 并已發現，當經由病毒載體移植到細胞中時，其中四種基因(Oct4、sox2、c-Myc和Klf4)誘導細胞的重編程(Yamanaka，Cell 1 :633_678，2006)。已顯示，這四種由逆轉錄病毒遞送的因子在小鼠成纖維細胞中表達并且被誘導重編程體細胞從而生成誘導性多能干細胞。另外，另一研究顯示，通過將四種重編程轉錄因子中的0ct4和Sox2與新的因子(即，LiM8和 Nanog) 一起遞送，人體細胞被成功地重編程(Yu J，Science 318(5858) 1917-20，2007)。 因此，可以意識到，在以上進行過實驗的六種轉錄因子(0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和 Lin28)中，0ct4和Sox2對于重編程的誘導是必不可少的，而c_Myc、Klf4、Nanog和LiM8 可以各種組合方式任選地與這兩種主要的轉錄因子一起使用并且在多能干細胞的建立和重編程過程中起重要作用。另外，前述基因對于多能性和自我更新，以及胚胎干細胞的未分化的維持是非常重要的。由這些基因表達出的轉錄因子在為實現自我更新而抑制抑制基因的同時彼此激活且誘導分化。0ct_4(也稱為第V類POU結構域)是一種屬于POU家族的八聚體轉錄因子。已知該蛋白質在未分化的細胞中特異性地表達，例如胚胎干細胞和胚胎腫瘤細胞。而且，其在維持干細胞的多能性中起著關鍵作用。如果Oct-4表達的水平處于正常范圍，干細胞的自我更新和多能性即被維持。但是，Oct-4的表達水平高于正常范圍會導致干細胞分化成原始內胚層和原始外胚層。相反，Oct-4的低表達水平會導致干細胞發育成滋養外胚層。因此， Oct-4對于調節胚胎干細胞的多能性以及細胞分化都是至關重要的。也有報導稱，Oct-4與 Sox2相互作用從而協同增加下游基因的表達，即，Fgf4、Utf-I、Nanog和Sox2。Sox家族的基因與單能干細胞以及多能干細胞有關。在這些基因中，Sox2(SRY型高遷移率組蛋白盒2)轉錄因子是包含HMG蛋白盒DNA結合基序的Sox家族的成員。Sox2 是Sox家族的20個蛋白質中唯一的在維持胚胎干細胞的多能性中起重要作用的蛋白質。與 Oct-4類似，如果Sox2的表達被抑制，小鼠胚胎干細胞被誘導分化。而且，在Sox2的幾個下游基因的啟動子區域發現的Sox2結合位點通常存在于鄰近Oct-4結合位點或Nanog結合位點的位置。因此，Sox2轉錄因子和Oct-4轉錄因子的相互作用使得被重編程的干細胞維持未分化的狀態并顯示出胚胎干細胞的特性。c-Myc ( 一種螺旋-環-螺旋/亮氨酸拉鏈轉錄因子)是與多種細胞內功能有關的原癌基因，例如細胞生長、分化、增殖、凋亡以及向癌細胞的轉變。c-Myc是通過LIF(白血病抑制因子)/STAT3和Wnt進行的信號遞送機制中的一個下游基因，該機制是多能性維持的主要機制。c-Myc轉錄因子防止p21基因通過被重編程的干細胞中的Klf4基因激活而抑制細胞增殖。另外，c-Myc通過結合至存在于基因組上的Myc識別位點并吸引組蛋白乙酰基轉移酶復合體來改變染色質的結構，因而Oct-4和Sox2可成功結合至靶基因。Klf4是屬于Kruppel樣因子(Klf)家族的轉錄因子。它之前被Yamanaka小組和Jaenisch小組用來生產鼠和人重編程干細胞。但是，考慮到Thomson小組報導過不使用Klf4建立人重編程干細胞，因此該轉錄因子對于生產人重編程干細胞可能不是必需的。 Klf4的特性在于其Kruppel型鋅指，并且其參與生長抑制，因而調節細胞周期。據報導，與 Myc類似，Klf4是胚胎干細胞中STAT3的下游基因，并且其過度表達維持0ct_4表達，因此抑制小鼠胚胎干細胞的分化。另外，Klf4與Sox2 —起負責調節Leftyl的表達，Leftyl是胚胎干細胞中Oct-4的下游基因并且抑制p53腫瘤抑制基因的功能。因此，人們認為Klf4 間接地增強Nanog的活性，Nanog被認為是胚胎特異性基因并且抑制c-Myc誘導的凋亡，從而誘導產生重編程干細胞。已報導稱，Klf2以及Klf4可被用于產生人重編程干細胞。而且，其他相關基因(即，Klfl和Klf5)雖然與Klf4或Klf2相比可能表現出較低的效率，但它們也可被用來產生人重編程干細胞。Nanog是一種胚胎特異性基因，其不通過LIF/STAT3機制起作用。與0ct_4或Sox2 類似，這種獨立的轉錄因子與胚胎干細胞的多能性維持有關并且抑制負責分化成內胚層的 GATA4和GATA6轉錄因子。最后，LI擬8 ( —種mRNA結合蛋白質)在胚胎干細胞和胚胎腫瘤細胞中表達，并且已知與分化和增殖有關。雖然Nanog和LI擬8在產生重編程干細胞中不是不可或缺的，但 Thomson小組證實了利用這兩個基因來建立重編程干細胞。在許多當前進行的利用這六種重編程轉錄因子建立重編程干細胞的研究中，關鍵問題是轉錄因子的體內轉導。因此，相關技術正被密集地研究。在這些技術中，利用病毒載體的轉導通常被用來遞送重編程轉錄因子。但是，病毒載體轉導技術伴有腫瘤生成的副作用。已報導，當編碼這六種重編程轉錄因子(0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28) 任何一個的逆轉錄病毒或慢病毒被插入體細胞基因中時，該基因由于外部基因的整合而突變，并且被插入的c-Myc原癌基因在由重編程細胞產生的25%的嵌合體中產生畸胎瘤。
利用病毒或質粒轉導重編程轉錄因子的這種方法由于突變形成和瘤形成的可能性而限于細胞療法。但是，利用蛋白質轉導法轉導可穿透細胞的重編程轉錄因子的方法是一種無需插入外部基因的安全方法。因此，本發明的發明人通過將“MTD”融合至重編程轉錄因子重組蛋白質而致力于產生可穿透細胞的重編程轉錄因子(可穿透細胞的CPTF)。同時，小分子的合成化合物或天然化合物可被傳輸到細胞中，但大分子(例如蛋白質、肽和核酸)由于大的分子量而不能被傳輸到細胞中。已普遍理解的是，大于500kDa 的大分子不能穿透活細胞的質膜(即，脂雙層結構)。為了克服該問題，開發出了“大分子細胞內轉導技術(MITT) ”，使得治療上有效的大分子被遞送至細胞中，從而便于利用肽、蛋白質和遺傳材料本身開發出新的生物分子藥物。根據這種技術，靶標大分子被融合至“疏水性MTD”和其他各種轉運體(transporter)并進入細胞中，并以重組蛋白質的形式被合成或表達且純化。隨后，它被施用至受治療者，并且可被快速和精確地遞送至其治療效果被有效顯示的靶標部位。參見韓國專利申請10-2009-7017564號；美國專利申請12/524935 號；加拿大專利申請2，676，797號；中國專利申請200880003468. 9號；澳大利亞專利申請 2008211854 ；印度專利申請5079/CHENP/2009號；歐洲專利申請08712219. 8號；以及日本專利申請2009-547177號(它們要求美國臨時申請60/887，060號的優先權)。這樣，MTD 通過被融合至肽、蛋白質、DNA、RNA、合成化合物等而允許許多不可穿透的材料傳輸進入細胞中。因此，本發明的發明人已通過將六種類型的轉錄因子(NanOg、0ct-4、SOX2、Klf4、 c-Myc和Lin28)融合至MTD而開發出了具有細胞穿透性的重編程轉錄因子重組蛋白質。發明人發現，這些重組蛋白質可以維持人類體細胞的多能性、自我更新以及未分化狀態，從而安全地誘導重編程而無需插入外源基因，因此完成了本發明。
發明內容
本發明的目的在于提供可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其可被高效地引入至細胞中并且可誘導體細胞的多能性，從而建立誘導性多能干細胞。為了實現上述目標，本發明通過將MTD融合至重編程轉錄因子而提供可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質。該重組蛋白質隨后可將重編程轉錄因子高效地引入至細胞中。本發明還提供編碼上述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質的多核苷酸。本發明進一步提供包含上述多核苷酸的表達載體以及使用該表達載體制備的轉化體。此外，本發明提供生產可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質的方法，該方法包括培養上述轉化體。最后，本發明提供可穿透細胞的重編程轉錄因子，其含有作為活性組分的上述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，該可穿透細胞的重編程轉錄因子可以高產率安全地建立誘導性多能干細胞。
