專利名稱：多發性硬化的治療的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及用于治療和/或預防多發性硬化(MQ的方法。根據本發明， GM-CSF的拮抗物在多發性硬化的治療中可以是有效的。GM-CSF的拮抗物包括，但不限于， 對GM-CSF或GM-CSF受體特異性的抗體。
背景技術：
多發性硬化(MS)，也稱作播散性硬化或播散性腦脊髓炎，是其中免疫系統攻擊中樞神經系統(CNQ的自身免疫病。實質上，MS通過損壞髓磷脂而影響腦和脊髓中神經細胞互相聯系的能力。當失去髓磷脂后，軸突不再有效地傳導信號。已描述了 MS的4個主要亞型(Neurology (1996)46 ；901-911 ；還參見
圖1)。復發緩解型亞型的特征是不可預測的復發，隨后幾月到幾年無疾病活動性的新體征的相對靜息 (緩解)時期。繼發性進行性MS描述了具有初始復發緩解型MS的那些人，且其然后開始在急性發作之間具有進行性神經衰退，而不具有任何確定的緩解時期。原發性進行性亞型描述了在其起始MS癥狀之后從沒有緩解的患者，特征為從發病開始的傷殘(disability)的進展，無緩解和改善或僅有偶發的和輕微的緩解和改善。最后，進行性復發型MS描述了從發病起具有持續的神經退化但還遭受明顯的重疊發作的那些個體。還存在MS的多種非典型病例。MS的癥狀是多方面的且通常在惡化(復發)的間歇性急性期、在神經功能逐步進行性退化中出現，或在二者的組合中出現。常見的為感覺中樞癥狀、視覺癥狀、小腦癥狀和運動癥狀。MS患者可遭受幾乎任何神經癥狀或體征，包括感覺的改變(感覺遲鈍和感覺異常)、肌無力、肌痙攣、運動困難；協調和平衡困難；語言或吞咽問題；視覺問題；疲勞、急性或慢性疼痛、和膀胱和腸困難。不同程度的認知損害和抑郁的情感癥狀或不安情緒也是常見的。MS通常在30多歲的成人中出現，但其也可出現在兒童中，且原發性進行性亞型在 50多歲的人中更常見。如許多自身免疫疾患一樣，該疾病在女性中更常見，且趨勢可能在漸
+曰O在MS中，免疫系統攻擊神經系統，可能地是暴露于與其自身具有相似結構的分子的結果。MS損害最常涉及靠近小腦室、腦干、基底神經節和脊髓的白質區域；和視神經。白質細胞的功能是在處理信號的灰質區域和機體的其它部分之間傳送信號。MS破壞少突膠質細胞，該細胞負責構建和維持脂肪層——稱作髓鞘——其協助神經元傳送電信號。MS導致髓磷脂變薄或完全缺失，且隨疾病進展導致神經元延伸或軸突的截斷(橫斷)。修復的過程稱作髓鞘再生，發生在疾病的早期階段，但少突膠質細胞不能完全重建細胞的髓鞘。重復發作導致連續較少的有效的髓鞘再生，直至在受損的軸突周圍形成疤痕樣斑。
3
除脫髓鞘之外，疾病的另一個病理標志是炎癥。T細胞將髓磷脂識別為外源的且將其視作侵入病毒來攻擊。這觸發了炎癥過程，刺激了其它免疫細胞和可溶性因子如細胞因子和抗體。存在用于多發性硬化的一些療法，但已知沒有治愈的。不同的療法用于急性發作的控制，以緩和疾病并控制MS的作用。對于急性癥狀的發作的控制，常規療法是靜脈施用或口服施用皮質類固醇。該治療在短期緩解癥狀中是有效的，但對患者的長期恢復沒有顯著作用。根據MS的確切性質和亞型不同，使用了用于疾病緩解治療的大量療法。用于復發-緩解型MS的治療包括干擾素(干擾素β -Ia和干擾素β -lb)、醋酸格拉默(Copaxone ； 通過將其自身替換為免疫系統攻擊的靶標而保護髓磷脂蛋白的多肽的混合物)、米托蒽醌 (免疫抑制劑，也用于癌癥化療)和那他珠單抗(Tysabri ；人源化的單克隆抗體，細胞粘附分子α 4-整聯蛋白)。用于繼發性進行性MS和進行性復發型MS的治療包括米托蒽醌、那他珠單抗和干擾素-P-lMbetaferon)。另外，還使用了主要探索性治療。MS與導致一系列進行性損害和障礙的多種癥狀和功能性缺陷相關聯。為控制MS的影響，大量療法是已知的，并按照具體病例可能所需來使用。已知一些細胞因子參與多發性硬化，所述細胞因子包括粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Ponomarev 等人；J Immunol (2007) 178 ；39-48 ；McQualter 等人；J Exp Med. (2001) 194 ；873-82)。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是作為白細胞生長因子發揮作用的細胞因子。GM-CSF刺激干細胞產生粒細胞(嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)和單核細胞。單核細胞退出循環并遷移到組織中，由此它們成熟為巨噬細胞。因此，其為天然免疫/炎癥級聯反應的一部分，由此小量巨噬細胞的激活可快速導致其數量的增加，這是抗感染的關鍵過程。在胞外發現GM-CSF的活性形式為可溶性單體。具體地， GM-CSF已被鑒定為如類風濕性關節炎(RA)的自身免疫疾患中的炎癥介導者，導致增加的促炎細胞因子、趨化因子和蛋白酶產生，且從而最終導致關節破壞。發明概述本發明證明，拮抗GM-CSF的作用是治療MS的有效方法。具體地，抗GM-CSF或其受體的抗體是MS治療中有效的干預點。因此，本發明提供了，例如，用于在受治療者中治療多發性硬化的方法，所述方法包括向所述受治療者施用有效量的GM-CSF拮抗物的步驟。在另一方面，本發明考慮了用于在受治療者中預防多發性硬化的方法，所述方法包括向所述受治療者施用有效量的GM-CSF拮抗物的步驟。在另一方面，本發明涉及一種組合物，所述組合物包括能夠拮抗GM-CSF在多發性硬化中的病生理作用的GM-CSF拮抗物，所述組合物還包括一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。在另一方面，本發明涉及一種組合物，所述組合物包括在多發性硬化的治療中有用的GM-CSF拮抗物，所述組合物還包括一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。