拮抗糖胺聚糖的mcp-1突變體及其用途的制作方法

專利名稱：拮抗糖胺聚糖的mcp-1突變體及其用途的制作方法
專利說明本發明涉及人單核細胞趨化因子蛋白I(MCP-I)的新突變體，以及它們用于炎性疾病的治療性治療的用途，所述新突變體與野生型MCP-I相比，具有增加的糖胺聚糖 (glycosaminoglycan, GAG)結合親和力和敲除或降低的GPCR活性。所有趨化因子，除了淋巴細胞趨化蛋白(lymphotactin)和CX3C趨化因子 (fraktaline)/神經趨化因子(neurotactin)(分別是C和CX3C趨化因子亞家族的成員) 外，在保守位置都具有4個半胱氨酸，分別基于N端兩個半胱氨酸之間氨基酸的存在與否， 可以將其分到C)(C或α-趨化因子和CC或β-趨化因子亞家族。趨化因子是小的分泌蛋白，作為細胞間的信使協調特定類型的白細胞活化，從血管腔遷移入組織(Baggiolini Μ.，J. Int. Med. 250,91-104 (2001)) 0該事件由趨化因子與靶細胞表面的7次跨膜G蛋白偶聯受體(GPCRs)的相互作用介導。這類相互作用在體內流動條件下發生。因此，需要建立局部濃度梯度，這通過趨化因子與細胞表面糖胺聚糖(G-protein-coupled receptors, GAGs)的相互作用來保證。趨化因子具有兩個與其受體相互作用的主要位點，一個在N端結構域(起觸發結構域的作用)，另一個位于第二個半胱氨酸后的暴露環內(起對接結構域(docking domain)的作用)(Gupta S. K. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 92, (17)， 7799-7803(1995))。趨化因子的GAG結合位點包括空間上分離的堿性氨基酸的簇(Ali S. et al.，Biochem. J. 358, 737-745 (2001))。一些趨化因子，諸如 RANTES，在 40s 環中具有 BBXB 模體(motif)作為主要GAG結合位點；IL-8通過C端α -螺旋和鄰近N環中的Lys 20與 GAGs相互作用。其他趨化因子，諸如MCP-I，顯示在包括受體結合和GAG結合位點的殘基之間存在顯著重疊(Lau Ε. K. et al.，J. Biol. Chem.，279 (21)，22294-22305 (2004))。就細胞因子的趨化因子-β家族來說，單核細胞趨化因子蛋白-I(MCP-I)是在各種以富集單核細胞的炎性成分為特征的疾病中發現的單核細胞和淋巴細胞特異性趨化因子和活化劑，所述疾病諸如動脈粥樣硬化(Nelken N. A. et al.，J. Clin. Invest. 88， 1121-1127(1991) ；Yla-Herttuala, S. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 88,5252-5256(1991), 類風濕性關節炎(Koch Α. Ε. et al.，J. Clin. Invest. 90,772-779(1992) ；Hosaka S. et al. , Clin. Exp. Immunol. 97 (3), 451-457 (1994), Robinson E. et al. , Clin. Exp. Immunol. 101 (3), 398-407 (1995)),炎癥性腸病(MacDermott R. P. et al.，J. Clin. Immunol. 19,266-272(1999))和充血性心力衰竭(Aukrust P.，et al.，Circulation 97， 1136-1143(1998), Hohensinner P. J. et al.，FEBS Letters 580,3532-3538 (2006)) 重要的是，不含MCP-I或其受體CCR2的敲除小鼠，無法將單核細胞和T細胞募集到炎性病變處(Grewal I. S. et al. , J. Immunol. 159 (1), 401-408 (1997), Boring L. et al.， J. Biol. Chem. 271 (13)，7551-7558 (1996)，Kuziel W. Α.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(22), 12053-8(1997), Lu B.，et al. , J. Exp. Med. 187 (4), 601-8 (1998))；此外，在數種動物模型中利用MCP-I中和抗體或其他生物拮抗劑的治療可以減輕炎癥(Lukacs N. W. et al. , J. Immunol.，158 (9)，4398-4404 (1997)，Flory C. M. et al. , 1. Lab. Invest. 69 (4)， 396-404 (1993)，Gong J. H.