專利名稱：特異性結合vcam-1的人單克隆抗體以及用于治療炎性疾病或癌癥、包含該人單克隆抗體 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及特異性結合VCAM-I的人單克隆抗體，以及用于炎性疾病或癌癥、包含該抗體的治療組合物。更具體地，本發明涉及特異性結合VCAM-I的人單克隆抗體，該抗體對人血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)表現出強特異性和親和力，有效地抑制白細胞和表達 VCAM-I的活化內皮細胞之間的相互作用，并表現出低免疫原性，本發明還涉及用于炎性疾病或癌癥、包含該抗體的治療組合物。
背景技術：
在從血流遷移到組織的過程中，包括白細胞在內的免疫細胞通過活化內皮細胞從而誘導免疫反應，許多細胞粘附分子(CAM)如整聯蛋白(integrin)、選擇蛋白(selectin)、 ICAM(細胞內粘附分子)和VCAM(血管細胞粘附分子)參與白細胞粘附到內皮細胞和遷移到組織的過程。細胞粘附分子從功能上可以分為涉及白細胞和內皮細胞之間的相互作用的選擇蛋白、參與白細胞粘附到內皮細胞的過程的整聯蛋白、免疫球蛋白或類似物質。這些細胞粘附分子在許多生理反應如免疫反應、炎癥和血栓形成中發揮著重要的作用。VCAM-I是血管內皮細胞粘附分子，其與在除嗜中性粒細胞以外的大多數白細胞表面上被表達的整聯蛋白(VLA-4)相互作用。VCAM-I在活化內皮細胞上被炎癥信號高度誘導，并參與白細胞附著于血管內皮細胞以及隨后白細胞經內皮遷移到損傷組織中。盡管有許多出版物與VCAM-I在炎癥和癌癥以及VLA-4相互作用中的作用相關，但抗VCAM-I的中和抗體的開發還未積極研究。盡管最近開發出M/K-2. 7——抗小鼠VCAM-I 的單克隆抗體，且該抗體對膠原誘導的關節炎小鼠模型的關節炎癥具有抑制作用，但它僅對小鼠模型有特異性，因而需要進一步測試該抗體在臨床應用中的有用性。進一步地，VCAM-I由7個IgG-樣結構域組成，其結構域1和4主要參與和配
體-整聯蛋白(α4β1 或 α4β7)的結合(1995，PNAS，92 :ρ5714 ； 1995，The journal of
immunology, 155 :p3135等)。所以，為了抑制VCAM-I抗原和其配體之間的相互作用，有效的中和抗體應當對結構域1或4具有強親和力。在這方面，迫切需要開發出這種用于臨床前研究和臨床研究的全人單克隆抗體，其表現出小鼠和人VCAM-I之間特異的交叉反應性， 有效地抑制VCAM-I抗原和整聯蛋白之間的相互作用，并使免疫原性的風險減到最低。
發明內容
技術問題因此，本發明人已經做了許多努力來開發人單克隆抗體，其對小鼠和人VCAM-I表現出特異的交叉反應性，有效地抑制VCAM-I抗原和整聯蛋白之間的相互作用，并使免疫原性的風險減到最低。本發明人已由人抗體文庫制備出對人和小鼠VCAM-I具有特異性、含有人源重鏈和輕鏈結構域的新型人單克隆抗體，他們發現該抗體結合VCAM-I抗原的結構域 1-2或3-4，從而表現出抑制U397前單核白細胞(promonocytic leukocytes)和活化內皮細胞之間的相互作用的強活性，由此完成本發明。解決問題的方案本發明的目的在于提供特異性結合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)從而抑制白細胞與活化內皮細胞之間相互作用的人單克隆抗體，該抗體包含人源重鏈(Vh)和輕鏈
結構域。本發明的另一目的在于提供用于診斷炎性疾病或癌癥的組合物，該組合物包含特異性結合VCAM-I的人單克隆抗體。本發明的又一目的在于提供提供有關炎性疾病或癌癥的診斷信息的方法，該方法包含檢測懷疑患有炎性疾病或癌癥的對象生物樣本中的VCAM-I和特異性結合VCAM-I的人單克隆抗體之間的抗原-抗體反應的步驟。本發明的再一目的在于提供用于炎性疾病或癌癥的治療組合物，該組合物使用了抑制VCAM-I介導的白細胞粘附到內皮細胞上的人單克隆抗體。本發明的再一目的在于提供通過給對象施用根據本發明的治療組合物來治療炎性疾病或癌癥的方法。本發明的再一目的在于提供利用根據本發明的單克隆抗體來抑制VCAM-I介導的白細胞粘附到內皮細胞上的方法。本發明的有利效果根據本發明的人單克隆抗體對在人或小鼠內皮細胞上被表達的VCAM-I表現出強親和力，有效地抑制白細胞粘附到表達VCAM-I的活化內皮細胞上，并具有人源重鏈和輕鏈結構域從而表現出低免疫原性，因此可用于治療癌癥或炎性疾病如哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞和移植排斥。附圖簡述
圖1示出利用人VCAM-1-D1-D4和小鼠VCAM-I抗原執行的淘選(panning)結果；圖2示出根據本發明的三類人單克隆抗體的可變區的氨基酸序列；圖3是ELISA(酶聯免疫吸附測定)的結果，示出抗原特異性抗VCAM-I人單克隆抗體對根據它們的人VCAM-I結構域的抗原的親和力，其中VD2表示重組人VCAM-I結構域 Dl-D2/Fc嵌合體，VD4表示重組人VCAM-I結構域D1_D4/Fc嵌合體，VD7表示重組人VCAM-I 結構域D1-D7/FC嵌合體；圖4是抗VCAM-I人單克隆抗體對純化人重組VCAM-I抗原和人白細胞之間的粘附的抑制活性的分析結果，其中它們的抑制活性是通過與未經抗體處理組相比熒光強度的降低確定的；圖5是抗VCAM-I人單克隆抗體對人白細胞和經TNF- α (腫瘤壞死因子-α )活化的人內皮細胞之間的粘附的抑制活性的分析結果，其中它們的抑制活性是通過與未經抗體處理的組相比熒光強度的降低確定的；圖6是抗VCAM-I人單克隆抗體對MioA (Ras同源基因家族，成員Α)活性的抑制活性的分析結果；圖7是抗VCAM-I人單克隆抗體對ROS (活性氧物質)活性的抑制活性的分析結果； 和圖8是在卵白蛋白誘導的哮喘小鼠模型中，抗VCAM-I抗體對炎性細胞浸潤到支氣管肺泡灌洗液中的抑制活性的分析結果(相比正常組##，P < 0.01 ；###, ρ < 0. 