專利名稱：用于檢測基孔肯雅病毒的探針和引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過使用“寡核苷酸”探針利用分離自血液樣品的核酸來檢測基孔肯雅病毒感染的方法。本發明所采用的檢測方法是實時PCR。
背景技術：
基孔肯雅病毒產于熱帶非洲和亞洲，通過感染的蚊子叮咬傳播給人類，通常是伊蚊屬。基孔肯雅病毒屬于多加病毒科的α病毒。它是一種“蟲媒病毒”(Ar-節肢動物， bo_傳播)。CHIK熱(基孔肯雅熱)流行病經由人類-蚊子-人類蔓延傳播。單詞“基孔肯雅”被認為來自當地方言所描述的與該病相關的嚴重的關節疼痛引起的患者的扭曲姿勢。 主要的病毒儲存宿主是猴子，但其他物種也會受到感染，包括人類。基孔肯雅(馬孔德語指“彎曲的”)病毒(CHIKV)是一種昆蟲傳播的病毒，α病毒屬，由病毒攜帶體伊蚊傳播給人類。最近有CHIKV的爆發，具有較高的發病率。CHIKV引起疾病的癥狀類似于登革熱。CHIKV顯現疾病的急性發熱階段，僅持續兩到五天，接著是長期的影響到四肢關節的關節痛病。CHIKV感染相關的關節疼痛持續數周或數月。基孔肯雅病的潛伏期是兩到四天。該病的癥狀包括高熱到40C(104F)，軀干及偶爾四肢的瘀斑或斑丘疹，及影響到多個關節的關節痛或關節炎。其他非特異癥狀包括頭痛、結膜感染及輕微畏光。典型地，發燒持續兩天，然后突然結束。然而，其他癥狀，即關節痛、劇烈頭痛、失眠與極度衰竭，持續時間不同，通常約5到7天。主訴關節痛持續時間很長的患者取決于他們的年齡。常見的實驗室檢查基孔肯雅包括RT-PCR、病毒分離和血清學試驗。病毒分離提供了最明確的診斷，但需要1-2周完成，且必須在生物研究安全性3級實驗室進行。 該技術包含使具體的細胞系接觸到全血樣品，并識別基孔肯雅病毒特異性反應。RT-PCR應用套式引物對(nested primer pairs)，放大全血的數個基孔肯雅特異性基因。結果在1_2 天確定。血清學診斷比其他方法需要更多量的血，應用ELISA試驗測量基孔肯雅特異性IgM 水平。結果需要2-3天，且其他相關病毒感染，如奧尼昂尼昂病毒(0’ nyong' nyong)和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)時常產生假陽性。
發明內容
因此，本發明涉及有SEQ ID No. 1和2的探針；有SEQ ID No. 1和2在5'末端或 3'末端或兩處與可檢測標記結合的探針；SEQ ID No. 3、4、5和6的引物；用于檢測基孔肯雅病毒的PCR反應混合物，所述混合物包含待檢測的樣品、核酸擴增試劑、選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針、及選自包含SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應引物；一種檢測及可選地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步驟a)形成反應混合物，包含待檢測的樣品、核酸擴增試劑、選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針、及選自包含SEQ ID No.3、4、5和6的組中的相應引物，b)使反應混合物進行PCR以獲得目標序列的拷貝，然后通過測量熒光信號的增加以檢測基孔肯雅感染，以及c)可選地從檢測信號構建標準曲線以獲得用于量化基孔肯雅感染的拷貝數；一種檢測基孔肯雅感染的試劑盒，所述試劑盒包含單獨地或組合地SEQ ID No. 1和2的探針；單獨地或組合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相應引物對，以及擴增試劑。
圖1顯示基孔肯雅病毒的標準曲線。
具體實施例方式本發明涉及有SEQ ID No. 1和2的探針。在本發明的一個實施例中，所述探針用于檢測基孔肯雅病毒。本發明涉及有SEQ ID No. 1和2在5'末端或3'末端或兩處與可檢測標記結合的探針。在本發明的一個實施例中，所述探針在5'末端與熒光團結合，而在3'末端與猝滅劑結合。在本發明的另一個實施例中，所述熒光團選自包含熒光素及熒光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組。在本發明的另一個實施例中，所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。在本發明的另一個實施例中，優選的熒光團是5'末端的6-羧基熒光素[FAM]，優選的猝滅劑是3'末端的四甲基羅丹明[TAMRA]。本發明涉及引物SEQ ID No. 3、4、5和6。在本發明的一個實施例中，有SEQ ID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5 和6的引物是反義引物。在本發明的另一個實施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物對應于探針SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物對應于探針SEQ ID No. 2。在本發明的另一個實施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針可選地在5'末端或3' 末端或兩處與可檢測標記結合。本發明涉及一種檢測基孔肯雅病毒的PCR反應混合物，所述混合物包含待檢測的樣品，核酸擴增試劑，選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針，及選自包含SEQ ID No. 3、 4、5和6的組中的相應引物。在本發明的一個實施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物對應于探針SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物對應于探針SEQ ID No. 2。在本發明的另一個實施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針可選地在5'末端或3' 末端或兩處與可檢測標記結合。