在本發明的特定的方面，GM-CSF拮抗物是對GM-CSF特異性的抗體。在本發明的可選的方面，GM-CSF拮抗物是對GM-CSF受體特異性的抗體。在其它方面，本發明涉及GM-CSF拮抗物用于制備治療多發性硬化的藥物的用途。在其它方面，本發明提供了用于治療多發性硬化的GM-CSF拮抗物。在整個說明書中，除非上下文另外要求，否則詞語“包含(comprise)”、“具有(have)“和“包括(include)”和其相應的變化形式諸如“包含(comprises) ”、“包含 (comprising) ”、“具有(has) ”、“具有(having) ”、“包括(includes) ”和“包括(including)，， 將理解為表示含有所指的元素或整數、或元素或整數的組，但不排除任何其它元素或整數、 或元素或整數的組。附圖簡述^！描繪了 MS的4個主要亞型的進行性類型。Sl顯示了 GM-CSF拮抗物在MOG誘導的MS的EAE模型中的效力(預防性治療)。 顯示了 0-15天的累積EAE評分。A 用媒介物(PBS)處理的動物；B 用10mg/kg MOR-GM處理的動物；C 用20mg/kgM0R-GM處理的動物；D 用50mg/kg MOR-GM處理的動物；E 用0. 5mg/ kg地塞米松處理的動物；F 用50mg/kg MOR-NOGM (同種型對照抗體)處理的動物；G 在第 14天第一次處理的用50mg/kg MOR-GM處理的動物(治療性治療)。* 與同種型對照抗體相比P < 0. 05。$ 與PBS處理相比P < 0. 05。Ml顯示了用MOR-GM處理后疾病發病的延遲。A 用媒介物(PBS)處理的動物；B 用 10mg/kg MOR-GM 處理的動物；C 用 20mg/kgM0R_GM 處理的動物；D 用 50mg/kg MOR-GM 處理的動物；E 用0. 5mg/kg地塞米松處理的動物；F 用50mg/kg MOR-NOGM(同種型對照抗體)處理的動物；G 在第14天第一次治療的用50mg/kg MOR-GM處理的動物(治療性治療)。* 與同種型對照抗體相比P < 0. 05。$ 與PBS處理相比P < 0. 10。Mi顯示了用本發明的化合物處理之后在脊髓的骶骨部分中炎性細胞的浸潤。A 用50mg/kg MOR-NOGM處理的動物(同種型對照抗體；預防性處理)；B 用50mg/kg MOR-GM 處理的動物(預防性處理)；C 用50mg/kg MOR-GM處理的動物(治療性處理)；D 用0. 5mg/ kg地塞米松處理的動物(預防性處理)。每個數據點指示一個個體動物的評分。與同種型對照抗體相比P < 0. 10。* 與同種型對照抗體相比P < 0. 05。M5顯示了脊髓的骶骨部分中脫髓鞘的程度。A 用50mg/kgM0R-N0GM處理的動物 (同種型對照抗體；預防性處理)；B 用50mg/kgM0R-GM處理的動物(預防性處理)；C 用 50mg/kg MOR-GM處理的動物(治療性處理)；D 用0. 5mg/kg地塞米松處理的動物(預防性處理)。每個數據點指示一個個體動物的評分。* :與同種型對照抗體相比P <0.05。發明詳述本發明證明了 GM-CSF是用于MS治療的有效靶標。在這方面，本發明在一方面提供了利用GM-CSF拮抗物在MS領域帶來預防性或治療性利益的方法。本發明提供了治療性方法，所述方法包括向需要這種治療的受治療者施用治療有效量的GM-CSF拮抗物。如本文所用的，“治療有效量”或“有效量”指引發期望的生物響應必需的GM-CSF拮抗物的量。根據本發明，治療有效量是治療和/或預防多發性硬化必需的 GM-CSF拮抗物的量。如本文所用的，“GM-CSF拮抗物”包括最寬泛含義的GM-CSF拮抗物；抑制GM-CSF的活性或功能、或通過任何其它途徑對GM-CSF施加治療性作用的任何分子。術語GM-CSF拮抗物包括，但不限于，特異性結合GM-CSF的抗體、對GM-CSF特異性的抑制性核酸或對GM-CSF 特異性的有機小分子。術語GM-CSF拮抗物的含義還包括與GM-CSF受體特異性結合的抗體、 對GM-CSF受體特異性的抑制性核酸或對GM-CSF受體特異性的有機小分子。術語GM-CSF 拮抗物還指非抗體支架分子，比如纖連蛋白支架、錨蛋白、maxybody/avimer、蛋白A衍生的分子、蛋白表位模擬物(PEM)或類似物。抑制性核酸包括但不限于，反義DNA、三鏈體形成寡核苷酸、外部指導序列、SiRNA 和微小RNA。有用的抑制性核酸包括與對照相比，減少編碼GM-CSF的RNA表達至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的那些抑制性核酸。抑制性核酸和產生它們的方法是本領域中熟知的。siRNA設計軟件是可獲得的。對GM-CSF或GM-CSF受體特異性的有機小分子(SMOL)可經由天然產物篩查或化學文庫的篩查來鑒定。通常SMOL的分子量低于500道爾頓，更通常從160到480道爾頓。 SMOL的其它典型性質是以下一種或多種·分配系數log P在從-0. 4至+5. 6的范圍中·摩爾折射率從40至130·原子的數目從20至70綜述參見Ghose 等人(1999) J Combin Chem 1，55-68 和 Lipinski 等人(1997) Adv Drug Del Rev :23，3-25。優選地，用于本發明的GM-CSF拮抗物是對GM-CSF特異性或對GM-CSF受體特異性的抗體。此類抗體可以是任何類型，比如鼠抗體、大鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。因此，“人類”抗體或功能性的人類抗體片段定義為非嵌合的(例如，非“人源化的”) 和非(全部地或部分地)來自非人物種的抗體。人類抗體或功能性抗體片段可來源于人類或可以是合成的人類抗體。“合成的人類抗體”在本文定義為具有整個或部分地計算機模擬地來源于基于已知人類抗體序列的分析的合成序列的序列的抗體。人類抗體序列或其片段的計算機模擬設計可例如通過分析人類抗體或抗體片段序列數據庫并利用從其獲得的數據設計多肽序列來實現。