雙特異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體的制作方法

專利名稱：雙特異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體的制作方法
雙特異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體本發明涉及針對人ErbB-3和針對人c_Met的雙特異性抗體，制備它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物，及其用途。
背景技術：
ErbB蛋白質家族ErbB蛋白質家族由4個成員組成ErbB-Ι，也稱為表皮生長因子受體(EGFR)， ErbB-2，在人中也稱為HER2和在嚙齒動物中也稱為neu，ErbB_3，也稱為HER3，和ErbB_4， 也稱為HER4。ErbB-3 和抗 _ErbB_3 抗體ErbB-3 (也已知為V_erb_b2成紅細胞白血病病毒癌基因同系物3(禽類)， ERBB3, HER3 ；SEQ ID NO :46)是膜結合蛋白，其具有神經調節蛋白結合結構域但是沒有活性激酶結構域(Kraus, M. H，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.) 86 (1989) 9193-7 ；Plowman, G. D.，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. )87(1999)4905-9 ；Katoh, Μ.，等，生物化學生物物理學研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 192(1993) 1189-97)。因此，其可以結合該配體，但是不通過蛋白磷酸化將信號傳送到細胞中。然而，其的確與確實具有激酶活性的其它EGF受體家族成員形成異二聚體。異二聚化導致引起細胞增殖或分化的途徑的激活。該基因的擴增和/或其蛋白的過表達已在多種癌癥中得以報道，包括前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、和乳腺腫瘤。已經表征了編碼不同同種型的可變轉錄剪接變體。一種同種型缺少膜間區，并且分泌到細胞外。這種形式起作用調節膜結合形式的活性(Corfas，G.，等，7 (6) (2004) 575-80)。認為ERBB3被活化時成為二聚化的底物并且隨后被ERBBl，ERBB2和ERBB4磷酸化。與多種受體酪氨酸-激酶相似，ERBB3被細胞外配體激活。已知結合ERBB3的配體包括調蛋白。例如，由WO 97/35885, WO 2007/077028 或 WO 2008/100624 可知用于抗癌治療的抗-ErbB-3抗體。c-Met 和抗-c-Met 抗體MET(間充質-上皮轉變因子)是一種原癌基因，其編碼蛋白質MET，(也已知為c-Met ；肝細胞生長因子受體HGFR ； HGF受體；分散因子受體；SF受體；SEQ ID NO 45) (Dean, Μ·，等，自然(Nature) 318 (1985) 385-8 (1985) ； Chan, A.M.，等，癌基因 (Oncogene) 1 (1987) 229-33 ；Bottaro, D. P.，等，科學(Science) 251 (1991) 802-4 ；Naldini, L.，等，EMBO 雜志(ΕΜΒ0 J.) 10 (1991) 2867-78 ；Maulik, G.，等，細胞因子生長因子綜述 (Cytokine Growth Factor Rev.) 13 (2002) 41-59)。MET 是胚胎發育和傷口愈合必需的膜受體。肝細胞生長因子(HGF)是MET受體僅有的已知配體。MET被上皮來源的細胞正常表達， 而HGF的表達局限于間充質來源的細胞。經HGF刺激，MET誘導數種生物學反應，它們共同產生已知為侵襲性生長的程序。癌癥中異常的MET活化與差的預后相關，在此異常活性的 MET引發腫瘤生長，形成向腫瘤供應營養素的新血管(血管生成)，以及癌癥擴散到其它器官(轉移)。MET在許多類型的人惡性腫瘤中下調，所述人惡性腫瘤包括腎癌、肝癌、胃癌、 乳腺癌和腦癌。通常，僅有干細胞和祖細胞表達MET，其允許這些細胞侵襲性生長以便在胚胎中產生新組織或在成人中再生受損傷的組織。然而，認為癌癥干細胞劫持了正常干細胞表達MET的能力，因此成為癌癥持續和擴散到身體中的其它部位的原因。原癌基因MET產物是肝細胞生長因子受體并且編碼酪氨酸-激酶活性。初級單鏈前體蛋白質被翻譯后分解以產生α和β亞基，其被二硫鍵連接以形成成熟的受體。MET基因的多種突變與乳頭狀腎癌相關。抗-C-Met抗體是已知的，例如，從 US 5686292，US 7476724, WO 2004072117， WO 2004108766， WO 2005016382， WO 2005063816， WO 2006015371， WO 2006104911， WO 2007126799，或 WO 2009007427 中得知。C-Met結合肽是已知的，例如，從Matzke，A.，等，癌癥研究(Cancer Res) 2005 ；65 (14)和 Tam，E.M，等，分子生物學雜志(J. Mol. Biol.) 385 (2009) 79-90 中得知。雙特異性抗體最近已經開發了廣泛多樣的重組抗體形式，例如通過融合例如IgG抗體形式和單鏈結構域的四價雙特異性抗體(參見例如Coloma，Μ. J.，等，自然生物技術(Nature Biotech) 15 (1997) 159-163 ；WO 2001/077342 ；和 Morrison, S. L.，等，自然生物技術 (Nature Biotech)25 (2007) 1233-1234)。此外，開發了能夠結合兩種以上抗原的若干其他新型形式，其中抗體核心結構(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)不再保持，諸如雙抗體(diabodies)、三鏈抗體或四鏈抗體(tetrabodies)、微型抗體(minibodies)、若干單鏈形式(scFv，雙-scFv) (HoiIiger P，等，自然生物技術(Nature Biotech) 23 (2005) 1126-1136 ；Fischer, N.，和 Leger, 0.，病理學(Pathobiology) 74 (2007) 3-14 ；Shen, J，等，免疫學方法雜志(Journal of Immunological Methods) 318 (2007) 65-74 ；ffu, C.,等，自然生物技術(Nature Biotech.)25 (2007) 1290-1297)。所有這樣的形式使用接頭將抗體核心(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)與其他結合蛋白(例如scFv)融合或融合例如兩個Fab片段或scFvs (Fischer, N.，Leger, 0.，病理學 (Pathobiology) 74 (2007) 3-14)。人們一直希望可以通過保持與天然存在的抗體的高度相似性而保持效應子功能，諸如例如通過Fc受體結合介導的補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在WO 2007/024715中，報道了雙重可變的結構域免疫球蛋白作為改造的多價和多特異性結合蛋白。在US 6，897，044中報道了用于制備生物活性的抗體二聚體的方法。在 US 7，129，330中報道了具有至少四個彼此通過肽接頭連接的可變結構域的多價FV抗體構建體。在US 2005/0079170中報道了二聚體和多聚體抗原結合結構。在US 6，511，663中報道了三價或四價單特異性抗原結合蛋白，其包含通過連接結構彼此共價結合的三個或四個Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報道了這樣的四價雙特異性抗體，其可以在原核細胞和真核細胞中有效表達，并且用于治療和診斷方法中。在US 2005/0163782中報道了在包含兩種類型的多肽二聚體的混合物中，將通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體與不通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或優先合成通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。在US 5，959，083中報道了雙特異性四價受體。在 WO 2001/077342中報道了具有三個或多個功能性抗原結合位點的改造的抗體。在WO 1997/001580中報道了多特異性和多價抗原結合多肽。WO 1992/004053報道了均綴合物(homoconjugate)，其典型地由結合相同抗原決定簇的IgG類的單克隆抗體制備，其通過合成交聯共價連接。在WO 1991/06305中報道了對于抗原具有高抗體親抗原性的低聚單克隆抗體，其中分泌典型地是IgG類的低聚物，其具有締合在一起的兩種以上的免疫球蛋白單體，以形成四價或六價IgG分子。在US 6，350，860中報道了綿羊來源的抗體和改造的抗體構建體，其可以用于治療其中Y干擾素活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中，報道了可靶向的構建體，所述構建體是雙特異性抗體的多價載體，即可靶向的構建體的每個分子可以作為兩種以上雙特異性抗體的載體。在WO 1995/009917中報道遺傳改造的雙特異性四價抗體。在WO 2007/1092M中，報道了由穩定的scFv組成或包含穩定的scFv的穩定的結合分子。US 2007/0274985涉及包含單鏈Fab(ScFab)片段的抗體形式。W02009111707 (Al)涉及使用 Met 和 HER拮抗劑的聯合治療。W02009111691 (A2A3) 涉及使用Met和EGFR拮抗劑的聯合治療。WO 2008/100624涉及具有增加的ErbB_3受體內在化的抗_ErbB_3抗體及其特別與作為第二抗原的c-Met在雙特異性抗體中的應用。發明概述本發明第一方面是特異性結合人ErbB-3和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，當在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量時，與不存在抗體時ErbB-3的內在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過15%的ErbB-3的內在化。在本發明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結合人ErbB-3和人c_Met的二價或三價、雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的一個或兩個抗原結合位點和特異性結合人c-Met的一個抗原結合位點。在本發明的一個實施方案中，所述抗體優選是特異性結合人ErbB-3和人c_Met 的三價、雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的兩個抗原結合位點和特異性結合人 c-Met的第三抗原結合位點。在本發明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的二價、雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的一個抗原結合位點和特異性結合人 c-Met的一個抗原結合位點。本發明的一個方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，i)所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 53的⑶R3H區， SEQ ID NO :54的⑶R2H區和SEQ ID NO :55的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 56 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 59 的 CDRlL 區；禾口所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H區，SEQ ID NO :67的CDR2H區和SEQ ID NO :68的CDRlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 區；ii)所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 60的⑶R3H區，SEQ ID NO :61的⑶R2H區和SEQ ID NO 62的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 63 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 66 的 CDRlL 區；禾口所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H區，SEQ ID NO :67的CDR2H區和SEQ ID NO :68的CDRlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 區。所述雙特異性抗體優選地特征在于，i)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 47和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 48 ；和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的序列 SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的序列SEQ ID NO 4 ；ii)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO :49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 50 ；和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；iii)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；iv)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :52，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；或ν)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO :1和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :2，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；或優選地，所述雙特異性抗體特征在于所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；在一個實施方案中，本發明所述的雙特異性抗體特征在于包含IgGl或IgG3亞類的恒定區。在一個實施方案中，本發明所述的雙特異性抗體特征在于所述抗體在Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈內巖藻糖的量為65 %以下。本發明另一方面是編碼所述雙特異性抗體的鏈的核酸分子。本發明的其它方面是包含本發明所述的雙特異性抗體的藥物組合物，所述組合物用于治療癌癥，所述雙特異性抗體用于制備用于治療癌癥的藥物的應用，治療患有癌癥的患者的方法，所述方法通過給需要所述治療的患者施用所述雙特異性抗體而進行。本發明所述的抗體表現出高度有價值的特性，如表達兩種受體<ErbB3>和 <c-Met>的癌細胞的生長抑制，給患有癌癥的患者帶來益處的抗腫瘤功效。本發明所述的雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體在與它們的親本單特異性<ErbB3>抗體相比較時，在表達這兩種受體<ErbB3>和<c-Met>的癌細胞上，其表現出減少的ErbB3/抗體復合物的內在化。發明詳述
本發明的第一方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，當在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時ErbB-3的內在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過15%的ErbB_3的內在化。因此，本發明涉及特異性結合人ErbB-3和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其中通過流式細胞術測定法測量，在A431細胞-抗體溫育1小時后測量時，與不存在抗體時在A431細胞上ErbB-3的內在化相比，所述雙特異性抗體引起不超過15%的A431細胞上 ErbB-3的內在化的增加。 在一個實施方案中，所述特異性結合人ErbB-3和人c_Met的雙特異性抗體包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，當在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時ErbB-3的內在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過10%的ErbB-3的內在化。在一個實施方案中，所述特異性結合人ErbB-3和人c_Met的雙特異性抗體包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，當在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時ErbB-3的內在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過7%的ErbB-3的內在化。在一個實施方案中，所述特異性結合人ErbB-3和人c_Met的雙特異性抗體包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，當在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時ErbB-3的內在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過5%的ErbB-3的內在化。術語“ErbB-3的內在化”指與不存在抗體時ErbB_3的內在化相比較，在A431細胞 (ATCC No. CRL-1555)上的抗體-誘導的ErbB-3受體內在化。ErbB-3受體的這種內在化由本發明所述的雙特異性抗體誘導，并且如在實施例8中所述，在流式細胞術測定法(FACS) 中2小時后測量。與不存在抗體時ErbB-3的內在化相比較，本發明所述的雙特異性抗體在抗體暴露2小時后表現出在A431細胞上不超過15%的ErbB-3內在化。在一個實施方案中，所述抗體表現出不超過10%的ErbB-3內在化。在一個實施方案中，所述抗體表現出不超過7%的ErbB-3內在化。在一個實施方案中，所述抗體表現出不超過5%的ErbB-3內在化。為了確定雙特異性ErbB3/cMet抗體在A431細胞上2小時后是否表現出10%以下的 ErbB-3內在化，可以在流式細胞術測定法(FACS)中與下述雙特異性ErbB3/cMet抗體MH_ TvAb24進行比較。為了確定雙特異性ErbB3/cMet抗體在A431細胞上2小時后是否表現出5%以下的ErbB-3內在化，可以在流式細胞術測定法(FACS)中與下述雙特異性ErbB3/ cMet抗體MH_TvAb29進行比較。本發明的另一方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，與由(相對應的)單特異性親本ErbB-3抗體誘導的ErbB-3內在化相比，當在流式細胞術測定中在A431細胞(ATCC No. CRL-1555)上2小時后測量時，所述雙特異性抗體將 ErbB-3內在化減少50%以上(在一個實施方案中，減少60%以上；在另一個實施方案中， 減少70%以上，在一個實施方案中，減少80%以上)。ErbB-3內在化的減少計算(使用在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量的值)如下100x(由單特異性親本ErbB-3 抗體誘導的％ ErbB3內在化-由雙特異性ErbB-3/cMet抗體誘導的％ ErbB3內在化)/由單特異性親本ErbB-3抗體誘導的％ ErbB3內在化。例如a)雙特異性ErbB-3/cMet抗體MH_ TvAb21表現出1 %的ErbB-3內在化，并且單特異性親本ErbB_3抗體Mab 205表現出40% 的ErbB-3內在化。因此，雙特異性ErbB-3/cMet抗體MH_TvAb21表現出IOOx (40-1) /40% =97. 5%的ErbB-3內在化減少；b)雙特異性ErbB-3/cMet抗體MH_TvAb25表現出11%的 ErbB-3內在化，并且單特異性親本ErbB-3抗體Mab 205表現出40%的ErbB-3內在化。因此，雙特異性 ErbB-3/cMet 抗體 MH_TvAb21 表現出 IOOx(40-11)/40% = 72. 5% 的 ErbB-3 內在化減少；或c)雙特異性ErbB-3/cMet抗體HER3/Met_C6表現出11%的ErbB-3內在化， 并且單特異性親本ErbB-3抗體HER3克隆29表現出54%的ErbB-3內在化。因此，雙特異性 ErbB-3/cMet 抗體 HER3/Met_C6 表現出 IOOx (54-6) /40 % = 88. 9 % 的 ErbB-3 內在化減少。(參見在實施例8中在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量的內在化值)。