001 ；相比哮喘誘導組*，P < 0. 05廣，ρ < 0. 01)。實施本發明的最佳方式為了實現上述目的，本發明的一個方面在于提供特異性結合到人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)從而抑制白細胞和活化內皮細胞之間的相互作用的人單克隆抗體。如本文使用的“抗體”包括提到的與特定抗原免疫學反應的免疫球蛋白分子，并包括多克隆和單克隆抗體。該術語也包括基因工程形式如嵌合抗體(例如，人源化鼠科動物抗體)和異源結合抗體(heteroconjugate antibody)(例如，雙特異性抗體)。術語“抗體”也包括抗體的抗原結合形式，包括具有抗原結合能力的片段(例如， Fab'、F (ab ‘ ) 2、Fab、Fv和rlgG)。該術語也指重組單鏈Fv片段(scFv)。該術語抗體也包括二價分子或雙特異性分子、雙抗體、三抗體和四抗體。二價分子和雙特異性分子描述在這些文獻中，例如，Kostelny 等人(1992，J. Immunol. 148 :15467)、Pack和Pluckthun(1992， Biochemistry 31 1579)、Hollinger 等人(1993，supra)、Gruber 等人(1994，J. Immunol. 5368)、Zhu 等人(1997,Protein Sci. 6 :781)、Hu 等人(1996，Cancer Res. 56 :3055) ,Adams 等人(1993，Cancer Res. 53 :4026)和 McCartney 等人(1995，Protein Eng. 8 :301)。而且，如本文使用的術語“單克隆抗體”是指從基本相同的抗體克隆獲得的抗體分子，其對特定表位表現出單一結合特異性和親和力。通常，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每個重鏈和輕鏈均含有恒定區和可變區(該區域也稱為“結構域”)。輕鏈和重鏈可變區含有被稱為“互補決定區”或“⑶R”的三個高變區和四個“框架”區。該CDR主要負責結合到抗原的表位上。每個鏈的CDR通常指從N-末端開始按順序編號的CDR1、CDR2和CDR3，通常也通過特定CDR位于其中的鏈鑒定。如本文使用的術語“人源化抗體”是源于人免疫球蛋白的分子，指構成抗體的所有氨基酸序列，包括互補決定區和框架區，都由人免疫球蛋白組成。人源化抗體用于人治療一般至少具有三個潛在的優點。首先，它可以與人免疫系統更好地相互作用，例如，從而通過補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)更有效地破壞靶細胞。其次，人免疫系統不會將該抗體識別為外來的(foreign)。第三，其在人體循環中的半衰期類似于天然存在的人抗體，從而允許較小的給藥劑量和較不頻繁的給藥次數。因此，根據本發明的人單克隆抗體對在人內皮細胞上被表達的VCAM-I表現出強親和力，并有效地抑制白細胞粘附到表達VCAM-I的活化內皮細胞上。另外，因為它們的重鏈和輕鏈結構域都來源于人從而表現出低免疫原性，所以根據本發明的人單克隆抗體可以用于治療癌癥或炎性疾病，如哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞和移植排斥。如本文使用的術語“抑制白細胞和活化內皮細胞之間的相互作用”是指所有這樣的機制本發明的人單克隆抗體特異性結合到在活化內皮細胞上表達的VCAM-1，從而抑制在白細胞上被表達的VLA_4(極遲抗原-4)和α 4β1整聯蛋白與在內皮細胞上被表達的 VCAM-I之間的相互作用，或抑制內皮細胞之間形成間隙。該相互作用的抑制不局限于此，但例如，可以通過抑制白細胞粘附到活化內皮細胞上而進行，或通過降低ROS(活性氧物質) 和I^hoA(Ras同源基因家族，成員Α)的活性抑制內皮細胞之間形成間隙來進行。當免疫細胞如白細胞結合到內皮細胞時，內皮細胞信號轉導通路中的細胞內MioA和ROS被活化從而觸發使連結細胞的分子的牢固連接松散的信號轉導。隨后，內皮細胞之間的間隙擴大從而形成空穴(hole)。免疫細胞通過該空穴，并遷移到發炎部位。但是，本發明抗體降低了內皮細胞信號轉導通路中的ROS和I^hoA活性，使得內皮細胞之間的間隙形成得到抑制而不形成空穴。結果，阻止了免疫細胞遷移到發炎部位，從而抑制白細胞和活化內皮細胞之間的相互作用。根據本發明的一個實施方式，發現，本發明的人單克隆抗體4B在0. 1 μ g或更多量時對于白細胞粘附到人VCAM-I抗原表現出80%的抑制率，而本發明的人單克隆抗體7C和 7H在10 μ g量時對于白細胞粘附到人VCAM-I抗原表現出90%或更高的抑制率(圖4)。進一步地，發現，本發明的人單克隆抗體4B在0. 1 10. Oyg量時對于白細胞粘附到人內皮細胞表現出50 60 %的抑制率，而本發明的人單克隆抗體7C和7H在10 μ g量時對于白細胞粘附到人內皮細胞表現出50 60%或更高的抑制率(圖幻。該結果表明，本發明抗體有效地抑制了白細胞粘附到活化內皮細胞上。另外，發現，人單克隆抗體4B表現出約80% 的IihoA抑制，而人單克隆抗體7H表現出約30%的I^hoA抑制(圖6)，并且人單克隆抗體4B 表現出約65%的ROS抑制，而人單克隆抗體7H表現出約25%的ROS抑制(圖7)，表明本發明抗體有效地降低了 MioA和ROS的活性，從而阻止內皮細胞之間的間隙形成。