圖1圖示本發明的重編程轉錄因子重組蛋白質的結構，其中JO-84 MTD和J0-86MTD中的一個被融合至每個重編程轉錄因子(Nanog、0ct4、Sox2、Klf4、cMyc*Lin28)。圖2顯示本發明的重編程轉錄因子重組蛋白質在存在(+)和不存在(-)IPTG( — 種蛋白質表達誘導劑)時的表達檢查結果。圖3是圖示制造多能干細胞的過程的示意圖并且顯示細胞集落的堿性磷酸酶染色結果，該結果是通過利用本發明的重組蛋白質來處理人真皮成纖維細胞(HDF細胞)來獲得的(如圖3所示)。圖4顯示利用圖3所示的本發明的重組蛋白質處理人真皮成纖維細胞(HDF細胞) 而獲得的集落中干細胞的細胞核中特異性表達的基因(0ct4和Nanog)的染色結果。圖5顯示特異性標記物(階段特異性胚胎抗原-3 :SSEA-3)在用圖3所示的本發明的重組蛋白質處理人真皮成纖維細胞(HDF細胞)而獲得的誘導性多能干細胞的表面上表達的流式細胞儀分析結果。圖6是RT-PCR分析結果，其顯示用圖3所示的本發明的重組蛋白質處理人真皮成纖維細胞(HDF細胞)而獲得的誘導性多能干細胞中干細胞特異性標記物的RNA表達。圖7是圖示制造本發明誘導性多能干細胞的過程的示意圖以及顯示利用本發明的重組蛋白質處理人真皮成纖維細胞(HDF細胞)而獲得的誘導性多能干細胞的集落的顯微照片(如圖7所示)。圖8顯示利用圖7所示的本發明的重組蛋白質處理人真皮成纖維細胞(HDF細胞) 而獲得的細胞集落中干細胞的細胞核中特異性表達的基因(0ct4和Nanog)的染色結果。圖9顯示兩種干細胞特異性標記物，即，SSEA_3(階段特異性胚胎抗原_3)和 TRA-l-60(腫瘤排斥抗原-1-60)，在利用圖7所示的本發明的重組蛋白質處理人真皮成纖維細胞(HDF細胞)而獲得的多能干細胞的表面上的表達的流式細胞儀分析結果。圖10圖示重編程轉錄因子重組蛋白質的結果，其中J0-10、J0-52、J0-132、 J0-145、J0-173和J0-181MTD中的一個根據本發明被融合至每個重編程轉錄因子(Nanog、 0ct4、Sox2、Klf4、cMyc 和 Lin28)。圖11是本發明的重編程轉錄因子重組蛋白質的表達的檢查結果，該重組蛋白質已進行密碼子優化以優化在存在(+)和不存在(_) IPTG(—種蛋白質表達誘導劑)時的表達。
具體實施例方式本發明提供可穿透細胞的Nanog、0ct4、Sox2、Klf4、cMyc和LiM8重組蛋白質 (CP-Nanog、CP-0ct4、CP-Sox2、CP-Klf4、CP-cMyc 和 CP_Lir^8)以及編碼該重組蛋白質的多核苷酸，在該重組蛋白質中，MTD被融合至重編程轉錄因子，重編程轉錄因子因此變成可穿透細胞的，并且可以高效率被引入到細胞中。本發明利用通過將MTD融合至Nanog、0ct4、Sox2、Klf4、cMyc和LiM8重編程轉錄因子而獲得細胞穿透性的蛋白質。在這些蛋白質中，全長Nanog被融合至核定位序列(NLS)(即NLS-Nanog (NNanog)) 的重組蛋白質具有如SEQ ID NO :20所示的氨基酸序列。NLS-Nanog可被例如具有SEQ ID NO 19所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用JO-84 MTD(MTD84)制備的全長Nanog重組蛋白質可包括以下蛋白質
NLS-MTD84-Nanog (NM84Nanog)，其具有如SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 21所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-Nanog-MTD84 (NNanogM84)，其具有如SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 23所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD84-Nanog-MTD84(NM84NanogM84)，其具有如 SEQ ID NO 26 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :25所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長Nanog重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD86-Nanog (NM86Nanog)，其具有如SEQ ID 28所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO ,21所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-Nanog-MTD86 (NNanogM86)，其具有如SEQ ID 30所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 29所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NL S-MTD86-Nanog-MTD86 (NM86NanogM86)，其具有如 SEQ ID 32 所示的氨基酸序列， 并且可被例如具有如SEQ ID NO :31所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。另外，上述Nanog重組蛋白質可進一步包含His標簽以易于分離和純化。His-NLS-Nanog(HNNanog)具有如SEQ ID 34所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 33所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長Nanog重組蛋白質可包括以下蛋白質Hi S-NLS-MTD84-Nanog (HNM84Nanog)，其具有如 SEQ ID 36 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 35所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；Hi S-NLS-Nanog-MTD84 (HNNanogM84)，其具有如 SEQ ID 38 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 37所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及Hi S-NLS-MTD84-Nanog-MTD84 (HNM84NanogM84)，其具有如 SEQ ID 40 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :39所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用JO-86 MTD(MTD86)制備的全長Nanog重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD86-Nanog (HNM86Nanog)，其具有如 SEQ ID 42 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 41所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼； His-NLS-Nanog-MTD86 (HNNanogM86)，其具有如 SEQ ID 44 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 43所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及Hi S-NLS-MTD86-Nanog-MTD86 (HNM86NanogM86)，其具有如 SEQ ID 46 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :45所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。進一步地，His-NLS-MTDltl-Nanog(HNMltlNanog)具有如 SEQ ID :237 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :236所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。