在本發明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的三價、雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的兩個抗原結合位點和特異性結合人 c-Met的第三抗原結合位點。在本發明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的二價、雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人 c-Met的第二抗原結合位點。在本發明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的四價、雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的兩個抗原結合位點和特異性結合人 c-Met的兩個抗原結合位點，其中所述特異性結合人c-Met的抗原結合位點抑制c_Met 二聚化(如例如在WO 2009007427中所述)。用于本文時，“抗體”指包含抗原結合位點的結合蛋白。術語“結合位點”或“抗原結合位點”用于本文時，指配體實際上結合的抗體分子的區域，所述位點源自抗體。術語“抗原結合位點”包含抗體重鏈可變結構域(VH)和/或抗體輕鏈可變結構域(VL)或VH/VL配對，并可源自完整抗體或抗體片段如單鏈Fv、VH結構域和/或VL結構域、Fab或(Fab) 2。 在本發明的一個實施方案中，每個抗原結合位點包含抗體重鏈可變結構域(VH)和/或抗體輕鏈可變結構域(VL)，和優選地由抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體重鏈可變結構域(VH) 組成的配對形成。對抗體來源的抗原結合位點進一步看來，例如，Matzke, A.，等，癌癥研究(Cancer Res) 652005(14). 2005年7月15日中所述的結合肽也可以特異性結合抗原(例如，c_Met)。 因此，本發明的另一方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性結合分子，其包含特異性結合人ErbB-3的抗原結合位點和特異性結合人c-Met的結合肽。因此，本發明的另一方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性結合分子，其包含特異性結合人 c-Met的抗原結合位點和特異性結合人ErbB-3的結合肽。ErbB-3 (也已知為V_erb_b2成紅細胞白血病病毒癌基因同系物3(禽類)， ERBB3, HER3 ；SEQ ID NO :46)是膜結合蛋白，其具有神經調節蛋白結合結構域但是沒有活性激酶結構域(Kraus, M. H，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.) 86 (1989) 9193-7 ；Plowman, G. D.，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad.Sci.U. S. Α.) 87 (1990) 4905-9 ；Katoh, Μ.，等，生物化學生物物理學研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 192(1993) 1189-97)。因此，其可以結合該配體，但是不通過蛋白磷酸化將信號傳送到細胞中。然而，其的確與確實具有激酶活性的其它EGF受體家族成員形成異二聚體。異二聚化導致引起細胞增殖或分化的途徑的激活。該基因的擴增和/或其蛋白的過表達已在多種癌癥中得以報道，包括前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、和乳腺腫瘤。已經表征了編碼不同同種型的可變轉錄剪接變體。一種同種型缺少膜間區，并且分泌到細胞外。這種形式起作用調節膜結合形式的活性(Corfas，G.，等，7 (6) (2004)575-80)。認為ERBB3被活化時成為二聚化的底物并且隨后被ERBBl，ERBB2和ERBB4磷酸化。與多種受體酪氨酸-激酶相似，ERBB3被細胞外配體激活。已知結合ERBB3的配體包括調蛋白。 特異性結合人ErbB-3的抗原結合位點，且特別是重鏈可變結構域(VH)和/或抗體輕鏈可變結構域(VL)可以來源于a)已知的抗-ErbB-3抗體，如例如在WO 97/35885, WO 2007/077028或WO 2008/100624中所述，b)通過使用特別是人ErbB_3蛋白或核酸或其片段的從頭(de novo)免疫法或通過噬菌體展示獲得的新的抗_ErbB_3抗體。MET(間充質-上皮轉變因子)是一種原癌基因，其編碼蛋白質MET，(也已知為c-Met ；肝細胞生長因子受體HGFR ；HGF受體；分散因子受體；SF受體；SEQ ID NO 45) (Dean, Μ.,等，自然(Nature) 318 (1985) 385-8 ;Chan，Α· Μ·，等，癌基因 (Oncogene) 1 (1987) 229-33 ；Bottaro, D. P.，等，科學(Science) 251 (1991) 802-4 ；Naldini, L.，等，EMBO 雜志(ΕΜΒ0 J.) 10 (1991) 2867-78 ；Maulik, G.，等，細胞因子生長因子綜述 (Cytokine Growth Factor Rev.) 13 (2002) 41-59)。MET 是胚胎發育和傷口愈合必需的膜受體。肝細胞生長因子(HGF)是MET受體僅有的已知配體。MET被上皮來源的細胞正常表達， 而HGF的表達局限于間充質來源的細胞。經HGF刺激，MET誘導數種生物學反應，它們共同產生已知為侵襲性生長的程序。癌癥中異常的MET活化與差的預后相關，在此異常活性的 MET引發腫瘤生長，形成向腫瘤供應營養素的新血管(血管生成)，以及癌癥擴散到其它器官(轉移)。MET在許多類型的人惡性腫瘤中下調，所述人惡性腫瘤包括腎癌、肝癌、胃癌、 乳腺癌和腦癌。通常，僅有干細胞和祖細胞表達MET，其允許這些細胞侵襲性生長以便在胚胎中產生新組織或在成人中再生受損傷的組織。然而，認為癌癥干細胞劫持了正常干細胞表達MET的能力，因此成為癌癥持續和擴散到身體中的其它部位的原因。特異性結合人c-Met的抗原結合位點，且特別是重鏈可變結構域(VH)和/或抗體輕鏈可變結構域(VL)，可以來源于a)已知的抗-c-Met抗體，如例如在US 5686292， US 7476724， WO 2004072117， WO 2004108766， WO 2005016382， WO 2005063816， WO 2006015371，WO 2006104911, WO 2007126799，或 WO 2009007427 中所述的抗體，b)例如通過使用特別是人抗-c-Met蛋白或核酸或其片段的從頭免疫法或通過噬菌體展示獲得的新的抗-c-Met抗體。本發明的另一個方面是選擇本發明所述的雙特異性抗體的方法，其包括下述步驟a)與不存在抗體時ErbB-3的內在化相比較，在流式細胞術測定(FACS)中2小時后，測量由雙特異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體誘導的A431細胞(ATCC No. CRL-1555)上的ErbB-3內在化，b)在不存在抗體時，在流式細胞術測定(FACS)中測量A431細胞(ATCCNo. CRL-1555)上的 ErbB_3 內在化，c)選擇與不存在抗體時ErbB-3的內在化相比，在抗體暴露2小時后在A431細胞上表現出不超過15%的ErbB-3內在化的雙特異性抗體。在一個實施方案中，選擇表現出不超過10%的ErbB-3內在化的雙特異性抗體。在一個實施方案中，選擇表現出不超過7%的ErbB-3內在化的雙特異性抗體。在一個實施方案中，選擇表現出不超過5%的ErbB-3內在化的雙特異性抗體。本發明的另一個方面是選擇本發明所述的雙特異性抗體的方法，其包括下述步驟a)與不存在抗體時ErbB-3的內在化相比較，在流式細胞術測定(FACS)中2小時后，測量由雙特異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體誘導的A431細胞(ATCC No. CRL-1555)上的ErbB-3內在化，b)在流式細胞術測定(FACS)中2小時后測量由相對應的單特異性抗_ErbB_3抗體誘導的A431細胞(ATCC No. CRL-1555)上的ErbB-3內在化，c)選擇與由相對應的單特異性親本ErbB-3抗體誘導的ErbB_3的內在化相比， (在A431細胞上2小時后)將ErbB-3內在化減少50%以上的雙特異性抗體。在一個實施方案中，選擇與相對應的單特異性親本ErbB-3抗體誘導的ErbB_3的內在化相比，將ErbB-3內在化減少60%以上的雙特異性抗體。在一個實施方案中，選擇與相對應的單特異性親本ErbB-3抗體誘導的ErbB-3的內在化相比，將ErbB-3內在化減少 70%以上的雙特異性抗體。在一個實施方案中，選擇與相對應的單特異性親本ErbB-3抗體誘導的ErbB-3的內在化相比，將ErbB-3內在化減少80%以上的雙特異性抗體。本發明的另一方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，i)所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 53的⑶R3H區， SEQ ID NO 54的⑶R2H區和SEQ ID NO 55的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 56 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 59的⑶RlL區；和所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 66的 CDR3H區，SEQ ID NO 67的CDR2H區和SEQ ID NO 68的CDRlH區，和在輕鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 區；ii)所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 60的⑶R3H區， SEQ ID NO 61的⑶R2H區和SEQ ID NO 62的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 63 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 66的⑶RlL區；和所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 66的 CDR3H區，SEQ ID NO 67的CDR2H區和SEQ ID NO 68的CDRlH區，和在輕鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 區。本發明的另一個方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 53的⑶R3H區，SEQID NO :54的CDR2H區和SEQ ID NO :55的CDRlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 56 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 59 的 ⑶RlL區；和所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H區， SEQ ID NO 67的⑶R2H區和SEQ ID NO 68的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 區。

本發明的另一個方面是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 60的⑶R3H區，SEQ ID NO :61的⑶R2H區和SEQ ID NO :62的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 63 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 66的⑶RlL區；和所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 66的⑶R3H 區，SEQ ID NO 67的⑶R2H區和SEQ ID NO 68的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 區。所述雙特異性抗體優選地特征在于i)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 47和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :48，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；ii)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID N0:49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :50，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；iii)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；iv)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :52，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；或ν)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO :1和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :2，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；或優選地，所述雙特異性抗體特征在于所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :4。抗體特異性指抗體對于抗原特定表位的選擇性識別。例如，天然抗體是單特異性的。根據本發明所述的“雙特異性抗體”是具有兩種不同的抗原結合特異性的抗體。如果抗體具有超過一種的特異性，識別的表位可以與單抗原或多于一種的抗原相關。本發明的抗體特異于兩種不同的抗原，即作為第一抗原的ErbB-3和作為第二抗原的c-Met。用于本文時，術語“單特異性”抗體指具有一個或多個分別結合于相同抗原的相同表位的結合位點的抗體。術語“價”在本申請中使用時指在抗體分子上存在的結合位點的具體數量。因此， 術語“二價”、“四價”、和“六價”分別指在抗體分子上存在兩個結合位點、四個結合位點、和六個結合位點。本發明所述的雙特異性抗體是至少“二價的”，并且可以是“三價”或“多價” 的(例如(“四價”或六價)的)。本發明的抗體的抗原結 合位點可包含六個互補性決定區(CDRs)，其在不同程度上有助于結合位點對于抗原的親和力。存在三個重鏈可變結構域CDRs (CDRH1，CDRH2和 ⑶RH3)和三個輕鏈可變結構域⑶Rs (⑶RL1，⑶RL2和⑶RL3)。⑶R和構架區(FRs)的程度通過與氨基酸序列的匯編數據庫進行比較來確定，所述氨基酸序列中那些區域根據序列之間的可變性來確定。此外，還包括在本發明范圍內的是包含更少CDRs的功能性抗原結合位點(即，在結合特異性由三個、四個或五個CDRs決定的情形中)。例如，少于6個CDRs的完整組對于結合可能是足夠的。在一些情形中，VH或VL結構域是足夠的。如例如，在EP 申請號 07024867. 9，EP 申請號 07024864. 6，EP 申請號 07024865. 3 或 Ridgway，J. B.，蛋白質工程(Protein Eng.) 9 (1996) 617-621 ；WO 96/027011 ；Merchant, A.M，等，自然生物技術(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ；Atwel 1, S.，等，分子生物學雜志(J. Mol. Biol.) 270 (1997) 26-35 和 EP 1870459A1 中所述，可以使用針對人 ErbB_3 和人 c-Met的包含免疫球蛋白恒定區的IgG樣雙特異性、二價抗體。術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時，指單一氨基酸組成的抗體分子制劑。術語“嵌合抗體”指這樣的抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區，即結合區， 以及源自不同來源或物種的恒定區的至少一部分，其通常通過重組DNA技術進行制備。優選包括鼠可變區和人恒定區的嵌合抗體。本發明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優選形式是這樣的那些，其中恒定區已經被從初始抗體的恒定區開始進行修飾或改變以產生本發明所述的特性，特別是關于Clq結合和/或Fc受體(FcR)結合的特性。也將這種嵌合抗體稱作“類別轉換抗體”。嵌合抗體是被表達的免疫球蛋白基因的產物，該基因包括編碼免疫球蛋白可變區的DNA區段和編碼免疫球蛋白恒定區的DNA區段。制備嵌合抗體的方法包括目前在本領域眾所周知的常規重組DNA和基因轉染技術。見，例如，Morrison，S. L.，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 US5, 204，244。術語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構架或“互補性決定區”(CDR)已經被修飾為包括與親本免疫球蛋白相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在一個優選實施方案中， 將鼠⑶R移植到人抗體的構架區以制備“人源化抗體”。見，例如，Riechmann, L.，等，自然 (Nature) 332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger，Μ. S.，等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270。特別優選的CDRs對應于識別以上指出的關于嵌合抗體的抗原的那些代表性序列。本發明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是這樣的那些，其中恒定區已經另外被從初始抗體的恒定區開始進行修飾或改變以產生本發明所述的特性，特別是關于Clq結合和/或Fc受體(FcR) 結合的特性。用于本文時，術語“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。人抗體是現有技術中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., 當前化學生物學觀點(Curr. Opin. Chem. Biol.) 5 (2001) 368-374)。人抗體還可以在轉基因動物(例如小鼠)中產生，所述轉基因動物在免疫時能夠在缺乏內源免疫球蛋白生成的條件下產生人抗體的全部所有組成成分或選擇部分(selection)。在所述種系突變小鼠中轉移人種系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原攻擊時產生人抗體(見，例如JakobovitsA.， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院學報)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, M. D.，等，Year Immunol.(免疫學年度)7 (1993) 33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫中產生(Hoogenboom，H. R.，和 Winter, G.，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)222 (1991) 581-597)。Cole, Α.，等和Boerner, P.，等的技術也可以用于制備人單克隆抗體(Cole，Α.，等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Liss, A. L.