在糖工程化的酵母巴斯德畢赤酵母中對半乳糖同化途徑的代謝工程化的制作方法

專利名稱：在糖工程化的酵母巴斯德畢赤酵母中對半乳糖同化途徑的代謝工程化的制作方法
在糖工程化的酵母巴斯德畢赤酵母中對半乳糖同化途徑的
代謝工程化
背景技術：
(1)發明領域本發明涉及低等真核細胞，例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，其通常不能利用半乳糖作為碳源，但通過基因工程化細胞為表達包含Leloir途徑的酶中的幾種，使其能夠利用半乳糖作為單一碳源。具體地，細胞被基因工程化為表達半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶，以及任選地半乳糖通透酶。另外，本發明進一步涉及用于改進在已被基因工程化為產生具有N-聚糖(其具有半乳糖殘基)的糖蛋白但通常缺乏包含Leloir途徑的酶的低等真核細胞中具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的產量的方法，包含用編碼半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向異構酶和半乳糖-ι-磷酸尿苷酰轉移酶的一個或多個核酸分子轉化低等真核細胞。(2)相關領域的描述基于蛋白的療法組成了藥物發現的最活躍領域之一并被期望是未來十年新的治療用化合物的主要來源(Walsh，Nat. Biotechnol. 18(8) :831-3 (2000)) 0治療用蛋白 (在它們的天然狀態未被糖基化)可在缺乏糖基化機制的宿主中表達，例如埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)。但是，大多數治療用蛋白是糖蛋白，其需要在蛋白的特定天冬酰胺殘基翻譯后添加聚糖，以確保正確的折疊和隨后在人血清中的穩定性(Helenius 和Aebi，Science 291 :2364-9 (2001)) 0在一些情況中，治療用蛋白的效力已通過在另外的糖基化位點中的工程化而被改進。一個實例是人紅細胞生成素，其添加另外兩個糖基化位點后已表明在體內顯示三倍長的半衰期(Macdougall等人，J.Am. Soc. Nephrol. 10 2392-2395(1999))。意在人中用于治療用途的大多數糖蛋白需要N-糖基化，因此，哺乳動物細胞系，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其具有類似的人糖蛋白加工，目前最常用于生產治療用糖蛋白。但是，這些細胞系具有明顯的缺點，包括較差的基因溯源性、較長的發酵時間、異源糖基化和正在發生的病毒污染問題(Birch和Racher, Adv.藥物Deliv. Rev. 58 671-85(2006) ；Kalyanpur, Mol.Biotechnol. 22 :87-98(2002))。許多工業蛋白表達系統基于可在化學上成分確定的培養基中生長至高細胞密度且通常不受上述限制的酵母菌株(Cereghino和Cregg FEMS Microbiol. Rev. 24 45-66(2000) ；Hollenberg 禾口 Gellisen， Curr. Opin. Biotechnol. 8 :554-560(1997)； Muller，酵母14 U67-1283 (1998)。盡管酵母已被用于生產缺乏糖基化的治療用蛋白，例如胰島素，但是其仍未被用于糖蛋白生產，因為酵母產生具有非人的、高甘露糖型N-聚糖的糖蛋白(參見圖1)，其產生具有縮短的體內半衰期并在高等哺乳動物中具有免疫原潛能的糖蛋白(Tanner 等人，Biochim. Biophys. Acta. 906 :81-99 (1987))。為解決這些問題，本發明人和其他研究者已聚焦到各種不同酵母和絲狀真菌中糖基化途徑的再工程化，以從這些蛋白表達宿主中獲得人樣糖蛋白。例如，Gerngr0ss等人， 美國公開的申請號2004/0018590 (所述公開內容在此通過參考并入本文)提供酵母巴斯德畢赤酵母的細胞，其已被基因工程化為消除酵母和絲狀真菌典型的高甘露糖-型N-聚糖的產生和提供具有糖基化機制的宿主細胞以產生具有雜合或復合N-聚糖的糖蛋白，即哺乳動物細胞產生的更典型的糖蛋白。Gerngross等人如上公開了重組酵母菌株，該重組酵母菌株可生產其上高百分比的N-聚糖含有半乳糖殘基的重組糖蛋白S卩，產生主要具有寡糖結構 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Gl)或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G2)和較少量寡糖結構 GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO)的N-聚糖的酵母菌株。已獲得70-85%的G2產率。但是，已發現在這些細胞中生產的一些糖蛋白例如免疫球蛋白和免疫粘附素，其中GO G1/G2的比值降低至約2 1(參見例如，Li等人，Nature Biotechnol. 24 :210-215 Q006)，其中通過用半乳糖和可溶型β -1，4-半乳糖基轉移酶體外處理糖蛋白，這些細胞中半乳糖末端的N-聚糖的產率得到改進)。相反，哺乳動物細胞例如CHO細胞中生產的免疫球蛋白的GO G1/G2 的比值約1 1。因此，期望的是提供能夠在體內產生GO G1/G2比值小于2 1的重組糖蛋白的重組酵母宿主細胞。巴斯德畢赤酵母僅可利用有限數量的碳源以生存。目前，這些碳源是甘油、葡萄糖、甲醇以及可能是鼠李糖和甘露糖，但不是半乳糖。期望的是具有可利用上述所列以外的碳源的巴斯德畢赤酵母菌株。發明概述本發明解決了上述確定的問題。本發明提供方法和材料用于從缺乏同化半乳糖作為碳源的能力的宿主細胞產生具有利用半乳糖作為能源的能力的重組宿主細胞。當重組宿主細胞被進一步基因工程化為生產具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白時，該宿主細胞能夠產生重組糖蛋白例如抗體，其中GO G1/G2比值小于2 1、或 GO G1/G2比值為1 1或更小或GO G1/G2比值為1 2或更小。一般而言，所述包括將編碼Leloir途徑酶(半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶以及任選地半乳糖通透酶)引入宿主細胞核酸分子。因此，本文中的方法和材料提供選擇系統，其僅通過在含有半乳糖作為碳源的培養基上培養細胞可用于鑒定已被轉化宿主細胞，以及提供用于生產糖蛋白(具有高水平的末端的或含有半乳糖的N-聚糖)例如免疫球蛋白的方法。利用半乳糖作為碳源的能力提供了選擇使用的表達系統的靈活性和經濟性。例如，在設計用于表達具有末端半乳糖或末端唾液酸化的重組糖蛋白的系統中，可將半乳糖添加至培養基，半乳糖被細胞吸收和被細胞利用作為能源并提供半乳糖殘基用于參入 N-聚糖，其在重組糖蛋白上被合成。本發明的優勢是通過使半乳糖存在于培養基或在發酵過程中添加半乳糖和/或誘導重組糖蛋白，重組蛋白的生產可得到高水平的半乳糖基化的或唾液酸化的糖蛋白。因此，如巴斯德畢赤酵母所表明的，通常缺乏Leloir途徑的酵母物種，以本文公開的方式基因工程化巴斯德畢赤酵母產生可利用半乳糖作為單一碳源的重組巴斯德畢赤酵母細胞系。另外，基因工程化巴斯德畢赤酵母細胞系(包括Leloir途徑酶和使得細胞能夠產生具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白所需的酶)產生了這樣的重組細胞系，其中半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的產率大于缺乏Leloir途徑酶的細胞系。因此，本發明引起了已被基因工程化為生產半乳糖基化的或唾液酸化的糖蛋白的巴斯德畢赤酵母細胞系的增加的生產率。具體地，本發明提供了用于在體內生產具有高水平半乳糖或唾液酸的抗體的方法
6和材料。利用本發明的方法和材料，將半乳糖添加至細胞生長培養基以完成多個目的，包括 (a)能夠利用半乳糖作為糖源的宿主細胞的選擇；(b)提供用于宿主細胞生長的碳源和(C) 提供用于參入N-聚糖的半乳糖殘基來源，其作為N-聚糖中的末端半乳糖殘基或提供底物用于末端唾液酸殘基隨后添加至N-聚糖。因此，本發明提供方法和材料，通過該方法和材料，可通過體內過程而不是使用更低效和更昂貴的體外反應使半乳糖基化的水平增加，在體外反應中，帶電的半乳糖和可溶性半乳糖基轉移酶被添加至含有純化的但部分半乳糖基化的重組糖蛋白的培養基或溶液中。本發明的一個實施方案是發展能夠在半乳糖作為單一碳能源存在的培養基上生存的巴斯德畢赤酵母宿主細胞。利用本發明的方法和材料，本領域普通技術人員將能夠從本文公開的利用半乳糖作為碳源的轉化的宿主細胞生產重組糖蛋白用于選擇和維持轉化的宿主細胞。另外，當宿主細胞已被基因工程化為產生半乳糖基化的或唾液酸化的N-聚糖時，通過提供具有半乳糖的細胞培養基，本發明可用于增加從細胞產生的半乳糖基化的或唾液酸化的糖蛋白的水平。因此，提供巴斯德畢赤酵母宿主細胞，其已被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、 UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性，以及任選地半乳糖通透酶活性，其中所述宿主細胞能夠利用半乳糖作為單一碳能源。在具體方面，巴斯德畢赤酵母宿主細胞已被進一步基因工程化為能夠產生這樣的重組糖蛋白，其具有包含半乳糖殘基的雜合或復合N-聚糖。在具體實施方案中，UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性被提供在融合蛋白中，所述融合蛋白包含半乳糖基轉移酶的催化結構域和UDP-半乳糖-4-差向異構酶的催化結構域。一般而言，宿主細胞能夠產生具有復合N-聚糖的糖蛋白，其中復合N-聚糖的 GO G1/G2比值小于2:1。在具體實施方案中，上述細胞產生的糖蛋白主要具有選自fedGlcNACMan5GlcNAc2、 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan3GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 禾口 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 的 N-聚糖。在另外的實施方案中，N-聚糖是半乳糖末端的N-聚糖，其選自 GalGlcNAcMan5GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 禾Π Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在其他實施方案中，N-聚糖是半乳糖末端的雜合N-聚糖；以及在另外的實施方案中，N-聚糖是唾液酸化的 N-聚糖，其選自 NANAfeilGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 和 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。另外提供的是在巴斯德畢赤酵母宿主中生產具有N-聚糖的重組糖蛋白的方法， 所述N-聚糖具有半乳糖殘基，所述方法包括a)提供重組宿主細胞，其已被基因工程化為表達(i)糖基化途徑，其使得所述宿主細胞能夠產生重組糖蛋白，所述重組糖蛋白具有包含半乳糖殘基的雜合或復合N-聚糖；(ii)半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性；和(iii)重組糖蛋白；和b)在含有半乳糖的培養基中培養所述宿主細胞以產生具有一個或多個N-聚糖的重組糖蛋白，所述N-聚糖具有半乳糖殘基。