人類抗體或功能性抗體片段的另一實例是由從人類來源抗體序列文庫(即，這種文庫是基于從人類天然來源獲取的抗體)分離的核酸編碼的抗體或功能性抗體片段。“人源化抗體”或功能性人源化抗體片段在本文定義為(i)來源于非人類來源 (例如，帶有異源免疫系統的轉基因小鼠)，該抗體是基于人類種系序列；或(ii)嵌合的，其中可變結構域來源于非人類來源，恒定結構域來源于人類來源；或(iii) CDR-嫁接的，其中可變結構域的CDR來自非人類來源，而可變結構域的一個或多個構架為人類來源，恒定結構域(如果存在)為人類來源。術語“嵌合抗體”或功能性嵌合抗體片段在本文定義為具有來源于或對應于見于一種物種的序列的恒定抗體區和來源于另一物種的可變抗體區的抗體分子。優選地，恒定抗體區來源于或對應于見于人類如，見于人類種系或體細胞的序列，可變抗體區(如，VH、 VL、CDR或FR區)來源于見于非人類動物如，小鼠、大鼠、兔或倉鼠的序列。如本文所用的，如果抗體能夠區分一種抗原(在本文是GM-CSF，或可選地GM-CSF 受體)與一種或多種參考抗原，則認為這樣的抗體“特異性結合”、“特異性結合”、“對...特異性”或“特異性識別”這樣的抗原，因為結合特異性不是絕對的，而是相對的性質。參考抗原可以是用作參考點的一種或多種緊密相關的抗原，如，IL3、IL5、IL-4、IL13或M-CSF。 以其最通用形式(且當未提及具體參考時)，“特異性結合”是指抗體區分目標抗原與無關抗原的能力，如例如根據以下方法之一確定的。所述方法包括但不限于，蛋白質印跡、 ELISA-檢驗、RIA-檢驗、ECL-檢驗、IRMA-檢驗和肽掃描。例如，可進行標準ELISA測定。
6評分可通過標準顯色進行(如，第二抗體以辣根過氧化物，四甲基聯苯胺以過氧化氫進行顯色)。某些孔中的反應通過光密度，例如在450nm的光密度評分。典型的背景(=陰性反應)可以是0. IOD ；典型的陽性反應可以是10D。這表示陽性/陰性的差異可以大于10 倍。通常，結合特異性的確定不是通過利用單個參考抗原，而是利用一組約三種到五種無關抗原進行，諸如奶粉、BSA、鐵傳遞蛋白或類似無關抗原。另外，“特異性結合”可能涉及抗體區分其靶抗原不同部分的能力，如，區分GM-CSF或GM-CSF受體的不同結構域或區域、或區分GM-CSF或GM-CSF受體的一個或多個關鍵氨基酸殘基或氨基酸殘基段。而且，本文所用的“免疫球蛋白”(Ig)在此定義為屬于類IgG、IgM、IgE、IgA或 IgD(或其任何亞類)的蛋白，包括所有常規已知的抗體和其功能性片段。因此，抗體/免疫球蛋白的“功能性片段”定義為保留抗原結合區的抗體/免疫球蛋白的片段(如，IgG可變區)。抗體的“抗原結合區”通常見于抗體的一個或多個高變區，即，CDR-l、-2、和/或-3 區；然而，可變“構架”區也可在抗原結合中起重要作用，諸如通過提供CDR的支架。優選地，“抗原結合區”至少包含可變輕(VL)鏈的氨基酸殘基4至103和可變重(VH)鏈的氨基酸殘基5至109，更優選地包含VL的氨基酸殘基3至107和VH的氨基酸殘基4至111，尤其優選地是完整VL鏈和VH鏈(VL的氨基酸位置1至109和VH的氨基酸位置1至113 ；按照TO 97/08320編號)。用于本發明的優選免疫球蛋白類是IgG。本發明的“功能性片段” 包括F(ab' )2片段、Fab片段、scFv或包含單免疫球蛋白可變結構域或單結構域抗體多肽的構建體的結構域，如，單重鏈可變結構域或單輕鏈可變結構域。可改造F(ab' )2或？油以使在Chi結構域和Q結構域之間發生的分子間二硫化物相互作用最小或完全去除。本發明的抗體可來源于基于計算機模擬設計并由合成產生的核酸編碼的氨基酸序列的重組抗體文庫。抗體序列的計算機模擬設計例如，通過分析人類序列數據庫并利用從其獲得的數據設計多肽序列來實現。用于設計和獲得計算機模擬產生的序列的方法描述于，例如，Knappik 等人，J. Mol. Biol. (2000)296 :57 ；Krebs 等人，J. Immunol. Methods. (2001)254 67, Rothe 等人，J. Mol. Biol. (2008) 376 :1182 ；和授予 Knappik 等人的美國專利第6，300, 064號中，其全部內容在此通過引用并入。對GM-CSF特異性的任何抗體可用在本發明。示例抗體包括含如SEQ ID N0:1中所描繪的重鏈可變區的氨基酸序列或如SEQ ID NO :2中所描繪的輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體。其它示例抗體包括來源于包含如SEQ ID NO :1中所描繪的重鏈可變區或如SEQ ID NO :2中所描繪的輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體的抗體。又一些其它示例性抗體包括與包括如SEQ ID NO :1中所描繪的重鏈可變區或如SEQ ID NO :2中所描繪的輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體具有相同特異性和/或結合相同表位的抗體。又一些其它示例性抗體包括含與如SEQ ID NO :1中所描繪的序列至少70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的重鏈可變區的抗體。又一些其它示例性抗體包括含與如SEQ ID NO :2中所描繪的序列至少 70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的輕鏈可變區的抗體。SEQ ID No. 1 Met Glu Leu lie Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val HisSer Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro GlyAla Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr AspTyr Asn lie His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp
lieGlyTyrlieAlaProTyrSerGlyGlyThrGly Tyr Asn Gln Glu
PheLysAsnArgAlaThrLeuThrValAspLysSer Ser Ser ThrAla
TyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerAspAspSerAlaValTyrTyr
CysAlaArgArgAspArgPheProTyrTyrPheAspTyrTrpGlyGln
ThrThrLeuArgValSerSerValSerGlySer
SEQID No.2
MetGlyPheLysMetGluSerGlnlieGlnValPheValTyrMetLeu
LeuTrpLeuSerGlyValAspGlyAsplieValMetlieGlnSerGln
LysPheValSerThrSerValGlyAspArgValAsnlieThrCysLys
AlaSerGlnAsnValGlySerAsnValAlaTrpLeuGlnGlnLysPro
GlyGlnSerProLysThrLeulieTyrSerAlaSerTyrArgSerGly
ArgValProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAsPPhelie
LeuThrlieThrThrValGlnSerGluAspLeuAlaGluTyrPheCys
GlnGlnPheAsnArgSerProLeuThrPheGlySerGlyThrLysLeu
GluLeuLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerliePheProPro
SerSerLysGlyGluPhe
可用于本發明的可選的示例性抗體是包括如SEQ ID No.3中所描繪的重
區的氨基酸序列或如SEQ ID No. :4中所描繪的輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體。其它示例性抗體包括來源于包括如SEQ ID No. :3中所描繪的重鏈可變區或如SEQ ID No. :4中所描繪的輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體的抗體。又一些其它示例性抗體包括與包括如SEQ ID No. :3中所描繪的重鏈可變區或如SEQ ID No. :4中所描繪的輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體具有相同特異性和/或結合相同的表位的抗體。又一些其它示例性抗體包括含與 SEQ ID No. :3中所描繪的序列至少70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的重鏈可變區的抗體。又一些其它示例性抗體包括含與SEQ ID No. :4中所描繪的序列至少70%、 至少80%、至少90%或至少95%同源的輕鏈可變區的抗體。SEQ ID NO. 3 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVSGIENKYAGGATYYAASVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFGTDFffGQGTLVTVSSSEQ IDNo. 4DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVLVIYKKRPSGIPERFSGSNSGNTAT LTISGTQAEDEADYYCSAffGDKGMVFGGGTKLTVLGQ可用于本發明的可選的示例性抗體是包括選自以下的H-CDR3序列的抗體Ser Gly Leu lie Phe Asp Tyr Trp Leu Asp1510(SEQ ID NO. 5)，Ser Gly Leu lie lie Asp Ala Leu Ser Pro1510(SEQ ID NO. 6)，Thr Ser Leu Met Ser lie Tyr Phe Asp Tyr
1510(SEQ ID NO. 7)，Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr1510(SEQ ID NO. 8)，Ser Gly Leu lie Asn Leu Gly Met His Pro1510(SEQ ID NO. 9)，Ser Gly Leu lie Phe Asp Ala Leu Arg Asp1510(SEQ ID NO. 10)，Ser Gly Leu lie Phe Asp Lys Leu Thr Ser1510(SEQ ID NO. 11)，Ser Gly Leu lie Asn Leu His Phe Asp Thr1510(SEQ ID NO. 12)，Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr1510(SEQ ID NO. 13)，Ser Gly Leu lie Met Asp Lys Leu Asp Asn1510(SEQ ID NO. 14)，Ser Gly Leu lie lie Asp Asn Leu Asn Pro1510(SEQ ID NO. 15)，禾ロSer Gly Leu lie Ala Val Tyr phe Asp Tyr1510(SEQ ID NO. 16).優選地，包括選自SEQ ID NO. 5-16中任ー個的H-⑶R3序列的抗體另外包括以下 的H-CDRl序列Asp Tyr Leu Leu His15(SEQ ID NO. 16),和/或以下的H-CDR2序列Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gin151015GlyArg Asn lie Leu Asn 10