，ρ· 77(1985)；和 Boerner, P.，等，J. Immunol.(免疫學雜志)147 (1991) 86-95)。如已經對本發明所述的嵌合和人源化抗體所提及地，術語“人抗體”用于本文中時還包括這樣的抗體，其在恒定區內進行修飾以產生本發明所述的特性，特別是關于Clq結合和/或FcR結合的特性，例如通過“類別轉換”即改變或突變Fc部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突變)進行。用于本文時，術語“重組人抗體”意欲包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的所有人抗體，諸如分離自宿主細胞，諸如NSO或CHO細胞的抗體或分離自人免疫球蛋白基因的轉基因動物(例如小鼠)的抗體，或利用轉染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體。 這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區和恒定區。本發明所述的重組人抗體已經經歷了體內體細胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列是這樣的序列，所述序列盡管源自并涉及人種系VH和VL序列，但在體內可能不天然存在于人抗體種系所有組成成分中。“可變結構域”(輕鏈的可變結構域(VL)，重鏈的可變區(VH))用于本文中時，表示直接參與抗體與抗原結合的每對輕鏈和重鏈對。可變人輕鏈和重鏈的結構域具有相同的一般結構且每個結構域包括4個構架(FR)區，所述構架區的序列普遍保守，其通過3個“高變區”(或互補性決定區，⑶Rs)相連接。構架區采用β-折疊構象且⑶Rs可以形成連接 β-折疊結構的環。每條鏈中的CDRs通過構架區以其三維結構保持并與來自另一條鏈的 CDRs 一起形成抗原結合位點。抗體重鏈和輕鏈CDR3區在本發明所述的抗體的結合特異性 /親和力方面發揮特別重要的作用并因此提供本發明的另一個目的。用于本文時，術語“高變區”或“抗體的抗原結合部分或抗原結合位點”指抗體負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區包括來自“互補性決定區”或“CDRs”的氨基酸殘基。“構架”或“FR”區是除本文中定義的高變區殘基之外的那些可變結構域區域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N端到C端包括結構域FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。各條鏈上的⑶Rs 通過所述構架氨基酸分開。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結合的區域。按照Kabat 等，免疫目的的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公眾健康服務，全國衛生研究所(Public Health Service, National Institutes of Health)，Bethesda, MD (1991))的標準定義來確定CDR和FR區域。用于本文時，術語“結合”或“特異性結合”指在體外測定法中，優選地在使用純化的野生型抗原的等離振子共振測定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，抗體與抗原(人ErbB-3或人c-Met)的表位的結合。結合的親和力由術語ka(來自抗體/抗原復合物的抗體的締合的速率常數)，kD(解離常數)和KD(kD/ka)定義。結合或特異性結合意為10_8mol/l以下，優選地10_9M到10_13mol/l的結合親和力(Kd)。因此，本發明所述的雙特異性<ErbB3-C-Met>抗體特異性結合每種抗原，對于每種抗原其是特異性的，具有10_8mol/ 1以下，優選地10、到10_13mOl/l的結合親和力(Kd)。抗體與FcyRIII的結合可以通過 BIAcore測定法(GE-Healthcare，Uppsala，瑞典)進行研究。結合的親和力由術語ka (來自抗體/抗原復合物的抗體的締合的速率常數)，kD (解離常數)和KD(kD/ ka)定義。術語“表位”包括能夠特異性結合抗體的任何多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學活性表面分組(groupings)，諸如氨基酸、糖側鏈、磷酰基或磺酰基，在某些實施方案中，可以具有特定的三維結構特征，和或特定的帶電特征。表位是被抗體結合的抗原區域。在某些實施方案中，當抗體在蛋白和/或大分子的復雜混合物中優先識別其靶抗原時，將該抗體稱為與抗原特異性結合。術語“恒定區”用于本申請時指除了可變區之外的抗體的結構域的總和。恒定區不直接參與抗原的結合，但是顯示不同的效應子功能。取決于它們重鏈的恒定區的氨基酸序列，抗體被分為下述類別IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，并且這些中的一些可以被進一步分為亞類，如IgGl，IgG2，IgG3，和IgG4，IgAl和IgA2。對應于不同種類的抗體的重鏈恒定區分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。可以在所有5種抗體種類中發現的輕鏈恒定區被稱為 κ (kappa)禾口 λ (lambda)。術語“來自人來源的恒定區”在本申請中使用時，指亞類IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4 的人抗體的恒定重鏈區和/或恒定輕鏈κ或λ區域。這樣的恒定區是現有技術中公知的并且例如由Kabat, Ε. Α.，描述(見，例如Johnson, G.和ffu, Τ. T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.) 28 (2000) 214-218 ;Kabat，Ε. Α.，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)72(1975)2785-2788)。在一個實施方案中，本發明所述的雙特異性抗體包含IgGl或IgG3亞類(優選 IgGl亞類)的恒定區，其優選地來自人來源。在一個實施方案中，本發明所述的雙特異性抗體包含IgGl或IgG3亞類(優選IgGl亞類)的Fc部分，其優選地來自人來源。抗體的恒定區直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用)和CDC(補體依賴的細胞毒性)。補體激活(CDC)由補體因子Clq與大多數IgG抗體亞類的恒定區結合而起始。Clq與抗體的結合由在所謂的結合位點的定義的蛋白-蛋白相互作用所導致。這樣的恒定區結合位點在現有技術中是已知的，并且例如由Lukas，Τ. J.，等，免疫學雜志(J. Immunol.) 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.，和 Cebra, J. J.，分子免疫學 (Mol. Immunol.) 16(1979)907-917 ；Burton, D. R.,等，自然(Nature)288(1980)338-344 ； Thommesen, J.E.，等，分子免疫學(Mol. Immunol.) 37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, Ε. E.， 等，免疫學雜志(J. Immunol.) 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, Μ.，等，病毒學雜志 (J. Virol.) 75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, Α.，等，免疫學(Immunology) 86 (1995) 319-324 ； 和EP 0307434所描述。例如，所述恒定區結合位點特征在于氨基酸L234，L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根據 Kabat 的 EU 索引編號)。術語“抗體依賴性細胞毒作用(ADCC) ”指在存在效應細胞時，由本發明所述的抗體裂解人靶細胞。ADCC優選地通過用本發明所述的抗體在存在效應細胞時處理表達ErbB3和c-Met的細胞的制備物進行測量，所述效應細胞如新鮮分離的PBMC或來自暗黃覆蓋層的純化的效應細胞，如單核細胞或天然殺傷(NK)細胞或永久生長的NK細胞系。術語“補體依賴的細胞毒性(CDC) ”指由補體因子Clq與大多數IgG抗體亞類的Fc部分結合而起始的過程。Clq與抗體的結合由在所謂的結合位點的限定的蛋白-蛋白相互作用所導致。這些 Fc部分結合位點是現有技術已知的(見上)。例如，這些Fc部分結合位點特征在于氨基酸 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根據 Kabat 的 EU 索引編號)。亞類IgGl，IgG2，和IgG3的抗體通常顯示包括Clq和C3結合的補體激活，而IgG4不激活補體系統并且不結合Clq和/或C3。單克隆抗體的細胞介導的效應子功能可以通過改造它們的寡糖成分而得以增強，如在 Umana, P.，等，自然生物技術(Nature Biotechnol.) 17(1999) 176-180， 和US 6，602，684中所述。IgGl型抗體是最常用的治療性抗體，其是在每個CH2結構域的Asn297處具有保守的N-連接的糖基化位點的糖蛋白。與Asn297附著的兩個復合雙分支(biantermary)寡糖包埋在CH2結構域之間，形成了與多肽主鏈的廣泛接觸，并且它們的存在對于抗體介導效應子功能諸如抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，Μ. R.，等，糖生物學(Glycobiology) 5 (1995) 813-822 ； Jefferis, R.,等，免疫學綜述(Immunol Rev.) 163 (1998) 59-76 ；Wright, Α.,和 Morrison, S. L.，生物技術趨勢(Trends Biotechnol.) 15(1997)26-32)。Umana, P.， 等，自然生物技術(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180 和 WO 99/54342 顯示， β (1,4)-N-乙酰葡糖胺轉移酶III( “GnTIII”)，一種催化平分型(bisected)寡糖形成的糖基轉移酶，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中的過量表達，顯著增加了抗體的體外ADCC活性。在Asn297糖的組成上的改變或其消除也影響Fc γ R和Clq的結合(Umana, P.，等，自然生物技術(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180 ；Davies, J., 等，生物技術生物工程(Biotechnol. Bioeng.) 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.， 等，生物化學雜志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 45539-45547 ；Radaev, S.，等，生物化學雜志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 16478-16483 ；Shields, R. L.，等，生物化學雜志 (J. Biol. Chem.) 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.，等，生物化學雜志(J.Biol. Chem.) 277 (2002) 26733-26740 ；Simmons, L. C.，等，免疫學方法雜志(J. Immunol. Methods)263(2002)133-147)。通過降低巖藻糖的量增強單克隆抗體的細胞介導的效應子功能的方法例如記述在 WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735， WO 2005/027966, WO 1997/028267， US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739, Niwa, R.，等，免疫方法雜志 (J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa,T.，等，生物化學雜志(J Biol Chem), 278(2003)3466-3473 ；WO 03/055993 或 US 2005/0249722 中。令人吃驚地，本發明所述的雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體與其親本<ErbB3>和/ 或<c-Met>抗體相比表現出ErbB-3受體內在化的強烈減少。(見

圖18，實施例8和表格)。 因此，在本發明的一個優選實施方案中，所述雙特異性抗體是在Asn297處用糖鏈糖基化的 (IgGl或IgG3亞類)，其中在所述糖鏈中的巖藻糖的量是65%以下(根據Kabat的編號)。 在另一個實施方案中，在所述糖鏈中的巖藻糖量在5% -65%，優選地20%-40%o根據本發明所述的“Asn297”意為在Fc區域中位于約位置297的氨基酸天冬酰胺。基于抗體的微小序列變化，Asn297也可以在定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超過士3 個氨基酸)，即在位置294-300之間。所述糖改造的抗體在本文中也稱為異常巖藻糖基化的抗體。人IgGl或IgG3在 Asn297發生糖基化，該糖基化作為核心巖藻糖基化的雙分支復合寡糖糖基化，末端為多至兩個Gal殘基。IgGl或IgG3亞類的人恒定重鏈區由 Kabat, Ε· A. ， ·， 貞目的胃白；^歹Ij (Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公眾健康服務(Public Health Service)，全國衛生研究所 (National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991),禾口由 Bruggemann, Μ.,等， 實驗醫學雜志(J. Exp. Med.) 166 (1987) 1351-1361 ；Love, Τ. W.，等，酶學方法(Methods Enzymol.) 178 (1989) 515-527中詳細報道。根據末端Gal殘基的量，將這些結構稱為GO， Gl (α-1，6-或 0-1，3-)，或62聚糖殘基(Raju, Τ. S.，Bioprocess Int. 1(2003)44-53)。 例如，抗體Fc部分的CHO型糖基化由Routier，F. H.，糖綴合物雜志(Glycoconjugate J.) 14(1997) 201-207描述。在未進行糖修飾的CHO宿主細胞中重組表達的抗體通常以至少 85%的量在Asn297進行巖藻糖基化。全長親本抗體的修飾的寡糖可以是雜合型的或復合型的。優選地，所述平分型的、減少的/未-巖藻糖基化的寡糖是雜合型的。在另一個實施方案中，所述平分型的、減少的/未_巖藻糖基化的寡糖是復合型的。根據本發明，“巖藻糖的量”意為與在Asn297附著的所有糖結構的總和(例如， 復合型、雜合型和高甘露糖型結構)相比的在Asn297的糖鏈中所述糖的量，所述糖的量通過MALDI-T0F質譜測量并且計算為平均值。巖藻糖的相對量是包含巖藻糖的結構相對于在 N-糖苷酶F處理的樣品中由MALDI-T0F鑒定的所有糖結構(例如，分別為復合型、雜合型和低聚_與高甘露糖型結構)的百分比(關于確定巖藻糖量的詳細步驟，見實施例14)。本發明所述的異常巖藻糖基化雙特異性抗體可以在糖修飾的宿主細胞中表達，所述糖修飾的宿主細胞被改造以足以部分巖藻糖基化Fc區中的寡糖的量表達至少一種編碼具有GnTIII活性的多肽的核酸。在一個實施方案中，所述具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。備選地，根據US 6，946，292，宿主細胞的α 1，6_巖藻糖基轉移酶活性可以減少或消除，從而產生糖修飾的宿主細胞。抗體巖藻糖基化的量可以預先確定，例如，通過發酵條件(例如，發酵時間)或通過組合至少兩種具有不同巖藻糖基化量的抗體預先確定。所述異常巖藻糖基化的抗體和各自的糖改造方法記述在WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875，Umana, P.，等，Nature Biotechnol.(自然生物技術)17 (1999) 176-180， WO 99/154342，WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2005/011735，WO 2005/027966， WO 97/028267， US 2006/0134709， US 2005/0054048, US 2005/0152894， WO 2003/035835，WO 2000/061739中。這些糖改造的抗體具有提高的ADCC。產生本發明所述的異常巖藻糖基化的抗體的其它糖改造法例如記述在Niwa，R.，等，J. Immunol. Methods (免疫學方法雜志)306 (2005) 151-160 ;Shinkawa，Τ·，等，J Biol Chem(生物化學雜志)， 278(2003)3466-3473 ；WO 03/055993 或 US 2005/0249722 中。一個實施方案是制備IgGl或IgG3亞類的雙特異性抗體的方法，所述抗體在Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈中的巖藻糖的量為65%以下，該方法使用在WO 2005/044859， WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P.，等，Nature Biotechnol.(自然生物技術)17(1999) 176-180，WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260， WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894, WO 2003/035835 或 WO 2000/061739 中描述的程序。一個實施方案是制備IgGl或IgG3亞類的雙特異性抗體的方法，所述抗體在 Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈中的巖藻糖的量為65%以下，該方法使用在Niwa，R.， 等，免疫學方法雜志(J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa, Τ.，等，生物化學雜志(J Biol Chem), 278 (2003) 3466-3473 ；WO 03/055993 或US 2005/0249722 中描述的程序。在一個實施方案中，本發明所述的抗體在Α549細胞中抑制HGF-誘導的c_Met受體磷酸化(見實施例2中所述)。在一個實施方案中，本發明所述的抗體在MCF7細胞中以lyg/ml的濃度抑制 HRG(Herregulin)-誘導的Her3受體磷酸化至少70% (如在實施例3中所述)(與作為對照的HRG相比)。在一個實施方案中，本發明所述的抗體以12，5yg/ml的濃度抑制HGF-誘導的 HUVEC細胞增殖至少40% (如在實施例4中所述)(與作為對照的單獨的HGF相比)。雙特異性抗體形式本發明的抗體具有兩個以上的結合位點，并且是雙特異性的。即，即使是在存在多于兩個結合位點(即，抗體是三價或多價的)的情形中，所述抗體可以是雙特異性的。本發明的雙特異性抗體包括，例如多價單鏈抗體、雙抗體和三鏈抗體，以及具有全長抗體的恒定結構域結構的抗體，另外的抗原結合位點(例如單鏈Fv、VH結構域和/或VL結構域，Fab, 或(Fab)2)通過一個或多個肽接頭連接所述全長抗體的恒定結構域結構。所述抗體可以是來自單一物種的全長抗體，或可以是嵌合化或人源化的。對于具有超過兩個抗原結合位點的抗體，一些結合位點可以是相同的，只要所述蛋白具有對于兩個不同抗原的結合位點。 即，當第一結合位點特異于ErbB-3時，第二結合位點特異于c-Met，反之亦然。在一個優選的實施方案中，根據本發明的特異性結合人ErbB-3和人c_Met的雙特異性抗體包含抗體的Fc區。所述抗體保留特性這意味著在一個實施方案中全長的二價雙特異性形式針對人ErbB-3和人c-Met的包含免疫球蛋白恒定區的雙特異性、二價抗體可如，例如 WO 2009/080251，WO 2009/080252, WO 2009/080253 或 Ridgway, J. B.，蛋白質工程(Protein Eng.) 9 (1996) 617-621 ；WO 96/027011 ；Merchant, A.M.，等，自然生物技術(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ； Atwel 1, S.，等，分子生物學雜志(J. Mol. Biol.) 270 (1997) 26-35 和 EP 1870459A1 中的描述進行使用。因此在本發明的一個實施方案中，本發明所述的雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體是二價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結合人ErbB-3的全長抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合人c-Met的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中恒定結構域CL和CH1、和/或可變結構域VL和VH被相互替換。在本發明的另一個實施方案中，本發明所述的雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體是二價、雙特異性抗體，其包含