在所述方法的進一步的方面，UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性被提供在融合蛋白中，所述融合蛋白包含半乳糖基轉移酶的催化結構域和UDP-半乳糖-4-差向異構酶的催化結構域。本發明另外提供選擇表達異源蛋白的重組宿主細胞的方法。用編碼異源蛋白和不存在于重組宿主細胞的Leloir途徑酶的一個或多個核酸分子轉化表達一種或兩種但不是全部的Leloir途徑酶活性的重組宿主細胞。由于轉化的重組宿主細胞含有完整的Leloir 途徑，從非轉化的細胞中選擇表達異源蛋白的轉化的重組宿主細胞可通過在半乳糖是單一碳源的培養基中培養轉化的重組宿主細胞獲得。因此，另外提供的是產生表達異源蛋白的重組宿主細胞的方法，其包括(a)提供已被基因工程化為表達一種或兩種酶的宿主細胞， 所述酶選自半乳糖激酶、UDP-半乳糖-4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶；(b) 用編碼異源蛋白和在步驟(a)的宿主細胞中不表達的選自步驟(a)的酶或多種酶的一個或多個核酸分子轉化所述宿主細胞；和(c)在含有半乳糖作為單一碳能源的培養基中培養所述宿主細胞以提供表達異源蛋白的重組巴斯德畢赤酵母宿主細胞。在所述方法的進一步的方面，宿主細胞被基因工程化為表達半乳糖通透酶。在還進一步的方面，宿主細胞被基因修飾以產生糖蛋白，所述糖蛋白具有一個或多個包含半乳糖的N-聚糖。另外提供的是產生和選擇能夠利用半乳糖作為單一碳源的巴斯德畢赤酵母宿主細胞的方法，所述方法包括a)提供巴斯德畢赤酵母宿主細胞；b)用編碼半乳糖激酶活性、 UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶的一個或多個核酸分子轉化所述宿主細胞；c)在含有半乳糖作為單一碳源的培養基上培養轉化的宿主細胞；和d)選擇可以在含有半乳糖作為單一碳源的培養基上生長的宿主細胞。本文中的宿主細胞和方法能夠生產包含重組糖蛋白的組合物，其中在藥學上可接受的載體中重組糖蛋白上的GO G1/G2糖形的比值小于2 1。在具體實施方案中，重組糖蛋白選自紅細胞生成素(EPO)，細胞因子例如干擾素α、干擾素β、干擾素Y和干擾素 ω，和粒細胞集落刺激因子(GCSF)，GM-CSF，凝固因子例如因子VIII、因子IX和人蛋白C， 抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受體α -鏈，免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合體和IgM，免疫粘附素和其它Fc融合蛋白例如可溶性TNF受體-Fc融合蛋白，RAGE-Fc融合蛋白，白細胞介素，尿激酶，糜蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制劑，IGF-結合蛋白，表皮生長因子，生長激素釋放因子，膜聯蛋白V融合蛋白，制管張素，血管內皮生長因子-2，骨髓樣前體抑制因子-1，骨保護蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白，DNA酶II，人纖溶酶原的三環3，葡糖腦苷脂酶，TNF結合蛋白1，促卵泡激素，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4-Ig，跨膜激活劑和鈣調節劑和親環蛋白配體，胰高血糖素樣蛋白1和IL-2受體激動劑。在另外的實施方案中，糖蛋白是抗體，具體是人源化的、嵌合或人抗體。在具體實施方案中，抗體選自抗_Her2抗體、抗-RSV(呼吸道合胞病毒)抗體、抗-TNFa抗體、 抗-VEGF抗體、抗-⑶3受體抗體、抗-⑶41 7E3抗體、抗-⑶25抗體、抗-⑶52抗體、抗-⑶33 抗體、抗-IgE抗體、抗-CDlla抗體、抗-EGF受體抗體和抗-CD20抗體及其變體。抗體的實例包括莫羅單抗-CD3、阿昔單抗、利妥昔單抗、達珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉姆單抗奧佐米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、阿達木單抗、奧馬珠單抗、托西莫單抗-1311、依法利珠單抗、西妥昔單抗、戈利木單抗和貝伐單抗。在還進一步的實施方案中，糖蛋白是Fc融合蛋白，例如依那西普。
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盡管巴斯德畢赤酵母證實作為如本文所公開的可被修飾的宿主細胞的實例，但是方法和宿主細胞不限于巴斯德畢赤酵母。本文的方法可用于產生來自其他低等真核細胞物種的重組宿主細胞，所述物種通常不表達Leloir途徑酶并如此不能利用半乳糖作為碳源。 因此，在另外的實施方案中，宿主細胞是通常不表達Leloir途徑酶的任何低等真核細胞物種。定義除非另有定義，本文所用的所有技術和科學具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。另外，除非上下文另有要求，單數術語應包括復數和復數術語應包括單數。通常地，所用的相關命名和本文所述的生化、酶學、分子和細胞生物學、微生物學、遺傳學以及蛋白和核酸化學以及雜交技術是本領域熟知并通常使用的。本發明的方法和技術通常根據本領域熟知的常規方法并如貫穿本說明書引用和討論的各種一般和更具體的參考中所述的進行，除非另有說明。參見，例如，Sambrook等人Molecular Cloning A Laboratory Manual,2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ；Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992,禾口 Supplements to 2002) ；Harlow 禾口 Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) ；Taylor 禾口 Drickamer, Inrroduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003) ；Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. , Freehold, NJ ；Handbook of Biochemistry :Section A Proteins,Vol I,CRC Press (1976) ；Handbook of Biochemistry :Section A Proteins, Vol II, CRC Press(1976) ；Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)。示例性方法禾口材料如下述，雖然與本文所述類似或等同的方法和材料也可用于本發明的實踐并應對本領域普通技術人員是顯而易見的。本文提及的所有公開和其他參考通過參考對于它們引用的公開內容而被整體引入。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。材料、方法和實施例僅是說明性的，且意圖不是以任何方式限制。以下術語，除非另有說明，應理解具有以下含有 如本文所用，術語“人源化的”、“人源化，，和“人樣，，可互換地使用，是指以一種方
式工程化非人細胞例如低等真核宿主細胞的方法，其中該方式引起工程化的細胞具有產生蛋白特別是糖蛋白的能力，所述糖蛋白具有糖基化，比相同物種的非工程化的、野生型非人細胞產生的糖蛋白具有更類似哺乳動物糖基化的模式。人源化可對于N-糖基化、O-糖基化或二者進行。例如，野生型巴斯德畢赤酵母和其它低等真核細胞通常在N-糖基化位點產生高甘露糖基化的蛋白。在本發明優選的實施方案中，本發明的“人源化的”宿主細胞能夠產生具有雜合和/或復合N-聚糖的糖蛋白；即“人樣N-糖基化”。人源化的宿主細胞產生的糖蛋白上主要存在的特定“人樣”聚糖將取決于進行的特定人源化步驟。
如本文所用，術語“N-聚糖”和“糖形”可互換地使用和是指N-連接的寡糖，例如， 通過天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺連接而連接到多肽的天冬酰胺殘基的寡糖。N-連接的糖蛋白含有連接到蛋白中天冬酰胺殘基的酰胺氮上的N-乙酰基葡糖胺殘基。糖蛋白上發現的主要糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰基-神經氨酸(NANA))。對于N-連接的糖蛋白，糖基團的加工在ER的腔中與翻譯同時發生并在高爾基體中繼續。N-聚糖具有共同的五糖核心Man3GlcNAc2( “Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖和“NAc”是指N-乙酰基、GIcNAC是指N-乙酰基葡糖胺)。根據分支(觸角)的數量，N-聚糖不同，所述分支(觸角)包含被添加至Man3GlcNAc2 ( "Man3")核心結構(還稱為“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”)的外周糖(例如GlcNAc、半乳糖、果糖和唾液酸)。N-聚糖根據它們分支的成分(例如高甘露糖、復合或雜合)而分類。“高甘露糖”型 N-聚糖具有5個或更多個甘露糖殘基。“復合”型N-聚糖通常具有至少一個連接至1，3甘露糖臂的GlcNAc和至少一個連接至“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂的GlcNAc。復合N-聚糖也可具有半乳糖(“foil”)或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)殘基，其任選地用唾液酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神經氨酸和“Ac”是指乙酰基)修飾。復合N-聚糖也可具有鏈內置換，其包含“等分的”GlcNAc和核心果糖(“Fuc”)。復合 N-聚糖也可在“三甘露糖核心”上具有多個觸角，通常稱為“多觸角聚糖”。“雜合” N-聚糖在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端具有至少一個GlcNAc并在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上具有0或多個甘露糖。多種N-聚糖也稱為“糖形”。圖2顯示多種高甘露糖、雜合和復合N-聚糖，其已在基因工程化為產生哺乳動物樣N-聚糖的巴斯德畢赤酵母中產生。如本文所用，術語“0-聚糖”和“糖形”可互換地使用和是指0-連接的寡糖，例如， 經由絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基連接至肽鏈的聚糖.在真菌細胞中，天然0-糖基化通過將在內質網中從多萜醇單磷酸甘露糖(Dol-P-Man)轉移的第一個甘露糖基殘基連接到蛋白而發生，和另外的甘露糖基殘基可在高爾基體中經由從GPD-Man轉移而被連接。高等真核細胞，例如人或哺乳動物細胞，通過將N-乙酰基-半乳糖胺(GlcNac)共價連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基經歷0-糖基化。如本文所用，術語“人樣0-糖基化”應理解為含義是真菌-特定的磷酸化甘露糖結構被降低或消除，引起電荷和甘露糖結構的降低或消除，或糖蛋白上存在的和糖蛋白組合物中的主要0-聚糖種類包括具有選自GlcNac、Gal或NANA (或Sia)的末端殘基加帽的聚糖。以這種方式，具有主要人樣0-糖基化的重組糖蛋白可被人或哺乳動物細胞識別， 如同它是天然產生的糖蛋白，其產生重組糖蛋白的改進的治療用性質。本文所用的縮寫是本領域常見使用的，參見，例如，上述糖的縮寫。其他常見縮寫包括“PNGase”或“聚糖酶”或“葡糖苷酶”均是指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2. 