這些結果揭示，這些抗體對白細胞和活化內皮細胞之間相互作用的抑制作用將可用于診斷和治療與 VCAM-I相關的疾病如炎性疾病或癌癥。在優選的實施方式中，本發明的人單克隆抗體可以包括重鏈可變區，其含有由SEQ ID NO. 2限定的重鏈⑶R1、由SEQ ID NO. 3限定的重鏈⑶R2和由SEQ ID NO. 4限定的重鏈 ⑶R3 ；以及輕鏈可變區，其含有由SEQ ID N0. 14限定的輕鏈⑶R1、由SEQ ID N0. 15限定的輕鏈⑶R2和由SEQ ID N0. 16限定的輕鏈⑶R3。更優選地，本發明的人單克隆抗體可以包括由SEQ ID NO. 1限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID N0. 13限定的輕鏈氨基酸序列。根據本發明的一個實施方式，包括由SEQ ID NO. 1限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID N0. 13 限定的輕鏈氨基酸序列的人單克隆抗體被命名為4B。根據一個優選的實施方式，人單克隆抗體對人VCAM-I具有親和力，并且人單克隆抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(Kd值)可以為1\10_、至9父101，該值可以通過利用BIAC0RE分析測定每個抗體對人VCAM-I抗原的締合/解離常數(Kd值)獲得。根據本發明的一個實施方式，發現人單克隆抗體4B對人VCAM-I抗原具有約InM的強親和力 (表1)，這揭示本發明抗體對VCAM-I具有強特異性親和力，因此本發明抗體可以用在需要 VCAM-I的抗原識別的任何應用中。根據一個優選實施方式，本發明的人單克隆抗體可以是特異性結合到小鼠血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)和人VCAM-I以便抑制白細胞和活化內皮細胞之間相互作用的人單克隆抗體。此種單克隆抗體是有利的，因為它結合到人和小鼠VCAM-1，S卩，具有交叉反應性， 因此可以用在小鼠的臨床前研究中。特異性結合到人和小鼠血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)的人單克隆抗體可以包括重鏈可變區，其含有由SEQ ID N0. 6限定的重鏈⑶R1、由SEQ ID N0. 7限定的重鏈⑶R2和由SEQ ID N0. 8限定的重鏈⑶R3 ；以及輕鏈可變區，其含有由SEQ ID N0. 18限定的輕鏈 CDRUfi SEQ ID N0. 19限定的輕鏈CDR2和由SEQ ID N0. 20限定的輕鏈CDR3。更優選的， 本發明的人單克隆抗體可以包括由SEQ ID N0. 5限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID N0. 17 限定的輕鏈氨基酸序列。根據本發明的一個實施方式，包括由SEQ ID N0. 5限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID NO. 17限定的輕鏈氨基酸序列的人單克隆抗體被命名為7C。進一步地，特異性結合到人和小鼠血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)上的人單克隆單體可以包括重鏈可變區，其含有由SEQ ID NO. 10限定的重鏈⑶R1、由SEQ ID NO. 11限定的重鏈⑶R2和由SEQ ID NO. 12限定的重鏈⑶R3 ；以及輕鏈可變區，其含有由SEQ ID NO. 22 限定的輕鏈⑶R1、由SEQ ID NO. 23限定的輕鏈CDR2和由SEQ ID NO. 24限定的輕鏈CDR3。 更優選的，本發明的人單克隆抗體可以包括由SEQ ID NO. 9限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID NO. 21限定的輕鏈氨基酸序列。根據本發明的一個實施方式，包括由SEQ ID NO. 9限定的重鏈氨基酸序列和由SEQID NO. 21限定的輕鏈氨基酸序列的人單克隆抗體被命名為7H。根據一個優選實施方式，人單克隆抗體對人VCAM-I具有親和力，并且人單克隆抗體與人和小鼠VCAM-I抗原的締合/解離常數(Kd值)可以為1 X KTkiM至9X101，該值通過可以利用BIAC0RE分析測定每個抗體對人VCAM-I的締合/解離常數(Kd值)獲得。根據本發明的一個實施方式，發現人單克隆抗體7C和7H對人和小鼠VCAM-I抗原具有約5 IOOnM的高親和力(表1)，這揭示本發明抗體對人和小鼠VCAM-I具有強特異性親和力，因此本發明抗體可以用在需要VCAM-I的抗原識別的任何應用中。就是說，本發明的人單克隆抗體對人VCAM-I，或者人和小鼠VCAM-I具有強特異性親和力，從而有效地抑制白細胞粘附到活化內皮細胞上，從而提供了對于VCAM-I相關的疾病如炎性病癥或癌癥有效的診斷和治療方法。在又一個方面，本發明涉及制備特異性結合到人，或者人和小鼠VCAM-I的人單克隆抗體的方法。本發明的單克隆抗體容易由產生單克隆抗體的眾所周知的方法產生。例如，制備單克隆抗體的方法可以通過利用從免疫動物中獲取的B白細胞產生雜交瘤而進行(Koeher and Milstein，1976，Nature，256 :495)，或利用噬菌體展示方法進行，但不局限于此。利用噬菌體展示的抗體文庫是這樣的方法，其利用直接從B淋巴細胞獲取的抗體基因在噬菌體表面上表達抗體，而不需要制備雜交瘤。噬菌體展示方法可以克服與通過B 細胞永生化產生單克隆抗體關聯的許多困難。