a)特異性結合人c-Met的全長抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合人ErbB-3的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中恒定結構域CL和CH1、和/或可變結構域VL和VH被相互替換。對于如下所述的“凸起-進入-孔洞(knob-into-holes)，，技術的示例性圖解結構，參見圖2a_c。為了提高這種異二聚體的二價的、雙特異性的抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體的產量，所述全長抗體的CH3結構域可以通過“凸起_進入-孔洞，，技術改變，該技術用例如WO 96/027011，Ridgway J. B.，等，Protein Eng (蛋白質工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant， A.M.，等，Nat BiotechnoK自然生物技術)16 (1998) 677-681中的若干實例詳細記述。在該方法中，改變兩個CH3結構域的相互作用表面，以增加包含這兩個CH3結構域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3結構域之一可以是“凸起”，而另一個是“孔洞”。二硫鍵的引入穩定該異二聚體(Merchant, A.M，等，Nature Biotech(自然生物技術)16 (1998) 677-681 ；Atwell, S.，等·，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)270 (1997) 26-35) 并增加產率。因此，在本發明的一個方面，所述二價雙特異性抗體進一步特征在于一條重鏈的CH3結構域和另一條重鏈的CH3結構域分別在包括抗體CH3結構域之間的初始界面的界面處相接；其中改變所述界面以促進二價雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結構域，由此，在與二價雙特異性抗體內的另一條重鏈的CH3結構域的初始界面相接的一條重鏈的CH3結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較大側鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結構域的界面內生成突起，該突起可以定位在另一條重鏈的CH3結構域的界面內的凹洞中；并且b)改變另一條重鏈的CH3結構域，由此，在與二價雙特異性抗體內的第一 CH3結構域的初始界面相接的第二 CH3結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較小側鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結構域的界面內生成凹洞，第一 CH3結構域的界面內的突起可以定位在該凹洞中。優選地，所述具有較大側鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)組成的組。優選地，所述具有較小側鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，纈氨酸(V)組成的組。在本發明的一個方面中，通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結構域相應位置處的氨基酸，進一步改變這兩個CH3結構域，從而可以形成兩個CH3結構域之間的二硫鍵。在優選實施方案中，所述二價雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結構域中的T366W突變和在“孔洞鏈”CH3結構域中的T366S，L368A，Y407V突變。還可以使用在CH3結構域之間的另外的鏈間二硫鍵(Merchant，Α. Μ.，等，自然生物技術(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681)，例如，通過向“凸起鏈” CH3結構域中引入Y349C突變和向“孔洞鏈” CH3結構域中引入E356C突變或S354C突變。因此，在另一個優選的實施方案中，所述二價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中的一個中包含Y349C，T366W突變，在這兩個CH3 結構域中的另一個中包含E356C，T366S，L368A，Y407V突變，或所述二價雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C，T366S，L368A，Y407V突變(在一個CH3結構域中的另外的Y349C突變與在另一個CH3結構域中的另外的E356C或S354C突變形成鏈間二硫鍵)(總是根據Kabat的EU索引編號)。但是，也可以備選或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技術。所述二價、雙特異性抗體的優選實例是在“凸起鏈”CH3結構域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的D399K ；E357K突變(總是根據Kabat的EU索引編號)。在另一個優選的實施方案中，所述二價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結構域中的T366W突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的T366S，L368A，Y407V突變，并且額外地， 包含在“凸起鏈” CH3結構域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的D399K ； E357K突變。在另一個優選的實施方案中，所述二價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，或者所述二價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C， T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，并且額外地，包含在“凸起鏈” CH3結構域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的 D399K ；E357K 突變。表達和純化的以表5和圖7所述的形式存在的二價雙特異性抗體的實例記述在下述實施例中(例如，見表5和圖7)。三價雙特異性形式本發明的另一個優選方面是三價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結合人ErbB-3并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成的全長抗體； 和b)特異性結合人c-Met的一個單鏈Fab片段，其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于如下所述的“凸起-進入-孔洞”技術的示例性圖解結構，參見圖5a。本發明的另一個優選方面是三價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結合人ErbB-3并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成的全長抗體； 和b)特異性結合人c-Met的一個單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于如下所述的“凸起-進入-孔洞”技術的示例性圖解結構，參見圖5b。因此，表達并純化具有表1中的scFv-Ab-命名的相對應的三價、雙特異性抗體 (見下述實施例)。 在一個優選的實施方案中，所述結合人C-Met的單鏈Fab或Fv片段通過肽連接體在所述全長抗體的重鏈的C-末端融合到所述全長抗體。本發明的另一個優選方面是三價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結合人ErbB-3并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成的全長抗體； 和b)由下述組成的多肽 ba)抗體重鏈可變結構域(VH)；或bb)抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體恒定結構域1 (CHl)，其中所述多肽的VH結構域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的一條重鏈的C端；C)由下述組成的多肽ca)抗體輕鏈可變結構域(VL)，或cb)抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體輕鏈恒定結構域(CL)；其中所述多肽的VL結構域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的另一條重鏈的C端；并且其中b)中所述多肽的抗體重鏈可變結構域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結構域(VL) —起形成特異性結合人c-Met的抗原結合位點。優選地，b)和C)中所述的肽連接體是相同的，并且是至少25個氨基酸的肽，優選在30和50個氨基酸之間的肽。對于示例性圖解結構參見圖3a_c。因此，表達并純化具有表4中的VHVL-Ab-命名的相對應的三價、雙特異性抗體 (見下述實施例和圖3c)。任選地，b)中所述多肽的抗體重鏈可變結構域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結構域(VL)通過鏈間二硫鍵連接并得以穩定，所述鏈間二硫鍵通過在下述位置之間引入二硫鍵形成i)重鏈可變結構域位置44到輕鏈可變結構域位置100，ii)重鏈可變結構域位置105到輕鏈可變結構域位置43，或iii)重鏈可變結構域位置101到輕鏈可變結構域位置100 (總是根據Kabat的EU 索引編號)。例如，引入用于穩定的非天然二硫鍵的技術記述在WO 94/029350，Rajagopal, V.，等，蛋白質工程(Prot. Engin.) (1997) 1453-59 ；Kobayashi, H.，等，核醫學和生物學(Nuclear Medicine & Biology) Vol. 25，(1998) 387-393 ；或 Schmidt，Μ·，等，癌基因 (Oncogene) (1999) 18,1711-1721中。在一個實施方案中，在b)和c)中所述多肽的可變結構域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結構域位置44和輕鏈可變結構域位置100之間。在一個實施方案中，在b)和c)中所述多肽的可變結構域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結構域位置105和輕鏈可變結構域位置43之間。(總是根據Kabat的EU索引編號)在一個實施方案中，優選在單鏈Fab片段的可變結構域VH和VL之間沒有所述任選的二硫化物穩定的三價、雙特異性抗體。通過將單鏈Fab、Fv片段融合到一條重鏈上(圖5a或5b)或通過將不同多肽融合到全長抗體的兩條重鏈上(圖3a_c)，產生異二聚化的、三價雙特異性抗體。為了提高這種異二聚化的三價的、雙特異性的抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體的產量，所述全長抗體的CH3結構域可以通過“凸起-進入-孔洞”技術改變，該技術用例如WO 96/027011， Ridgway J. B.，等，Protein Eng (蛋白質工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant，A.M.，等， Nat BiotechnoK自然生物技術)16 (1998) 677-681中的若干實例詳細記述。在該方法中， 改變兩個CH3結構域的相互作用表面，以增加包含這兩個CH3結構域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3結構域之一可以是“凸起”，而另一個是“孔洞”。二硫鍵的引入穩定該異二聚體(Merchant, Α. M，等，Nature Biotech (自然生物技術)16 (1998) 677-681 ； Atwell，S.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物學雜志)270 (1997) 26-35)并增加產率。因此，在本發明的一個方面，所述三價雙特異性抗體進一步特征在于全長抗體的一條重鏈的CH3結構域和該全長抗體的另一條重鏈的CH3結構域分別在包括抗體CH3結構域之間的初始界面的界面處相接；其中改變所述界面以促進二價雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結構域，由此，在與二價雙特異性抗體內的另一條重鏈的CH3結構域的初始界面相接的一條重鏈的CH3結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較大側鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結構域的界面內生成突起，該突起可以定位在另一條重鏈的CH3結構域的界面內的凹洞中；并且b)改變另一條重鏈的CH3結構域，由此，在與三價雙特異性抗體內的第一 CH3結構域的初始界面相接的第二 CH3結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較小側鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結構域的界面內生成凹洞，第一 CH3結構域的界面內的突起可以定位在該凹洞中。優選地，所述具有較大側鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)組成的組。優選地，所述具有較小側鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，纈氨酸(V)組成的組。在本發明的一個方面中，通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結構域相應位置處的氨基酸，進一步改變這兩個CH3結構域，從而可以形成兩個CH3結構域之間的二硫鍵。在優選實施方案中，所述三價雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結構域中的T366W突變和在“孔洞鏈”CH3結構域中的T366S，L368A，Y407V突變。還可以使用在CH3結構域之間的另外的鏈間二硫鍵(Merchant，Α. Μ.，等，自然生物技術(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681)，例如，通過向“凸起鏈” CH3結構域中引入Y349C突變和向“孔洞鏈”CH3結構域中引入E356C突變或S354C突變。因此，在另一個優選的實施方案中，所述三價雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個 CH3結構域中的另一個中的E356C，T366S，L368A，Y407V突變，或所述三價雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C，T366S，L368A，Y407V突變(在一個CH3結構域中的另外的Y349C突變與在另一個CH3結構域中的另外的E356C或S354C突變形成鏈間二硫鍵)(總是根據Kabat的EU索引編號)。但是，也可以備選或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技術。所述三價、雙特異性抗體的優選實例是在“凸起鏈”CH3結構域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的D399K ；E357K突變(總是根據Kabat的EU索引編號)。在另一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結構域中的T366W突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的T366S，L368A，Y407V突變，并且額外地， 包含在“凸起鏈” CH3結構域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的D399K ； E357K突變。在另一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，或者所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C， T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，并且額外地，包含在“凸起鏈” CH3結構域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的 D399K ；E357K 突變。本發明的另一個實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人ErbB-3并且由下述組成aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結構域(VH)，抗體恒定重鏈結構域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(HR)，抗體重鏈恒定結構域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結構域3(CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結構域(VL)，和抗體輕鏈恒定結構域(CL) (VL-CL)組成；和b) 一個特異性結合人c-Met的單鏈Fab片段，其中所述單鏈Fab片段由抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體恒定結構域1 (CHl)，抗體輕鏈可變結構域(VL)，抗體輕鏈恒定結構域(CL)和接頭組成，并且其中所述抗體結構域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一ba) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 bb) VL-CL-接頭-VH-CH1 ；其中所述接頭是至少30個氨基酸的肽，優選在32和50個氨基酸殘基之間的肽；并且其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C-或N-末端(優選重鏈的C-末端)融合到所述全長抗體；其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優選在10和50個氨基酸之間的肽。在這一實施方案中，優選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的T366S，L368A, Y407V突變，并且更優選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變。任選地，在所述實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈”CH3結構域中的R409D ； K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的D399K ；E357K突變。本發明的另一個實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人ErbB-3并且由下述組成aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結構域(VH)，抗體恒定重鏈結構域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(HR)，抗體重鏈恒定結構域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結構域3(CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結構域(VL)，和抗體輕鏈恒定結構域(CL) (VL-CL)組成；和b) 一個特異性結合人c-Met的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端(優選重鏈的C-末端)融合到所述全長抗體；其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優選在10和50個氨基酸之間的肽。