(SEQ ID NO. 19)，
0118](SEQ ID NO. 17)，
0119]和/或以下的L-⑶Rl序列
0120]Arg Ala Ser Gln Asn Ile
0121]15
0122](SEQ ID NO. 18)，
0123]和/或以下的L-⑶R2序列
0124]Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
0125]15
0126]
0127]和/或以下的L-⑶R3序列
0128]Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Ars Thr
0129]15
0130](SEQ ID NO. 20).
0131]可用于本發明的可選的示例性抗體是包括以下的L-CDRl序列的抗體
0132]Arg Ala Ser His Arg Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
0133]1510(SEQ
0134]ID Ν0· 21)，
0135]和/或以下的L-⑶R2序列
0136]Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr
0137]15
0138]和/或以下的L-CDR3序列
0139]Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro
0140]15
0141]和/或以下的H-⑶Rl序列
0142]Gly Tyr lie Phe Pro Thr Phe Ala
0143]15
0144](SEQ ID NO. 24),
0145]和/或以下的H-⑶R2序列
0146]Ser lie Asn Thr Ala Ser Gly Lys
0147]15
0148](SEQ ID N0. 25)，
0149]和/或以下的H-⑶R3序列
0150]Asp Arg Phe Gln Asn lie Met Ala
0151]15
0152](SEQ ID NO. 26).
0153]優選地所述抗體包括SEQ ID NO. 21-26的所有CRD。
0154]GM-CSF受體是促紅細胞生成素(haematopoietin)受體超家族的成員。它是異二聚體的，由α亞基和β亞基組成。α亞基對GM-CSF是高度特異性的，而β亞基是與其它細胞因子受體包括IL3和IL5共有的。這反映在β受體亞基的組織分布較廣泛。α亞
(SEQ ID Ν0. 22)，
Val Thr
(SEQ ID N0. 23)，
Leu His 10
Thr Lys Phe Ser Thr Lys Phe Gln 1015
Thr lie Leu Asp Val 10基，GM-CSFR α，主要表達于骨髓細胞和非促紅細胞生成素細胞，比如嗜中性粒細胞、巨噬細胞、嗜曙紅粒細胞、樹突細胞、內皮細胞和呼吸道上皮細胞。全長GM-CSFR α是400個氨基酸的I型膜糖蛋白，屬于I型細胞因子受體家族，由22個氨基酸的信號肽(位置1-22)、 298個氨基酸的胞外結構域(位置23-320)、位置321-345的跨膜結構域和短的55個氨基酸的胞內結構域組成。信號肽被裂解以提供GM-CSFRa的成熟形式，為378個氨基酸的蛋白。人類和鼠GM-CSFRa的cDNA克隆是可獲得的，并且在蛋白水平，受體亞基具有36%的同一性。GM-CSF能夠以相對低的親和力與單獨α亞基結合(Kd 1_5ηΜ)，但根本不結合單獨β亞基。然而，α亞基和β亞基二者的存在導致高親和力配體-受體復合體(Kd >> IOOpM)。GM-CSF信號傳導如下發生通過初始與GM-CSFRa鏈結合，然后與較大亞基即共有的β鏈交聯產生高親和力相互作用，這將JAK-STAT途徑磷酸化。
對GM-CSF特異性的任何抗體可用于本發明。示例性抗體包括含SEQ ID No. 27-45中任一個中所描繪的H-CDR3序列的氨基酸序列的抗體。其它示例性抗體包括來源于包括SEQ ID No. :27-45中任一個中所描繪的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗體的抗體。 又一些其它示例性抗體包括與包括SEQ ID No. :27-45中任一個中所描繪的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗體具有相同的特異性和/或結合相同表位的抗體。又一些其它示例性抗體包括含與SEQ ID No. :27-45中任一個中所描繪的H-⑶R3序列至少70%、至少80%、至少 90%或至少95%同源的H-⑶R3序列的抗體。
0156]SEQID No 27 0157]ValGly Ser PheSerGly lie AlaTyrArgPro0158]5100159]SEQID No 28 0160]ValGly Ser PheSerGly Pro AlaLeuArgPro0161]5100162]SEQID No 29 0163]ValGly Ser PheSerPro Pro ThrTyrGlyTyr0164]5100165]SEQID No 30 0166]<400>450167]ValGly Ser PheSerGly Tyr ProTyrArgPro0168]5100169]SEQID No 31 0170]ValGly Ser PheSerPro Leu ThrLeuGlyLeu0171]5100172]SEQID No 32 0173]ValGly Ser PheSerGly Pro ValTyrGlyLeu0174]5100175]SEQID No 33 0176]ValGly Ser PheSerPro Pro AlaTyrArgPro0177]510SEQ ID No 34 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 35 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 36 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 37 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 38 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 39 Leu Gly Ser Val