，et al.，J. Exp. Med. 186 (1)，131-7 (1997)，Zisman D. A. et al.， J. Clin. Invest. 99 (12)，2832-6 (1997))。最后，與 WT MCP-I 品系相比，LDL-受體/MCP-1-缺陷和apoB-轉基因/MCP-I-缺陷小鼠在其整個主動脈顯示顯著更少的脂沉積和巨噬細胞積聚(Alcami A. et al.，J. Immunol. 160 (2), 624-33 (1998), Gosling J. et al.，J. Clin. Invest. 103(6)，773-8(1999))。Potzinger et al. (Biochemical Society Transactions, 34,2006,435-437) 了作為基于蛋白的GAG拮抗劑的改良IL-8蛋白在炎癥環境中的生成。Piccinini et al.顯示了有限數量的MCP-I定點突變對增強糖胺聚糖結合的影響 (J Biol Chem. 2010 Jan 22.[電子出版早于印刷])。Proudfoot et al. (Proc. Natl. Acad. ki.，100，4，2003，1885-1890)研究了眾多 MCP-I中的趨化因子在其GAG結合位點中進行突變的效果。具體突變體(18AA19)-MCP-I僅顯示出對肝素的殘余親和力。US2003/0162737披露了治療肺高血壓的拮抗性MCP-I突變蛋白。所述MCP-I突變蛋白在其N端包含多個缺失，最多缺失1-10或2-8個N端氨基酸。而且，該突變蛋白可以在氨基酸位置22或M包含修飾。Steitz S. et al. (FEBS Letters，430，3，1998，158-164)研究了多種 N 端修飾對受體結合的作用。其披露了在氨基酸位置13和18包含取代的MCP-I突變體。Y13A誘導 THP-I趨化的功能顯著丟失。Lubkowski J. et al. (Nature Structural Biology，4，1，1997，64. 69)研究了重組人MCP-I的X-線晶體結構。該蛋白的N端被修飾，并測量了其對活性的影響。結果表明， 具體在位置10和13的修飾降低了 MCP-I活性，并對二聚體的穩定有影響。一些突變體的趨化活性受損提示Tyr28，Arg 29，Arg30和Asp68在功能方面的重要性。引人注意的是，帶電荷的氨基酸(Arg，Asp)使另一種二聚體發生去穩定化，而引入不帶電荷的殘基可以顯著提高穩定性。因為已經鑒定出第一批趨化因子及其受體，完全了解它們在正常和患病生理狀態中的作用的興趣變得越來越強烈。對新抗炎藥物(不同于現有藥物的作用方式)的恒定需要，支持了開發新的基于蛋白的GAG拮抗劑以及它們在炎性條件下的用途。在過去幾年已經仔細研究了 MCP-I與CCR2和GAGs相互作用的分子基礎，將趨化因子靶向修飾為MCP-I生物作用的有效拮抗劑是可行的。為了這個目的，已經制備了數種重組MCP-I變體，其與它們的野生型對應物競爭糖胺聚糖結合，并顯示對白細胞活化作用的減弱或敲除。因此，本發明的一個主題是，特別在炎性或變應性(allergic)進程中，通過利用基于MCP-I的突變蛋白拮抗GAG相互作用，抑制白細胞(更具體地是抑制單核細胞和T細胞)遷移。W02009/015884A1描述了，通過修飾野生型GAG結合區，或通過將新的GAG結合區導入MCPl蛋白、并同時敲除或降低其GPCR活性(尤其是趨化因子的CCR2活性)，得到具有更高GAG結合親和力的MCP-I突變體。W02009/015884A1描述了一些MCP-I蛋白，其中 MCP-I蛋白的區域通過結構保守方法進行修飾，方法是，導入堿性和/或供電子氨基酸或用堿性和/或供電子氨基酸取代天然氨基酸，以及可選的還通過添加、缺失和/或取代氨基酸，和，可選的，向突變MCP-I蛋白中添加N端甲硫氨酸(M)來修飾所述MCP-I蛋白的N端區域，導致趨化活性的部分或完全喪失，都在該文獻中予以披露。所述MCP-I突變體對于標準GAGs (肝素或硫酸乙酰肝素(h印aran sulfate))特別顯示Kd最少增加五倍，而在標準單核細胞的細胞培養物中顯示了在誘導鈣釋放方面的缺陷或降低。根據本發明，研發了具有更高GAG結合親和力的新的MCP-I突變體，其對標準 GAG(肝素或硫酸乙酰肝素)的Kd比野生型提高至少6倍。這是通過具體修飾野生型蛋白的氨基酸位置17和/或34來實現的。根據本發明的一個具體實施方案，所述MCP-I突變體還在氨基酸位置21包含修飾。還可以將本發明的這些突變MCP-I蛋白配制為藥物組合物，所述藥物組合物包括突變的MCP-I蛋白或編碼MCP-I突變蛋白的多核酸分子，含有編碼MCP-I突變蛋白的分離的DNA分子的載體，和可藥用載體。所述MCP-I突變蛋白或編碼其的多核苷酸或包含所述多核苷酸的載體還可以用于抑制或消除(inhibiting or suppressing)相應野生型蛋白的生物活性。本發明的MCP-I突變蛋白也可以用于制備治療慢性或急性炎性疾病或變應性疾病的藥物的方法。優選的，所述疾病選自類風濕性關節炎，葡萄膜炎，炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease),心肌梗死，充血性心力衰竭(congested heart failure), 糖尿病并發癥(如視網膜病，腎病等)或局部缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury)。附圖