常規噬菌體展示包含1)將具有隨機序列的寡核苷酸插入到與噬菌體外殼蛋白PlII (或piv)的N-末端對應的區域中；2)表達天然外殼蛋白和所述具有隨機序列的寡核苷酸編碼的多肽的融合蛋白；幻處理可以結合到所述寡核苷酸編碼的多肽的受體材料；4)利用低PH或具有結合競爭能力的分子洗脫結合在該受體上的肽-噬菌體顆粒力)擴增通過淘選在宿主細胞中洗脫下來的噬菌體；6)重復所述步驟以便獲得期望量的噬菌體；和7)通過對淘選選擇的噬菌體克隆進行DNA測序來測定活性肽的序列。在優選實施方式中，本發明單克隆抗體的制備方法可以通過噬菌體展示方法進行。本發明所屬領域的技術人員參考，例如由Barbas等人(METHODS :A Companionto Methods in Enzymology 2 :119,1991 and J. Virol. 2001 Jul ；75(14) :6692-9)和Winter 等人(Arm. Rev. Immunol. 12 :433,1994)公開的眾所周知的噬菌體展示技術能夠容易地進行上述步驟。可用于構建抗體文庫的噬菌體可以是絲狀噬菌體，例如，fd、M13、fl、Ifl、Ike、 Zj/Z、Ff、Xf、Pfl或Pf3，但不局限于此。而且，可用于表達絲狀噬菌體表面上的外源基因的載體可以是噬菌體載體如fUSE5、fAFFl、fd-CATl或fdtetDOG，或噬菌粒載體如pHEm、 pComb3、pComb8或pSEX，但不局限于此。
進一步地，可用于提供重組噬菌體成功再感染所需的天然外殼蛋白的輔助噬菌體可以由Mi;3K07或VSCM13示例，但不局限于此。根據本發明的一個實施方式，檢驗通過重組技術獲得的VCAM-I的分子量和純度， 然后將其用于制備單克隆抗體。通過噬菌體展示技術獲得的對人和小鼠VCAM-I具有特異性的人抗體是人源scFv (單鏈可變區片段)，并作為單噬菌體克隆被篩選，從而獲得22類對人VCAM-1，或者人和小鼠VCAM-I都具有特異性的單克隆噬菌體。如下獲得單克隆噬菌體。首先，使VCAM-I與來自具有多樣性的人幼稚scFv文庫細胞的文庫噬菌體反應，接著淘選并篩選強有力地結合到VCAM-I抗原的單克隆(表1和圖2)。通過指紋法確認所選的單克隆，接著進行測序從而確認該抗體的VH和VL的CDR區。通過NCBI網站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)的Ig BLAST程序研究上述抗體和種系(germ line)抗體組之間的同源性。結果，獲得對VCAM-I具有特異性的22類噬菌體抗體。進一步地，根據本發明的一個實施方式，構建了含有多核苷酸的表達載體，該多核苷酸編碼所選22類人抗體噬菌體的重鏈和輕鏈或其具有免疫活性的片段。在構建表達載體后，可以對表達調控元件，如啟動子、終止子和增強子，以及用于靶向膜或分泌的序列加以適當地選擇，并可為了某種目而將其結合使用，這取決于用于產生人抗體的輕鏈和重鏈或其片段的宿主細胞。本發明的表達載體包括質粒載體、粘粒載體、細菌噬菌體載體、病毒載體或類似載體，但不局限于此。合適的表達載體包括用于靶向膜或分泌的信號序列或前導序列以及表達調控元件，如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號和增強子，并可以根據其目的被構建成多種形式。進一步地，根據本發明的一個實施方式，本發明提供了識別與人抗體結合的人 VCAM-I抗原結構域的位置的方法。已報道VCAM-I由7個IgG-樣結構域組成，并且它的結構域1和4主要參與和其配體——整聯蛋白(α4β1或α4β7)的結合。根據本發明的一個實施方式，表達和純化人VCAM-I抗原的每個結構域(D1-D2、D1-D4、D1-D7)，然后進行 ELISA分析22類抗體的抗原結合區。結果，該抗原結合區根據抗體的類型而變化，并且在它們當中，獲得結合到結構域D1-D2的抗體4Β和7Η，以及結合到結構域D3-D4的抗體7C(圖 3)。進一步地，本發明中的VCAM-I介導白細胞和活化內皮細胞之間的相互作用，從而分析了該抗體對人白細胞(U937細胞)和用重組人VCAM-I或人TNF-α刺激的人內皮細胞 (HUVEC)之間相互作用的抑制活性。根據本發明的一個實施方式，用各種濃度的抗體處理人 VCAM-I固定化固體支持板或HUVEC單層板。為了檢驗該抗體是否抑制熒光標記的U937細胞和抗原的結合，測量了熒光強度。結果，所有三類抗體都表現出抑制活性。特別地，發現對人VCAM-I抗原表現出最強親和力的抗體4Β即使在低的濃度下也表現出強抑制活性(圖 4 禾口 5)。因為本發明的單克隆抗體對在多種細胞類型如人或小鼠細胞中表達的VCAM-I具有強親和力，所以它可以用于使用對VCAM-I抗原識別的任何應用中。此外，該單克隆抗體強有力地抑制白細胞結合到活化內皮細胞。所以，本發明提供了診斷和治療與VCAM-I相關的疾病如炎性疾病或類似疾病的有效方法。因此，可以將特異性結合到人VCAM-I，或者人和小鼠VCAM-I的本發明人單克隆抗體單獨使用，或者將其以藥物組合物形式，與藥學上可接受的載體一起用于診斷和治療與 VCAM-I相關的疾病。而且，本發明單克隆抗體也可以與其它抗體、生物活性劑或材料組合用于各種目的。例如，本發明單克隆抗體可以與4B9或其它抗-VCAM-I抗體組合用于治療以內皮中的 VCAM-I表達為特征的病癥。或者，本發明單克隆抗體可以與識別在炎癥事件中鑒定的其它內皮細胞受體(例如，ELAMl、ICAMl等)的抗體，以及用于炎性疾病的已知治療藥物組合使用。在再一方面，本發明提供了用于診斷炎性疾病或癌癥的組合物，該組合物包含人單克隆抗體。就是說，包含特異性結合到人VCAM-1，或者人和小鼠VCAM-I的單克隆抗體的診斷組合物可以用于診斷與VCAM-I表達相關的疾病或VCAM-I介導的疾病，例如，炎性疾病或癌癥。