18)。如本文所用，術語“抗體”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子”可互換地使用。每個免疫球蛋白分子具有獨特結構，使得其結合它的特異性抗原，但所有免疫球蛋白具有本文所述的相同整體結構。基礎的免疫球蛋白結構單元已知包括亞基的四聚體。每個四聚體具有兩對相同的多肽鏈，每對具有一個“輕”鏈(LC)(約25kDa)和一個“重”鏈(HC)(約 50-70kDa)。每個鏈的氨基-末端部分包括約100-110或更多個氨基酸的可變區，主要負責抗原識別。每個鏈的羧基-末端部分確定恒定區，主要負責效應物功能。輕鏈(LCs)被分類為K或λ。重鏈(HCs)分類為γ、μ、α、δ或ε和確定抗體同種型分別為IgG、IgM、 IgA、IgD 和 IgE。輕和重鏈被亞分類為可變區和恒定區(通常參見Fundamental Immunology (Paul, W. , ed. ,2nd ed. Raven Press，N. Y.，1989)，Ch. 7。每個輕 / 重鏈對的可變區形成抗體結合位點。因此，天然抗體具有兩個結合位點。除了雙功能或雙特異抗體，兩個結合位點是相同。鏈都顯示相同的通常結構，被三個高度可變區連接的相對保守構架區 (FR)，還稱為互補決定區或⑶R。來自每對的兩個鏈的⑶R通過構架區連接，使得結合特異性表位。術語包括天然形成形式、以及片段和衍生物。包括在術語范圍內的是免疫球蛋白 (Igs)的種類，稱為IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。還包括在術語范圍內的是IgG的亞型，稱為 IgGU IgG2、gG3和IgG4。術語用于最廣泛的含義并包括單個單克隆抗體(包括激動劑和拮抗劑抗體)以及結合多個表位或抗原的抗體組合物。術語特定地覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異抗體(例如雙特異抗體)和抗體片段，只要它們含有或被修飾為含有重鏈免疫球蛋白恒定區的G2結構域的至少一部分，其包括(^2結構域的 N-連接的糖基化位點或其變體。包括在術語內的是僅包含Fc區的分子，例如免疫黏附素 (美國公開的專利申請號20040136986)、Fc融合和抗體樣分子。可選地，這些術語可以是指至少Fab區的抗體片段，其至少含有N-連接的糖基化位點。術語“Fe”片段是指抗體的“片段結晶的”C-末端區，其含有G2和Ch3結構域。術語“Fab”片段是指抗體的“片段抗原結合”區，其含有VH、ChUVl和Q結構域。如本文所用術語“單克隆抗體”(mAb)是指獲自基本上均一的抗體群體的抗體，即包含群體是相同的單獨的抗體，除了可以小量存在的可能天然存在的突變。單克隆抗體是高度特異性的，是針對單個抗原性位點。另外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體制備物相反，每個mAb針對抗原上的單個決定簇。除了它們特異性，單克隆抗體是有利的，原因在于它們可以是通過雜交瘤培養合成的，不被其他免疫球蛋白污染。術語“單克隆”指示抗體的特征為獲自基本上均一的抗體群體，并且不解釋為要求通過任何具體方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可由Kohler等人， (1975)Nature, 256 :495首次描述的雜交瘤方法制備或可通過重組DNA方法制備(參見，例如，Cabilly等人的美國專利號4，816，567)。 在術語“抗體”或“免疫球蛋白”范圍內的術語“片段”包括those通過用多種蛋白酶消化產生的、通過化學切割和/或化學解離產生的和重組地產生的片段，只要片段保持能夠特異性結合靶分子。在這類片段中的是Fc、Fab、Fab，、FV、F(ab，)2和單鏈Fv (scFv) 片段。下文中，術語“免疫球蛋白，，也包括術語“片段”。免疫球蛋白另外包括免疫球蛋白或片段，其在序列上已被修飾但保持能夠特異性結合靶分子，包括物種間嵌合和人源化的抗體；抗體融合；異聚體抗體復合物和抗體融合，例如雙抗體(雙特異抗體)，單鏈雙抗體和胞內抗體(參見，例如，Intracellular Antibodies :Research and Disease Applications, (Marasco,ed. ,Springer-Verlag New York, Inc.，1998)。術語“催化抗體”是指能夠催化生化反應的免疫球蛋白分子。催化抗體是本領域熟知的并已被描述在Schochetman等人的美國專利號7，205，136 ；4, 888，281和5，037，750， 以及 Barbas，III 等人的美國專利號 5，733，757 ；5, 985, 626 和 6，368,839 中。如本文所用術語“載體”意圖是指能夠轉運已被連接的另一個核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，在其中另外的DNA片段可被連接。其他載體包括黏粒、細菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可連接至病毒基因組(如下更詳細討論)。某些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自我復制(例如，載體具有在宿主細胞中發揮作用的復制起點)。其
11他載體在引入宿主細胞后可以被整合到宿主細胞的基因組，以及從而隨宿主基因組一起復制。另外，某些優選的載體能夠引導被可操作地連接的基因的表達。這類載體在本文稱為 “重組表達載體”(或簡稱“表達載體”)。如本文所用，術語“目的序列”或“目的基因”是指核酸序列，通常編碼蛋白，其通常不能在宿主細胞中產生。本文公開的方法使得穩定整合到宿主細胞基因組中的一個或多個目的序列或目的基因的有效表達。目的序列的非限制實例包括編碼一個或多個具有酶促活性的多肽的序列，例如，所述酶為在宿主中影響N-聚糖合成酶，例如甘露糖基轉移酶、N-乙酰基葡糖胺轉移酶、UDP-N-乙酰基葡糖胺轉運蛋白、半乳糖基轉移酶、UDP-N-乙酰基半乳糖基轉移酶、唾液酸轉移酶和巖藻糖基轉移酶。術語“標記序列”或“標記基因”是指這樣的核酸序列，其能夠表達使得對于在宿主細胞存在或缺乏序列進行陽性或陰性選擇的活性。例如，巴斯德畢赤酵母URA5基因是標記基因，因為它的存在可以是通過含有基因的細胞在尿嘧啶缺乏下生長的能力而被選擇。它的存在還可通過含有基因的細胞不能在5-F0A存在下生長而被選擇。標記序列或基因不必需地顯示陽性和陰性可選擇性。來自巴斯德畢赤酵母的標記序列或基因的非限制實例包括 ADE1、ARG4、HIS4和URA3。對于抗生素抗性標記基因，通常利用卡那霉素、新霉素、遺傳霉素 (或G418)、巴龍霉素和潮霉素抗性基因以允許在這些抗生素存在下生長。術語“可操作地連接”表達控制序列是指這樣的連接，其中表達控制序列與目的基因是連續的以控制目的基因以及表達控制序列，其以反式或以一定距離發揮作用以控制目的基因。術語“表達控制序列”或“調節序列”可互換地使用和如本文所用是指多核苷酸序列，其對影響被可操作地連接的編碼序列的表達是必需的。表達控制序列是控制轉錄、轉錄后事件和核酸序列翻譯的序列。表達控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效RNA加工信號例如剪切和多聚腺苷酸信號；穩定細胞質mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(例如，核糖體結合位點)；增強蛋白穩定性的序列和當期望時，增強蛋白分泌的序列。這類控制序列的性質根據宿主生物而不同；在原核生物中，這類控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列。術語“控制序列”意圖最小程度地包括其存在對表達是必要的所有成分，還可包括其存在是有利的另外的成分，例如，引導序列和融合配偶體序列。如本文所用，術語“重組宿主細胞”(“表達宿主細胞”，“表達宿主系統”，“表達系統”或簡稱"宿主細胞")意圖是指重組載體已被引入其中的細胞。應理解的是這類術語意圖不僅是指具體對象細胞，而且是指這類細胞的后代。因為某些修飾可在后代中發生，原因在于突變或環境影響，這類后代實際上可以與母本細胞不相同，但仍包括在本文所用的術語“宿主細胞”范圍內。重組宿主細胞可以是分離的細胞或在培養物中生長的細胞系或可以是存在于活體組織或生物中的細胞。術語“真核”是指有核細胞或生物并包括昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞和低等真核細胞.術語“低等真核細胞”包括酵母、真菌、領鞭毛蟲、微孢子蟲、alveolate"例如腰鞭毛蟲)、原生藻(例如褐色藻類、原生動物)、紅藻(例如紅藻(red algae))、植物(例如綠藻、植物細胞、苔蘚)和其它原生生物。酵母和絲狀真菌包括但不限于巴斯德畢赤酵母、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小畢赤酵母(Pichia minuta) (Ogataea minuta> Pichia lindneri) > Pichia opuntiae> Pichia thermotolerans>^P-^ 赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普畢赤酵母(Pichia pi jperi)、樹干畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬的種 (Pichia sp.)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌屬的禾中(Saccharomyces sp.)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬的種(Kluyveromyces sp.)、 乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、構巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、 里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、鍵抱菌屬的禾中(Fusarium sp.)、禾谷鍵抱菌(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens 禾口粗糙脈胞菌(Neurospora crassa)。本文所用術語“肽”指短的多肽，例如通常少于約50個氨基酸長度且更通常少于約30個氨基酸長度的多肽。如本文所用的術語包括類似物和模擬結構并因此模擬生物學功能的模擬物。術語“多肽”包括天然形成的和非天然形成的蛋白及其片段、突變體、衍生物和類似物。多肽可單體的或多聚體的。另外，多肽可包括多個不同結構域，其中各個具有一種或多種獨特的活性。術語“分離的蛋白”或“分離的多肽”是這樣的蛋白或多肽，由于其衍生的起源或來源(1不與在其天然狀態中伴隨它的天然結合的成分結合，(2)在自然界中未發現以純化物存在，其中可以就其它細胞成份而論判斷純化物(例如，不含來自同一物種的其它蛋白質)，(3)由來自不同物種的細胞表達，或(4)在自然界中不存在(例如，它是在自然界中發現的多肽的片段或它包括在自然界中沒有發現的氨基酸類似物或衍生物或不是標準肽鍵的連接)的蛋白質或多肽。因此，化學合成的多肽或在與多肽所來源的細胞體系不同的細胞體系中合成的多肽將從其天然結合的成分中“分離”。也可以使用本領域熟知的蛋白純化技術，通過分離，使多肽或蛋白質基本上不含或純化天然結合的成分。如這樣所定義的，“分離的”不必要求這樣描述的蛋白質、多肽、肽或寡肽已經從其自然環境中物理地移出。本文所用術語“多肽片段”是指具有缺失，例如，與全長多肽比較的氨基端和/或羧基端缺失的多肽。在優選的實施方案中，多肽片段是連續序列，其中片段的氨基酸序列與在天然存在的序列中的相應位置同一。片段的長度典型地為至少5、6、7、8、9或10個氨基酸，優選至少12、14、16或18個氨基酸，更優選至少20個氨基酸，更優選至少25、30、35、40 或45個氨基酸，甚至更優選至少50或60個氨基酸，和甚至更優選至少70個氨基酸。修飾的衍生物”指在一級結構序列中基本上同源的，但包括，例如，在體內的或在體外的化學修飾和生物化學修飾的、或摻入在天然多肽中沒有發現的氨基酸的多肽或其片段。這樣的修飾包括，例如，乙酰化、羧化、磷酰化、糖基化、泛素化、標記例如用放射性核素、和各種酶的修飾，如將容易被本領域的技術人員所了解的。標記多肽的多種方法和用于此目的的多種取代物或標記物為本領域所熟知，并包括放射性同位素例如125I、32P、35S、 和咕，結合至標記的抗配體(例如，抗體)的配體，熒光團，化學發光劑，酶，和可以用作標記的配體的特異性結合配對成員的抗配體。標記物的選擇依賴于所需要的靈敏度、與引物