圖1 :MCP_1突變體的序列，相對于野生型趨化因子的突變用下劃線標出。圖2 =MCP-I和多種MCP-I突變體對天然糖胺聚糖配體硫酸乙酰肝素的親和力(表示為解離常數Kd)。圖 3 表面等離子體共振分析-wtMCP-1/CCL2，Met-MCP-1 (Y13AS21K)和 Met-MCP-I (Y13AS21KQ23R)與未經分級分離的硫酸乙酰肝素的結合。已經證明通過增加GAG結合區中堿性和/或供電子氨基酸的相對量可以增加GAG 結合親和力(還描述于WO 05/(^4觀5，在此完整引入作為參考)，這產生了可以作為天然 GAG結合蛋白的競爭者的修飾蛋白。這尤其適用于白細胞介素_8。但對于MCP-I蛋白來說， 沒有公開GAG結合區的具體位點和它們通過選擇性導入至少兩個堿性和/或供電子氨基酸進行的修飾。此外，發現MCP-I的氨基端對經由其GPC受體CCR2進行的趨化因子信號轉導是非常重要的。為了構建基于MCP-I的拮抗劑，其他人以完全敲除MCP-I結合和保留CCR2結合完整的方式修飾MCP-I (W003084993A1)。利用這些方法，旨在通過封閉中性粒細胞上的 CCR2受體來阻斷MCP-I介導信號轉導和預防經由GAG鏈對內皮進行吸附。通過封閉內皮上的GAG鏈(通過構建更高的GAG結合親和力實現)來轉變這種方法以及敲除MCP-I的CCR2 結合不是顯而易見的。本發明現在提供一種新的MCPl突變蛋白，其與野生型MCPl蛋白相比，具有增加的 GAG結合親和力和降低的GPCR活性，其特征在于，通過將至少兩個氨基酸替換為堿性和/或供電子氨基酸(其中位置17或34的至少一個氨基酸被替換，并任選位置21、23或47的至少一個氨基酸被替換)，以結構保守地方式來修飾MCP-I蛋白。備選地，所述突變包括在位置17或34之一處的修飾、以及在位置21處的修飾。通過取代位置17和/或34的氨基酸，GAG結合親和力可以比已知的MCPl突變蛋白大大地進一步增強> 1. 5倍；優選> 2倍。意外發現，這些位置與GAG結合親和力高度相關，因為在多種已披露的MCP-I晶體結構的其中一種中，這些殘基附近發現了兩個硫酸根離子。還在MCP-I內部成功建立了第二個潛在GAG結合位點的模型。因此，用所提議的方法向這些位點進一步引入堿性氨基酸，不僅增加更高GAG結合親和力的可能性，還有可能擴展這些突變體在治療方案中的作用模式。根據具體的實施方案，修飾的MCP-I蛋白還包括，通過至少一個氨基酸殘基的添加、缺失和/或取代，對所述MCP-I蛋白N端區的前1到10個氨基酸中至少一個氨基酸進
一步修飾。如果被所述堿性或供電子氨基酸取代的天然氨基酸是堿性氨基酸，則取代的氨基酸必須是堿性更強的氨基酸，或包含不同于天然氨基酸殘基的另一種結構柔性。本發明的結構柔性被定義為，對GAG配體結合所致契合(fit)的適應程度。根據本發明的一個具體實施方案，被堿性和/或供電子氨基酸取代的天然氨基酸為非堿性氨基酸。根據本申請使用的定義，術語MCP-I突變蛋白還可以包括其仍然顯示趨化因子-樣折疊、但增加/敲除了諸如單核細胞或τ細胞趨化性和Ca釋放等趨化因子活性的任意部分或片段。本發明定義的術語“鄰近(vicinity) ”包括位于GAG結合位點的構象附近區域內但不位于GAG結合位點上的氨基酸殘基。構象鄰近區域可以被定義為在蛋白的氨基酸序列中接近GAG結合氨基酸殘基的氨基酸殘基，或由于蛋白的三維結構或折疊在構像上接近的
氨基酸。本發明的術語“接近(adjacent) ”被定義為位于待修飾的相應氨基酸殘基的不超過20nm，優選的15nm，優選的10nm，優選的5nm的截止半徑(cut-off radius)內。蛋白為了能夠發揮生物功能，由多種非共價相互作用(諸如氫鍵鍵合，離子相互作用，范德華力和疏水性堆積)驅動，而折疊成一種或多種特異性空間構象。三維結構可以通過已知的方法諸如X射線晶體成像或NMR光譜法來確定。天然GAG結合位點的鑒定可以通過誘變實驗來確定。蛋白GAG結合位點的特征在于位于蛋白表面的堿性殘基。為了驗證這些區域是否限定GAG結合位點，可以將這些堿性氨基酸殘基進行誘變，然后檢測肝素結合親和力的降低。這可以通過本領域已知的的任意親和力測量技術來進行。可以進行合理設計的誘變(通過插入或取代堿性或供電子氨基酸)，以便在天然 GAG結合位點附近導入外源氨基酸，這可以導致GAG結合位點大小的增加和GAG結合親和力的增加。