在這一實施方案中，優選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的T366S，L368A, Y407V突變，并且更優選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變。任選地，在所述實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈”CH3結構域中的R409D ； K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的D399K ；E357K突變。因此，優選的實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人ErbB-3并且由下述組成aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結構域(VH)，抗體恒定重鏈結構域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(HR)，抗體重鏈恒定結構域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結構域3(CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結構域(VL)，和抗體輕鏈恒定結構域(CL) (VL-CL)組成；和b) 一個特異性結合人c-Met的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈的C-末端融合到所述全長抗體(產生兩抗體重鏈_單鏈Fv融合肽)；和其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽。在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO 26的多肽作為第一抗體重鏈_單鏈Fv融合肽，SEQ ID NO ,21的多肽作為第二抗體重鏈_單鏈Fv融合肽，和兩個抗體輕鏈SEQ ID NO :28ο在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO 29的多肽作為第一抗體重鏈_單鏈Fv融合肽，SEQ ID NO 30的多肽作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，和兩個抗體輕鏈SEQ ID NO :31ο在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO :32的多肽作為第一抗體重鏈_單鏈Fv融合肽，SEQ ID NO 33的多肽作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，和兩個抗體輕鏈SEQ ID NO :34ο在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO :35的多肽作為第一抗體重鏈_單鏈Fv融合肽，SEQ ID NO 36的多肽作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，和兩個抗體輕鏈SEQ ID NO :37ο在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO 38的多肽作為第一抗體重鏈_單鏈Fv融合肽，SEQ ID NO 39的多肽作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，和兩個抗體輕鏈SEQ ID NO :40ο
本發明的另一個實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人ErbB-3并且由下述組成aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結構域(VH)，抗體恒定重鏈結構域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(HR)，抗體重鏈恒定結構域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結構域3(CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結構域(VL)，和抗體輕鏈恒定結構域(CL)組成；和b)由下述組成的多肽ba)抗體重鏈可變結構域(VH)；或bb)抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體恒定結構域1 (CHl)，其中所述多肽的VH結構域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的一條重鏈的C端(產生抗體重鏈-VH融合肽)，其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優選在25和50個氨基酸之間的肽；c)由下述組成的多肽ca)抗體輕鏈可變結構域(VL)，或cb)抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體輕鏈恒定結構域(CL)；其中所述多肽的VL結構域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的另一條重鏈的C端(產生抗體重鏈-VL融合肽)；其中所述肽連接體與b)中所述肽連接體相同；并且其中b)中所述多肽的抗體重鏈可變結構域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結構域(VL) —起形成特異性結合人c-Met的抗原結合位點。在這一實施方案中，優選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的T366S，L368A, Y407V突變，并且更優選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結構域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結構域中的另一個中的S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變。任選地，在所述實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈”CH3結構域中的R409D ； K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結構域中的D399K ；E357K突變。在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO 11的多肽作為抗體重鏈-VH融合肽，SEQ ID NO 12的多肽作為抗體重鏈-VL融合肽，和兩個抗體輕鏈 SEQ ID NO :13ο在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO 14的多肽作為抗體重鏈-VH融合肽，SEQ ID NO 15的多肽作為抗體重鏈-VL融合肽，和兩個抗體輕鏈 SEQ ID NO :16。在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO 17的多肽作為抗體重鏈-VH融合肽，SEQ ID NO 18的多肽作為抗體重鏈-VL融合肽，和兩個抗體輕鏈 SEQ ID NO :19。在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO 20的多肽作為抗體重鏈-VH融合肽，SEQ ID NO :21的多肽作為抗體重鏈-VL融合肽，和兩個抗體輕鏈 SEQ ID NO :22。
在一個優選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含SEQ ID NO :23的多肽作為抗體重鏈-VH融合肽，SEQ ID NO 24的多肽作為抗體重鏈-VL融合肽，和兩個抗體輕鏈 SEQ ID NO :25。在本發明的另一個方面中，本發明所述的三價、雙特異性抗體包含a)結合人ErbB-3的全長抗體，其由兩個抗體重鏈VH-CH1-HR-CH2-CH3和兩個抗體輕鏈VL-CL組成；(其中優選地，兩個CH3結構域中的一個包含Y349C，T366W突變，并且這兩個CH3 結構域中的另一個包含S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變)；b)由下述組成的多肽ba)抗體重鏈可變結構域(VH)；或bb)抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體恒定結構域1 (CHl)，其中所述多肽的VH結構域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的一條重鏈的C端；c)由下述組成的多肽ca)抗體輕鏈可變結構域(VL)，或cb)抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體輕鏈恒定結構域(CL)；其中所述多肽的VL結構域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的另一條重鏈的C端；并且其中b)中所述多肽的抗體重鏈可變結構域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結構域(VL) —起形成特異性結合人c-Met的抗原結合位點。四價雙特異性形式在一個實施方案中，本發明所述的雙特異性抗體是四價的，其中特異性結合人 c-Met的抗原結合位點抑制c-Met 二聚化(例如，如在WO 2009/007427中所述)。因此，本發明的另一個優選方面是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人ErbB-3并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成； 和b)特異性結合人c-Met的兩個相同的單鏈Fab片段，其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。因此，本發明的另一個方面是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人c-Met并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成； 和b)特異性結合人ErbB-3的兩個相同的單鏈Fab片段，其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于示例性圖解結構，參見圖6a。因此，本發明的另一個優選方面是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人ErbB-3并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成； 和
b)特異性結合人c-Met的兩個相同的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。因此，本發明的另一個優選方面是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人C-Met并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成； 禾口b)特異性結合人ErbB-3的兩個相同的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于示例性圖解結構，參見圖6b。在一個優選的實施方案中，所述結合人c-Met或人ErbB-3的單鏈Fab或Fv片段通過肽連接體在所述全長抗體的重鏈的C-端融合到所述全長抗體。本發明的另一個實施方案是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結合人ErbB-3并且由下述組成aa)兩個相同的抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結構域(VH)，抗體恒定重鏈結構域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(HR)，抗體重鏈恒定結構域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結構域3(CH3)組成；和ab)兩個相同的抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結構域(VL)，和抗體輕鏈恒定結構域(CL) (VL-CL)組成；和b)特異性結合人c-Met的兩個單鏈Fab片段，其中所述單鏈Fab片段由抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體恒定結構域1 (CHl)，抗體輕鏈可變結構域(VL)，抗體輕鏈恒定結構域(CL)和接頭組成，并且其中所述抗體結構域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一ba) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 bb) VL-CL-接頭-VH-CH1 ；其中所述接頭是至少30個氨基酸的肽，優選在32和50個氨基酸殘基之間的肽；并且其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C-或N-末端融合到所述全長抗體；其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優選在10和50個氨基酸之間的肽。當用在三價或四價形式中時，術語“全長抗體”指由兩條“全長抗體重鏈”和兩條 “全長抗體輕鏈”組成的抗體(見圖1)。“全長抗體重鏈”是這樣的多肽，其在N端到C端方向由抗體重鏈可變結構域(VH)，抗體恒定重鏈結構域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(HR)，抗體重鏈恒定結構域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結構域3 (CH3)組成，縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ；并且在IgE亞類的抗體的情形中，任選地還包括抗體重鏈恒定結構域4(CH4)。優選地，“全長抗體重鏈”是在N端到C端方向由VH，CHI, HR, CH2和CH3組成的多肽。“全長抗體輕鏈”是在N端到C端方向由抗體輕鏈可變結構域(VL)，和抗體輕鏈恒定結構域(CL)組成的多肽， 縮寫為VL-CL。所述抗體輕鏈恒定結構域(CL)可以是κ (kappa)或λ (lambda) 0兩條全長抗體鏈通過在CL結構域和CHl結構域之間的多肽間二硫鍵和全長抗體重鏈的鉸鏈區之間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的全長抗體的實例是天然抗體如IgG(例如，IgGl和 IgG2)，IgM，IgA，IgDjP IgE。根據本發明所述的全長抗體可以來自單一物種，例如人，或它們可以是嵌合的或人源化的抗體。根據本發明所述的全長抗體包含分別由VH和VL配對形成的兩個抗原結合位點，這兩個抗原結合位點都特異性結合于相同的抗原。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端指在所述重鏈或輕鏈的C端的最后的氨基酸。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的N端指在所述重鏈或輕鏈的N端的最后的氨基酸。術語“肽連接體”用于本發明時指具有氨基酸序列的肽，其優選地是合成來源的。 這些本發明所述的肽連接體用于將單鏈Fab片段融合到全長抗體的C-或N-端，以形成本發明所述的多特異性抗體。優選地，b)中所述肽連接體是具有長度為至少5個氨基酸的氨基酸序列的肽，優選長度為5-100個、更優選長度為10-50個氨基酸的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述肽連接體是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，且(χ =3，η = 3，4，5 或 6，且 m = 0，1，2 或 3)或(χ = 4，η = 2，3，4 或 5 且 m = 0，1，2 或 3)， 優選地χ = 4且η = 2或3，更優選地χ = 4，η = 2。優選地，在三價、雙特異性抗體中，其中VH或VH-CHl多肽和VL或VL-CL多肽(圖7a_c)通過兩個相同的肽連接體融合到全長抗體的C-端，所述肽連接體是至少25個氨基酸的肽，優選是30-50個氨基酸的肽，并且更優選地，所述肽連接體是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，且(χ = 3，n = 6，7 或 8，且 m = 0，1，2 或 3)或(χ = 4，n = 5，6，或7且111 = 0，1，2 或 3)，優選 χ = 4 且 η =5,6,7。“單鏈Fab片段”(見圖2a)是由抗體重鏈可變結構域(VH)，抗體恒定結構域 1 (CHl)，抗體輕鏈可變結構域(VL)，抗體輕鏈恒定結構域(CL)和接頭組成的多肽，其中所述抗體結構域和所述接頭從N端到C端方向具有下列順序之一 a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CHl，c) VH-CL-接頭-VL-CH1或d) VL-CHl-接頭-VH-CL ；并且其中所述接頭是至少30個氨基酸的多肽，優選地32-50個氨基酸的多肽。所述單鏈Fab片段a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 和 d) VL-CHl-接頭-VH-CL，通過在CL結構域和CHl結構域之間的天然二硫鍵穩定。術語“N-端”指N-端的最后的氨基酸。術語“C-端”指C-端的最后的氨基酸。術語“接頭”在本發明中與單鏈Fab片段聯系使用，并且指具有氨基酸序列的肽， 其優選地是合成來源的。將本發明所述的這些肽用于連接a)VH-CHl與VL-CL，b)VL-CL 與VH-CHl，c) VH-CL與VL-CHl或d) VL-CHl與VH-CL，從而形成下列本發明所述的單鏈 Fab 片段a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 d) VL-CHl-接頭-VH-CL。在所述單鏈Fab片段中的所述接頭是具有至少30個氨基酸長度的氨基酸序列，優選地具有32-50個氨基酸長度的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述接頭是(GxS)n，其中G =甘氨酸，S =絲氨酸，(χ = 3，η = 8，9或10和m = 0，1，2或3)或(χ =4禾口 η = 6，7或8和m = 0，1，2或3)，優選地其中χ = 4，n = 6或7和m = 0，1，2或3， 更優選地x = 4，n = 7和m = 2。在一個實施方案中，所述接頭是(G4S) 6G2。在一個優選的實施方案中，在所述單鏈Fab片段中的所述抗體結構域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一a) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 b) VL-CL-接頭-VH-CHl，更優選地 VL-CL-接頭-VH-CHl。在另一個優選的實施方案中，在所述單鏈Fab片段中的所述抗體結構域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一
a) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 b) VL-CHl-接頭-VH-CL。任選地，在所述單鏈Fab片段中，除了在CL-結構域和CHl結構域之間的天然二硫鍵之外，還通過在下列位置之間引入二硫鍵來對抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)進行二硫化物穩定i)重鏈可變結構域位置44到輕鏈可變結構域位置100，ii)重鏈可變結構域位置105到輕鏈可變結構域位置43，或iii)重鏈可變結構域位置101到輕鏈可變結構域位置100 (總是根據Kabat的EU 索引編號)。單鏈Fab片段的這些另外的二硫化物穩定通過在單鏈Fab片段的可變結構域VH 和VL之間引入二硫鍵來實現。例如，引入非天然的二硫鍵來穩定單鏈Fv的技術描述在WO 94/029350, Rajagopal，V.，等，蛋白質工程(Prot. Engin.) (1997) 1453-59 ；Kobayashi，H.， 等，核醫學和生物學(Nuclear Medicine & Biology), Vol. 25，(1998)387-393 ；或khmidt， Μ.，等，癌基因(Oncogene) (1999) 18，1711-1721中。在一個實施方案中，包含在本發明所述的抗體中的單鏈Fab片段的可變結構域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結構域位置44和輕鏈可變結構域位置100之間。在一個實施方案中，包含在本發明所述的抗體中的單鏈Fab 片段的可變結構域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結構域位置105和輕鏈可變結構域位置43之間(總是根據Kabat的EU索引編號)。在一個實施方案中，優選在單鏈Fab片段的可變結構域VH和VL之間不具有所述任選的二硫化物穩定的單鏈Fab片段。“單鏈Fv片段”(見圖2b)是由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體輕鏈可變結構域 (VL)、和單鏈Fv接頭組成的多肽，其中所述抗體結構域和所述單鏈Fv接頭從N端到C端方向具有下列順序之一 a) VH-單鏈Fv接頭-VL，b) VL-單鏈Fv接頭-VH ；優選a) VH-單鏈Fv 接頭-VL，并且其中所述單鏈Fv接頭是具有至少15個氨基酸長度的氨基酸序列的多肽，在一個實施方案中，是具有至少20個氨基酸長度的氨基酸序列的多肽。術語“N-端”指N端的最后的氨基酸。術語“ C-端，，指C端的最后的氨基酸。當用于單鏈Fv片段中時，術語“單鏈Fv接頭”指具有氨基酸序列的肽，其優選地是合成來源的。所述單鏈Fv接頭是具有至少15個氨基酸長度的氨基酸序列的肽，在一個實施方案中，是具有至少20個氨基酸長度的氨基酸序列的肽，且優選是具有15-30個氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述單鏈接頭是(fo^)n，其中G=甘氨酸， S =絲氨酸，(χ = 3 且 η = 4，5 或 6)或(χ = 4 且 η = 3，4，5 或 6)，優選 χ = 4，η = 3，4 或5，更優選χ = 4，η = 3或4。在一個實施方案中，所述單鏈Fv接頭是(G4S)3或(G4S)40此外，所述單鏈Fv片段優選是二硫化物穩定的。單鏈抗體的這些另外的二硫化物穩定通過在單鏈抗體的可變結構域之間引入二硫鍵來實現，并且，例如，在WO 94/029350, Rajagopal, V.，等，蛋白質工程(Prot. Engin.) 10 (1997) 1453-59 ；Kobayashi, H.，等，核醫學和生物學(Nuclear Medicine& Biology), Vol. 25 (1998) 387-393 ；或 khmidt，M.，等，癌基因(Oncogene) 18(1999) 1711-1721 中所述。在二硫化物穩定的單鏈Fv片段的一個實施方案中，對于每種單鏈Fv片段，包含在本發明所述的抗體中的單鏈Fv片段的可變結構域之間的二硫鍵獨立地選自i)重鏈可變結構域位置44到輕鏈可變結構域位置100，
ii)重鏈可變結構域位置105到輕鏈可變結構域位置43，或iii)重鏈可變結構域位置101到輕鏈可變結構域位置100。在一個實施方案中，包含在本發明所述的抗體中的單鏈Fv片段的可變結構域之間的二硫鍵在重鏈可變結構域位置44和輕鏈可變結構域位置100之間。本發明所述的抗體由重組方式產生。因此，本發明的一個方面是編碼本發明所述的抗體的核酸，并且另一個方面是包含編碼本發明所述的抗體的核酸的細胞。用于重組生產的方法是現有技術中廣泛已知的并且包括在原核細胞和真核細胞中的蛋白表達， 以及隨后的抗體分離和通常純化為藥用純度。對于前述抗體在宿主細胞中的表達，將編碼各個修飾的輕鏈和重鏈的核酸通過標準方法插入表達載體中。在適合的原核或真核宿主細胞如CHO細胞，NSO細胞，SP2/0細胞，HEK293細胞，COS細胞，PER. C6細胞，酵母， 或大腸桿菌(E. coli)細胞中進行表達，并且將所述抗體從細胞(上清液或裂解后的細胞)中回收。用于抗體重組生產的一般方法是現有技術中公知的，并且例如在Makrides， S. C.，蛋白表達和純化(Protein Expr. Purif.) 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.，等，蛋白表達和純化(Protein Expr. Purif.) 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R.J.，分子生物技術(Mol. Biotechnol.) 16 (2000) 151-161 ；Werner, R. G.，藥物研究(Drug Res.) 48 (1998) 870-880 的綜述文章中描述。通過常規免疫球蛋白純化方法，將雙特異性抗體適當地從培養基中分離，所述純化方法如，例如蛋白質A-瓊脂糖，羥基磷灰石層析法，凝膠電泳，透析或親和層析法。編碼所述單克隆抗體的DNA和RNA容易地使用常規方法進行分離和測序。雜交瘤細胞可以充當所述DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達載體中，所述表達載體接著被轉染到不另外產生免疫球蛋白的宿主細胞如HEK 293細胞、CHO細胞、或骨髓瘤細胞中，從而在宿主細胞中獲得重組單克隆抗體的合成。雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過將適合的核苷酸變化引入抗體 DNA中，或通過核苷酸合成進行制備。然而，這樣的修飾可以僅在例如如上述的非常有限的范圍內進行。例如，修飾不改變上述提及的抗體特征如IgG同種型和抗原結合，但是可以提高重組生產的產率、蛋白穩定性或有利于純化。術語“宿主細胞”用于本申請時是指可以被改造從而產生本發明所述的抗體的細胞系統的任何種類。在一個實施方案中，將HEK293細胞和CHO細胞用作宿主細胞。用于本文時，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，且全部這些名稱都包括后代。因此，詞語“轉化體”和“轉化的細胞”包括原代受試者細胞和來源于其的培養物，而不考慮轉移數。還理解，由于有意或無意的突變，所有的后代的DNA內容物可能不精確一致。包括具有與在最初轉化的細胞中篩選的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的變體后代。在NSO細胞中的表達記述在，例如，Barnes, L. Μ.，等，細胞技術學 (Cytotechnology) 32 (2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.，等，生物技術和生物工程(Biotech. Bioeng. )73(2001)261-270中。瞬時表達記述在，例如，Durocher，Y.，等，核酸研究(Nuc 1. Acids. Res.) 30 (2002) E9中。可變結構域的克隆記述在Orlandi，R.，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (1992) 4285-4289 ；和 Norderhaug，L.，等，免疫學方法雜志(J. Immunol. Method) 204 (1997) 77-87中。優選的瞬時表達系統(HEK 293)記述在Schlaeger, E. -J.，和 Christensen，K.，細胞技術學(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83 中和 Schlaeger, E. -J.，免疫學方法雜志(J. Immunol. Methods) 194 (1996) 191-199 中。適合用于原核生物的控制序列，例如包括啟動子，任選地操縱子序列，和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、增強子和多腺苷酸化信號。當核酸在被置于與另一個核酸序列的功能關系中時，其是“可操作地連接的”。例如，前序列(pre-sequence)或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA可操作地連接，條件是其表達為參與多肽分泌的前蛋白(pre-protein)；啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，條件是其影響序列的轉錄；或核糖體結合位點與編碼序列可操作地連接，條件是其被定位為促進翻譯。一般地，“可操作地連接的”意指被連接的DNA序列是連續的，且在分泌前導序列的情形中，是連續的且在閱讀框中。然而，增強子不必須是連續的。連接通過在方便的限制性位點處的連接來實現。如果不存在這樣的位點，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸適體或接頭。通過標準技術，包括堿/SDS處理，CsCl分級(CsCl banding)，柱層析法，瓊脂糖凝膠電泳，和其它本領域公知的技術，進行抗體的純化從而消除細胞成分或其它污染物，例如其它細胞核酸或蛋白。見Ausubel，F.，等，編，現代分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing 禾口 Wiley Interscience, (1987)。不同的方法是充分建立的并且廣泛用于蛋白純化，如用微生物蛋白進行的親和層析法(例如，蛋白質A或蛋白質G親和層析法)，離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)，陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式的交換)，親硫吸附(例如，用巰基乙醇和其它SH 配體)，疏水相互作用或芳香吸附層析法(例如用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂， 或間-氨基苯基硼酸)，金屬螯合親和層析法(例如用Ni (II)-和Cu (II)-親和性材料)， 大小排阻層析法和電泳方法(如凝膠電泳，毛細管電泳)(Vijayalakshmi，Μ. Α.，應用生物化學生物技術(App 1. Biochem. Biotech.) 75 (1998) 93-102)。用于本文時，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，且全部這些名稱都包括后代。因此，詞語“轉化體”和“轉化的細胞”包括原代受試者細胞和來源于其的培養物，而不考慮轉移數。還理解，由于有意或無意的突變，所有的后代的DNA內容物可能不精確一致。包括具有與在最初轉化的細胞中篩選的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的變體后代。在需要不同命名的情形中，其將從上下文中變得清楚。術語“轉化”用于本文中時，指將載體/核酸轉移到宿主細胞中的過程。如果將不具有難以克服的細胞壁屏障的細胞用作宿主細胞，則轉染例如通過如Graham，F. L.，和 van der Eh, A.J.，Virology (病毒學)52 (1973) 456-467所述的磷酸鈣沉淀法來進行。然而，還可以使用其他將DNA引入細胞的方法，諸如通過核注射或通過原生質體融合。如果使用原核細胞或包含實質細胞壁結構的細胞，例如一種轉染方法是利用氯化鈣的鈣處理，如 Cohen, F. N，等，PNAS (美國國家科學院學報)· 69 (1972) 7110ff所述。用于本文中時，“表達”指將核酸轉錄為mRNA的過程和/或將轉錄的mRNA(也稱為轉錄物)隨后翻譯為肽、多肽或蛋白質的過程。轉錄物和所編碼的多肽共同稱為基因產物。 如果多核苷酸源自基因組DNA，則在真核細胞中的表達可以包括mRNA的剪接。“載體”是一種核酸分子，特別是自體復制的，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞之中和/或之間。該術語包括主要功能為將DNA或RNA插入細胞(例如，染色體整合)的載體，主要功能是復制DNA或RNA的復制載體，和功能是轉錄和/或翻譯DNA或RNA的表達載體。還包括提供多于一種上述功能的載體。“表達載體”是一種多核苷酸，其在引入到合適的宿主細胞中時能夠被轉錄和翻譯為多肽。“表達系統”通常指包括表達載體的適當宿主細胞，所述表達載體可以起作用產生所需的表達產物。藥物組合物本發明的一個方面是包含本發明所述的抗體的藥物組合物。本發明的另一個方面是本發明所述的抗體用于制備藥物組合物的應用。本發明的另一個方面是制備包含本發明所述的抗體的藥物組合物的方法。在另一個方面中，本發明提供一種組合物，例如，一種藥物組合物，其包含本發明所述的抗體，本發明所述的抗體與藥物載體一起配制。本發明的一個實施方案是用于治療癌癥的本發明所述的雙特異性抗體。本發明的另一個方面是用于治療癌癥的所述藥物組合物。本發明的另一個方面是本發明所述的抗體用于制備用于治療癌癥的藥物的應用。本發明的另一個方面是治療患有癌癥的患者的方法，其通過向需要所述治療的患者施用本發明所述的抗體進行。當用于本文時，“藥物載體”包括生理相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、 抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優選地，所述載體適于靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。本發明的組合物可以通過多種本領域已知的方法施用。如技術人員清楚地，施用的路徑和/或方式將根據需要的結果變化。為了通過某些施用路徑施用本發明的化合物， 可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物與防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在適合的載體或稀釋劑中施用于受試者，所述載體例如是脂質體。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥物載體包括無菌水溶液或分散體和用于即時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。這些介質和藥劑用于藥物活性物質是本領域已知的。措辭“腸胃外施用”和“腸胃外地施用”用于本文時意為除了腸和局部施用之外的施用方式，通常通過注射施用，并且包括，但不限于，靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質下(subcuticular)、關節內、囊下、蛛網膜下、脊內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。術語癌癥用于本文時指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴細胞白血病 (lymphocytic leukemias),月市癌(lung cancer),非小細胞肺(NSCL)癌(non small cell lung (NSCL) cancer),支氣管月市泡細胞月市癌(bronchio loalvio Iar cell lung cancer),骨
(bone cancer)，月夷—(pancreatic cancer)，1 月夫· (skin cancer), ^JlKSIilS (cancer of the head or neck)，夫 $ 目艮內 11 ;) (cutaneous or intraocular melanoma)，〒宮癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直腸癌(rectal cancer),月工區癌(cancer of the anal region)，胃· (stomach cancer), (gastric cancer),(colon
cancer),乳腺癌(breast cancer),子宮癌(uterine cancer),輸卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes),子宮內膜癌(carcinoma of the endometrium),子宮頸癌 (carcinoma of the cervix)，陰道癌(carcinoma of the vagina),夕卜陰癌(carcinomaof the vulva)，霍奇金病(Hodgkin' s Disease)，食管癌(cancer of the esophagus), 小腸癌(cancer of the small intestine),內分泌系統癌(cancer of the endocrine system)，甲狀腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲狀旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，l^f 上—(cancer of the adrenal gland), ^1 ^ (sarcoma of soft tissue),尿道癌(cancer of the urethra)，陰蓮癌(cancer of the penis),前列腺癌(prostate cancer),膀胱癌(cancer of the bladder),腎癌或輸尿管癌(cancer of the kidney or ureter),腎細胞癌(renal cell carcinoma)，腎盂癌(carcinoma of the renal pelvis),間皮瘤(mesothelioma),肝細胞癌(hepatocellular cancer),膽管癌(biliary cancer),中樞神經系統(CNS)月中瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS)), 脊椎軸腫瘤(spinal axis tumors)，腦干膠質瘤(brain stem glioma)，多形性成膠質細胞瘤(glioblastoma multiforme),星形細胞瘤(astrocytomas),神經鞘瘤(schwanomas),室管膜瘤(印endymonas)，成髓細胞瘤(medulloblastomas)，腦膜瘤(meningiomas)，鱗狀細胞癌(squamous cell carcinomas)，垂體腺瘤(pituitary adenoma)，禾口尤因肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任一種上述癌癥的難治性形式，或一種或多種上述癌癥的組合。本發明的另一方面是作為抗-血管生成劑的本發明所述的雙特異性抗體或所述藥物組合物。這種抗-血管生成劑可用于治療癌癥(特別是實體瘤)和其它血管疾病。本發明的一個實施方案是用于治療血管疾病的本發明所述的雙特異性抗體。本發明的另一方面是本發明所述的抗體用于制備用于治療血管疾病的藥物的應用。本發明的另一方面是治療患有血管疾病的患者的方法，其通過向需要這種治療的患者施用本發明所述的抗體進行。術語“血管疾病(vascular diseases) ”包括癌癥(Cancer)，炎癥疾病 (Inflammatory diseases),云力脈粥樣硬化(Atherosclerosis), iE^iil (Ischemia),倉丨J傷 (Trauma)，膿毒癥(S印sis)，COPD,哮喘(Asthma)，糖尿病(Diabetes)，AMD,視網膜病 (Retinopathy)，中風(Stroke)，肥胖(Adipositas)，急性肺損傷(Acute lung injury)， 出血(Hemorrhage)，血管滲漏(Vascular leak)(例如細胞因子誘導的血管滲漏)，變態反應(Allergy)，格雷夫斯病(Graves，Disease)，橋本自身免疫性甲狀腺炎(Hashimoto，s Autoimmune Thyroiditis),(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)，巨細胞動脈炎(Giant Cell Arteritis)，類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis)，系統性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus (SLE))，狼瘡性腎炎(Lupus N印hritis)，局限性回腸炎(Crohn，s Disease)，多發性硬化(Multiple Sclerosis), 潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis)，特別是實體瘤，眼內新血管綜合征(intraocular neovascular syndrome)諸如增殖性視網膜病(proliferative retinopathies)或年齡相關的黃斑變個生(age-related macular degeneration) (AMD)，類風 關節炎(rheumatoid arthritis)和銀屑病(psoriasis) (Folkman, J.，和 Shing，Y.，等，J. Biol. Chem.(生物化學雜志)267 (1992) 10931-10934 ；Klagsbrun, Μ·，等，Annu. Rev. Physiol.(生理學年度綜述)53 (1991) 217-239 ；和 Garner，Α.，Vascular diseases (血管疾病)，在Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach (目艮禾斗疾病，艮口動力學途徑的病理學)，Garner, A.，和 Klintworth，G. K，(編)第 2 版，Marcel Dekker，紐約(1994)，第 1625-1710 頁)。