融合至NLS的全長0ct4重組蛋白質包括NLS_0ct4 (N0ct4)，其具有如SEQ ID 48 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :47所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長0ct4重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD84-0ct4 (NM840ct4)，其具有如SEQ ID 50所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 49所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-0ct4-MTD84 (N0ct4M84)，其具有如SEQ ID 52所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 51所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD84-0ct4-MTD84 (NM840ct4M84)，其具有如 SEQ ID 54 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :53所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長0ct4重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD86-0ct4 (NM860ct4)，其具有如SEQ ID 56所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 55所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-0ct4MTD86 (N0ct4M86)，其具有如SEQ ID 58所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :57所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD86-0ct4-MTD86 (NM860ct4M86)，其具有如 SEQ ID 60 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :59所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。另外，上述0ct4重組蛋白質可進一步包含His標簽以易于分離和純化。His-NLS-0ct4 (HN0ct4)具有如SEQ ID :62所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :61所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長0ct4重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD84-0ct4 (HNM840ct4)，其具有如SEQ ID 64所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 63所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-0ct4-MTD84 (HN0ct4M84)，其具有如SEQ ID 66所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 65所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD84-0ct4-MTD84 (HNM840ct4M84)，其具有如 SEQ ID 68 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :67所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長0ct4重組蛋白質可包括以下蛋白質Hi s-NLS-MTD86-0ct4 (HNM860ct4)，其具有如SEQ ID 70所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 69所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-0ct4-MTD86 (HN0ct4M86)，其具有如SEQ ID 72所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 71所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD86-0ct4-MTD86 (HNM860ct4M86)，其具有如 SEQ ID 74 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :73所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。進一步地，His-NLS-MTD52-0ct4(HNM520ct4)具有如SEQ ID :240 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :239所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。融合至NLS的全長Sox2重組蛋白質包括NLS_Sox2 (NSox2)，其具有如SEQ ID 76 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :75所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長Sox2重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD84-SOX2 (NM84SOX2)，其具有如SEQ ID 78所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :77所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-Sox2-MTD84 (NSOX2M84)，其具有如SEQ ID 80所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 79所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD84-Sox2_MTD84(NM84Sox2M84)，其具有如 SEQ ID :82 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :81所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。