所述大小可以通過向MCP-I蛋白中引入至少一個額外的氨基酸，尤其可通過引入至少兩個，更尤其引入至少三個氨基酸，而增加。根據本發明，通過far-UV⑶光譜法檢測，所述修飾的結構與野生型MCP-I結構的偏離低于30%，優選的低于20%，優選的低于10%被定義為結構保守性修飾。根據另一實施方案，結構保守性修飾不位于MCPl蛋白的N端內。與襯103-1的646結合域相關的關鍵殘基是附7，521，023，5；34和/或￥47。位置 17或34的至少一個氨基酸，以及任選位置21、23或47的至少一個氨基酸，通過插入堿性和 /或供電子氨基酸而被修飾。如果修飾位置17和34，并任選組合至少一個額外的修飾，與在這些位置進行單個修飾相比，GAG結合親和力更進一步增強。本發明的MCP-I可以在位置17，21，23，34和/或47包含任何組合的氨基酸修飾， 所得MCP-I突變蛋白具有比wt MCP-I增強的GAG結合。尤其是，在位置17，21，23，34和47的全部氨基酸都可以根據本發明進行修飾。所述修飾可以是，例如，用至少兩個堿性或供電子氨基酸進行替換或取代。供電子氨基酸是提供電子或氫原子的那些氨基酸(Droenstedt定義)。具體來說，這些氨基酸可以是N或Q。堿性氨基酸可以選自R、K和H。根據本發明進一步的實施方案，氨基酸位置18的R可以被修飾為K，和/或氨基酸位置19的K位可以被修飾為R，和/或P8可以通過任意氨基酸取代進行修飾，以至少部分減少經修飾的MCP-I的受體結合。可選的，本發明MCP-I突變蛋白的特征在于13位的Y還被任意氨基酸殘基取代， 優選的被A取代。Y13和R18被證明也是信號轉導的關鍵殘基，這些殘基被其他氨基酸殘基取代導致蛋白不能誘導趨化性。從缺失和取代MCP-I變體上記錄的二維1H-15N HSQC譜顯示,這些突變不產生錯誤折疊的蛋白(Chad D. Paavola et al. , J. Biol. Chem. ,273(50), 33157-33165(1998))。此外，N端甲硫氨酸降低MCP-I對THP-I細胞上CCR2的結合親和力(Hemmerich S. et al, Biochemistry 38 00)，13013-13025 (1999))，這樣的話[Met]-MCP-I 的趨化效應比野生型低大約 300 倍(Jamagin K. et al. , Biochemistry 38,16167-16177 (1999)) 這與有效受體拮抗劑[Met]-RANTES(不誘導趨化性但以高親和力結合受體)相反。因此，根據本發明的另一實施方案，MCP-I突變蛋白可以包含N端Met。保留N 端甲硫氨酸的MCP-I變體看起來對肝素的表觀親和力增加(Lau E.K.et al. , J.Biol. Chem. 279(21)，22294-22305(2004))。根據本發明，可以被修飾的野生型MCP-I區N端區包括前1到10個N端氨基酸。 本發明的MCP-I突變蛋白還可以缺失N端氨基酸殘基2-8。殘基2-8的截除([1+9-76] hMCP-Ι)產生無法誘導趨化性的蛋白。為了敲除GPCR活性并同時提高對GAGs的親和力，將修飾的數目盡可能降到最低， 使用生物信息學和生物結構學工具設計定點MCP突變體。這意味著，因為wtMCP-Ι的結構是已知的，所以突變體是合理設計的。這意味著為引入(knocking-in)更高的GAG結合親和力，通過取代以下氨基酸，將更多的GAG結合位點導入已經存在的GAG結合結構域不直接參與GAG結合的，結構上次要的，和因靠近堿性氨基酸諸如K或R而暴露于溶劑的。通過這樣做，注意力集中于維持MCP-I的特異性GAG相互作用位點，即負責以下作用的那些氨基酸與GAG配體的氫鍵鍵合和范德華接觸，以及趨化因子的總體折疊以保留趨化因子穿透趨化因子網絡的能力(其依賴于MCP-I表面包含的蛋白-蛋白相互作用)。修飾的MCP-I分子的氨基酸序列可以用下列通式來描述MCP-I突變蛋白，其特征在于，其包含以下通式的氨基酸序列(M)nQ (PDAINA (Zl))mVTCC (Xl) NFT (X2) (Z2) (Z3) I (X3) V (X4) RLASYRRITS (X5)KCPKEAVIFKTI (X6)AKEICADP KQKffVQDSMDHL DKQTQTPKT其中Zl選自P和A，G，L，優選的是A，