這些組合物還可以包含輔藥如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。防止微生物的存在可以通過滅菌方法(見上文)和通過包含各種抗細菌和抗真菌藥劑來確保，所述抗細菌和抗真菌藥劑例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。可能需要在組合物中包含等滲劑，如糖、氯化鈉等。此外，可以通過包含延緩吸附的試劑如單硬脂酸鋁和明膠來導致可注射藥物形式的延長的吸收。不管所選擇的施用路徑為何，通過本領域技術人員已知的常規方式，將可以以適合的水合形式使用的本發明的化合物、和/或本發明的藥物組合物配制成藥用劑型。在本發明的藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可以變化從而獲得這樣的活性成分的量，其對于特定的患者、組合物和施用方式有效獲得需要的治療反應，而不會對患者具有毒性。選定的劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學因素，包括所用的本發明的特定組合物的活性、施用路徑、施用時間、使用的特定化合物的排泄速率、治療的延續時間、 與所用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、待治療的患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康和以前的醫療病史，以及醫療領域中公知的類似因素。所述組合物必需是無菌和可流動的，到所述組合物可通過注射器遞送的程度。除了水之外，所述載體優選地是等滲緩沖的鹽水溶液。適當的流動性可以例如通過使用涂層如磷脂酰膽堿(lecithin)，在分散體的情形中通過維持需要的顆粒大小，和通過使用表面活性劑來維持。在許多情形中，優選在所述組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇、和氯化鈉。現在已經可見，本發明所述的針對人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體具有有價值的特征，諸如生物學或藥理學活性、藥物代理動力學特性。與親本<ErbB3>和/或<c-Met> 抗體相比，本發明所述的雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體表現出減少的內在化。提供下述實施例、序列表和附圖來輔助理解本發明，本發明的真正范圍在后附的權利要求書中描述。應該理解，在不背離本發明的精神的前提下，可以在所述的方法中進行
修改。
氨基mWi丨描沭
SEQIDNO1重鏈可變結構域<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO2輕鏈可變結構域<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO3重鏈可變結構域<c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO4輕鏈可變結構域<c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO5重鏈<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO6輕鏈<ErbB-3>HER3克隆四
SEQIDNO7 重鏈 <c-Met> Mab 5D5
SEQIDNO8 輕鏈 <c-Met> Mab 5D5
SEQIDNO9 重鏈 <c-Met>Fab 5D5
SEQIDNO:10 輕鏈 <c-Met>Fab 5D5
SEQIDNO:11 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQIDNO12 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQIDNO13 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQIDNO14 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQIDNO15重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQIDNO16輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQIDNO17重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQIDNO18重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQIDNO19輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQIDNO20重鏈 KErbB3-c-Met>Her3/Met_lC
SEQIDNO21重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC
SEQIDNO22輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC
SEQIDNO23重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQIDNO24重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQIDNO25輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQIDNO26重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS
SEQIDNO27重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS
SEQIDNO28輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS
SEQIDNO29重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH
SEQIDNO30重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH
SEQIDNO31輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH
SEQIDNO32重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH
SEQIDNO33重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH
SEQIDNO34輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH
SEQIDNO35重鏈 l<ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKHSB
SEQIDNO36重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB
SEQIDNO37輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB
SEQIDNO38重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS
SEQIDNO39重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS
SEQIDNO40輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS
SEQIDNO41人IgGl的重鏈恒定區
SEQIDNO42人IgG3的重鏈恒定區
SEQIDNO43人輕鏈κ恒定區
SEQIDNO44人輕鏈λ恒定區
SEQIDNO45人 c-Met
SEQIDNO46人 ErbB-3
SEQIDNO47重鏈可變結構域VH，<ErbB3>Mab 205 (鼠)
SEQIDNO48輕鏈可變結構域VL，<ErbB3>Mab 205 (鼠)
SEQIDNO49重鏈可變結構域VH，<ErbB3>Mab 205. 10 (人源化的)
SEQIDNO50輕鏈可變結構域VL, <ErbB3>Mab 205. 10. 1 (人源化的)
SEQIDNO51輕鏈可變結構域VL, <ErbB3>Mab 205. 10. 2 (人源化的)
SEQIDNO52輕鏈可變結構域VL, <ErbB3>Mab 205. 10. 3 (人源化的)
SEQIDNO53重鏈 CDR3H, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO54重鏈 CDR2H, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO55重鏈 CDR1H, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO56輕鏈 CDR3L, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO57輕鏈 CDR2L, <ErbB3>Mab 205. 10
SEQIDNO58輕鏈 CDRlL (變體 1)，<ErbB3>Mab 205
SEQIDNO59輕鏈 CDRlL (變體 2)，<ErbB3>Mab 205
SEQIDNO60重鏈 CDR3H, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO61重鏈 CDR2H, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO62重鏈 CDR1H，<ErbB3>HER3 克隆 29
SEQIDNO63輕鏈 CDR3L, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO64輕鏈 CDR2L, <ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO65輕鏈 CDRlL<ErbB3>HER3 克隆四
SEQIDNO66重鏈 CDR3H, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO67重鏈 CDR2H, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO68重鏈 CDR1H, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO69輕鏈 CDR3L, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO70輕鏈 CDR2L, <c-Met>Mab 5D5
SEQIDNO71輕鏈 CDRlL<c-Met>Mab 5D5
附圖描沭
圖1特異性結合第一抗原1的不具有CH4結構域的4
全長抗體具有以典型順序包含可變結構域和恒定結構域的兩對重鏈和輕鏈。圖加-c 二價雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體的示意性結構，所述抗體包含a)特異性結合人ErbB-3的全長抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合人c-Met的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中恒定結構域CL和CHl、和/或可變結構域VL和VH相互替換，其用凸起-進入-孔洞技術修飾。圖3本發明所述的三價雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體示意圖，所述抗體包含特異性結合第一抗原1的全長抗體，對其a)圖3a 融合兩個多肽VH和VL (這兩個多肽的VH和VL結構域一起形成特異性結合第二抗原2的抗原結合位點)；b)圖北融合兩個多肽VH-CHl和VL-CL (這兩個多肽的VH和VL結構域一起形成特異性結合第二抗原2的抗原結合位點)；圖3c 具有“凸起和孔洞”的本發明所述的三價雙特異性抗體的示意圖，所述抗體包含特異性結合第二抗原1的全長抗體，對其融合兩個多肽VH和VL (這兩個多肽的VH和 VL結構域一起形成特異性結合第二抗原2的抗原結合位點)；圖3d 具有“凸起和孔洞”的本發明所述的三價雙特異性抗體示意圖，所述抗體包含特異性結合第一抗原1的全長抗體，對其融合兩個多肽VH和VL (這兩個多肽的VH和VL 結構域一起形成特異性結合第二抗原2的抗原結合位點，其中這些VH和VL結構域包含在位置VH44和VL100之間的鏈間二硫鍵)。圖44a 四種可能的單鏈Fab片段的示意性結構；
4b 兩種單鏈Fv片段的示意性結構。圖5三價雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體的示意性結構，所述抗體包含全長抗體和一個單鏈Fab片段(圖5a)或一個單鏈Fv片段(圖恥)-具有凸起和孔洞的雙特異性三價實例。圖6四價雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體的示意性結構，所述抗體包含全長抗體和兩個單鏈Fab片段(圖6a)或兩個單鏈Fv片段(圖6b) -c-Met結合位點來源于抑制c_Met 二聚化的抗體。圖7 二價雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體的示意性結構，其中一個Fab臂替換為 scFab片段。圖8雙特異性抗體與癌細胞細胞表面的結合。圖9通過雙特異性Her3/C-Met抗體形式對HGF-誘導的c_Met受體磷酸化的抑制。圖10通過雙特異性Her3/C-Met抗體形式對HRG-誘導的Her3受體磷酸化的抑制。圖11，12和13通過雙特異性Her3/c_Met抗體形式對HGF-誘導的HUVEC增殖的抑制。圖14通過雙特異性Her3/C-Met抗體形式對癌細胞系A431中增殖的抑制。圖15和16分析雙特異性Her3/c_Met抗體形式對癌細胞系A431中HGF-誘導的細胞-細胞散布(分散)的抑制。圖17分析四種不同癌細胞系中的Her3和c_Met細胞表面表達。圖18分析癌細胞系A431，AM9，和DU145中的抗體介導的受體內在化。圖19分析A431細胞的HGF-誘導的細胞遷移。A.以存在遞增劑量的雙特異性抗體 MH_TvAbl8時阻抗的函數測量A431癌細胞的遷移。顯示的是M小時后的終點讀數。B.作為對照，以與所述雙特異性抗體相似的濃度范圍加入非特異性人IgG對照。圖20在Η ^9細胞中分析雙特異性Her3/c_Met_scFv_SSKH抗體的細胞-細胞交聯(用 ΡΚ 6 和 PKH67 (SIGMA)染色)。圖 2I 雙特異性 HerVc-Met 抗體 Her3/Met_scFvSS_KH (左側)和 Her3/Met_scFv_ KH(右側)的 SDS page。圖 22 雙特異性 Her3/c_Met 抗體 Her3/Met_scFvSSKH(圖 22a)和 Her3/MetscFv_ KH(圖22b)的HP SEC分析(純化的蛋白)。實驗方法
實施例材料和方法重組DNA技術使用標準方法操作 DNA，如 Sambrook，J.等，Molecular cloning :A laboratory manual (分子克隆實驗室手冊)；Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實驗室出版社)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989中所述。分子生物學試劑按照供應商的使用說明使用。DNA和蛋白序列分析和序列數據管理關于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的通用信息在Kabat，Ε. Α.等，(1991) : 目的的歹I」(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第五版，NIH出版號91-3242中提供。抗體鏈的氨基酸按照EU編號進行編號(Edelman， G.M.，等，PNAS 63(1969)78-85 ；Kabat, Ε. A.，等，(1991)免疫目的的蛋白質序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版，NIH 出版號 91-3242)。 GCG (Genetics Computer Group (遺傳學計算小組)，Madison，威斯康星)的軟件包版本 10. 2禾口 Infomax載體NTl 進展組版本8. Odnfomax’ s Vector NTI Advance suite version 8. 0)用于序列構建、作圖、分析、注解和說明。DNA 測序DNA序列通過在 SequiServe (Vaterstetten,德國)禾口 Geneart AG (Regensburg,德國)進行的雙鏈測序來確定。基因合成所需基因區段由Geneart AG (Regensburg，德國)從合成的寡核苷酸和通過自動化基因合成的PCR產物來制備。將側鄰單個限制性內切核酸酶裂解位點的基因區段克隆到 pGA18 (ampR)質粒中。從轉化的細菌純化質粒DNA，并且通過UV光譜法確定濃度。亞克隆基因片段的DNA序列通過DNA測序驗證。合成編碼在CH3結構域中攜帶T366W突變的“凸起-進入-孔洞”Her3(克隆29)抗體重鏈(具有通過(G4S)n肽連接體連接的C端5D5VH 區)的基因區段和編碼攜帶T366S，L368A*W07V突變的“凸起-進入-孔洞” Her3(克隆29)抗體重鏈(具有通過(G4S)1Ji連接體連接的C端5D5VL區)的基因區段，所述基因區段具有5’-BamHI和3’_XbaI限制性位點。以相似的方式，通過基因合成制備編碼在CH3 結構域中攜帶S354C和T366W突變的“凸起-進入-孔洞， θι·3(克隆29)抗體重鏈(其具有由(G4S)1Ji連接體連接的C-端OT5VH區)的DNA序列和編碼攜帶TO49C，T366S，L368A