13結合的容易程度、穩定性要求、和可利用的儀器。用于標記多肽的方法為本領域所熟知。 見，例如，Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992，和2002的增刊)(通過引用并入本文中)。術語“嵌合基因”或“嵌合核苷酸序列”是指核苷酸序列，其包含偶聯到異源核苷酸序列的核苷酸序列或片段。嵌合序列用于融合蛋白的表達。嵌合基因或嵌合核苷酸序列也可包括一個或多個片段或結構域，其對于意圖的宿主細胞是異源的，并且可具有產生異源重組蛋白的優勢性質。通常，嵌合核苷酸序列包括來自基因的至少30個連續核苷酸，更優選至少60或90或更多個核苷酸。嵌合核苷酸序列在本發明中具有特別用途，所述嵌合核苷酸序列具有至少一個對于意圖的宿主細胞是異源的但與意圖的重組蛋白同源的片段或結構域。例如，意圖用于在利用巴斯德畢赤酵母宿主細胞以表達重組人糖蛋白的表達系統中的嵌合基因應優選具有至少一個片段或結構域，其是人來源的，例如編碼具有潛在治療用價值的人蛋白的序列，而嵌合基因的其余部分，例如應使得宿主細胞處理并表達嵌合基因的調節序列，應優選是巴斯德畢赤酵母來源的。如果期望的，人來源的片段也可以是對于在宿主細胞中表達是密碼子最優化的。(參見，例如，美國專利6，884，602，在此通過引用并入)。術語“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是指包含與異源氨基酸序列偶聯的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因為它們可以被構建以包含來自兩種或更多種不同蛋白的兩個或多個所需功能元件。融合蛋白包含來自目的多肽的至少10個連續氨基酸，優選至少20 或30個氨基酸，甚至更優選至少40、50或60個氨基酸，還更優選至少75、100或125個氨基酸。包括整個本發明蛋白的融合具有特殊的效用。包含于本發明融合蛋白內的異源多肽的長度為至少6個氨基酸，通常至少8個氨基酸，和有用地為至少15、20、和25個氨基酸。 融合體還包括較大的多肽、或甚至整個蛋白質，例如綠色熒光蛋白(“GFP”)，具有特殊效用的含發色團的蛋白質。可以通過將編碼多肽或其片段的核酸序列在框內與編碼不同蛋白質或多肽的核酸序列一起構建，然后表達融合蛋白，來重組產生融合蛋白。或者，可以通過交聯多肽或其片段至另一蛋白質，來以化學方法產生融合蛋白。術語“非肽類似物”是指具有與那些參考多肽類似的性質的化合物。非肽化合物也可以稱為“肽模擬物”或“擬肽”.參見，例如，Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press(1992) ；Jung, Combinatorial Peptide and Nonpeptide 文庫A Handbook, John Wiley (1997) ；Bodanszky 等，Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag(1993) ；Synthetic Peptides :A Users Guide, (Grant,編輯， W. H. Freeman and Co. , 1992) ；Evans 等，J. Med. Chem. 30 :1229(1987) ；Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 :29(1986) ；Veber禾口Freidinger，Trends Neurosci.，8 :392-396(1985)；禾口在以上各出版物中所引用的參考文獻，其通過參考并入本文。這樣的化合物經常在計算機分子模擬的幫助下開發。在結構上與本發明的有用肽相似的肽模擬物可用于產生同等作用并因此被考慮為本發明的一部分。術語“區域”如本文所用是指生物分子的一級結構的在物理上的鄰接部分。對于蛋白質而言，區域被定義為該蛋白質的氨基酸序列連續部分。術語“結構域”如本文所用是指作用于生物分子已知或未知功能的生物分子結構。 結構域可與區域或其部分共延伸；結構域也可以包括生物分子的不同的、非連續的區域。
如本文所用，術語“分子”意思是任意化合物，包括但不是限于小分子、肽、蛋白質、 糖、核苷酸、核酸、脂類等，并且這樣的化合物可以是天然的或合成的。如本文所用，術語“包括”(“comprise”)或變化例如“包括”(“comprises”)或 “包括”(“comprising”)，應理解為意指包含規定的整體或成組的整體但不排除任何其它的整體或成組的整體。如本文所用，術語“主要地”或變化例如“主要的”或“其是主要的”應理解為意指在已經用PNG酶處理糖蛋白并由質譜例如MALDI-TOF MS分析釋放的聚糖之后具有最高摩爾百分比(％)的總0-聚糖或N-聚糖的聚糖種類。換言之，短語“主要地”被定義為為個體實體，以使特定“主要”糖形以比任何其它個體實體更大的摩爾百分比存在。例如，如果組合物由40摩爾百分比的種類A、35摩爾百分比的種類B和25摩爾百分比的種類C組成， 則組合物主要包含種類A。


圖1圖解了人和巴斯德畢赤酵母中N-糖基化途徑。ER中的早期事件是高度保守的，包括由葡糖苷酶I和II去除三個葡萄糖殘基和由ER甘露糖苷酶處理單個特定α -1， 2-連接的甘露糖殘基，引起相同核心結構Man8GlcNAc2 (ManSB)。但是，加工事件在高爾基體中不同。Mns，α-1，2-甘露糖苷酶；MnsII，甘露糖苷酶II ;GnT I，α-1，2_N_乙酰基葡糖胺轉移酶Ι;&ιΤ II，α-1，2-Ν-乙酰基葡糖胺轉移酶II ;ΜηΤ，甘露糖基轉移酶。兩個核心 GlcNAc殘基雖然在所有情況中存在，但在命名中忽略。圖2圖解了 N-糖基化中的關鍵中間步驟以及縮寫命名，其指產生各自聚糖結構 (GS)的基因工程化巴斯德畢赤酵母菌株。圖3圖解了 N-糖苷酶F釋放的N-聚糖的MALDI-T0F質譜(MS)分析。K3 (人纖溶酶原的三環3結構域)在巴斯德畢赤酵母菌株GS115來源的野生型對照(Invitrogen， Carlsbad, CA)、YSH44、YSH71、RDP52和RDP80中產生并通過Ni-親和層析從培養物上清液中純化。通過N-糖苷酶F處理釋放N-聚糖并進行MALDI-TOF MS分析(陽性模式，除了圖 3G是陰性模式)，其表現為鈉或鉀絡合物。兩個核心GIcNAC殘基雖然存在，但在命名中忽略。GN，GlcNAc ;M，甘露糖。圖3A :GS115來源的野生型對照菌株中產生的N-聚糖；圖;3B 菌株YSH44中K3上產生的N-聚糖；圖3C 菌株YSH71 (YSH44表達hGalTI)中K3上產生的N-聚糖，圖(3D)菌株RDP52 (YSH44表達hGalTI和SpGALE)中K3上產生的N-聚糖，圖(3E)菌株 RDP80 (YSH44 表達 hGalTI、SpGALE 和 DmUGT)中 K3 上產生的 N-聚糖；圖(3F)在α -半乳糖苷酶體外處理后來自RDP80的聚糖；和圖(3G)在用α _2，6_ (N)-唾液酸轉移酶處理后在陰性模式中來自RDP80的聚糖。圖4圖解了 Leloir半乳糖利用途徑。經由半乳糖通透酶引入細胞外半乳糖。通過酶半乳糖激酶，半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶和UDP-半乳糖C4-差向異構酶的作用半乳糖被轉化成葡萄糖-6-磷酸。來自釀酒酵母的蛋白名稱在括號中。圖5顯示巴斯德畢赤酵母糖工程化的菌株YGLY578-1的構建。編碼高爾基體糖基轉移酶的巴斯德畢赤酵母基因0CH1，MNN4, PNOl, MNN4L1和BMT2被敲除然后敲入12個異源基因，包括分泌的hK3的表達盒。YGLY578-1能夠生產糖蛋白具有 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖。CS，反選擇。圖6顯示質粒pRCD977b的示意圖。該質粒是argl :HIS1敲除質粒，其整合進并刪除巴斯德畢赤酵母ARGl基因而利用PpHISl基因作為選擇標記并含有分別在PpOCHl、 PpGAPDH、PpPMAl和PpTEF啟動子的控制下編碼全長黑腹果蠅高爾基體UDP-半乳糖轉運蛋白(DmUGT)、全長釀酒酵母半乳糖激酶(&GAL1)、全長釀酒酵母半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶(&GAL7)和釀酒酵母半乳糖通透酶(&GAL2)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖7顯示表達釀酒酵母GALl、GAL2和GAL7基因的糖工程化的巴斯德畢赤酵母菌株可在半乳糖(作為單一碳源)上生長而母本菌株不能。糖工程化的菌株YGLY578-1 (表達 ScGALIO和hGalTI β )用質粒pRCD977b轉化，所述質粒含有編碼&GALl、ScGAL7和&GAL2 的表達盒。菌株在成分確定的培養基上培養，所述培養基含有酵母氮源、生物素和3%半乳糖或2%葡萄糖作為碳源或二者均無。圖8顯示巴斯德畢赤酵母糖工程化的菌株YGLY317-36的構建。通過敲除五個酵母糖基轉移酶產生巴斯德畢赤酵母菌株YGLY16-3。隨后敲入八個異源基因，得到RDP696-2， 能夠將人N-聚糖Gal2GlCNAC2Man3GlcNAc2轉移到分泌的蛋白的菌株。經由CSTR培養和引入表達分泌的人Fc的質粒選擇健康(robust)克隆得到菌株YGLY317-36。CS，反選擇。圖9顯示質粒pGLY954的示意圖。該質粒是KINKO質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母TRPl基因座而不刪除基因。質粒含有分別在PpHHTl和PpPMAl啟動子的控制下編碼全長釀酒酵母半乳糖激酶GcGALl)和全長釀酒酵母半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶(&GAL7)的表達盒。質粒還含有在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(CO hGalTI) (包含^^壯1(5冰儀2)前導肽(33)融合至人半乳糖基轉移酶I催化結構域的N-末端)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖10顯示單獨在BMMY培養基中誘導或在含有葡萄糖或半乳糖的培養基中誘導的菌株PBP317-36和RDP783中產生的人Fc片段上N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。菌株從飽和的種子培養物接種至約一個0D，在SOOmL BMGY中培養72小時，然后分離(split)并將 IOOmL培養液等分樣離心和在25mL BMMY、25mL ΒΜΜΥ+0. 5%葡萄糖或25mL ΒΜΜΥ+0. 5%半乳糖中誘導對小時。蛋白A純化的蛋白進行蛋白N-糖苷酶F消化和通過MALDI-TOF MS分析釋放的N-聚糖。