其中Z2選自R和K，其中選自K和R，其中Xl選自Y和/或A，優選是A，其中X2選自N，R，K，H，N或Q，優選是K，其中X3選自S，K，H，N和/或Q，優選是K，其中X4選自R，K，H，N和/或Q，優選是K或R，其中)(5選自5，1(，!^和/或0，優選是1(，其中)(6選自V，R，K，H，N和/或Q，優選是K，且其中η和/或m可以是0或1，且其中X1-X6的至少兩個氨基酸被修飾，條件是，位置X2或)(5的至少一個，以及任選地位置XI、X3或X4的至少一個被修飾。尤其是，本發明的MCP-I突變蛋白可以選自Met-MCP-I Y13A N17KS21K Q23K V47K, Met-MCP-I Y13A N17K S21K S34K, Met-MCP-I Y13AN17K S21K Q23K S34K 和 Met-MCP-I Y13A S21K Q23K S34K V47K。本發明的另一方面是編碼上述本發明蛋白的分離的多核苷酸分子。多核酸可以是DNA或RNA。因此導致產生本發明MCP-I突變蛋白的那些修飾可以在DNA或RNA水平進行。本發明分離的多核酸分子適合于診斷方法以及基因治療，和大規模產生本發明的MCP-I突變蛋白。另一方面涉及載體，其包含如上確定的本發明分離的DNA分子。所述載體包括用于有效轉染以及蛋白有效表達所需的所有調控元件。這類載體是本領域公知的，為了這個目的可以選擇任意合適的載體。本發明的另一方面涉及重組細胞，尤其是非人細胞，其被如上所述的本發明載體轉染。細胞的轉染和重組細胞的培養可以按照本領域公知的進行。這類重組細胞以及由此而來的任意后代細胞包括所述載體。因此，提供連續的或在活化時表達MCP-I突變蛋白(取決于載體)的細胞系。本發明的另一方面涉及一種藥物組合物，包括如上確定的本發明MCP-I突變蛋白、多核苷酸或載體，和可藥用載體。理所當然，所述藥物組合物還可以包括藥物組合物中通常存在的其他物質，諸如鹽，緩沖液，乳化劑，著色劑，等等。所述藥物組合物可以用本領域已知的任何途徑給藥，尤其是通過口服、皮下、靜脈、肌肉給藥或通過吸入給藥。本發明的另一方面涉及如上確定的本發明MCP-I蛋白、多核苷酸或載體在體內或體外用于抑制或消除相應野生型蛋白的生物活性的方法中的用途。如上所述，本發明的 MCP-I突變蛋白將起拮抗劑的作用，且本發明的MCP-I突變蛋白不會有已知的重組蛋白能引起的副作用中。在本例中，這特別是指涉及炎癥反應的生物活性。因此，如上確定的本發明MCP-I蛋白、多核苷酸或載體的進一步用途是用于產生治療炎性疾病的藥物的方法。具體來說，它將充當沒有副作用或副作用降低的拮抗劑，尤其適用于治療炎性疾病或病癥，無論是慢性病還是急性病。因此，本發明的另一方面是治療炎性疾病或變應性疾病的方法，其中給患者施用本發明的MCP-I突變蛋白、本發明的分離多核苷酸分子或載體或本發明的藥物制劑。
更具體來說，所述炎性疾病或變應性疾病是呼吸道變應性疾病諸如哮喘，過敏性鼻炎，C0PD，過敏性肺病，過敏性肺炎，間質肺病，(例如特發性肺纖維化，或與自身免疫病有關)，過敏反應或過敏癥應答，藥物變態反應和昆蟲叮咬變態反應；炎性腸疾病，諸如克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎；脊椎關節病，硬皮病；銀屑病和炎性皮膚病諸如皮炎，濕疹，特應性皮炎，變應性接觸性皮炎，蕁麻疹；血管炎；具有病因的自身免疫病，包括炎性成分諸如關節炎(例如類風濕性關節炎，慢性進育性關節炎，牛皮癬關節炎和變形性關節炎)和風濕病，包括涉及骨丟失、炎性疼痛、過敏癥(包括氣道過敏癥和皮膚過敏癥)和變態反應的炎性疾病和風濕病。具體的自身免疫疾病包括自身免疫血液病癥(包括例如溶血性貧血，再生障礙性貧血，純紅細胞貧血和自發性血小板減少)，系統性紅斑狼瘡，多軟骨炎，Wegener 肉芽腫病，皮肌炎，慢性活動型肝炎，重癥肌無力，銀屑病，Steven-Johnson綜合征，自身免疫炎癥性腸病(包括例如潰瘍性結腸炎在內，克羅恩氏病和過敏性腸綜合征)，自身免疫甲狀腺炎，Behcet' s病，內分泌眼病，Graves病，結節病，多發性硬化，原發性膽汁性肝硬化， 青少年糖尿病(I型糖尿病)，葡萄膜炎(前端和后端的)，干性角膜結膜炎和春季角膜結膜炎，間質肺部纖維化，和腎小球腎炎(患有和不患有腎病綜合征，例如，包括自發性腎病綜合征或微小病變腎病)；移植排斥(例如在移植中包括心臟，肺，組合的心-肺，肝，腎，胰腺，皮膚，或角膜的移植)包括同種異體移植排斥或異種移植排斥或移植-對-宿主疾病， 和器官移植相關的動脈硬化；動脈粥樣硬化；具有皮膚或器官白細胞浸潤的癌癥；血管的狹窄或再狹窄，尤其是動脈，冠狀動脈，包括導致血管介入以及新生內膜增生的狹窄或再狹窄；和其他疾病或病癥包括炎性應答，包括局部缺血再灌注損傷，血液惡性腫瘤，細胞因子誘導的毒性(例如膿毒性休克或內毒素性休克)，諸如視網膜病、腎病等糖尿病并發癥，多肌炎，皮肌炎，和肉芽腫疾病包括結節病。優選的，炎性疾病選自類風濕性關節炎，葡萄膜炎，炎癥性腸病，心肌梗死，充血性心力衰竭或局部缺血再灌注損傷。下列實施例更詳細地描述本發明，而不是限制本發明的范圍。 實施例對突變體進行以下分析參等溫熒光滴定(Isothermal fluorescence titrations，IFTs)，以研究對諸如硫酸乙酰肝素等糖胺聚糖配體增強的結合親和力。因該法是基于非固相配體，故所得結果與下述sra法互補。 表面等離子體共振(Surface plasmon resonance, SPR)實驗，以研究它們比野生型蛋白增強的結合親和力以及增強的結合動力學。