突變的“凸起-進入-孔洞” Her3(克隆29)抗體重鏈(其具有由(G4S)n肽連接體連接的C-端5D5VL區)的DNA序列，所述DNA序列具有側連的BamHI和)(baI限制性位點。最后，合成編碼Her3(克隆29)抗體和5D5抗體的未修飾的重鏈和輕鏈的DNA序列，所述DNA序列具有側連的BamHI和)(baI限制性位點。將所有的構建體設計具有編碼前導肽 (MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’ -端DNA序列，所述前導肽靶向用以在真核細胞中分泌的蛋白。使用可變和恒定區的各自的元件(例如，在下述設計部分和表1-5中特定說明的)，類似地進行下述其他雙特異性抗體的基因合成。構建表達質粒將Roche表達載體用于構建所有編碼重鏈和輕鏈scFv融合蛋白的表達質粒。所述載體包括下述元件-作為選擇標記的潮霉素抗性基因，-埃巴病毒(EBV)的復制起點，oriP，-來自載體pUC18的復制起點，其允許該質粒在大腸桿菌中復制，-β -內酰胺酶基因，其賦予大腸桿菌氨芐青霉素抗性，-來自人巨細胞病毒(HCMV)的即時早期增強子和啟動子，-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“聚Α”)信號序列，和-特有的BamHI和)(baI限制性位點。如所描述的，通過基因合成制備免疫球蛋白融合基因，其包含重鏈或輕鏈構建體以及具有C端VH和VL結構域的“凸起-進入-孔洞”構建體，將該融合基因克隆進入 pGA18 (ampR)質粒。帶有合成的DNA區段的pG18(ampR)質粒和Roche表達載體用BamHI 和)(bal限制性酶(Roche Molecular Biochemicals)消化并進行瓊脂糖凝膠電泳。然后將純化的重鏈和輕鏈編碼DNA區段連接到分離的Roche表達載體BamHlAbaI片段，產生最終表達載體。將最終表達載體轉化到大腸桿菌細胞中，分離表達質粒DNA (Minipr印)并進行限制性酶分析和DNA測序。正確的克隆在150mlLB-Amp培養基中生長，再次分離質粒 DNA(Maxiprep)并通過DNA測序確認序列完整性。免疫球蛋白變體在HEK293細胞中的瞬時表達根據供應商的說明書，使用Fre必tyle 293表達系統(Invitrogen，USA) 通過人胚腎^3-F細胞的瞬時轉染來表達重組免疫球蛋白變體。簡言之，將混懸的 Freestyle 293-F細胞在FreeMyle 293表達培養基中在37°C /8% CO2進行培養，并在轉染當天將細胞以1-2χ106個活細胞/ml的密度接種在新鮮的培養基中。使用325μ 1 的^3fectin (Invitrogen，德國)和250 μ g 1 1摩爾比率的重鏈和輕鏈質粒DNA在 Opti-MEM I培養基(Invitrogen，USA)中制備DNA-293feCtinTM復合物，最終轉染體積為250ml。“凸起-進入-孔洞"DNA-293feCtin復合物如下制備在Opti-MEM I培養基 (Invitrogen，USA)中使用 325μ 1 的293fectin (Invitrogen，德國)和 250μ g的 1 :1:2 摩爾比的“凸起-進入-孔洞”重鏈1和2和輕鏈質粒DNA(最終轉染體積250ml)制備。在轉染后7天，通過以14000g離心30分鐘并通過無菌濾器(0. 22 μ m)過濾收獲包含抗體的細胞培養物上清液。將上清液貯存在_20°C直到純化。雙特異性抗體和對照抗體的純化使用蛋白質A-S印harose (GE Healthcare，瑞典)和Superdex200大小排阻層析法，通過親和層析法從細胞培養物上清液中純化雙特異性抗體和對照抗體。簡言之，將無菌過濾的細胞培養物上清液應用到用PBS緩沖液(IOmM Na2HPO4, ImM KH2PO4,137mM NaCl和 2. 7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap蛋白質A HP (5ml)柱上。將未結合的蛋白用平衡緩沖液洗滌下來。抗體和抗體變體用PH 2. 8的0. IM檸檬酸緩沖液洗脫，并且用pH 8. 5的0. Iml 1 M Tris中和含有蛋白的級分。然后，匯聚洗脫的蛋白級分，將其用Amicon超離心過濾裝置(MWC0 :30K,Millipore)濃縮至 3ml 體積，并且上樣到用 pH 6. O 的 20mM Histidin, 140mM NaCl 平衡的 Superdex200HiLoad 120ml 16/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare，瑞典)上。匯聚具有少于5%的高分子量聚集物的包含純化的雙特異性抗體和對照抗體的級分，并且以 1. 0mg/ml的等分試樣保存在_80°C。通過木瓜蛋白酶消化純化的5D5單克隆抗體產生Fab 片段，并且隨后通過蛋白質A層析法去除污染的Fc結構域。將未結合的Fab片段進一步在用 pH 6. 0 的 20mM Histidin, HOmMNaCl 平衡的 Superdex200 HiLoad 120ml 16/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare，瑞典)上純化，并且以1. 0mg/ml的等分試樣保存在_80°C。純化的蛋白的分析利用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數，通過測量^Onm的光密度(OD)，來確定純化的蛋白樣品的蛋白濃度。通過在存在和不存在還原劑(5mM 1，4-二硫蘇糖醇)條件下的SDS-PAGE并且用考馬斯亮藍染色，分析雙特異性抗體和對照抗體的純度和分子量 (示例性的圖 21，雙特異性 Her3/c-Met 抗體 Her3/MetscFvSS_KH (左側)和 Her3/MetscFv_ KH(右側)的SDS-Page)。按照供應商的使用說明使用NuPAGE I^e-Cast凝膠系統(Invitrogen,USA) (4-20% Tris-甘氨酸凝膠)。使用Superdex 200分析級大小排阻柱(GE Healthcare，瑞典)，在 200mM KH2PO4, 250mM KCl，pH 7. 0 運行緩沖液中在 25°C，通過高效 SEC分析雙特異性抗體和對照抗體樣品的聚集物含量。將25μ g蛋白以0. 5ml/分鐘的流速注射到柱上，并且在50分鐘內勻速(isocratic)洗脫。對于穩定性分析，將濃度為lmg/ml 的純化的蛋白在4°C和40°C溫育7天，然后通過高效SEC評估(例如，雙特異性Her3/C-Met 抗體 Her3/MetscFvSS_KH(圖 22a)和 Her3/MetscFv_KH(圖 22b)的 HP SEC 分析(純化的蛋白))。在通過用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶處理去除N-聚糖后，通過納米電噴霧Q-TOF質譜法驗證還原的雙特異性抗體輕鏈和重鏈的氨基酸骨架的完整性。產率如下例如，對于雙特異性Her3/c-Met抗體Her3/MetscFvSS_KH為 . 8mg/L (蛋白質 A 和 SEC)，對于 Her3/MetscFv_KH 為 12. 3mg/L(蛋白質 A 和 SEC))。c-Met磷酸化測定在HGF刺激前一天，將切1(^5個A549細胞接種在6孔板的每個孔中的具有0. 5% FCS (胎牛血清)的RPMI中。次日，用含有0. 2 % BSA (牛血清白蛋白)的RPMI替換生長培養基1小時。然后，向培養基中加入5 μ g/mL雙特異性抗體，并且將細胞溫育10分鐘，對其加入HGF以50ng/mL的終濃度繼續10分鐘。將細胞用含有ImM釩酸鈉的冰冷PBS洗滌一次，將其置于冰上，在細胞培養板中用100 μ L裂解緩沖液(50mM Tris-Cl pH7. 5,150mM NaCl, 1% NP40，0. 5% DOC, aprotinine, 0. 5mM PMSF, ImM 釩酸鈉)裂解。將細胞裂解物轉移到印pendorf管中，并且允許裂解在冰上繼續進行30分鐘。利用BCA法(Pierce)確定蛋白濃度。在4-12% Bis-Tris NuPage凝膠(Invitrogen)上分離30-50 μ g裂解物，并且將凝膠上的蛋白轉移到硝基纖維素膜上。將膜用含有5% BSA的TBS-T封閉1小時，并且用針對Y1230, 1234，1235的磷-特異性c-Met抗體(44-888, Biosource)按照供應商的使用說明進行顯色。免疫印跡用結合未磷酸化的c-Met的抗體(AF276，R&D)再次探測。Her3 (ErbB3)磷酸化測定將hl0e5個MCF7細胞接種在12-孔板的每個孔中的完全生長培養基中(RPMI 1640，10% FCS)。允許細胞在兩天內生長至90%的匯合。然后，用含有0. 5% FCS的饑餓培養基更換培養基。次日，在加入SOOng/mLHeregulin (R&D)前1小時，以指定的濃度補充各種抗體。當加入Heregulin時，將細胞進一步培育10分鐘，然后收集細胞并裂解。使用BCA法 (Pierce)確定蛋白濃度。在 4-12% Bis-Tris NuPage 凝膠(Invitrogen)上分離 30-50 μ g 裂解物，并且將凝膠上的蛋白轉移到硝基纖維素膜上。將膜用含有5% BSA的TBS-T封閉1 小時，并且用特異性識別Tyrl289的磷-特異性Her3/ErbB3抗體(4791，Cell Signaling) 進行顯色。分散測定在化合物處理前一天，將A549 (4000個細胞/孔)或A431 (8000個細胞/孔)以 200 μ L的總體積接種在96孔E-板(Roche, 05232368001)中的具有0. 5 % FCS的RPMI中。 貼壁和細胞生長用實時細胞分析儀機器監測過夜，每15分鐘掃描(swe印s)監測阻抗。次日，將細胞用5 μ L在PBS中的各自抗體稀釋液預先溫育，每5分鐘掃描。30分鐘后，加入產生20ng/mL終濃度的2，5 μ L的HGF溶液，并且允許實驗再繼續進行72小時。每分鐘掃描持續180分鐘監測即時變化，然后其余的時間每15分鐘掃描。遷移測定
40
遷移測定基于實時細胞分析儀技術(Roche)進行。為了這一目的，將具有8 μ m孔的CIM裝置的下室裝滿160 μ L HGF-條件培養基(50ng/mL)。裝配該裝置，并且將在150 μ L 總體積中的100000個Α431細胞接種在上室中。對其加入雙特異性抗體或對照抗體。允許遷移繼續M小時，在期間每15分鐘規律掃描。輸出數據并且表示為M小時后的終點讀數。流式細胞術測定(FACS)a)細胞表面受體狀態的相對定量將細胞保持在對數生長期。將亞匯合的細胞用accutasdSigma)解離，離心 (1500rpm,4°C,5min)并隨后用含有2% FCS的PBS洗滌一次。為了確定與其他細胞系相比較的相對受體狀態，將Ixl0e5個細胞在冰上與5 μ g/mL Her3或c_Met特異性一級抗體溫育30分鐘。使用非特異性IgG(同種型對照)作為特異性對照。在指定的時間后，將細胞用含有2% FCS的PBS洗滌一次，然后在冰上與熒光團偶聯的二級抗體溫育30分鐘。將細胞如所述進行洗滌并且重懸在適當體積的包含7-AAD(BD Biosciences)的BD CellFix溶液(BD Biosciences)中，以區分活細胞和死細胞。通過流式細胞術(FACS Canto,BD)確定平均熒光強度(mfi)。Mfi以至少兩次獨立染色的重復確定。使用Flowjo軟件(Tre必tar) 進一步處理流式細胞儀光譜。a)結合測定解離并且計數A431。將1. 5xl0e5個細胞接種在錐形96孔平板的每個孔中。將細胞離心(1500rpm，4°C，5分鐘)并且在冰上在具有2 % FCS (胎牛血清)的PBS中的50 μ L 各種雙特異性抗體的系列稀釋液中溫育30分鐘。將細胞再次離心，并且用200 μ L含有 2% FCS的PBS洗滌一次，然后用針對人Fc的藻紅蛋白-偶聯的抗體第二次溫育30分鐘， 所述藻紅蛋白-偶聯的抗體稀釋在含有2% FCS的PBS (Jackson Immunoresearch (杰克遜免疫研究)，10911609 中。將細胞離心，用200 μ L含有2% FCS的PBS洗滌兩次，重懸在 BD CellFix溶液(BD Biosciences (BD生物科學))中并且在冰上溫育至少10分鐘。通過流式細胞術(FACS Canto,BD)確定細胞的平均熒光強度(mfi)。至少進行重復的兩次獨立染色來確定Mfi。使用Flowjo軟件(Tre必tar)進一步處理流式細胞術光譜。使用XLFit 4. O(IDBS)和劑量反應單位點模型(one site model) 205確定半最大結合。b)內在化測定解離并且計數細胞。將切1065個細胞置于印？611(10什管中的501^完全培養基中，并且在37°C用5 μ g/mL各種雙特異性抗體溫育。在指定的時間點后，將細胞保存在冰上，直到時間過程結束。然后，將細胞轉移到FACS管中，離心(1500rpm，4°C，5分鐘)，用 PBS+2% FCS洗滌，并且在50 μ L針對人Fc的藻紅蛋白-偶聯的二級抗體中溫育30分鐘， 所述二級抗體稀釋在含有2 % FCS的PBS (Jackson Immunoresearch (杰克遜免疫研究)， 109116098)中。將細胞再次離心，用PBS+2% FCS洗滌，并且通過流式細胞術(FACS Canto, BD)確定熒光強度。c)交聯實驗將HD9細胞解離、計數并分成兩個群體，各自用ΡΚ 6和PKH67 (Sigma)按照供應商的使用說明染色。從每個染色的群體中取切10巧個細胞，合并并且在完全培養基中用 10 μ g/mL各種雙特異性抗體溫育30和60分鐘。在指定的時間點后，將細胞保存在冰上，直到時間過程結束。將細胞離心(1500rpm，4°C，5分鐘)，用PBS+2% FCS洗滌，并且通過流式細胞術(FACS Canto, BD)確定熒光強度。細胞滴定發光測定(CellTiter Glow Assay)使用細胞滴定發光測定(!Iomega)量化細胞存活力和增殖。該測定按照供應商的使用說明進行。簡言之，將細胞在96孔板中以100 μ L的總體積培養所需要的時間期間。對于增殖測定，將細胞從溫箱中取出，并且置于室溫下30分鐘。加入100 μ L細胞滴定發光試劑，并且將多孔板放置在定軌搖床上2分鐘。15分鐘后在微量平板讀數儀(Tecan)上定量發光。Wst-I 測定進行Wst-I存活力和細胞增殖測定作為終點分析，以檢測代謝活性細胞的數目。 簡言之，向200 μ L培養基中加入20 μ L Wst-I試劑(Roche，11644807001)。將96孔板進一步溫育30分鐘-1小時，直到出現染料的強顯色。在微量平板讀數儀(Tecan)上在450nm 波長定量染色強度。表面等離振子共振在25°C使用標準結合測定，諸如表面等離振子共振技術(BIAcore ， GE-Healthcare Uppsala，瑞典)，確定結合親和力。對于親和力測量，將30 μ g/ml抗Fc γ 抗體(來自山羊，Jackson Immuno Research)在SPR儀器(Biacore T100)上通過標準的胺-偶聯和封閉化學偶聯到CM-5傳感器芯片的表面上。綴合后，在25°C以5 μ L/min的流速注射單特異性或雙特異性Her3/CMet抗體，然后以30 μ L/min注射人HER3或c_Met ECD 的稀釋系列(OnM-lOOOnM)。對于結合實驗，使用PBS/0. 1 % BSA作為運行緩沖液。然后，用 PH 2. 0的IOmM甘氨酸-HCl溶液的60秒脈沖再生芯片。表達和純化的雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體的設計所有下述表達的和純化的雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體包括IgGl亞類的恒定區或至少Fc部分(SEQ ID NO 11的人恒定IgGl區)，其最終按下述修飾。在表1中具有表1所示的各自的特征的基于全長ErbB-3抗體(HER3克隆29)(通過免疫獲得(用人HER3-E⑶免疫的NMRI小鼠))和來自c_met抗體(cMet 5D5)的一個單鏈Fv片段(關于基本結構圖見圖5—一最終并非表中所提及的所有特征都包括在該附圖中)的三價雙特異性<ErbB3-C-Met>抗體按照上述通用方法表達和純化。在序列表中提供 HER3克隆四和cMet 5D5的相對應的VH和VL0表 1
權利要求
1.特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB_3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于，當在流式細胞術測定中在A431細胞上2小時后測量時，與不存在抗體時ErbB-3的內在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過15%的ErbB-3的內在化。
2.根據權利要求1的抗體，其特征在于是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的二價的或三價的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的一個或兩個抗原結合位點和特異性結合人c-Met的一個抗原結合位點。
3.根據權利要求1的抗體，其特征在于是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的三價的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的兩個抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第三抗原結合位點。
4.根據權利要求1的抗體，其特征在于是特異性結合人ErbB-3和人c-Met的二價的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的一個抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點。
5.特異性結合人ErbB-3和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結合人ErbB-3的第一抗原結合位點和特異性結合人c-Met的第二抗原結合位點，其特征在于i)所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQID NO :53的⑶R3H區，SEQ ID NO 54的⑶R2H區和SEQ ID NO 55的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO 56 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 57 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 59 的CDRlL區；和所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID N0:66的⑶R3H區，SEQ ID NO :67的⑶R2H區和SEQ ID NO :68的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 71 的 CDRlL 區；ii)所述第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQID NO 60的⑶R3H區，SEQ ID NO :61的CDR2H區和SEQ ID NO :62的CDRlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 63 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 64 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO 65 的 CDRlL 區或 SEQ ID NO 66 的CDRlL區；和所述第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO :66的⑶R3H區，SEQ ID NO :67的⑶R2H區和SEQ ID NO :68的⑶RlH區，和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 69 的 CDR3L 區，SEQ ID NO 70 的 CDR2L 區和 SEQ ID NO :71 的 CDRlL 區。
6.根據權利要求5的雙特異性抗體，其特征在于i)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQID NO :47和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :48，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；ii)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQID N0:49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :50，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；iii)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQID N0:49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；iv)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID N0:49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :52，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO 4 ；或ν)所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO :1和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :2，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :4。
7.根據權利要求5的雙特異性抗體，其特征在于所述第一抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 49和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :51，和所述第二抗原結合位點包含作為重鏈可變結構域的SEQ ID NO 3 和作為輕鏈可變結構域的SEQ ID NO :4。
8.根據權利要求1至7的雙特異性抗體，其特征在于包含IgGl或IgG3亞類的恒定區。
9.根據權利要求1至8的雙特異性抗體，其特征在于所述抗體在Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈內巖藻糖的量為65%以下。
10.編碼根據權利要求1至9的雙特異性抗體的核酸。
11.藥物組合物，其包含根據權利要求1至9的雙特異性抗體。
12.根據權利要求11的藥物組合物，其用于治療癌癥。
13.根據權利要求1至9的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。
14.根據權利要求1至9的雙特異性抗體用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。
15.治療患有癌癥的患者的方法，其通過向需要這樣的治療的患者施用根據權利要求 1至9的雙特異性抗體進行。
全文摘要
本發明涉及針對人ErbB-3和針對人c-Met的雙特異性抗體，制備它們的方法，含有所述抗體的藥物組合物，及其用途。
文檔編號C07K16/28GK102378768SQ201080015072
公開日2012年3月14日 申請日期2010年3月30日 優先權日2009年4月7日
發明者烏爾里希·布林克曼, 于爾根·邁克爾·尚策, 克勞迪奧·祖斯特曼, 克里斯蒂安·克萊因, 埃克·霍夫曼, 巴勃羅·烏馬納, 揚·奧拉夫·斯特拉克, 格哈德·尼德費爾納, 比吉特·博森梅爾, 維爾馬·勞 申請人:羅氏格黎卡特股份公司