如本文使用的，術語“炎性疾病”可以包括，但不局限于與VCAM-I相關的炎性疾病，例如，哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞或移植排斥。用于診斷炎性疾病或癌癥的本發明組合物可以進一步包括藥學上可接受的載體， 并可以與該載體一起被配制。如本文使用的，術語“藥學上可接受的載體”是指不對活性成分的生物活性和特性造成損害的載體或稀釋劑。對于液體制劑，應當對該藥學上可接受的載體進行滅菌，使其適合于生物體。例如，該藥學上可接受的載體可以包括鹽水、無菌水、林格液、緩沖鹽水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇，或以上成分中的一種或多種的混合物。必要時，可以添加其它常見的添加劑，如抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑或類似物。而且，可以進一步添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑或潤滑劑以便將該組合物配制成注射制劑，如水溶液、懸浮液和乳液、丸劑、膠囊、顆粒或片劑。在再一方面，本發明提供了提供有關炎性疾病或癌癥的診斷信息的方法，該方法包含檢測懷疑患有炎性疾病或癌癥的對象生物樣本中的VCAM-I和人單克隆抗體之間的抗原-抗體反應的步驟。就是說，可以通過使本發明重組人單克隆抗體與生物樣本反應并檢測抗原-抗體復合物的形成來檢測VCAM-1。結果，可以提供有關炎性疾病或癌癥的診斷信肩、ο如本文使用的，術語“對象”包括，但不限于馬、狗、貓、豬、山羊、兔、倉鼠、猴、豚鼠、 大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、綿羊、牛、魚和鳥類，并指任何動物(如人)。如本文使用的，術語“生物樣本”可以是組織、細胞、全血、血清、血漿液、組織(腦、 皮膚、淋巴結、脊髓)的剖解樣本、細胞培養上清液、破壞性真核細胞和細菌表達系統，但不局限于此。VCAM-1、炎性疾病或癌癥的存在可以通過使經處理或未經處理的生物樣本與本發明單克隆抗體反應進行檢測。如本文使用的，術語“抗原-抗體復合物”是指樣本中的VCAM-I抗原和本發明單克隆抗體的組合物質。此種抗原-抗體復合物的形成可以通過選自比色法、電化學法、熒光法、發光測定法、顆粒計數法、視覺評估和閃爍計數法的方法檢測。然而，該方法不局限于上述實例而且有多種應用。可利用各種標記檢測本發明中的抗原-抗體復合物。其具體實例可以選自酶、熒光物質、配體、發光物質、微粒顆和放射性同位素，但不局限于此。
用作標記的材料的合適的實例包括作為酶的乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β -D-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶和內酰胺酶；作為熒光劑的熒光素、Eu3+、Eu3+螯合物和穴狀化合物；作為配體的生物素衍生物；作為發光物質的吖啶酯(acridinium ester), 異魯米諾衍生物；作為微顆粒的膠體金、彩色乳膠；和作為放射性同位素的ctCo、3H、125I、 125I-Bonton Hunter 試劑。優選地，抗原-抗體復合物可以通過利用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測。ELISA 技術包括直接ELISA，其利用識別粘附到支撐體的抗原的標記抗體；間接ELISA，其利用標記二抗，該二抗識別所捕獲的其中抗原粘附到支撐體上的抗原-抗體復合物的抗體；直接夾心ELISA，其利用識別粘附到支撐體上的抗原-抗體復合物的抗原的另一標記抗體；間接夾心ELISA，其利用另一標記二抗，該二抗在與識別粘附到支撐體上的抗原-抗體復合物的抗原的抗體反應后識別抗體。該單克隆抗體可以具有可檢測標記，另外該抗原-抗體復合物可以通過處理可捕獲本發明單克隆抗體并具有可檢測標記的另一抗體進行檢測。在再一個實施例中，本發明提供了用于炎性疾病或癌癥、包含人單克隆抗體的治療組合物，和治療炎性疾病或癌癥的方法，該方法包含給對象施用該治療組合物的步驟。用于炎性疾病或癌癥的本發明治療組合物可以進一步包括藥學上可接受的載體， 并可以與該載體一起被配制。有用的載體與以上描述的相同。在這方面，炎性疾病可以選自哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞和移植排斥，但不局限于此。根據本發明的一個實施方式，對小鼠哮喘進行了效力試驗，以便證實根據本發明的人單克隆抗體是否具有體內抗炎作用。在用抗VCAM-I人抗體處理后，炎性細胞，特別是淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的總數目顯著減少。也就是說，發現該抗體對哮喘中炎性細胞流入的抑制作用與當前用于治療哮喘的氨茶堿的抑制作用相似(圖8)。包含人單克隆抗體的本發明治療組合物可以藥學有效量的單劑量或多劑量形式施用。在這方面，該組合物可以以溶液、粉末、氣霧劑、膠囊、腸溶片或膠囊或栓劑形式施用。 考慮了各種施用方式，包括腹膜內施用、靜脈內施用、肌肉施用、皮下施用、皮內施用、經口施用、局部施用、鼻內施用、肺內施用和直腸內施用，但本發明不局限于這些示例的施用方式。然而，因為肽在口服施用后被消化，所以應當對用于經口施用的組合物活性成分進行包衣或配制以便阻止它們在胃中降解。另外，該藥物組合物可以利用能夠將該活性成分運送到靶細胞的某些器具施用。包含單克隆抗體的本發明組合物可以藥學有效量施用。