圖A-C，菌株PBP317-36中產生的人Fc上的N-聚糖；圖D-E，菌株RDP783 中產生的人Fc上的N-聚糖。圖11顯示巴斯德畢赤酵母糖工程化的菌株YDX477的構建。敲除五種酵母糖基轉移酶產生巴斯德畢赤酵母菌株YGLY16-3(Aochl，Δρηο , Abmt2, Amnn4a, Δmnn4b) 隨后敲入八個異源基因，得到RDP697-1，能夠將人N-聚糖^il2GlCNAc2Man3GlcNAc2轉移到分泌的蛋白的菌株。引入表達分泌的抗體的質粒和表達分泌的形式的里氏木霉MNSl的質粒得到菌株YDX477。CS，反選擇。圖12顯示質粒pGLY1418的示意圖。該質粒是KINKO質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母TRPl基因座而不刪除基因。質粒含有分別在PpHHTl和PpPMAl啟動子的控制下編碼全長&GAL1和&GAL7的表達盒。質粒還含有在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(hfelTI)(包含kMntl (ScKre2)前導肽融合至人半乳糖基轉移酶I催化結構域的N-末端)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖13A-F顯示單獨在BMMY培養基中誘導或在含有半乳糖的培養基中誘導的菌株YDX477和RDP968-1中產生的抗_Her2抗體上N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。菌株在 150mL BMGY中培養72小時，然后分離并將50mL培養液等分樣離心和在25mL BMMY、25mL ΒΜΜΥ+0. 半乳糖或25mL ΒΜΜΥ+0. 5%半乳糖中誘導M小時。蛋白A純化的蛋白進行蛋白 N-糖苷酶F消化和通過MALDI-TOF MS分析釋放的N-聚糖。圖13A-C，菌株YDX477中產生的抗體上的N-聚糖；圖13D-F，菌株RDP968-1中產生的抗體上的N-聚糖。圖14顯示質粒pAS24的示意圖。該質粒是巴斯德畢赤酵母bmt2敲除質粒，其含有PpURA3選擇標記和含有在PpOCHl啟動子的控制下編碼全長小鼠高爾基體UDP-GlcNAc 轉運蛋白(MmSLC35A;3)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖15顯示質粒pRCD742b的示意圖。該質粒是KINKO質粒，其含有PpURA5選擇標記以及在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(FB8 MarmI)(包含融合至小鼠甘露糖苷酶I催化結構域的N-末端的前導肽)的表達盒、在PpPMAl啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(C0NA10)(包含融合至人GIcNAC轉移酶I (&ιΤ I)催化結構域的N-末端的Ppkcl2前導肽)的表達盒和在PpSEC4啟動子的控制下編碼小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白(MmSLC35A;3)的全長基因。TT是指轉錄終止序列。圖16顯示質粒pDMG47的示意圖。質粒包括在PpGAPDH的控制下啟動子編碼分泌途徑靶向融合蛋白(KD53)(包含融合至黑腹果蠅甘露糖苷酶II催化結構域的N-末端的 &Mrm2前導肽)的表達盒。質粒還含有在PpPMAl啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(TC54)(包含融合至大鼠GIcNAc轉移酶II (GnT II)催化結構域的N-末端的&Mrm2 前導肽)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖17顯示質粒pRCD82;3b的示意圖。該質粒是KINKO質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母HIS4基因座而不刪除基因，并含有PpURA5選擇標記。質粒包括在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(TAM)(包含^^皿2前導肽融合至大鼠GIcNAC轉移酶 II (GnTII)催化結構域的N-末端)的表達盒和分別在PpOCHl和PpPMAl啟動子的控制下編碼全長黑腹果蠅高爾基體UDP-半乳糖轉運蛋白(DmUGT)和釀酒酵母UDP-半乳糖C4-差向異構酶(ScGALlO)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖18顯示質粒pGLY893a的示意圖。該質粒是巴斯德畢赤酵母hi si敲除質粒，其含有PpARG4選擇標記。質粒含有在PpPMAl啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白 (KDlO)(包含PpSEC12前導肽融合至黑腹果蠅甘露糖苷酶II催化結構域的N-末端)的表達盒，在PpTEF啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(TA33)(包含kMntl (ScKre2)前導肽融合至大鼠GIcNAc轉移酶II (&ιΤ II)催化結構域的N-末端)的表達盒和在PpGAPDH 啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(包含&Mrm2前導肽融合至人半乳糖基轉移酶I催化結構域的N-末端)表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖19顯示質粒pRCD74h的示意圖。該質粒是KINKO質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母ADEl基因座而不刪除基因并含有PpURA5選擇標記。質粒含有在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(FB8 MarmI)(包含&SEC12前導肽融合至小鼠甘露糖苷酶I催化結構域的N-末端)的表達盒、在PpPMAl啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(C0NA10)(包含PpSEC12前導肽融合至人GIcNAc轉移酶I (GnT I)催化結構域的N-末
17端)的表達盒和在PPSEC4啟動子的控制下編碼全長小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白 (MmSLC35A3)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖20顯示質粒pRCD1006的示意圖。該質粒是巴斯德畢赤酵母hisl敲除質粒，其含有PpURA5基因作為選擇標記。質粒含有在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(乂833)(包含^^壯1(5冰儀2)前導肽融合至人半乳糖基轉移酶I催化結構域的 N-末端)的表達盒和分別在PpOCHl和PpPMAl啟動子的控制下編碼全長黑腹果蠅高爾基體 UDP-半乳糖轉運蛋白(DmUGT)和粟酒裂殖酵母UDP-半乳糖C4-差向異構酶(SpGALE)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖21顯示質粒pGLY167b的示意圖。該質粒是巴斯德畢赤酵母argl敲除質粒， 其含有PpURA3選擇標記并含有在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白 (C0-KD53)(包含&MNN2前導肽融合至黑腹果蠅甘露糖苷酶II催化結構域的N-末端)的表達盒和在PpPMAl啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(C0-TC54)(包含&Mrm2 前導肽融合至大鼠GlcNAc轉移酶ΙΙ(&ιΤ II)催化結構域的N-末端)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖22顯示質粒ρΒΚ 138的示意圖。該質粒是滾入(roll-in)質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母AOXl啟動子同時復制啟動子。質粒含有編碼融合蛋白(包含釀酒酵母A交配因子前信號序列融合至人Fc抗體片段(人IgGlH鏈的C-末端233-aa)的N-末端)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。圖23顯示質粒pGLY510的示意圖。該質粒是滾入質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母 TRP2基因同時復制基因并含有AOXl啟動子-ScCYCl終止子表達盒以及PpARGl選擇標記。 TT是指轉錄終止序列。圖對顯示質粒pDX459-l的示意圖。該質粒是滾入質粒，其靶向并整合進巴斯德畢赤酵母A0X2啟動子和含有同時復制啟動子。質粒含有分開的表達盒，其編碼抗-HER2 抗體重鏈和抗-HER2抗體輕鏈，每個在N-末端融合至黑曲霉α -淀粉酶信號序列并在巴斯德畢赤酵母AOXl啟動子的控制下。TT是指轉錄終止序列。圖25顯示質粒pGLY1138的示意圖。該質粒是滾入質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母ADEl基因座同時復制基因和含有&ARR3選擇標記基因盒(其賦予亞砷酸鹽抗性)以及在PpAOXl啟動子的控制下編碼分泌的里氏木霉麗Sl (包含麗Sl催化結構域在其N-末端融合至釀酒酵母α因子前信號序列)的表達盒。TT是指轉錄終止序列。發明詳述酵母已被成功用于生產細胞內和分泌的重組蛋白(參見例如，Cereghino Cregg FEMS Microbiology Reviews 24(1) :45-66(2000) ；Harkki，等人 Bio-iTechnology 7(6) 596(1989) ；Berka，等人 Abstr. Papers Amer. Chem. Soc. 203 121-BI0T (1992) ；Svetina，等人J. Biotechnol. 76 (2-3) :245-251 (2000))。多種酵母，例如乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和多形漢遜酵母，已作為用于生產重組蛋白的真核表達系統發揮特別重要的作用，因為它們能夠生長至高細胞密度和分泌大量重組蛋白。但是，在任意這些真核微生物中的糖蛋白表達在N-聚糖結構上實質不同于哺乳動物中產生的糖蛋白表達。糖基化中的該差異已阻止酵母或絲狀真菌用作用于生產許多治療用糖蛋白的宿主。為了能夠利用酵母以產生治療用糖蛋白，酵母已被基因工程化為產生具有雜合或復合N-聚糖的糖蛋白。能夠生產包含具體雜合或復合N-聚糖的組合物的重組酵母已在例如，美國專利號7，029, 872和美國專利號7，449，308中公開。另外，Hamilton等人，Science 313 :1441-1443(2006)和美國公開的申請號2006/(^86637報道了酵母巴斯德畢赤酵母中糖基化途徑的人源化和具有復合N-糖基化(具有末端唾液酸)的重組人糖蛋白的分泌。對于末端唾液酸的具有寡糖結構(^al2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G2)前體N-聚糖是也作為從人血清中分離的幾種蛋白上主要N-聚糖發現的結構，所述從人血清中分離的幾種蛋白包括促卵泡激素(FSH)、脫唾液酸轉鐵蛋白，以及最顯著的是在人免疫球蛋白(抗體)以不同的量存在。