SEQ ID No 40 Ala Gly Ser Ile
SEQ ID No 41 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 42 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 43 Val Gly Ser Phe
SEQ ID No 44 Val Gly Ser Val
SEQ ID No 45 Val Gly Ser Phe
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Thr 5
Pro 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Ser 5
Pro Val Thr Tyr
Gly Leu Ala Tyr
Pro lie Thr Tyr
Gly Trp Ala Phe
Gly Trp Ala Phe
Ala Trp Ala Phe
Gly 10
Leu
Arg Pro 10
Gly 10
Asp 10
Asp 10
Asp 10
Leu
Tyr
Tyr
Tyr
Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 10
Pro Leu Thr Met
Pro Leu Thr Met
Gly Pro Ala Leu
Arg lie Thr Tyr
Gly 10
Gly 10
His 10
Gly 10
Leu
Leu
Leu
Phe
Pro Leu Thr Leu Gly Leu 10
可用于本發明的對GM-CSF特異性的另外的抗體包括含SEQ ID No. 46-56中任一項所描繪的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗體。其它示例性抗體包括來源于包括SEQ ID No. 46-56中任一項所描繪的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗體的抗體。又一些其它示例
12性抗體包括與包括SEQ ID No. 46-56中任一項所描繪的H-⑶R3序列的氨基酸序列的抗體具有相同的特異性和/或結合相同表位的抗體。又一些其它示例性抗體包括含與SEQ ID No. 46-56中任一項所描繪的H-⑶R3序列至少70%、至少80%、至少90%或至少95%同源的H-⑶R3序列的抗體。SEQ ID No 46 EGGYSYGYFDYSEQ ID No 47 DKffLDGFDYSEQ ID No 48 DRffLDAFDISEQ ID No 49 APYDffTFDYSEQ ID No 50 DRffLDAFEISEQ ID No 51 QRYYYSMDVSEQ ID No 52 RPffELPFDYSEQ ID No 53 NGDYVFTYFDYSEQ ID No 54 FGYFGYYFDYSEQ ID No 55 DPYTSGFDYSEQ ID No 56 EDTAMDYFDY本發明的組合物可用于治療性或預防性應用。因此本發明包括含有發明性抗體 (或功能性抗體片段)和藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。在一個相關的方面， 本發明提供了用于治療多發性硬化的方法。所述方法包括向需要該施用的受治療者施用有效量的含有如本文所描述或考慮的發明性抗體的藥物組合物。在某些方面，本發明提供了用于在受治療者中治療多發性硬化的方法，所述方法包括向所述受治療者施用GM-CSF拮抗物的步驟。在這一上下文中使用的“受治療者”是指任何哺乳動物，包括嚙齒動物諸如小鼠或大鼠、和靈長類諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、獼猴(Macaca mulatta)或人類(Homo sapiens)。優選地受治療者是靈長類，最優選地是人類。在某些方面，本發明提供了用于治療多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用GM-CSF拮抗物的步驟，其中所述GM-CSF拮抗物能夠以低于約ΙΟΟηΜ，更優選地為低于約60nM，且進一步更優選地為低于約30nM的親和力結合GM-CSF。進一步優選地是以低于約ΙΟηΜ，且更優選地為低于約3nM的親和力結合GM-CSF的抗體。