該“藥學有效量”是指足夠以適用于醫學治療或預防的合理利益/風險比預防或治療疾病的量。該有效劑量的水平可以根據以下因素確定疾病的嚴重性，藥物活性，患者的年齡、體重、健康和性別，患者的藥物過敏性，施用時間、途徑和釋放率，治療持續時間，或者包括與本發明組合物混合在一起或與本發明組合物同時使用的藥物在內的元素，或者醫學領域中眾所周知的其它元素。另外，包含單克隆抗體的本發明組合物可以單獨施用或與其它治療劑組合施用，或者也可以與常規治療劑相繼施用或同時施用。在施用藥學有效量的本發明藥物組合物的情況下，對VCAM-I具有強親和力的本發明單克隆抗體特異性結合到在內皮細胞上表達的VCAM-I并使得VCAM-I中和。最終， 本發明單克隆抗體抑制白細胞粘附到內皮細胞上，從而治療VCAM-I介導的疾病。優選地，VCAM-I介導的疾病是炎性疾病或癌癥，更優選地，該炎性疾病是關節炎、鼻炎、多發性硬化癥、腸道疾病、哮喘、動脈硬化、心肌梗塞或移植排斥。在再一方面，本發明提供了利用根據本發明的人單克隆抗體抑制VCAM-I介導的白細胞粘附到內皮細胞的方法。也就是說，VCAM-I結合到在炎癥和免疫排斥反應中的活化白細胞上表達的VLA_4(極遲抗原-4)和α4β1整聯蛋白，并在促進內皮細胞和包括單核細胞和T細胞在內的白細胞之間的相互作用方面發揮著關鍵的作用。根據本發明的單克隆抗體特異性結合VCAM-1，從而抑制白細胞粘附到內皮細胞上。實施本發明的方式下文，將參考實施例更詳細地描述本發明。然而，下列實施例僅為說明本發明的目的而提供，因此本發明不意欲局限于此。實例1 人和小鼠VCAM-I抗原的制備<1-1> 人 VCAM-I 的克隆含有人VCAM-I基因(hMU012650) (Kugi#IRAU-75-G02)的質粒購自韓國生命科學與生物技術研究所(KRIBB)，人類基因組功能分析中心提供的KUGI (Korean UniGene Information)。該質粒用作模板DNA，為了僅表達VCAM-I的D1-D2結構域和D1-D4結構域,對于 VCAM-I 的 D1-D2 結構域，利用正向引物(5' -CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGA CCACCCC-3 ‘，SEQ ID NO. 25)和反向引物(5' -TAGCGGCCGACGCGGCCAATTGCAATTCTTTTACAG CCTG-3'，SEQ ID NO. 26)對每個基因進行擴增，而對于VCAM-I的D1-D4結構域，利用正向引物(5' -CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCCC-3'，SEQ ID N0. 27)和反向引物 (5' -TAGCGGCCGACGCGGCCAAGAGCTCCACCTGGATTCCCT-3'，SEQ ID N0. 28)對每個基因進行擴增。在用sfil處理后，利用連接酶分別將基因克隆到pI602-Fc載體和pI602-His唯一載體(由KRIBB構建的載體)中。在下面的PCR條件下獲得PCR產物對于50 μ 1的總反應體積，使IOOng模板在94°C下反應2分鐘，然后在94°C下反應30秒，在55°C下反應30秒， 并在72°C下反應1分鐘30秒(D1-D4)和45秒(D1-D2)，持續30個循環，然后在72°C下反應 10 分鐘。而且，檢驗了所克隆的 pI602-FC-VCAM-l-Dl-D2、pI602-His-VCAM-l-Dl-D2、 PYK602-FC-VCAM-1-D1-D4 和 pI602-His-VCAM-l-Dl_D4 載體的堿基序列。<1-2>VCAM_1蛋白質的表達和純化為了從對hVCAM-Ι具有強親和力的抗體中選取對mVCAM-1具有交叉反應性的抗體，制備了若干種蛋白質。在它們當中，含有整個分子的hVCAM-Fc-嵌合體(R&D系統，cat# 862-VC)和mVCAM-1-Fc嵌合體(R&D系統，Cat# :643_VM)是商購獲得的，含有每個VCAM-I 結構域的片段的表達和純化如下執行。首先，將5X IO6個細胞鋪于10個直徑為150mm的培養皿中，次日用 PEI (23966 美國 Polysciences 公司)處理 20 μ g 克隆的 pYK602-VCAM-l-Dl_D2 載體和 20 μ g pYK602-VCAM-l-Dl-D4載體的每一個以便進行轉染。次日，用不含血清的DMEM替換該培養基，然后每隔一天收集上清液，接著在10% SDS-PAGE凝膠中電泳并進行蛋白質印跡以便分析表達水平。收集其中hVCAM-l-Dl-D2-Fc和hVCAM-l-Dl-D4_Fc的表達被證實的上清液，并利用0. 22 μ m Top過濾器(Millipore，Cat# =SCGP T05RE)過濾從而獲得足夠量的蛋白質。 在使用之前如下純化該蛋白質。首先，用PBS洗滌Econo柱(Bio-Rad Cat. No 737—1006，