在本發明的另一個實施例中，所述樣品選自包含血液、血清和血漿的組。本發明涉及一種檢測及可選地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步驟a)形成反應混合物，所述反應混合物包含待檢測的樣品、核酸擴增試劑、選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針、以及選自包含SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應引物；b)使反應混合物進行PCR以獲得目標序列的拷貝，然后通過測量熒光信號的增加以檢測基孔肯雅感染；以及c)可選地從檢測信號構建標準曲線以獲得用于量化基孔肯雅感染的拷貝數。在本發明的一個實施例中，有SEQ ID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5 和6的引物是反義引物，其中樣品選自包含血液、血清和血漿的組。在本發明的另一個實施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物對應于探針SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物對應于探針SEQ ID No. 2。在本發明的另一個實施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針在5'末端或3'末端或兩處與可檢測標記結合，其中熒光信號由在5'末端的熒光團和在3'末端有猝滅劑的探針產生。在本發明的另一個實施例中，所述熒光團選自包含熒光素及熒光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組，其中，所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。本發明涉及一種用于檢測基孔肯雅感染的試劑盒，所述試劑盒包含單獨地或組合地探針SEQ ID No. 1和2，單獨地或組合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相應引物對，以及擴增試齊LU在本發明的一個實施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針可選地在5 ‘末端或3 ‘末端或兩處與可檢測標記結合。在本發明的另一個實施例中，所述擴增試劑是包含氯化鎂、Taq聚合酶和擴增緩沖液的組合。本發明的主要目的是利用分離自感染的血液樣本的核酸來檢測基孔肯雅病毒感染。檢測的方式是通過使用標記熒光團與猝滅劑的“寡核苷酸”探針，應用實時PCR監測熒光的增加。探針和引物設計有SEQ ID No. 1的探針與有SEQ ID No. 3和5的引物一起被設計針對基孔肯雅的非結構性蛋白nsP4基因。類似地，SEQ ID No. 2探針與SEQ ID No. 4和6引物被設計成針對基孔肯雅的結構蛋白基因。本發明涉及稱為SEQ ID No. 1探針的“寡核苷酸”探針與稱為SEQ ID No. 3和5的引物一起用于檢測基孔肯雅病毒感染，其中所述引物分別是正義和反義引物；SEQ ID No. 2 探針與稱為SEQ ID No. 4和6的引物一起用于檢測基孔肯雅病毒感染，其中所述引物分別是正義和反義引物。根據本發明，SEQ ID No. 1探針分別與其正義和反義引物一起被設計用作基孔肯雅的非結構性蛋白nsP4基因。類似地，SEQ ID No. 2探針分別與其相應的正義和反義引物一起被設計用作基孔肯雅的結構蛋白基因。根據本發明，所述“寡核苷酸”探針與在5'末端有熒光團在3'末端有猝滅劑的可檢測標記結合。所述熒光團選自包含熒光素及熒光素衍生物FAM、VIC、J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、 德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組。在本發明的另一個實施例中，所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4 ‘ - (4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及BHQ染料的組。在本發明的另一個實施例中，所述熒光團是6-羧基熒光素[FAM]，所述猝滅劑是四甲基羅丹明[TAMRA]。在本發明的另一個實施例中，所述檢測本質上是定性或定量的。本發明涉及一個檢測基孔肯雅病毒感染的PCR反應混合物，其中所述混合物包含核酸擴增試劑，稱為SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的“寡核苷酸”探針結合稱為SEQ ID No. 3 和5或SEQ ID No.4和6的引物，和分離自血液/血清/血漿樣品的基孔肯雅核酸。本發明涉及一種檢測基孔肯雅病毒感染的方法，其中所述PCR混合物包含核酸擴增試劑，稱為SEQ ID No.l或SEQ ID No. 2的“寡核苷酸”探針及其相應引物，和應用實時PCR擴增獲得目標序列拷貝的待檢測的樣品。擴增的測量依據熒光信號的增加。所述“寡核苷酸”探針的大小范圍是2046個核苷酸。所設計的探針5'末端有熒光團，3'末端有猝滅劑。5'末端的熒光團是6-羧基熒光素[FAM]，當猝滅劑存在于3'末端時是四甲基羅丹明[TAMRA]。本發明用于檢測血液/血清/血漿樣品中的基孔肯雅病毒感染。用于檢測的方法是通過監測PCR反應熒光的增加。根據本發明，所述“寡核苷酸探針”指的是一種脫氧核糖核酸(DNA)的短序列。該寡核苷酸探針能與目標DNA特異雜交，而與未感染的DNA沒有表現出非特異雜交。本文所用探針遵循Taqman化學原則。TaqMan探針也稱為雙染寡核苷酸或雙標探針，是最廣泛應用的探針類型。因此，根據本發明，所述“寡核苷酸”探針被進一步與其相應的正義和反義引物結合提供，通過實時PCR能夠用于特異擴增和檢測檢驗樣品中的基孔肯雅病毒序列。也可以基于從標準曲線獲得的Ct量化病毒負載量。有SEQ ID No. 1和2的探針與其相應的引物具有如表1和表2中所描述的序列。表.1