在某些方面，本發明提供了用于治療多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用GM-CSF拮抗物的步驟，其中所述GM-CSF拮抗物與抗體競爭結合GM-CSF，其中所述抗體的重鏈包括SEQ ID No. :3的氨基酸序列。在可選的方面，本發明提供了用于治療多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用GM-CSF拮抗物的步驟，其中所述GM-CSF拮抗物與抗體競爭結合GM-CSF，其中所述對GM-CSF特異性的抗體的輕鏈包括SEQ ID No. :4的氨基酸序列。在某些方面，本發明提供了用于治療多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用GM-CSF拮抗物的步驟，其中所述GM-CSF拮抗物是對GM-CSF特異性的抗體且其中所述對GM-CSF特異性的抗體與大鼠和/或獼猴(Hiacaca)GM-CSF交叉反應，如通過溶液平衡滴定(SET)和/或TFl增殖測定所測定的。在某些方面，本發明提供了包括能夠拮抗GM-CSF在多發性硬化中的病生理作用的GM-CSF拮抗物的組合物，所述組合物還包括一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。本發明的抗-GM-CSF抗體可拮抗GM-CSF在多發性硬化中的任何作用。在某些方面，本發明提供了包括能夠減少髓磷脂層的脫髓鞘的GM-CSF拮抗物的組合物，所述組合物還包括一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。在某些方面，本發明提供了包括能夠減少炎性細胞流入脊髓的GM-CSF拮抗物的組合物，所述組合物還包括一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。在某些方面，本發明提供了用于在受治療者中治療或預防多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步驟，其中所述施用延遲了多發性硬化的發病。在另一方面，本發明提供了在受治療者中預防多發性硬化的方法，所述方法包括向所述受治療者施用GM-CSF拮抗物。該上下文所用的“預防”指目的為預防疾病的發病或延遲疾病的發病的方法。在某些方面，本發明提供了用于在受治療者中治療或預防多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步驟，其中所述施用降低了 T細胞的增殖。在某些方面，本發明提供了用于在受治療者中治療或預防多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用有效量的GM-CSF拮抗物，其中所述施用減少了 T細胞的IL17 釋放。用來測量和定量T細胞增殖和IL17的釋放的測定是本領域中已知的。在某些方面，本發明提供了包括在多發性硬化的治療中有用的GM-CSF拮抗物的組合物，所述組合物還包括一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。在其它方面，本發明提供了 GM-CSF拮抗物用于制備治療多發性硬化的藥物的用途。在其它方面，本發明提供了用于治療多發性硬化的GM-CSF拮抗物。在特定的方面，本發明的GM-CSF拮抗物是皮下施用的。在其它方面，本發明的 GM-CSF拮抗物是脊柱內施用的。當皮下施用或脊柱內施用時，GM-CSF拮抗物可以是對多發性硬化的治療特別有效的。本發明的組合物優選地是藥物組合物，所述藥物組合物包括GM-CSF拮抗物和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，以用于治療多發性硬化。所述載體、稀釋劑和賦形劑是本領域中已知的，且技術人員將發現最適合利用本發明的GM-CSF拮抗物治療受治療者的制劑和施用途徑。在某些方面，本發明提供了用于在受治療者中治療或預防多發性硬化的方法，所述方法包括向受治療者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步驟。在某些方面所述受治療者是人類。在可選的方面所述受治療者是嚙齒動物，比如大鼠或小鼠。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是對GM-CSF特異性的抗體。在特定的方面，所述對GM-CSF特異性的抗體的可變重鏈包括SEQ ID No. :3的氨基酸序列。在其它特定的方面，所述對GM-CSF特異性的抗體的可變輕鏈包括SEQ ID No. :4的氨基酸序列。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是對GM-CSF受體特異性的抗體。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用減少了髓磷脂層的脫髓鞘。在其它方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用減少了炎性細胞流入脊柱。在又一些其它方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用減少了 T細胞的增殖。在又一些其它方面，所述GM-CSF的拮抗物的施用減少了 T細胞的IL17釋放。在又一些其它方面，所述施用延遲了多發性硬化的發病。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是皮下施用或脊柱內施用的。在某些方面，本發明提供了用于治療或預防多發性硬化的GM-CSF的拮抗物。在某些方面，所述治療或預防包括向受治療者施用有效量的GM-CSF的拮抗物的步驟。在某些方面，所述受治療者是人類。在可選的方面，所述受治療者是嚙齒動物，比如大鼠或小鼠。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是對GM-CSF特異性的抗體。在某些方面，所述對GM-CSF特異性的抗體的可變重鏈包括SEQ ID No. :3的氨基酸序列。在某些方面，所述對GM-CSF特異性的抗體的可變輕鏈包括SEQ ID No. :4的氨基酸序列。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是對GM-CSF受體特異性的抗體。在某些方面，利用所述GM-CSF的拮抗物進行的治療或預防減少了髓磷脂層的脫髓鞘。在其它方面，利用所述GM-CSF的拮抗物進行的治療或預防減少了炎性細胞流入脊柱。在其它方面，用所述GM-CSF的拮抗物的治療或預防減少了 T細胞的增殖。在其它方面，用所述GM-CSF的拮抗物的治療或預防減少了 T細胞的IL17釋放。在其它方面，用所述GM-CSF的拮抗物的治療或預防延遲了多發性硬化的發病。在某些方面，所述GM-CSF的拮抗物是皮下施用或脊柱內施用的。