利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長Sox2重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD86-Sox2 (NM86Sox2)，其具有如SEQ ID 84所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 83所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-Sox2-MTD86 (NSox2M86)，其具有如SEQ ID 86所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 85所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD86-Sox2_MTD86(NM86Sox2M86)，其具有如 SEQ ID :88 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :87所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。另外，上述Sox2重組蛋白質可進一步包括His標簽以易于分離和純化。His-NLS-Sox2 (HNSox2)具有如SEQ ID :90所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 89所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長Sox2重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD84-Sox2 (HNM84Sox2)，其具有如SEQ ID 92所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 91所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-Sox2-MTD84 (HNSox2M84)，其具有如SEQ ID 94所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 93所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD84-Sox2-MTD84 (HNM84Sox2M84)，其具有如 SEQ ID 96 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :95所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長Sox2重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD86-Sox2 (HNM86Sox2)，其具有如SEQ ID 98所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 97所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-Sox2-MTD86(HNSox2M86)，其具有如 SEQ ID :100 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 99所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD86-Sox2-MTD86 (HNM86Sox2M86)，其具有如 SEQ ID 102 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :101所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。進一步地，His-NLS-MTD181-Sox2(HNM181Sox2)具有如 SEQ ID :243 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :242所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。融合至NLS的全長Klf4重組蛋白質包括NLS-Klf4(NKlf4)，其具有如SEQ ID :104 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :103所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長Klf4重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD84-Klf4 (NM84Klf4)，其具有如SEQ ID :106所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 105所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-Klf4-MTD84 (NKlf4M84)，其具有如SEQ ID :108所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 107所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD84-Klf4-MTD84(NM84Klf4M84)，其具有如 SEQ ID :110 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :109所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長Klf4重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD86-Klf4 (NM86Klf4)，其具有如SEQ ID :112所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO=Ill所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；
NLS-Klf4-MTD86 (NKlf4M86)，其具有如SEQ ID :114所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :113所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD86-Klf4-MTD86(NM86Klf4M86)，其具有如 SEQ ID :116 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :115所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。另外，上述Klf4重組蛋白質可進一步包含His標簽以易于分離和純化。His-NLS-Klf4(HNKlf4)具有如SEQ ID :118所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 117所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長Klf4重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD84-Klf4(HNM84Klf4)，其具有如 SEQ ID :120 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 119所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-Klf4-MTD84(HNKlf4M84)，其具有如 SEQ ID :122 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 121所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD84-Klf4-MTD84(HNM84Klf4M84)，其具有如 SEQ ID :124 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :123所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長Klf4重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTDai-KlfA (HNM86Klf4)，其具有如 SEQ ID 126 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 125所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-Klf4-MTD86(HNKlf4M86)，其具有如 SEQ ID 128 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 127所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD86-Klf4-MTD86(HNM86Klf4M86)，其具有如 SEQ ID :130 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。