序列名核苷酸序列SEQ ID No. 15 ‘ -TTCGATGCCATCATAGCCGCACACTT-3‘SEQ ID No. 35 ‘ -CCTCCTACCCAATGTACATACACTATTT-3‘SEQ ID No. 55' -AGGAGGCTATGTCCGTTTCTAAAA-3‘表.2
權利要求
1.有SEQID No. 1和2的探針。
2.根據權利要求1所述的探針，其中所述探針用于檢測基孔肯雅病毒。
3.有SEQID No. 1和2在5'末端或3'末端或兩處與可檢測標記結合的探針。
4.根據權利要求3所述的探針，其中所述探針在5'末端與熒光團結合、而在3'末端與猝滅劑結合。
5.根據權利要求4所述的探針，其中所述熒光團選自包含熒光素及熒光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組。
6.根據權利要求4所述的探針，其中所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4'-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。
7.根據權利要求5和6所述的探針，其中優選的熒光團是5'末端的6-羧基熒光素 [FAM]，而優選的猝滅劑是3'末端的四甲基羅丹明[TAMRA]。
8.引物SEQ ID No. 3、4、5 和 6。
9.根據權利要求8所述的引物，其中有SEQID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5和6的引物是反義引物。
10.根據權利要求9所述的引物，其中所述有SEQID No. 3和5的引物對應于探針SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物對應于探針SEQ ID No. 2。
11.根據權利要求9所述的引物，其中所述有SEQID No. 1和2的探針可選地在5'末端或3'末端或兩處與可檢測標記結合。
12.—種檢測基孔肯雅的PCR反應混合物，所述混合物包含待檢測的樣品、核酸擴增試劑、選自包括SEQ ID No. 1和2的組中的探針、以及選自包括SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應引物。
13.根據權利要求12所述的反應混合物，其中所述有SEQID No. 3和5的引物對應于探針SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物對應于探針SEQ ID No. 2。
14.根據權利要求13所述的反應混合物，其中所述有SEQID No. 1和2的探針在5' 末端或3'末端或兩處與可檢測標記可選地結合。
15.根據權利要求12所述的反應混合物，其中所述樣品選自包括血液、血清和血漿的組。
16.一種檢測與可選地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步驟(a)形成反應混合物，所述反應混合物包含待檢測的樣品、核酸擴增試劑、選自包括SEQ ID No. 1和2的組中的探針、以及選自包括SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應引物；(b)使反應混合物進行PCR以獲得目標序列的拷貝，然后通過測量熒光信號的增加來檢測基孔肯雅感染；以及(c)可選地，由檢測信號構建標準曲線以獲得用于量化所述基孔肯雅感染的拷貝數。
17.根據權利要求16所述的方法，其中有SEQID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5和6的引物是反義引物，并且其中所述樣品選自包含血液、血清和血漿的組。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述有SEQID No. 3和5的引物對應于探針SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物對應于探針SEQ ID No. 2。
19.根據權利要求16所述的方法，其中所述有SEQID No. 1和2探針在5'末端或3' 末端或兩處與可檢測標記結合，其中所述熒光信號由在5'末端具有熒光團和在3'末端具有猝滅劑的探針產生。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述熒光團選自包含熒光素及熒光素衍生物 VIC、J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、 四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組， 并且其中所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。
21.一種檢測基孔肯雅感染的試劑盒，所述試劑盒包含單獨地或組合地探針SEQ ID No. 1和2 ；單獨地或組合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相應引物對，及擴增試劑。
22.根據權利要求21所述的試劑盒，其中所述有SEQID No. 1和2的探針可選地在5 ‘ 末端或3'末端或兩處與可檢測標記結合。
23.根據權利要求21所述的方法，其中所述擴增試劑是包含氯化鎂、Taq聚合酶和擴增緩沖液的組合。
全文摘要
本發明詳細描述了通過使用“寡核苷酸”探針，確定血液/血清/血漿樣品中基孔肯雅病毒核酸存在的方法。通過使用實時PCR，所設計的“寡核苷酸”探針能用于定性或定量檢測感染樣品中的基孔肯雅病毒。
文檔編號C07H21/04GK102414217SQ201080018304
公開日2012年4月11日 申請日期2010年2月23日 優先權日2009年2月25日
發明者曼尤拉·賈甘納特, 皮拉里塞蒂·文卡塔·蘇巴拉奧, 錢德拉塞克哈爾·布哈斯卡拉恩·奈爾 申請人:彼格泰格私人有限公司