為此，將強效GAG配體(硫酸乙酰肝素或硫酸軟骨素)固定在STO芯片上，于恒流實驗中定量測定所述相互作用。 在用熒光標記的wtMCP-Ι以及其它趨化因子進行的競爭試驗中，研究新的 MCP-I突變體相比于現有MCP-I突變體和野生型的競爭優勢。實施例1 用標準的基因合成技術構建WT MCP-I基因，密碼子使用特點按照大腸桿菌表達來優化，將該基因克隆到pJExpress 411載體(1)中。該載體的特點包括T7啟動子和卡那霉素抗性標記，前者用于該基因在大腸桿菌中被IPTG誘導而高水平表達，后者用于在大腸桿菌中進行篩選。每一突變的引入是通過從頭合成相應基因、并再摻入pJExpress 411表達載體而實現的。這些構建體經DNA測序而檢查后，進行蛋白表達。將含MCP-I突變基因的pJExpress 411質粒轉化到大腸桿菌菌株BL21-DE3中。制得起始培養物，用于進行蛋白表達。使培養物在3L Erlenmeyer搖瓶中含30 μ g/ml卡那霉素的LB培養液中37°C振蕩培養，直至0D_為0. 8。蛋白表達的誘導是通過添加1. OmM異丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷來實現。將細胞進一步振蕩保溫3-4小時，6，OOOx g離心10-15分鐘以進行收獲。將每g濕細胞團重懸于細1含IOmM KH2PO4 pH 7. 5的緩沖液中，在冰上超聲破碎。裂解物經 4°C, 20, OOOxg離心20分鐘而澄清。內含體沉淀團溶于IOml緩沖液，含IOmM KH2PO4 ρΗ7· 5， 鹽酸胍6Μ，每g濕細胞團室溫搖動3小時。20，OOOx g，4°C離心20分鐘后，4°C將上清對 IOmM KH2PO4 pH 7. 5進行透析。將沉淀旋降，將溶液上樣至SP-S印harose高效柱(Amersham Bioscience)。突變體用線性梯度進行洗脫從 IOmM KH2PO4 pH 7. 5 至 IOmM KH2PO4 pH 7.5， IM NaCl, 75分鐘，流速2ml/min。MCP-I突變體在0. 6-0. 8M NaCl被洗脫。將多個峰部級分合并，在C18柱上用反相HPLC純化。突變體用非線性梯度進行洗脫10%-40%乙腈(0，1% TFA) 5 分鐘，40% -60% 乙腈(0，1% TFA) 20 分鐘，以及 60% -90% 乙腈(0，1% TFA) 5 分鐘， 流速lOml/min。蛋白質在48 士 5%乙腈處被洗脫，上樣至上述SP-S印harose高效柱進行再折疊。將多個峰部級分對PBS透析，濃縮至lmg/ml。MCP-I突變體的純度和特性分別通過銀染 SDS-PAGE 和 nano-HPLC ESI-MS/MS 確認。熒光光譜法-穩態熒光測量在Jasco FP6500熒光儀(日本)LS50B熒光計上進行， 用Origin程序(Microcal Inc. , Northampton, MA)分析。所有實驗期間，用外部水浴將溫度維持在20°C。等溫熒光滴定實驗(IFT)-記錄每種突變體的1 μ M PBS液經處的激發后在 300-400nm范圍的發射光譜。激發和發射夾縫的寬度分別設為3和5nm。以500nm/min的速度記錄所述光譜。添加GAG試樣后平衡lmin，再記錄下一個光譜。在扣除本底后，將光譜整合，對從三個毒力實驗獲得的多個經標準化的熒光強度平均變化(-AFAg取平均值，并對應于所加配體的經體積校正的濃度做圖。所得結合等溫線的分析通過非線性回歸為別處 (44)記載的描述雙分子結合反應的等式來進行。結果見圖2。實施例2 表面等離子體共振分析-wtMCP_l/CCL2和本發明的MCP-I突變體與未經分級分離的硫酸乙酰肝素的結合在BIAcore X100設備(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)中進行研究。 按照最近的文獻描述的成熟方案，將生物素化肝素固定到被鏈霉親和素包被的SA感應芯片上。對于在含0.05% (v/v)Tween20表面活性劑(BIAcoreAB)的PBST pH 7. 4中25°C時的真實結合作用進行記錄。不同蛋白濃度的15min注射以30 μ 1/min的流速和60秒-120 秒的接觸時間進行，然后在緩沖液中進行60-120秒的解離，脈沖IM氯化鈉以便徹底再生。 蛋白與GAG表面結合的最大反應信號，是對應于各自感應圖譜的平臺期的那些，被用來進 Rkatchard作圖分析并計算平衡解離常數(Kd值)。所有實驗都在蛋白濃度1ηΜ_1，5μΜ 時進行。用BIAevaluation軟件計算，就是按照1 1的穩態相互作用模型，分別去吻合各個解離相。結果見圖3。