進一步地，HiS-NLS-MTD173-Klf4 (HNM173Klf4)具有如 SEQ ID :246 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :245所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。融合至NLS的全長cMyc重組蛋白質包括NLS-cMyc(NcMyc)，其具有如SEQ ID :132 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :131所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長cMyc重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD84-cMyc (NM84cMyc)，其具有如SEQ ID 134所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 133所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-CMyC-MTD84 (NcMycM84)，其具有如SEQ ID 136所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 135所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD84-CMyC-MTD84 (NM84cMycM84)，其具有如 SEQ ID 138 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :137所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86 MTD(MTD86)制備的全長cMyc重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD86-cMyc (NM86cMyc)，其具有如SEQ ID 140所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 139所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼； NLS-cMyc-MTD86 (NcMycM86)，其具有如SEQ ID 142所示的氨基酸序列，并且可被例
如具有如SEQ ID NO 141所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及 NLS-MTD86-CMyC-MTD86 (NM86cMycM86)，其具有如 SEQ ID 144 所示的氨基酸序列，并
13且可被例如具有如SEQ ID NO :143所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。另外，上述cMyc重組蛋白質可進一步包含His標簽以易于分離和純化。His-NLS-cMyc (HNcMyc)具有如SEQ ID :146所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 145所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長cMyc重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD84-cMyc (HNM84cMyc)，其具有如 SEQ ID :148 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 147所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-cMyc-MTD84(HNcMycM84)，其具有如 SEQ ID :150 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 149所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD84-cMyc-MTD84(HNM84cMycM84)，其具有如 SEQ ID :152 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :151所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86 MTD(MTD86)制備的全長cMyc重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD86-cMyc (HNM86cMyc)，其具有如 SEQ ID 154 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 153所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-cMyc-MTD86(HNcMycM86)，其具有如 SEQ ID :156 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 155所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD86-cMyc-MTD86(HNM86cMycM86)，其具有如 SEQ ID :158 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :157所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。進一步地，His-NLS-MTD145-cMyc(HNM145cMyc)具有如 SEQ ID :249 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :248所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。融合至NLS的全長LiM8重組蛋白質可包括NLS_Lin28 (NLiM8)，其具有如SEQ ID :160所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :159所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長LiM8重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD84-Lin28 (NM84Lir^8)，其具有如SEQ ID :162所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 161所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-Lir^8-MTD84 (NLir^8M84)，其具有如SEQ ID :164所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 163所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTD84-Lin28-MTD84 (NM84Lin28M84)，其具有如 SEQ ID 166 所示的氨基酸序列， 并且可被例如具有如SEQ ID NO :165所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長LiM8重組蛋白質可包括以下蛋白質NLS-MTD86-Lin28 (NM86Lir^8)，其具有如SEQ ID :168所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 167所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；NLS-Lir^8-MTD86 (NLir^8M86)，其具有如SEQ ID :170所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 169所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及NLS-MTDai-Lir^S-MTD86 (NM86Lir^8M86)，其具有如 SEQ ID :172 所示的氨基酸序列， 并且可被例如具有如SEQ ID NO :171所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。