Davidson等人在美國公開的申請號2006/0040353教導了利用已被基因工程化為產生半乳糖末端的N-聚糖的酵母細胞獲得半乳糖基化的糖蛋白的有效方法。這些宿主細胞能夠生產糖蛋白組合物具有G2或Gl (GalGlcNAc2Man3GlcNAc2)寡糖結構的多種混合物，其具有GO寡糖結構的變化量。GO是GlcNAc2Man3GlcNAc2，其是半乳糖基轉移酶的底物。但是，對于某些糖蛋白，特別是抗體和Fc片段，已發現半乳糖轉移過程的效率不是最適的。在抗體和Fc片段的情況下，認為的是在細胞內加工期間抗體或Fc片段上糖基化位點的定位和可及性抑制半乳糖有效轉移到抗體或Fc片段的N-聚糖上。因此，含有半乳糖的寡糖結構的量小于其他糖蛋白例如三環3蛋白中已觀察到的量。為了克服該問題，本發明提供增加半乳糖轉移到抗體或Fc片段的N-聚糖上的量的方法，因此增加含有抗體或Fc片段的Gl和 G2的量高于含有抗體或Fc片段的GO。巴斯德畢赤酵母僅可利用有限數量的碳源進行生存。目前，這些碳源已知是甘油、 葡萄糖、甲醇以及可能是鼠李糖和甘露糖但不是半乳糖。在許多商業生產過程中，利用巴斯德畢赤酵母，重組蛋白的表達在AOX啟動子的控制下，其w在甲醇存在下是有活性的但在甘油存在下被抑制。因此，巴斯德畢赤酵母通常在含有甘油或甘油/甲醇的培養基中生長直到細胞的濃度達到期望的水平，在此時，通過用僅含有甲醇作為碳源的培養基替換培養基來進行重組蛋白的表達。但是，細胞處于低能量狀態，因為甲醇僅含有一個碳，使其成為貧瘠碳源。因此，期望的是具有這樣的生產過程，其中巴斯德畢赤酵母可利用更高級的能源， 例如半乳糖。本發明通過提供能夠利用半乳糖作為單一碳源的基因工程化巴斯德畢赤酵母也解決了該問題。因此，本發明已解決上述確定的兩個問題。本發明提供重組低等真核細胞，特別是酵母和真菌細胞，其已被糖工程化以產生糖蛋白例如抗體或Fc片段，其中與未被如本文所教導的基因工程化的細胞相比，其上N-聚糖上的末端半乳糖水平增加。基因工程化宿主細胞可用于產生具有N-聚糖(含有半乳糖)的糖蛋白的方法，其中所述N-聚糖中半乳糖的量高于未被如本文所教導的基因工程化的宿主細胞中可獲得的量。本發明還提供基因工程化宿主細胞，其中通常不能利用半乳糖作為單一碳源的宿主細胞已被如本文所教導的基因工程化以能夠利用半乳糖作為單一碳源。本文的使得宿主細胞能夠利用半乳糖作為單一碳源的方法利用巴斯德畢赤酵母作為模型。本文的方法可用于使得通常不能利用半乳糖作為碳源的其他酵母或真菌物種能夠利用半乳糖作為碳源。為解決兩個問題，基因工程化的宿主細胞(其已被基因工程化為能夠產生半乳糖末端的N-聚糖)被進一步基因工程化為表達Leloir途徑酶半乳糖激酶(EC 2.7. 1.6)、UDP-半乳糖-4-差向異構酶(EC 5. 1.3.2)和半乳糖磷酸尿苷酰轉移酶(EC 2. 7. 7. 12)。任選地，宿主細胞可另外表達半乳糖通透酶。這使得宿主細胞能夠利用半乳糖
19作為碳源并產生UDP-半乳糖庫，其反過來作為涉及包括半乳糖殘基的N-聚糖合成的半乳糖轉移酶的底物。因此，本文中的宿主細胞和方法能夠產生糖蛋白組合物，特別是抗體和Fc 片段組合物，其中所述半乳糖末端的N-聚糖的比例高于在糖工程化的低等真核細胞中可獲得的比例。重組宿主細胞可生產重組糖蛋白例如抗體和Fc融合蛋白，其中GO G1/G2 比值小于2 1或GO G1/G2比值為1 1或更小或GO G1/G2比值為1 2或更小。本文所述的宿主細胞和方法特別用于生產這樣的抗體和Fc片段，其含有具有 N-聚糖的融合蛋白，所述N-聚糖具有半乳糖殘基末端。在抗體或抗體片段重鏈Asn-297 處的N-聚糖對抗體的結構和功能重要。這些功能包括Fcy受體結合、激活補體的能力、激活細胞毒性T細胞(ADCC)的能力和血清穩定性。但是，在酵母或哺乳動物細胞中目前的抗體生產通常缺乏對于N-糖基化的控制，特別是在重鏈的恒定區或Fc區Asn-297處發生的 N-糖基化，以及特別是控制在N-聚糖上末端半乳糖的水平的能力。一般而言，已發現盡管已被基因工程化為產生在N-聚糖中包括半乳糖殘基的糖蛋白的酵母細胞可以高效地產生許多具有含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白，但是細胞產生抗體具有含有半乳糖的N-聚糖的能力并不一樣高效。如本文所示，本文的宿主細胞和方法提供這樣的宿主細胞，其與未被如本文所述基因工程化的細胞相比，可以產生更高水平的具有含有半乳糖的N-聚糖的抗體。盡管在不具有末端半乳糖殘基的N-聚糖上末端的半乳糖水平可以在體外在利用可溶性半乳糖基轉移酶以將帶電的半乳糖殘基添加到N-聚糖的末端的反應中增加，但是該體外方法費用高、復雜并且不容易擴大規模用于生產大量糖蛋白。因此，本文公開的宿主細胞(并且其能夠在體內產生分泌的具有增加的末端半乳糖水平的N-聚糖的糖蛋白，包括抗體或抗體片段)提供生產具有含有增加的半乳糖水平的N-聚糖的抗體組合物的更理想的方法。因此，本發明在抗體生產中具有顯著改進并且首次提供控制具體抗體特征例如 N-聚糖中半乳糖水平的能力，和特別是生產具有改進的功能性特征的重組糖蛋白。另外，當本文的方法用于已被基因工程化為產生具有唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的宿主細胞中時，半乳糖末端的N-聚糖是唾液酸轉移酶的底物。因此，唾液酸化的N-聚糖的量部分地隨可用于唾液酸化的半乳糖末端的N-聚糖的量而變化。本文中的宿主細胞和方法提供用于增加半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的量的方法，其中當在已被基因工程化為產生唾液酸化的N-聚糖的宿主細胞中生產時，產生這樣的宿主細胞，其與未被如本文所教導的基因工程化的宿主細胞相比，產生增加量的唾液酸化的N-聚糖。盡管本發明用于生產包含半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白，但是本發明還用作用于選擇表達任意類型異源蛋白(不論是否是糖蛋白)的重組宿主細胞的選擇方法。表達一種或兩種但不是全部Leloir途徑酶活性的重組宿主細胞用編碼異源蛋白和不存在于重組宿主細胞中的Leloir途徑酶的一個或多個核酸分子轉化。由于轉化的重組宿主細胞含有完整的Leloir途徑，可通過在半乳糖是單一碳源的培養基中培養轉化的重組宿主細胞來獲得選擇表達對于非轉化的細胞是異源蛋白的轉化的重組宿主細胞。因此，提供的是用于產生表達異源蛋白的重組宿主細胞的方法，其包含以下步驟。提供宿主細胞，其已被基因工程化為表達一種或兩種選自半乳糖激酶、UDP-半乳糖-4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶的Leloir途徑酶。在一些實施方案中，宿主細胞能夠產生具有人樣N-聚糖的糖蛋白，和在其他實施方案中，宿主細胞不產生具有人樣N-聚糖的糖蛋白，因為要在宿主細胞中表達的異源蛋白不具有N-聚糖。用編碼異源蛋白和提供的重組宿主細胞中不表達的Leloir途徑酶或多種酶的一個或多個核酸分子轉化宿主細胞。轉化的宿主細胞在含有半乳糖作為單一碳能源的培養基中培養以提供表達異源蛋白的重組宿主細胞。任選地，宿主細胞可另外包括編碼半乳糖通透酶的核酸分子。在具體實施方案中，宿主細胞被基因工程化為控制O-糖基化或在控制O-糖基化的條件下生長或二者。在另外的實施方案中，宿主細胞另外已被修飾為降低磷酸甘露糖基轉移酶和/或β-甘露糖基轉移酶活性.在低等真核細胞中基因工程化糖基化途徑在大多數真核細胞中N-糖基化通過將脂類-連接的Glc3Man9GlcNAc2寡糖結構轉移到新生多肽的特定Asn殘基上在內質網(ER)中起始(Lehle和Tanner， Biochim. Biophys. Acta 399:364—74(1975) ；Kornfeld 禾口 Kornfeld，Annu. Rev. Biochem 54:631-64(1985) ；Burda 禾口 Aebi， Biochim. Biophys. Acta-General Subjects 1426 239-257(1999))。對來自N-連接寡糖的所有三個葡萄糖部分和單個特定甘露糖的修飾產生Man8GlcNAc2 (參見圖1)，其使得糖蛋白易位到高爾基體，在高爾基體中發生進一步寡糖力口工(Herscovics, Biochim. Biophys. Acta 1426 :275-285(1999) ；Moremen 等人， Glycobiology 4 :113-125 (1994))。在高爾基體中，哺乳動物N-聚糖加工不同于酵母和許多其他真核細胞，包括植物和昆蟲。哺乳動物以特定反應順序加工N-聚糖，涉及在從寡糖在添加GIcNAc以形成雜合中間體N-聚糖GlcNAcMan5GlcNAc2之前，去除三個末端α-1， 2-甘露糖(Schachter, Glycoconj. J. 17 :465-483(2000))(參見圖 1)。該雜合結構是甘露糖苷酶II的底物，所述甘露糖苷酶II在寡糖上去除末端α-1，3-和α-1，6-甘露糖以得到 N-聚糖 GlcNAcMan3GlcNAc2 (Moremen，Biochim. Biophys. Acta 1573(3) :225-235 (1994))。 最后，如圖1所示，通過在添加半乳糖和唾液酸殘基后，添加至少一個另外的GlcNAc殘基， 產生復合N-聚糖(khachter，(2000)，如上)，雖然唾液酸通常在某些人蛋白，包括IgGs上缺乏(Keusch 等人，Clin. Chim. Acta 252:147-158(1996) ；Creus 等人，Clin. Endocrinol. (Oxf)44 :181-189(1996))。在釀酒酵母中，N-聚糖加工涉及在其通過整個高爾基體時，添加甘露糖至寡糖，有時產生具有大于100個甘露糖殘基的高甘露糖基化的聚糖(Trimble和Verostek，Trends Glycosci. Glycotechnol. 7 1-30 (1995) ；Dean,Biochim. Biophys. Acta-General Subjects 1426 :309-322(1999))(參見圖1)。在通過α-1，6-甘露糖基轉移酶(Ochlp)將第一個 α-1，6-甘露糖添加到Man8GlcNAc2后，另外的甘露糖基轉移酶延伸具有α_1，2_、α-1, 6-和末端α -1，3-連接的甘露糖以及甘露糖基磷酸的Man9GlcNAc2聚糖。巴斯德畢赤酵母是甲基營養酵母，通常用于異源蛋白的表達，具有與釀酒酵母類似的糖基化機制(Bretthauer 禾口 Castellino,Biotechnol. Appl. Biochem. 30 193-200(1999) ；Cereghino 禾口 Cregg, Fems Microbiol. Rev. 24 :45-66(2000) ；Verostek和Trimble，Glycobiol. 5 :671-681(1995))。但是，與N-糖基化的復雜度一致，巴斯德畢赤酵母中的糖基化不同于釀酒酵母中的糖基化， 原因在于它缺乏添加末端α-1，3-連接的甘露糖的能力，而是添加其他甘露糖殘基，包括磷酸甘露糖和β-連接的甘露糖(Miura等人，基因324 :129-137(2004) ；Blanchard等人， Glycoconj. J. 24 :33-47 (2007) ；Mille 等人，J. Biol. Chem. 283 :9724-9736 (2008))。在以往工作中，我們證明巴斯德畢赤酵母的OChl突變體缺乏起始酵母型外鏈形成的能力，并且因此，不能高甘露糖化N-聚糖(Choi等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 100 :5022-5027(2003)).另外，我們鑒定了編碼負責β -甘露糖轉移的高爾基體定位(residing)酶的新的基因家族并證明該家族的多個成員的缺失降低或消除免疫原性 β-甘露糖轉移(參見美國公開的申請號US2006/0211085)。