12IX 5cm)，然后裝填 500 μ 1 蛋白質 A(Amersham Cat. No. 17-1279-30)。在裝填期間，將 IOml PBS (pH 7. 4)施加到該柱子從而洗滌小珠(bead)，并施加30ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)作為結合緩沖液。隨后，利用蠕動泵(Bio-Rad Cat. No. 731-8142)，以0. 5ml/min的流速向其中施加所獲得的上清液。在結合到該柱之后，用PBS以2ml/min的流速對它進行洗滌，持續1小時，然后進行洗脫。利用500 μ 1 0. IM甘氨酸-HCl (pH 2. 5)洗脫，并添加1/10 體積的IM Tris-HCKpH 9.0)用于中和。在6個洗脫餾分當中，該蛋白質主要洗脫在#1和 #2餾分中。將這兩個餾分放在IOK透析膜中，接著在4L PBS中進行ο/η透析。上面所有過程都是在4°C的冷藏室內進行的。在量化之后，將該產物等分并儲存在_70°C下。純化之后， 在10% SDS-PAGE凝膠上證實該產物。分別獲得2. 8mg和800 μ g量的hVCAM-l-Dl-D2_Fc 和 hVCAM-l-Dl-D4-Fc。收集其中 hVCAM-l-Dl-D2_his 和 hVCAM-l-Dl-D4_his 的表達被證實的上清液，利用 0. 22 μ m Top 過濾器(Millipore,Cat# =SCGP T05RE)過濾，并利用 Lal^cale TFF 系統(Millipore，Cat# :XX42LSS11) Wpellicon XL 膜(Millipore，8K，cat# :ΡΧΒ0 08Α 50)濃縮至1/10的體積。將10倍體積的IMAC緩沖溶液(300mM KCl、50mM KH2P04、5mM咪唑、pH 8.0)添加到濃縮物中，并用IMAC緩沖溶液替換。利用ftOfinia 蛋白質純化系統 (Bio-fcid)的Bio-Scle Mini profinity IMAC cartridge (cat# :732-4610)，根據制造商的說明書以lml/min的速度純化。在4°C下利用膜(10K, 132574 :SPECTRAP0R,USA)在4L PBS 溶液中對洗脫液進行透析，持續4小時或更長時間，然后在4L預先冷卻的PBS溶液中再次透析過夜。在ο/η透析之后，將所得物轉移到e_管中，并通過Bradford法測定蛋白質濃度。 結果，獲得400μ ghVCAM-l-Dl-D4-his蛋白質，在10% SDS-PAGE凝膠中對其進行檢驗。實例2 文庫噬菌體的構建在37 °C下將具有多樣性的2. 7X IOltl個人scFv (單鏈可變區片段)文庫細胞在含有 17g 2 X YTCM [Tryptone (C0NDA, 1612. 00) UOg 酵母提取物(C0NDA, 1702. 00)、 5gNaCl (sigma, S7653-5kg) ,34 μ g/ml 氯霉素(sigma，C0857)) ]、2%葡萄糖(sigma，G5400) 和 5mM MgCl2 (sigma, M2393)的培養基(3L)中培養 2-3 小時(OD600 = 0· 5 0· 7)。此后， 用輔助噬菌體感染該細胞，接著在30°C下將該細胞在含有2XYTCMK[2XYT CM、卡那霉素 (sigma, K1876) 70 μ g/mlUmM IPTG (ELPISBI0，IPTG025)]的培養基中培養 16 小時。然后將該細胞離心(4500rpm，15min,4°C )，得到上清液，將該上清液溶解在添加有4% PEG (Fluka 81253)6000和3% NaCl (Sigma S7653)的溶液中，接著在冰上反應1小時。再次離心該反應物(8000rpm, 20min, 4°C )。將沉淀物溶解在PBS中，然后再次離心(12000rpm, IOmin, 4°C )。 結果，獲得含有文庫噬菌體的上清液，將其轉移到新管中并儲存在4°C下。實例3 通過噬菌體展示進行淘選當由7個IgG-樣結構域組成的VCAM-I與其配體——alpha4betal整聯蛋白 (α4β 1整聯蛋白)結合時，已知它的結構域1和4充當結合基序(binding motif)。因而， 利用人VCAM-l-Dl-D4(hVCAM-l-Dl-D4)以及整個VCAM-I分子進行淘選。在這個實施例中， 將描述針對hVCAM-l-Dl-D4的淘選方法和結果。<3_1> 在 hVCAM-l-Dl_D4 上的淘選在4°C下，利用旋轉機，使用包被緩沖液[包被緩沖液1. 59gNa2C03(sigma, S7795), 2. 93g NaHCO3(si gma , S8875),0.2g NaN3 (sigma, S2002)], M SOyghVACMl-Dl-D-His抗原包被免疫吸收管(Nunc 470319)。然后，在室溫下將該抗原溶解在PBS中2小時，接著在免疫管中用脫脂乳[(BD，232100)-4%，1XPBS中的]進行封閉 (block)。將2ml制備的文庫噬菌體添加到免疫管中，接著在室溫下反應2小時。免疫管用 PBST(0. 05% )洗滌5次，用PBS洗滌2次。洗滌后，利用IOOmMTEA(Sigma T-0886)洗脫抗原特異性scFV-噬菌體。用洗脫的噬菌體轉染大腸桿菌(XLl-Blue，stratagene, 200249)， 接著進行擴增。在第1輪淘選時擴增的噬菌體用PBST洗滌13次，用PBS洗滌23次，接著按照與以上描述的相同的方式——除了洗滌次數增加以外——進行第2-3輪淘選。為了利用第3輪多克隆噬菌體抗體的噬菌體抗體篩選對小鼠VCAM-I具有交叉反應性的抗體，利用 mVCAM-1-His作為抗原進行第四輪淘選。結果，結合到mVCAM-1-His上的噬菌體抗體數目沒有增加。然而，因為利用mVCAM-1-His抗原對對hVCAM_l_Dl_4具有結合能力的噬菌體抗體進行了第4輪淘選，由此可知，所得噬菌體抗體具有交叉反應性。進一步地，對來自第4輪淘選的噬菌體抗體進行第5輪淘選。結果，對抗mVCAM-1-His抗原的噬菌體的菌落滴度增加至少10倍(表1和圖1)。表1通過hVCAM-l-Dl-4抗原和mVCAM-l-His抗原淘選的結果
權利要求
1.人單克隆抗體，其特異性結合人血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)從而抑制白細胞與活化內皮細胞之間的相互作用。