實施例實施例1 本發明中所用的示例性抗體和動物MOR-GM在本發明中用作示例性的GM-CSF拮抗物。MOR-GM是完全人類GM-CSF-特異性抗體(W0 06/122797)。MOR-GM的重鏈可變區顯示于SEQ ID No. :3中，輕鏈可變區顯示于 SEQ ID No. 4 中。抗體22E9，一種抗小鼠GM-CSF抗體，曾用于其它實驗中(AbD Serotec, Martiηsried/Germany ；Cat. No. 1023501)。
顯然地，任何其它GM-CSF拮抗物，例如包括選自SEQ ID No. :1_45的氨基酸片段的任何抗體可根據本發明來使用。iffi Dark Agouti ^H, 7-8 MS (Harlan Laboratories, Inc. , Indianapolis/ IN)飼養于21 士3°C、40-70%的相對濕度和12小時光/暗循環的清潔的常規條件下。大鼠成對飼養且自由獲取嚙齒動物飼料(SSNIFF，Bio-Services，Hie Netherlands)。個體動物通過標記尾部來確認身份。在實驗開始之前，將大鼠飼養4周的時間。在實驗起始之前對大鼠進行隨機分組。在實驗開始時，大鼠為11-12周齡且具有200-250g的重量。實施例2 在MOG誘導的MS的EAE模型中GM-CSF拮抗物的治療有效性為誘導實驗性的自身免疫腦脊髓炎(EAE)，在尾部的背側基底的兩側的兩個位點中通過用在200 μ 1的弗氏不完全佐劑(IFA)和IOnM NaAc ρΗ3. 0的1 1混合物中乳化的15 μ g的重組髓磷脂-少突膠質細胞-糖蛋白(rMOG)進行皮內注射而使雄性DA大鼠免疫。為協助免疫，通過吸入含2-4%的異氟烷的氧氣和隊0的混合物而麻醉大鼠。與媒介物(PBQ處理相比較地和與用非特異性的/無關的同種型對照抗體 M0R-N0GM (50mg/kg)處理組相比較地檢驗測試化合物MOR-GM的腹膜內施用的效果。以3個劑量，即10mg/kg、20mg/kg和50mg/kg來檢驗利用化合物MOR-GM進行的預防性治療。在第 7天、第10天、第14天、第17天和第21天施用化合物。并且，在疾病發病之后開始首次治療的方案中檢驗化合物(50mg/kg)的效力。在該情況中，在第14天、第17天和第21天施用化合物。陽性對照組包括用從第9天開始每天腹膜內施用地塞米松(0.5mg/kg)處理的大鼠。每個實驗組包括12只動物。在第17天和第21天(處理之前)和終點時從尾靜脈采集血樣品。每天測量每個大鼠的體重。利用以下的傷殘評分系統每天對大鼠的EAE進行評估0 無疾病0. 5 尾局部麻痹或部分麻痹1 完全尾麻痹2 后肢無力或部分麻痹2. 5 如2 一樣，但具有額外的前肢的受累3 后肢和/或機體的下部分的完全麻痹3. 5 如3 一樣，但具有額外的前肢的受累4 死于 EAE因為EAE相關共病而需要被安樂死的大鼠在安樂死那天被指定為3. 5的值，且在整個監測期所有隨后的天指定為4的評分。“最大臨床評分”指實驗期間每個大鼠的最高EAE評分。“累積評分”是在確定的時期中對于給定的大鼠的所有EAE評分的總和(曲線下面積)。計算整個隨訪期、第一疾病期(第0-15天)和復發期(第16天-結束)的累積評分。“發病日”指達到至少3的累積評分的3個連續日中的第一個。組織學分析將福爾馬林固定的組織包埋在石蠟中并用蘇木精/伊紅對5pm的組織切片進行染色以能夠對炎性細胞的浸潤程度進行半定量，或用根據Kluver-Barrera的Luxol堅牢藍染色以進行髓磷脂染色。以半定量的方式對來自脊髓的骶骨部分的三個非連續切片(間隔100 μ m)的炎性細胞的浸潤和脫髓鞘的程度進行評價。利用如以下表中所描述的評分系統進行組織學分級。組織學分級以盲法方式進行。用于炎性細胞浸潤入脊髓組織的半定量分級的組織學評分系統
權利要求
1.一種用于治療或預防多發性硬化的GM-CSF的拮抗物。
2.如權利要求1所述的拮抗物，其中所述治療或預防包括向受治療者施用有效量的 GM-CSF的拮抗物的步驟。
3.如權利要求2所述的拮抗物，其中所述受治療者是人類。
4.如權利要求2所述的拮抗物，其中所述受治療者是嚙齒動物，比如大鼠或小鼠。
5.如前述權利要求中任一項所述的拮抗物，其中所述拮抗物是對GM-CSF特異性的抗體。
6.如權利要求5所述的拮抗物，其中所述對GM-CSF特異性的抗體的可變重鏈包括SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
7.如權利要求5或6所述的拮抗物，其中所述對GM-CSF特異性的抗體的可變輕鏈包括 SEQ ID No. 4的氨基酸序列。
8.如權利要求1-4中任一項所述的拮抗物，其中所述拮抗物是對GM-CSF受體特異性的抗體。
9.如前述權利要求中任一項所述的拮抗物，其中所述治療或預防減少髓磷脂層的脫髓鞘。
10.如前述權利要求中任一項所述的拮抗物，其中所述治療或預防減少炎性細胞流入脊髓。
11.如前述權利要求中任一項所述的拮抗物，其中所述治療或預防減少T細胞的增殖。
12.如前述權利要求中任一項所述的拮抗物，其中所述治療或預防減少T細胞釋放 IL17。
13.如前述權利要求中任一項所述的拮抗物，其中所述治療或預防延遲多發性硬化的發病。
14.如權利要求2-13中任一項所述的拮抗物，其中所述GM-CSF的拮抗物是皮下施用或脊柱內施用的。
全文摘要
本發明涉及用于治療和/或預防多發性硬化(MS)的方法。GM-CSF的拮抗物，比如對GM-CSF或GM-CSF受體特異性的抗體，在多發性硬化的治療和/或預防中是有效的。
文檔編號C07K16/24GK102439039SQ201080019701
公開日2012年5月2日 申請日期2010年5月4日 優先權日2009年5月5日
發明者伊麗莎白·托馬森-沃爾夫, 斯特凡·施泰德爾, 曼紐拉·迪爾, 羅伯特·佛里森, 馬修·唐納姆 申請人:莫佛塞斯公司