另外，上述LiM8重組蛋白質可進一步包含Hi s標簽以易于分離和純化。His-NLS-Lin28 (HNLin28)具有如SEQ ID :174所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :173所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-84MTD(MTD84)制備的全長LiM8重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD84-Lin28(HNM84Lir^8)，其具有如 SEQ ID :176 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 175所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-Lir^8-MTD84(HNLir^8M84)，其具有如 SEQ ID :178 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 177所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTD84-Lir^8-MTD84 (HNM84Lir^8M84)，其具有如 SEQ ID 180 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :179所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。利用J0-86MTD(MTD86)制備的全長LiM8重組蛋白質可包括以下蛋白質His-NLS-MTD86-Lin28 (HNM86Lin28)，其具有如 SEQ ID :182 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :181所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；His-NLS-Lir^8-MTD86(HNLir^8M86)，其具有如 SEQ ID :184 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO 183所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼；以及His-NLS-MTDai-Lir^8-MTD86 (HNM86Lir^8M86)，其具有如 SEQ ID 186 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :185所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。進一步地，His-NLS-MTD132-Lin28(HNM132Lin28)具有如 SEQ ID :252 所示的氨基酸序列，并且可被例如具有如SEQ ID NO :251所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。本發明的特征在于提供一種重編程轉錄因子，它是一種不能被引入到細胞中的大分子，通過利用MITT將它融合至特定的大分子轉導結構域(以下稱“MTD”)而使其具有細胞穿透性。因此，該重編程轉錄因子可被高效地傳輸進細胞中。MTD可被融合至該重編程轉錄因子的任一末端或兩個末端。利用來自分泌蛋白的疏水性肽MTD的MITT通過僅處理蛋白質而使貨物蛋白質能夠穿過細胞膜。因此，蛋白質可被遞送到細胞核。利用這個作用，不在體細胞中表達的重編程轉錄因子可被遞送至細胞中。因此，誘導性多能干細胞可被安全地建立而不需要如現有技術那樣插入外源性遺傳材料，例如病毒和質粒。本發明已開發出可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其通過將每個重編程轉錄因子融合至能夠將大分子傳輸至細胞中的肽結構域(即，MTD)而被構建。本文所用的術語“可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質”是指包含MTD和重編程轉錄因子的共價連接的復合物，它們通過遺傳融合或化學偶聯而被連接。本文所用的術語“遺傳融合”是指通過編碼蛋白質的多核苷酸(DNA序列)分子的遺傳表達而生成的蛋白質的線性、共價連接。Nanog是一種能夠重編程體細胞的轉錄因子，它具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其維持胚胎細胞的多能性并抑制細胞向內胚層分化。該重編程轉錄因子是由SEQ ID NO 2的氨基酸序列的1至306氨基酸殘基組成的結構域所構成。0ct4是一種能夠重編程體細胞的轉錄因子，它具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列，其維持多能性并調節干細胞的自我更新。該重編程轉錄因子是由SEQ ID NO :4的氨基酸序列的1至361氨基酸殘基組成的結構域所構成。
Sox2是一種能夠重編程體細胞的轉錄因子，它具有如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列，其維持多能性并調節干細胞的未分化狀態。該重編程轉錄因子是由SEQ ID NO :6的氨基酸序列的1至318氨基酸殘基組成的結構域所構成。Klf4是一種能夠重編程體細胞的轉錄因子，它具有如SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列。該重編程轉錄因子通過抑制增殖和調節細胞周期而誘導重編程。Klf4是由SEQ ID NO :8的氨基酸序列的1至471氨基酸殘基組成的結構域所構成。cMyc是一種能夠重編程體細胞的轉錄因子，它具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :10所示的氨基酸序列。該重編程轉錄因子通過調節細胞生長、增殖、 凋亡和細胞周期而誘導重編程。cMyc是由SEQ ID NO 10的氨基酸序列的1至456氨基酸殘基組成的結構域所構成。LiM8—種能夠重編程體細胞的轉錄因子，它具有如SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列。該重編程轉錄因子調節干細胞的分化和增殖。 Lin28是由SEQ ID NO 12的氨基酸序列的1至210氨基酸殘基組成的結構域所構成。因為MTD能夠被融合至六種類型的重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO 15所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :16所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。因為MTD能夠被融合至六種類型的重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO 17所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :18所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。因為MTD能夠被融合至Nanog重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO :223 所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :2 所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。因為MTD能夠被融合至0ct4重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO :225所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :2 所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。