實施例3 在巰基乙醇酸誘導的腹膜炎模型中MCP-I突變體對炎性單核細胞浸潤的抑制效應巰基乙醇酸(thioglycolate，TG)-誘導的小鼠腹膜炎模型是急性炎癥模型，特征是單核細胞/巨噬細胞浸潤，在TG注射的16-M小時后達到峰值。因此，為評估體內抗單核細胞遷移活性，可以選用該模型。在有或無1 μ g或50 μ g/小鼠的MCP-1突變蛋白的條件下，腹腔注射ImL無菌巰基乙醇酸液)，16小時后收獲灌洗液，用流式細胞術進行分析。實施例4 實驗性自身免疫葡萄膜炎被MCP-I突變體改善葡萄膜炎是內眼的炎性自身免疫病，是發達國家致盲的主要原因之一。各種葡萄膜炎動物模型與人類疾病有多個共有特征，因此有助于理解葡萄膜炎的病理生理學，并允許評估和引入新的治療性處置和方案。Lewis大鼠中的實驗性自身免疫葡萄膜炎(EAU)由特異于視網膜抗原的⑶4+T細胞介導。它們一旦進入眼內，就分泌細胞因子和趨化因子，這些因子吸引白細胞到眼部。這些炎性浸潤物，主要是單核細胞/巨噬細胞，引起眼內組織的損傷。因此，在自身免疫葡萄膜炎的實驗性大鼠模型中測試MCP-I突變體的效果。將來自牛視網膜S抗原的致葡萄膜炎肽PDSAg，配弗氏完全佐劑(FCA)后，施加到兩條后腿中， 用結核桿菌菌株H37RA強化，以此進行主動免疫。這導致T細胞被初步活化，然后遷移并浸潤到眼內。這種現象始于免疫后約第8天。對5只Lewis大鼠，從主動免疫后的第1天直至第22天，每天用溶于PBS的MCP-I突變體(劑量為100 μ g/動物)或用PBS進行腹腔注射。每天用檢眼鏡檢查動物，以確定疾病的時程，根據雙眼/組動物/日的平均臨床評分來確定葡萄膜炎的臨床等級。實施例5 apoE+小鼠的多個再狹窄參數被MCP-I突變體改善動脈粥樣硬化及其臨床表現心肌梗死快要變成全球范圍內的最主要死因。動脈粥樣硬化是動脈壁的慢性炎性疾病，以流入單核細胞為特征，這些細胞釋放細胞因子和趨化因子來增加其補新(recruitment)和活化。因此，損害單核細胞補新應代表了將來臨床療法的極具價值的治療目標。我們測試了 MCP-I突變體在ApoE+小鼠中影響動脈粥樣硬化的全標記的能力。ApoE+小鼠被給予致動脈粥樣硬化的飲食，然后用線損傷常見的頸動脈，制得模型，沿血管進行3次穿透(passes)而進行內皮剝離。在損傷的前一天以及之后的每一天， 對小鼠腹腔給予10 μ g溶于PBS的MCP-I突變體或僅給予載體(PBS)，共3周。3周后，原位灌注，再切取頸動脈，用4%福爾馬林固定，包埋在石蠟中。與此同時，另一些動物在剝離M小時后分離頸動脈，用注射泵以MOPS-緩沖的生理鹽水進行體外灌注。單核MonoMac6細胞(500. 000/mL)用Calcein-AM(Molecular Probes)標記，并在將頸動脈與1 μ g/ml、5 μ g/ml和10 μ g/ml MCP-I突變蛋白預保溫后以 5yL/min進行灌注。MonoMace與受損血管壁的粘附作用(滯留，卷起)用頻閃觀測儀的表面焚光照度(stroboscopic epifluorescence illumination)來記錄。
實施例6:心肌梗死的多個參數被MCP-I突變體改善在心肌梗死(MI)小鼠模型中進一步研究MCP-I突變蛋白的活性。事實上，心肌梗死還觸發復雜的以細胞因子和趨化因子增加為特征的炎癥反應，其導致單核細胞在缺血部位補新。在單核細胞浸潤受損的動物模型中進行的研究顯示，在實驗性誘導心肌梗死后，新內膜的形成減少，但保持了心臟功能。在對照小鼠和經MCP-I突變蛋白處理的小鼠中，對左前降動脈(left anterior descending artery)進行30分鐘的近端連接，以誘導Ml。在外科手術后的10分鐘和2小時之時，腹腔給予10，5和1 μ g劑量的MCP-I突變體，然后每連續7天每天進行治療(組大小n = 5)。實施例7:MCP-I突變體在多發性硬化動物模型中的效力多發性硬化(MQ是人中樞神經系統(CNQ最常見的炎性脫髓鞘疾病。MS病理學的特征是，血腦屏障(BBB)被打破，伴有巨噬細胞和T淋巴細胞向CNS中的浸潤。這些細胞向CNS實質中的遷移看來至少部分地受趨化因子調節，在這些趨化因子中，MCP-I似乎起主要作用。MCP-I和CCR2在MS中的表達和細胞定位已在三個區室中描述腦，腦脊髓液和血液。尤其重要的是所報告的以下發現在活性脫髓鞘性以及在慢性活動性MS損傷中， 反應性肥大性星形細胞對MCP-I產生強烈的免疫反應，提示MCP-I在降解髓磷脂的巨噬細胞的補新和活化中的重要作用，并因此引起MS的進展。在同一研究中，血管外周和實質部位的泡沫巨噬細胞不表達MCP-I蛋白。因為泡沫巨噬細胞顯示類似于抗炎M2巨噬細胞那樣的表型，它們很可能引起炎癥的消退，并因此負責抑制進一步的損傷進展并促進損傷修復。 靶向MCP-I的治療性方法因此可以特異性針對炎性M1，不影響抗炎性/修復性M2巨噬細胞。MCP-I突變蛋白可以在大鼠-M0G35_55-誘導的C57BL/6雌性小鼠慢性EAE模型中測試。已有人報道，免疫后第7天時未出現臨床病灶，但循環的細胞因子和趨化因子增加(包括JE 鼠MCP-1)，從這開始治療，經腹腔途徑給予40，200和400 μ g/kg (約1，5和10 μ g/ 小鼠)，持續21天。可以用地塞米松作為參考化合物，用與MCP-I突變體相同的給藥途徑和給藥方案給予lmg/kg地塞米松。每天監測體重和臨床評分，以評估動物的健康和疾病進展程度。收集脊柱和腦， 進行組織學分析，以便根據臨床評分(TBA)的陽性效果評估對炎性浸潤和脫髓鞘的治療效果。后續實驗旨在評估MCP-I突變蛋白在在復發延遲型EAE模型中阻止/減少復發率和嚴重性方面的活性。為此，在復發延遲型EAE的PLP-SJL小鼠模型中，每天給予MCP-I突變蛋白。每天的記錄和終點都與前面的實驗相同，但還計算復發和延遲的次數和持續時間。