2.根據權利要求1所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體進一步特異性結合小鼠血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)。
3.根據權利要求1所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區含有由SEQ ID NO. 2限定的重鏈⑶Rl、由SEQ ID NO. 3限定的重鏈⑶R2，和由SEQ ID NO. 4限定的重鏈⑶R3 ；所述輕鏈可變區含有由SEQ ID NO. 14限定的輕鏈CDR1、由SEQ ID NO. 15限定的輕鏈CDR2，和由SEQ ID NO. 16限定的輕鏈CDR3。
4.根據權利要求3所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體包含由SEQID NO. 1 限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID NO. 13限定的輕鏈氨基酸序列。
5.根據權利要求3所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(Kd值)為1 X KT11M至9 X IO-9M0
6.根據權利要求2所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區含有由SEQ ID NO. 6限定的重鏈⑶Rl、由SEQ ID NO. 7限定的重鏈⑶R2，和由SEQ ID NO. 8限定的重鏈⑶R3 ；所述輕鏈可變區含有由SEQ ID NO. 18限定的輕鏈CDR1、由SEQ ID NO. 19限定的輕鏈CDR2，和由SEQ ID NO. 20限定的輕鏈CDR3。
7.根據權利要求6所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體包含由SEQID NO. 5 限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID NO. 17限定的輕鏈氨基酸序列。
8.根據權利要求6所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體與人和小鼠VCAM-I抗原的締合/解離常數(Kd值)為IX KTkiM至9X10、。
9.根據權利要求2所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆單體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區含有由SEQ ID NO. 10限定的重鏈⑶R1、由SEQ ID NO. 11限定的重鏈⑶R2，和由SEQ ID N0. 12限定的重鏈⑶R3 ；所述輕鏈可變區含有由SEQ ID N0. 22限定的輕鏈⑶R1、由SEQ ID N0. 23限定的輕鏈⑶R2，和由SEQ ID N0. 24限定的輕鏈⑶R3。
10.根據權利要求9所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體包含由SEQIDN0.9 限定的重鏈氨基酸序列和由SEQ ID N0. 21限定的輕鏈氨基酸序列。
11.根據權利要求9所述的人單克隆抗體，其中所述人單克隆抗體與人和小鼠VCAM-I 抗原的締合/解離常數(Kd值)為IX KTkiM至9X10、。
12.根據權利要求1所述的人單克隆抗體，其中所述對白細胞和活化內皮細胞之間的相互作用的抑制是通過抑制白細胞粘附到活化內皮細胞上或通過降低ROS(活性氧物質) 和I^hoA(Ras同源基因家族，成員A)活性來阻止內皮細胞之間形成間隙進行的。
13.用于診斷癌癥或一種或多種炎性疾病的組合物，其包含根據權利要求1至12中任一項所述的人單克隆抗體，所述一種或多種炎性疾病選自哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞和移植排斥。
14.提供有關炎性疾病或癌癥的診斷信息的方法，所述方法包含檢測懷疑患有炎性疾病或癌癥的對象生物樣本中的VCAM-I和根據權利要求1至12中任一項所述的人單克隆抗體之間的抗原-抗體反應的步驟。
15.用于癌癥或一種或多種炎性疾病的治療組合物，其包含根據權利要求1至12中任一項所述的人單克隆抗體，所述一種或多種炎性疾病選自哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞和移植排斥。
16.用于治療癌癥或一種或多種炎性疾病的方法，其包含給對象施用根據權利要求15 所述的治療組合物的步驟，所述一種或多種炎性疾病選自哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞和移植排斥。
全文摘要
本發明涉及特異性結合VCAM-1的人單克隆抗體，以及用于治療炎性疾病或癌癥、包含該抗體的治療組合物。根據本發明的人單克隆抗體對在人或小鼠內皮細胞上表達的VCAM-1表現出強親和力，有效地抑制白細胞粘附到表達VCAM-1的活化內皮細胞上，并表現出低免疫原性，因此可用于治療癌癥或炎性疾病如哮喘、鼻炎、關節炎、多發性硬化癥、腸道疾病、動脈硬化、心肌梗塞和移植排斥。
文檔編號C07K16/18GK102369216SQ201080014771
公開日2012年3月7日 申請日期2010年3月31日 優先權日2009年3月31日
發明者尹志容, 崔昭瑛, 張明熙, 成炳濟, 文慶德, 樸芝賢, 樸榮祐, 李一仙, 李東垠, 李東憲, 李廷泰, 柳修娟 申請人:韓華石油化學株式會社