因為MTD能夠被融合至Sox2重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO :233所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :234所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。因為MTD能夠被融合至Klf4重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO :231所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :232所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。因為MTD能夠被融合至cMyc重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO :2 所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :230所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。因為MTD能夠被融合至LiM8重編程轉錄因子，所以可使用具有SEQ ID NO ,221 所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :2 所示的氨基酸序列的可穿透細胞的肽。具有如以上SEQ ID NO 16、18、2對、2洸、2沘、230、232或234所示的任一氨基酸序列的MTD都是可穿透細胞的多肽，其能夠介導生物活性分子(例如多肽、蛋白質結構域或全長蛋白質)傳輸通過細胞膜。本發明的MTD被設計成包括疏水區，該疏水區通過形成螺旋而具有細胞膜靶定活性，該螺旋由包含以下三個區域的信號肽衍生而來，即，N-末端區域、疏水區和含有分泌蛋白切割位點的C-末端區域。這些MTD可直接穿過細胞膜，同時避免了任何的細胞損傷，并且將目標蛋白質遞送進細胞以讓它表現出其期望的功能。下表1總結了具有SEQ ID NO 16、18、2對、2洸、2沘、230、232或234所示的任一氨基酸序列且要被融合至本發明的重編程轉錄因子的MTD。[表1]
權利要求
1.一種可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質包含融合到重編程轉錄因子的一個末端或兩個末端的大分子轉導結構域 (MTD)，其中所述重編程轉錄因子具有選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10和12的氨基酸序列， 其中所述MTD具有選自SEQ ID NO 16和18的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其中所述MTD為具有如SEQ ID NO :16所示的氨基酸序列的JO-84 MTD或具有如SEQ ID N0:18所示的氨基酸序列的J0-86 MTD0
3.如權利要求1所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其中所述重組蛋白質包含融合至任一末端的核定位序列(NLQ和/或組氨酸標簽親和結構域中的至少一種。
4.如權利要求1至3的任一項所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其特征在于選自JO-84 MTD被融合至重編程轉錄因子的N-末端的重組蛋白質，其中，所述JO-84 MTD具有如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列，所述重編程轉錄因子具有選自SEQ ID NO :2、4、6、 8、10和12的氨基酸序列；JO-84 MTD被融合至重編程轉錄因子的C-末端的重組蛋白質，其中，所述JO-84 MTD具有如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列，所述重編程轉錄因子具有選自SEQ ID NO :2、4、6、 8、10和12的氨基酸序列；JO-84 MTD被融合至重編程轉錄因子的兩個末端的重組蛋白質，其中，所述JO-84 MTD 具有如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列，所述重編程轉錄因子具有選自SEQ ID NO :2、4、 6、8、10和12的氨基酸序列；J0-86 MTD被融合至重編程轉錄因子的N-末端的重組蛋白質，其中，所述J0-86 MTD具有如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列，所述重編程轉錄因子具有選自SEQ ID NO :2、4、6、 8、10和12的氨基酸序列；J0-86MTD被融合至重編程轉錄因子的C-末端的重組蛋白質，其中，所述J0-86MTD具有如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列，所述重編程轉錄因子具有選自SEQ ID NO :2、4、6、8、 10和12的氨基酸序列；和J0-86 MTD被融合至重編程轉錄因子的兩個末端的重組蛋白質，其中，所述J0-86 MTD 具有如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，所述重編程轉錄因子具有選自SEQ ID NO :2、4、 6、8、10和12的氨基酸序列。
5.如權利要求1至4的任一項所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其中所述重組蛋白質具有選自以下的氨基酸序列對于 Nanog, SEQ ID NO :22、24、26、28、30 或 32 ； 對于 0ct4, SEQ ID NO :50、52、54、56、58 或 60 ； 對于 Sox2, SEQ ID NO :78、80、82、84、86 或 88 ； 對于 Klf4, SEQ ID NO :106、108、110、112、114 或 116 ； 對于 cMyc, SEQ ID NO :134、136、138、140、142 或 144 ；并且對于 Lin28，SEQ ID NO :162、164、166、168、170 或 172。
6.如權利要求1至4的任一項所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其中所述重組蛋白質具有選自以下的氨基酸序列對于 Nanog, SEQ ID NO :36、38、40、42、44 或 46 ； 對于 0ct4, SEQ ID NO :64、66、68、70、72 或 74 ； 對于 Sox2, SEQ ID NO :92、94、96、98、100 或 102 ； 對于 Klf4，SEQ ID NO :120、122、124、126、128 或 130 ； 對于 cMyc, SEQ ID NO :148、150、152、154、156 或 158 ；并且對于 Lin28，SEQ ID NO :176、178、180、182、184 或 186。
7.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求1所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質。
8.如權利要求7所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有選自以下的核苷酸序列 對于 Nanog，SEQ ID NO :21、23、25、27、29 或 31 ；對于 0ct4, SEQ ID NO :49、51、53、55、57 或 59 ； 對于 Sox2, SEQ ID NO :77、79、81、83、85 或 87 ； 對于 Klf4, SEQ ID NO :105、107、109、111、113 或 115 ； 對于 cMyc, SEQ ID NO :133、135、137、139、141 或 143 ；并且對于 Lin28，SEQ ID NO :161、163、165、167、169 或 171。