權利要求
1.MCPl突變蛋白，具有與野生型MCP-I蛋白相比增強的GAG結合親和力和降低的GPCR 活性，其特征在于，所述MCP-I蛋白通過將至少兩個氨基酸替換為堿性和/或供電子氨基酸而以結構保守的方式來修飾，其中按照SEQ ID NO. 1編號的位置17或34的至少一個氨基酸被替換，并任選位置21、23或47的至少一個氨基酸被替換。
2.權利要求1的MCP-I突變蛋白，其特征在于，位置17和34的氨基酸都被修飾。
3.權利要求1的MCP-I突變蛋白，其特征在于，位置21的氨基酸以及位置17或34的氨基酸都被修飾。
4.權利要求1-3之一的MCP-I突變蛋白，其特征在于，野生型MCP-I蛋白N端前1_10 個氨基酸的至少一個氨基酸通過添加、缺失和/或替換至少一個氨基酸而被修飾。
5.權利要求1-4之一的MCP-I突變蛋白，其特征在于，所述以結構保守的方式進行的修飾是，通過far-UV CD光譜法檢測，所述被修飾的結構相比于野生型MCP-I結構的偏離低于 30%，優選低于20%。
6.權利要求1-5之一的MCP-I突變蛋白，其特征在于，堿性氨基酸選自R，K，H。
7.權利要求1-6之一的MCP-I突變蛋白，其特征在于，供電子氨基酸選自N或Q。
8.權利要求1-7之一的MCP-I突變蛋白，其特征在于，位置13的Y被A取代。
9.權利要求1-8之一的MCP-I突變蛋白，含N端Met。
10.權利要求1-9之一的MCP-I突變蛋白，其中N端氨基酸殘基2-8都缺失。
11.MCP-I突變蛋白，其特征在于，包含以下通式的氨基酸序列(M)nQ (PDAINA (Zl))mVTCC (Xl) NFT (X2) (Z2) (Z3) I (X3) V (X4) RLASYRRITS (X5)KCPKEAVIFKTI(X6)AKEICADPKQ KffVQDSMDHL DKQTQTPKT其中Zl選自P和A，G，L，優選的是A，其中Z2選自R和K，其中Z3選自K和R，其中Xl選自Y和/或A，優選是A，其中X2選自N，R，K，H，N或Q，優選是K，其中X3選自S，K，H，N和/或Q，優選是K，其中X4選自札1(，!^和/或0，優選是1(或1 ，其中)(5選自S，K，H，N和/或Q，優選是K，其中X6選自V，R，K，H，N和/或Q，優選是K，且其中η和/或m可以是0或1，且其中X1-X6的至少兩個氨基酸被修飾，條件是，位置X2或)(5的至少一個，以及任選地位置XI、X3或X4的至少一個被修飾。
12.MCP-I 突變蛋白，選自 Met-MCP_1Y13AN17K S21K Q23K V47K, Met_MCP_lY13A N17K S21K S34K，Met-MCP-lY13A N17K S21K Q2!3KS34K和Met_MCP_lY13A S21K Q23K S34K V47K。
13.分離的多核酸分子，其特征在于，編碼權利要求1-12之一的蛋白。
14.載體，其特征在于，包含權利要求13的分離的DNA分子。
15.重組非人細胞，其特征在于，被權利要求14的載體轉染。
16.藥物組合物，其特征在于，包含權利要求1-12之一的蛋白，或權利要求13的多核酸分子，或權利要求14的載體，以及可藥用載體。
17.權利要求1-12之一的MCP-I突變蛋白，或權利要求13的多核酸分子，或權利要求 14的載體，在體外抑制或消除相應野生型蛋白的生物學活性的方法中的用途。
18.權利要求1-12之一的MCP-I突變蛋白，或權利要求13的多核酸分子，或權利要求 14的載體，在制備治療急性或慢性炎性疾病或自身免疫病的藥物的方法中的用途。
19.權利要求18的用途，其特征在于，所述炎性疾病選自類風濕性關節炎，葡萄膜炎， 炎癥性腸病，心肌梗死，充血性心力衰竭，或局部缺血再灌注損傷，多發性硬化和動脈粥樣硬化。
全文摘要
人單核細胞趨化因子蛋白1(MCP-1)的新突變體，以及它們用于炎性疾病的治療性治療的用途，所述新突變體與野生型MCP-1相比，具有增加的糖胺聚糖(GAG)結合親和力和敲除或降低的GPCR活性。
文檔編號C07K14/52GK102378765SQ201080014445
公開日2012年3月14日 申請日期2010年1月29日 優先權日2009年1月30日
發明者A.孔格爾 申請人:普羅塔芬生物技術股份公司