9.如權利要求7所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有選自以下的核苷酸序列 對于 Nanog, SEQ ID NO :35、37、39、41、43 或 45 ；對于 0ct4, SEQ ID NO :63、65、67、69、71 或 73 ； 對于 Sox2, SEQ ID NO :91、93、95、97、99 或 101 ； 對于 Klf4, SEQ ID NO :119、121、123、125、127 或 129 ； 對于 cMyc, SEQ ID NO :147、149、151、153、155 或 157 ；并且對于 Lin28，SEQ ID NO :175、177、179、181、183 或 185。
10.一種重組表達載體，所述重組表達載體包含權利要求7所述的多核苷酸。
11.如權利要求10所述的重組表達載體，其中所述表達載體選自pET28a(+-HNM8zNanog、pET28a ( +-HNNanogM84^pET28a ( +-HNMgzNanogM84、pET28a(+-HNM8fNanog、pET28a ( +-HNNanogM86^pET28a ( +-HNM8fNanogM86、pET28a ( +-HNMH0ct4、pET28a ( +-HN0ct4M84、pET28a ( +-HNMf40ct4M84、pET28a ( +-HNM川0ct4、pET28a ( +-HN0ct4M86、pET28a ( +-HNMf60ct4M86、pET28a ( +-HNMMSox2、pET28a ( +-HNSOX2M84、pET28a ( +-HNMf4SOX2M84、pET28a ( +-HNM川Sox2、pET28a ( +-HNSOX2M86、pET28a ( +-HNMf6Sox2M86、pET28a ( +-HNMHKlf4、pET28a ( +-HNKlf4M84、pET28a ( +-HNMf4Klf4M84、pET28a ( +-HNM川Klf4、pET28a ( +-HNKlf4M86、pET28a ( +-HNMf6Klf4M86、pET28a ( +-HNMHcMyc、pET28a ( +-HNcMycM84、pET28a ( +-HNMf4cMycM84、pET28a ( +-HNM川cMyc、pET28a ( +-HNcMycM86、pET28a ( +-HNMf6cMycM86、pET28a(+)-HNM8zLin28、pET28a ( + )-HNLin28M84、pET28a ( +-HNMgzLin28M84、pET28a (+) -HNM86Lin28, pET28a (+) -HNLin28M86 和 pET28a (+) -HNM86Lin28M86o
12. —種轉化體，所述轉化體通過使用權利要求10所述的重組表達載體轉化而獲得。
13.如權利要求12所述的轉化體，其中所述轉化體為E. coliDH5a/HNM860ct4(KCTC11640BP)或 DH5 α /HNM86cMyc (KCTC 1166 IBP)。
14.一種生產權利要求1所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質的方法，所述方法包括以下步驟1)培養權利要求12所述的轉化體從而表達所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質；和2)從培養物中回收表達出的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質。
15.一種可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質包含融合至重組蛋白質的大分子轉導結構域(MTD)，其中具有如SEQ ID NO 224所示的氨基酸序列的MTD被融合至SEQ ID NO 2的N-末端； 具有如SEQ ID NO 226所示的氨基酸序列的MTD被融合至SEQ ID NO 4的N-末端； 具有如SEQ ID NO 234所示的氨基酸序列的MTD被融合至SEQ ID NO 6的N-末端； 具有如SEQ ID NO 232所示的氨基酸序列的MTD被融合至SEQ ID NO 8的N-末端； 具有如SEQ ID NO 230所示的氨基酸序列的MTD被融合至SEQ ID NO 10的N-末端；或者具有如SEQ ID NO 228所示的氨基酸序列的MTD被融合至SEQ ID NO 12的N-末端。
16.如權利要求15所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其中所述MTD為以下的任何一個具有如SEQ ID NO 224所示的氨基酸序列的J0-10 MTD ； 具有如SEQ ID NO 226所示的氨基酸序列的J0-52 MTD ； 具有如SEQ ID NO 228所示的氨基酸序列的J0-132 MTD ； 具有如SEQ ID NO 230所示的氨基酸序列的J0-145 MTD ； 具有如SEQ ID NO 232所示的氨基酸序列的J0-173 MTD ；或者具有如SEQ ID而234所示的氨基酸序列的幾-181 MTD0
17.如權利要求15所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其中所述重組蛋白質包含融合至所述重組蛋白質的任一末端的核定位序列(NLQ和/或組氨酸標簽親和結構域中的至少一種。
18.如權利要求15至17任一項所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質，其中所述重組蛋白質具有選自SEQ ID NO :237、240、243、246、249和252所示的氨基酸序列。
19.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求15所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質。
20.如權利要求19所述的多核苷酸，所述多核苷酸特征在于具有選自SEQID NO :236、 239、242、245、248和251的核苷酸序列。
21.—種重組表達載體，所述重組表達載體包含權利要求19所述的多核苷酸。
22.如權利要求21所述的重組表達載體，其中所述重組表達載體選自pET28a ( + )-HNM10Nanog、pET28a ( + ) _HNM520ct4、pET28a ( + ) _HNM181Sox2、 pET28a (+) -HNM173Klf4, pET28a (+) -HNM145cMyc 和 pET28a (+) _HNM132Lir^8。
23.一種轉化體，所述轉化體通過使用權利要求21所述的重組表達載體轉化而獲得。
24.如權利要求23所述的轉化體，其中所述轉化體為E.coliDH5 α /HNM10Nanog(KCTC 11660BP)、DH5 α /HNM181Sox2 (KCTC 11659BP)、DH5 α /HNM173Klf4 (KCTC 11662BP)或 DH5 α /HNM132Lin28 (KCTC 11663BP)。
25. 一種生產權利要求15所述的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質的方法，所述方法包括以下步驟1)培養權利要求23所述的轉化體從而表達所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質；和2)從培養物中回收表達出的可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質。
全文摘要
本發明涉及一種重編程轉錄因子重組蛋白質，其中大分子轉導結構域(MTD)被融合至重編程轉錄因子以獲得細胞穿透性。本發明還涉及編碼所述重編程轉錄因子重組蛋白質的多核苷酸以及所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質的表達載體。使用所述可穿透細胞的重編程轉錄因子重組蛋白質處理體細胞誘導了體細胞的干細胞特異性基因的重編程，因此可被有效地用于建立與胚胎干細胞在形態學和遺傳學方面具有相似特性的誘導性多能干細胞(iPS細胞)。
文檔編號C07K19/00GK102439045SQ201080021034
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月12日 優先權日2009年3月12日
發明者林貞姬, 趙大雄, 鄭仁熙, 鄭繡英, 金正恩 申請人:株式會社普羅賽爾制藥, 趙大雄