隨后引入五種單獨的糖基化酶得到在分泌的模式蛋白上產生復合人N-聚糖的菌株(參見圖3Α相對于圖3Β) (Choi 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 100:5022-5027(2003) ；HamiIton 等人 Science 310 1244-1246(2003)；美國專利號7,029,872 ；美國公開的申請號2004/0018590 ；美國公開的申請號2004/023004 ；美國公開的申請號2005/0208617 ；美國公開的申請號2004/01718 ； 美國公開的申請號2005/0208617 ；美國公開的申請號2005/0170452和美國公開的申請號2006/0040353。更近期地，構建能夠在酵母菌株產生的分泌的蛋白上產生充分唾液酸化的N-聚糖的重組酵母菌株已在美國公開的申請號2005/(^607 和2006/(^86637和 Hamilton 等人，Science 313 :1441-1443(2006)中描述。復合N-聚糖的成熟涉及添加半乳糖至末端GIcNAC部分，這是可以被幾種半乳糖基轉移酶(GalT)催化的反應。在人中，存在feilT的七種同種型(I-VII)，其中至少四種已顯示在體外在UDP-半乳糖存在下轉移半乳糖至末端GlcNAc (Guo，等人，Glycobiol. 11 813-820(2001))。最先鑒定的酶，已知為felTI，通常被認為是作用N-聚糖的主要酶，這已由體外實驗、小鼠敲除研究和組織分布分析支持(Berger和Rohrer，Biochimie 85: 261-74 (2003) ；Furukawa 禾口 Sato, Biochim. Biophys. Acta 1473 :54-66 (1999))。如本文所示，人felTI的表達，當其在宿主細胞高爾基體適當定位時，可以在能夠產生含有末端 GlcNA的前體的糖工程化的酵母菌株中轉移半乳糖至復合N-聚糖上。另外，UDP-半乳糖 4-差向異構酶的表達以產生UDP-半乳糖庫和UDP-半乳糖轉運蛋白的表達以將底物移動至高爾基體在能夠產生末端GIcNAC前體的菌株中產生幾乎相當量的β _1，4_半乳糖轉移到 N-聚糖上。經由對于中間N-聚糖底物在GIcNAC和半乳糖基轉移酶之間的分離和降低的競爭，定位子文庫的重復篩選得到復合N-聚糖結構高于于雜合N-聚糖結構的改進的產生。以往，在一組精確設計的實驗(an elegant set of experiments)中，人feilTI顯示具有將β-1，4-半乳糖轉移到末端GlcNAc的活性，這要求首先產生Alglp酶的突變體， 其將核心或少甘露糖轉移到在生長中的N-聚糖前體分子(^Awientek等人，J. of Biol. Chem 271 :3398-3405 (1996))。該突變引起GIcNAc2截短的N-聚糖部分地轉移到蛋白，并產生末端GlcNAc。這之后，作者表明人feilTI能夠將半乳糖以β-1，4-連接轉移到該人工末端GIcNAC結構。重要的是，顯示了人felTI可以在酵母的高爾基體中以活性形式表達。基于上述，首先利用靶向宿主細胞高爾基體的人(ialTI-前導肽融合蛋白的表達來檢測本發明。在隨后篩選人&11111、&111111、&1111￥、&1117、牛63111和一對推測的線蟲(C. elegans)GalT后，發現人GalTI看起來是在該異源的系統中將半乳糖轉移到復合雙觸角N-聚糖的最具活性的酶。這可能表明hGalTI是用于轉移至該底物(雙觸角復合N-聚糖)的最具能力的酶或它可能僅是檢測的feilT酶中最穩定的和最具活性的或二者的組合。 有意思的是，當利用將甘露糖苷酶II和&iT II催化結構域-引導融合蛋白定位于高爾基體的相同前導肽將feilT定位于高爾基體時，產生其中末端半乳糖在α -1，3臂上的雜合N-聚糖結構的顯著百分比(直至20%)。甘露糖苷酶II或&ιΤ II活性的表達的增加不能顯著降低該現象。但是，篩選酵母型II分泌途徑定位前導肽(定位于分泌途徑期望的細胞器例如ER、高爾基體或反式高爾基體網絡的肽)文庫得到幾種活性(ialT-前導肽融合蛋白，其當
22被轉化至宿主細胞時，產生顯著降低水平的雜合N-聚糖結構和增加的復合N-聚糖結構。之前，已報道等分的(bisecting) GIcNAc轉移是高爾基體中N-聚糖的成熟中對于隨后糖轉移的停止信號，包括阻止果糖的轉移(Umana等人，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999))。 此處的數據表明半乳糖轉移到α -1，3臂產生類似的停止信號，阻止甘露糖苷酶II和&ιΤ II進行的α-1，6臂的成熟。上述結果表明在重組宿主細胞中產生的具有半乳糖末端或含有半乳糖的雜合 N-聚糖與具有半乳糖末端的或含有半乳糖的復合N-聚糖的比值是GalTI位于高爾基體相對于甘露糖苷酶II和&1Τ II位于高爾基體中的結果，并且通過操縱三種酶的定位，可以操縱雜合N-聚糖與復合N-聚糖的比值。為了增加具有半乳糖末端的或含有半乳糖的雜合 N-聚糖的產率，所有三種酶活性應被靶向至高爾基體的相同區域，例如通過利用相同分泌途徑靶向前導肽來靶向所有三種酶活性。或者，篩選GalT-前導肽融合蛋白的文庫來鑒定將felT活性定位于高爾基體的融合蛋白，在高爾基體中更可能的是在其他兩個酶可以發揮作用之前，GalT作用N-聚糖底物。該增加了具有半乳糖末端的或含有半乳糖的雜合N-聚糖相比于具有半乳糖末端的或含有半乳糖的復合N-聚糖的產率。相反地，為了降低具有半乳糖末端的或含有半乳糖的雜合N-聚糖的產率，應利用與其他兩種酶活性所利用的分泌途徑靶向前導肽不同的分泌途徑靶向前導肽來定位feilT活性。這可通過篩選GalT-前導肽融合蛋白文庫以鑒定feilT-前導肽融合蛋白組合來獲得，所述(ialT-前導肽融合蛋白組合產生這樣的宿主細胞，在其中與具有半乳糖末端的或含有半乳糖的雜合N-聚糖的產率相比，具有半乳糖末端的或含有半乳糖的復合N-聚糖的產率增加。該結果進一步強調了當在異源宿主系統中表達嵌合糖基化酶時，篩選催化結構域和分泌途徑定位前導肽文庫的價值，這是之前在Choi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 :5022-5027(2003)中說明的并在美國專利號7，0 , 872和7，449，308中描述的概念。 由于全基因組序列的可獲得性、更復雜的PCR和克隆技術以及更高通量的分析技術如質譜，篩選數以百計甚至數以千計的組合是可能的。重要的是，這種類型的組合篩選已證實在檢測酶活性與驅動逐步反應之間的差異，每個依賴于之前的產物而完成。此處，盡管在 UDP-半乳糖4-差向異構酶的情況下，篩選的幾種酶看起來具有產生UDP-半乳糖庫相對相同的能力，但是檢測的四種UDP-半乳糖轉運蛋白中僅一種在該異源宿主中證實有活性，包括令人^C訝地，來自一種酵母(粟酒裂殖酵母)的一種無活性轉運蛋白。另外，從多種分泌途徑定位前導肽的篩選中，其中許多產生活性酶組合，發現僅三種得到較高程度的具有雙觸角末端半乳糖(G2)的均一的復合N-聚糖(> 85% )。高甘露糖和雜合中間結構的減少對于這類異源表達系統在生產治療用糖蛋白中的用途具有重要的作用，因為高甘露糖結構已顯示具有有效免疫原性并且最近的證據已表明肝毒性可源自過于豐富的雜合N-聚糖。因此，美國公開的申請號2006/(^86637教導了在不通常產生含有半乳糖的糖蛋白的宿主細胞中獲得半乳糖轉移的方法，三種條件已被克服(1)在高爾基體中內源半乳糖基轉移酶(GalT)的缺乏，(2)內源UDP-Gal不能轉運至高爾基體和(3)低的內源細胞質 UDP-Gal庫。在缺乏UDP-Gal轉運蛋白的情況下，半乳糖向N-聚糖上末端GlcNAc殘基的轉移為約55-60%。在缺乏UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的情況下，半乳糖向N-聚糖上末端 GlcNAc殘基的轉移為約10-15%。利用具有暴露的N-聚糖(其在人中通常被唾液酸化)的報告子蛋白(人纖溶酶原的K3結構域)已制備了所有上述修飾以產生宿主細胞(其可產生半乳糖基化的N-聚糖)， 并在美國公開的申請號20060040353中報道。但是，以可與哺乳動物細胞相比較的方式，這些糖工程化的酵母菌株僅產生部分的半乳糖轉移到抗體Fc聚糖上，引起具有小于10% G2 和小于25% Gl結構的N-聚糖庫，偏好于具有末端GIcNAC的復合N-聚糖。這與哺乳動物細胞系類似，其中抗體(IgG Fc Asn四7)N-聚糖含有減少量的末端半乳糖。半乳糖殘基轉移到N-聚糖上需要活化的半乳糖(UDP-Gal)庫。在低等真核細胞中產生高于內源水平的這類庫的一種方式是如上所述并在美國公開的申請號2006/0040353 所示的UDP-半乳糖4差向異構酶的表達。另一種方式本發明，其包括上述細胞，其中用核酸分子轉化所述宿主細胞，所述核酸分子編碼至少以下三種Leloir途徑酶半乳糖激酶 (EC2. 7. 1. 6)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶EC 2. 7. 7. 12)和UDP-半乳糖4差向異構酶(EC 5. 1. 3. 2)。半乳糖激酶是催化半乳糖代謝的第一步(稱為半乳糖磷酸化為半乳糖-1-磷酸)的酶。半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶催化半乳糖代謝的第二步驟，其是UDP-葡萄糖和半乳糖-1-磷酸轉換為UDP-半乳糖和葡萄糖-1-磷酸。任選地，另外可以包括的是編碼質膜半乳糖通透酶的核酸分子。半乳糖通透酶是質膜己糖轉運蛋白，其從外部來源輸入半乳糖。Leloir途徑顯示于圖4。如本文所示，當編碼半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-ι-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性的基因被引入上述酵母，同時向該酵母給料酵母外源半乳糖，并誘導抗體表達時，抗體Fc N-聚糖上末端半乳糖的水平實質增加，因此增加產生的G2N-聚糖的量N-聚糖可在人Fc上獲得，其中大于50%的N-聚糖是G2。通透酶是任選的，因為發現細胞中的內源通透酶能夠將半乳糖輸入細胞。因此， 當使用時，半乳糖通透酶可以是能夠使半乳糖穿過細胞膜轉運的任意質膜己糖轉運蛋白， 例如，來自釀酒酵母的GAL2半乳糖通透酶(參見GenBank :M81879)。半乳糖激酶可以是能夠催化半乳糖磷酸化為半乳糖-1-磷酸的任意酶，例如，來自釀酒酵母的GALl基因(參見 GenBank :X76078)。半乳糖磷酸尿苷酰轉移酶可以是催化UDP-葡萄糖和半乳糖-1-磷酸轉換為UDP-半乳糖和葡萄糖-1-磷酸的任意酶，例如，釀酒酵母的GAL7 (參見GenBank M12348)。UDP-半乳糖4差向異構酶可以是催化UDP-葡萄糖轉換為UDP-半乳糖的任意酶， 例如釀酒酵母的GALlO (參見GenBank NC_001134)，粟酒裂殖酵母的GALE (參見GenBank NC_003423)和人的hGALE(參見GenBank NM_000403)。差向異構酶還可提供為融合蛋白， 其中差向異構酶的催化結構域被融合至半乳糖基轉移酶的催化結構域(參見美國公開的申請號 US2006/0040;353)。將上述Leloir途徑酶引入巴斯德畢赤酵母菌株產生能夠同化環境半乳糖的重組細胞。另外，當上述Leloir途徑酶被引入能夠生產具有含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白的細胞中時，得到的重組細胞能夠產生與未被如此工程化的細胞產生的糖蛋白相比，在復合 N-聚糖上具有更高水平β-1，4-半乳糖的糖蛋白。因此，這些工程化步驟的組合已得到這樣的宿主細胞，其被特定地糖工程化和代謝地工程化為對于糖蛋白例如抗體和Fc-融合蛋白的N-聚糖的糖基化的增加的控制。因此，這些糖工程化的酵母細胞系能夠有效的產生重組抗體和Fc融合蛋白同時允許控制N-聚糖加工。表達載體一般而言，半乳糖激酶、UDP-半乳糖-4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉
24移酶(以及任選地半乳糖通透酶)作為來自表達載體的表達盒的組分而表達。在另外的方面，在宿主細胞中另外包括的是編碼重組目的蛋白的表達載體，其在具體的實施方案中另外包括促進重組蛋白從宿主細胞中分泌的序列。對于每種Leloir途徑酶和重組目的蛋白， 編碼它的表達載體最低程度含有這樣的序列，其影響編碼Leloir途徑酶或重組蛋白的核酸序列的表達。該序列被可操作連接到編碼Leloir途徑酶或重組蛋白的核酸分子。這類表達載體還可含有另外的元件，如復制起點、選擇標記、轉錄或終止信號、著絲粒、自我復制序列等。根據本發明，編碼重組目的蛋白和上述Leloir途徑酶的核酸分子可以分別地位于表達載體中以允許過表達的重組目的蛋白和上述Leloir途徑酶的受調節的表達。盡管重組蛋白和上述Leloir途徑酶可以在相同的表達載體中編碼，但是上述Leloir途徑酶優選地在與編碼重組蛋白的載體分開的表達載體中編碼。編碼上述Leloir途徑酶和重組蛋白的核酸分子位于分開的表達載體中可以增加產生的重組蛋白的量。如本文所用，表達載體可以是可復制的或不可復制的表達載體。可復制的表達載體可以不依賴于宿主細胞染色體DNA復制或因為這類載體具有整合到宿主細胞染色體DNA 而依賴于宿主細胞染色體DNA復制。整合至宿主細胞染色體DNA后，這類表達載體可以失去一些結構元件但保留編碼重組蛋白或上述Leloir途徑酶的核酸分子和可以作用于重組蛋白或上述Leloir途徑酶的表達的片段。因此，本發明的表達載體可以是染色體整合或染色體非整合的表達載體。在引入編碼上述Leloir途徑酶和重組蛋白的核酸分子后，然后通過誘導編碼重組蛋白的核酸的表達，使重組蛋白過表達。在另一實施方案中，建立這樣的細胞系，其組成型或誘導型表達上述Leloir途徑酶。編碼將被過表達的重組蛋白的表達載體被引入這類細胞系以獲得重組蛋白的增加的產生。在具體實施方案中，編碼Leloir途徑酶的核酸分子被可操作連接到組成型啟動子。本發明表達載體可以是在一種宿主細胞類型例如大腸桿菌(Escherichia coli) 中可復制的并在另一種宿主細胞類型例如真核宿主細胞中進行很少復制或不能復制的，只要表達載體允許上述Leloir途徑酶或過表達的重組蛋白的表達并因而促進這類重組蛋白在選擇的宿主細胞類型中的分泌。如本文所述的表達載體包括這樣的DNA或RNA分子，其被工程化為對期望的基因即編碼上述Leloir途徑酶或重組蛋白的基因的控制表達。這類載體還編碼核酸分子片段， 其被可操作連接到編碼本發明上述Leloir途徑酶或重組蛋白的核酸分子。在本發明上下文中，可操作連接意思是這類片段可以作用于編碼上述Leloir途徑酶或重組蛋白的核酸分子的表達。這些核酸序列包括啟動子、增強子、上游控制元件、轉錄因子或抑制子結合位點、終止信號和可以在預期的宿主細胞中控制基因表達的其它元件。優選載體是載體、細菌噬菌體、黏粒或病毒。本發明的表達載體在酵母或哺乳動物細胞中發揮功能。酵母載體可以包括酵母 2 μ環及其衍生物，編碼酵母自我復制序列的酵母載體，酵母小染色體，任意酵母整合載體等。多種類型酵母載體的詳細列表在Parent等人(Yeast 1 :83-138(1985))中提供。能夠作用于基因產物的表達的元件或核酸序列包括啟動子、增強子元件、上游激活序列、轉錄終止信號和多聚腺苷酸位點。所有這類啟動子和轉錄調節元件，單獨或組合，被預期用于本發明的表達載體中。另外，基因-工程化的和突變的調節序列還在本文中的預期。啟動子是用于控制基因表達的DNA序列元件。具體地，啟動子確定轉錄起始位點并可以包括TATA盒和上游啟動子元件。選擇的啟動子是期望在選擇的具體宿主系統中可操縱的那些。例如，當利用酵母宿主細胞例如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母或巴斯德畢赤酵母時，酵母啟動子用于本發明的表達載體，而真菌啟動子將用于宿主細胞例如黑曲霉、粗糙脈胞菌或里氏木霉。酵母啟動子的實例包括但不限于GAPDH，AOXl, SEC4，HHl, PMAl, OCHl, GALl, PGK, GAP, TPI, CYCl, ADH2, PH05, CUP1, MFa 1，FLD1, PMAl, PDI, TEF 和 GUTl 啟動子。 Romanos等人(Yeast 8 :423-488 (199 )提供了酵母啟動子和表達載體的綜述。Hartner 等人，Nucl. Acid Res. 36 :e76 (于2008年6月6日在線出版)描述了用于巴斯德畢赤酵母中異源蛋白精確調節表達的啟動子文庫。可操作連接本文公開的核酸分子的啟動子可以是組成型啟動子和誘導型啟動子。 誘導型啟動子是結合轉錄因子后以增加或降低的速率引導轉錄的啟動子。如本文所用的轉錄因子包括可以結合啟動子的調節或控制區并因而影響轉錄的任意因子。在宿主細胞中轉錄因子的合成或啟動子結合能力可以通過將宿主暴露于誘導物或將誘導物從宿主細胞培養基中去除來控制。因此，為了調節誘導型啟動子的表達，將誘導物添加或從宿主細胞的生長培養基中去除。這類誘導物可以包括糖、磷酸、醇、金屬離子、激素、熱、冷等。例如，在酵母中常用誘導物是葡萄糖、半乳糖等。選擇的轉錄終止序列是在選擇的具體宿主系統中可操縱的那些。例如，當利用酵母宿主細胞例如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母或巴斯德畢赤酵母時，酵母轉錄終止序列用于本發明的表達載體，而真菌轉錄終止序列將用于宿主細胞例如黑曲霉、粗糙脈胞菌或里氏木霉。轉錄終止序列包括但不限于釀酒酵母CYC轉錄終止序列(&CYC TT)、巴斯德畢赤酵母ALG3轉錄終止序列(ALG3 TT)、巴斯德畢赤酵母ALG6轉錄終止序列(ALG6 TT)、巴斯德畢赤酵母ALG12轉錄終止序列(ALG12 TT)、巴斯德畢赤酵母AOXl轉錄終止序列(A0X1 TT)、巴斯德畢赤酵母OCHl轉錄終止序列(0CH1 TT)和巴斯德畢赤酵母PMAl轉錄終止序列(PMA1 TT)。本發明的表達載體還可編碼選擇標記。選擇標記是基因功能物，其賦予宿主細胞可鑒定的性狀以使用攜帶選擇標記的載體轉化的細胞可以與非轉化的細胞區分。載體中包含選擇標記還可用于確保連接到標記的基因功能物保留在宿主細胞群體中。這類選擇標記可以賦予任意容易鑒定的顯性性狀，例如藥物抗性、合成或代謝細胞營養物的能力等。酵母選擇標記包括藥物抗性標記和基因功能物，其允許酵母宿主細胞合成基本的細胞營養物，例如氨基酸。常用于酵母的藥物抗性標記包括氯霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、G418(遺傳霉素)、博萊霉素等。允許酵母宿主細胞合基本的細胞營養物的基因功能物與在相應基因組功能中具有營養缺陷型突變的可利用的酵母菌株一起使用。常見酵母選擇標記提供用于合成亮氨酸(LEU2)、色氨酸(TRP1和TRP》、尿嘧啶(URA3，URA5, URA6)、 組氨酸(HIS3)、賴氨酸(LYS2)、腺嘌呤(ADE1或ADE^等的基因功能物。其他酵母選擇標記包括來自釀酒酵母的ARR3基因，其賦予在亞砷酸鹽存在下生長的酵母細胞亞砷酸鹽抗性(Bobrowicz 等人，Yeast, 13 :819-828(1997) ；Wysocki 等人，J. Biol. Chem. 272 30061-30066(1997))。大量合適的整合位點包括美國公開的申請號2007/0072262中列舉的那些并包括與已知釀酒酵母和其它酵母或真菌的基因座的同源物。用于將載體整合至酵母的方法是熟知的，例如，參見W02007136865。因此，本發明表達載體可以編碼選擇標記，其用于在存在于培養物中的細胞群體中鑒定和維持含有載體的宿主細胞。在一些環境下，選擇標記還可用于擴增表達載體的拷貝數。在誘導來自本發明表達載體的轉錄以產生編碼過表達的重組蛋白或Leloir途徑酶的RNA后，RNA被細胞因子翻譯以產生重組蛋白或Leloir途徑酶。在酵母和其它真核細胞中，通過核糖體結合mRNA的5'帽和核糖體延mRNA移動至第一個AUG起始密碼子(在此處多肽合成可以開始)而啟動信使RNA(mRNA)的翻譯。在酵母和哺乳動物細胞中的表達通常不需要核糖體-結合位點和起始密碼子之間特定數量的核苷酸(如有時在原核表達系統中需要的)。但是，對于在酵母或哺乳動物宿主細胞中表達，mRNA中第一個AUG密碼子優選是期望的翻譯起始密碼子。另外，當表達在酵母宿主細胞中進行時，長的非翻譯引導序列例如長于50-100個核苷酸的存在可以減弱mRNA的翻譯。酵母mRNA引導序列具有約50個核苷酸的平均長度， 富含腺嘌呤，具有較少的二級結構和幾乎通常使用第一個AUG來起始。由于不具有這些特征的引導序列可以降低蛋白翻譯的效率，酵母引導序列優選用于在酵母宿主細胞中過表達的基因產物或分子伴侶蛋白的表達。許多酵母引導序列的序列是本領域技術人員已知的和可利用的，例如，參考Cigan等人(Gene 59:1—18(1987)).除了啟動子、核糖體-結合位點和起始密碼子的位置，可以影響得到的表達水平的因素包括可復制的表達載體的拷貝數。通常通過載體復制起點和與其關聯的任意順式作用控制元件來確定載體的拷貝數。例如，編碼調節的著絲粒的酵母游離載體的拷貝數的增加可通過誘導緊密排列至著絲粒的啟動子的轉錄來獲得。另外，在酵母載體中編碼酵母FLP 功能物還可增加載體的拷貝數。通過組合來自可利用的載體的DNA片段，通過合成編碼這類調節元件的核酸分子或通過克隆新的調節元件并使新的調節元件位于該載體，本領域技術人員還可容易地設計和制備包括上述序列的表達載體。產生表達載體的方法是熟知的。過表達的DNA方法見于種種關于基因工程的標準實驗室手冊中的任意。本發明的表達載體可以通過以適當的方法將上述Leloir途徑酶和重組蛋白的編碼區連接到啟動子和用于控制基因表達的其它序列元件上來制備。在該表達載體構建后， 這類載體被轉化至宿主細胞，其中可以表達過表達的重組蛋白和Leloir途徑酶。用表達載體轉化酵母和其它低等真核細胞的方法是本領域技術人員熟知的和容易利用的。例如，表達載體可以通過幾種方法包括醋酸鋰、原生質體、電穿孔和類似方法中的任意被轉化至酵母細胞。宿主細胞酵母例如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和多形漢遜酵母可用于細胞培養，因為它們能夠生長至高細胞密度和分泌大量重組蛋白。同樣，絲狀真菌例如黑曲霉、鐮孢菌屬的種、粗糙脈胞菌等可用于以工業規模產生本發明的糖蛋白。一般而言，用于實踐本文的方法的低等真核細胞包括通常不能利用半乳糖作為碳源的酵母和真菌。不能利用半乳糖作為碳源的酵母的實例包括但不限于畢赤酵母屬的甲基營養酵母，例如巴斯德畢赤酵母，和酵母， 例如 S. kudriavzevii、C. glabrata、K. waltii 和 Ε. gossypii。酵母可用于糖蛋白的表達，因為它們可以是較經濟地培養，提供高產量，并且當適當修飾時，能夠合適的糖基化。酵母特別提供了確定的遺傳學，允許快速轉化、測試蛋白定位策略和容易的基因敲除技術。合適的載體具有表達控制序列，例如啟動子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，以及復制起點，終止序列等，如期望的。因此，上述宿主細胞(其不能通常利用半乳糖作為碳源) 已被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性，使得宿主細胞能夠利用半乳糖作為碳源。低等真核細胞，特別是酵母，還可被基因修飾以使它們表達糖蛋白，其中糖基化模式是人樣或人源化的。這可通過如Gerngross等人，美國公開的申請號2004/0018590所述去除選擇的內源糖基化酶和/或提供外源酶來獲得。例如，宿主細胞可以被選擇或工程化為缺乏1，6-甘露糖基轉移酶活性，其將另外添加甘露糖殘基至糖蛋白的N-聚糖上。在一個實施方案中，如本文所述被基因工程化為同化環境半乳糖作為碳源的宿主細胞還如下所述被基因工程化為產生復合N-聚糖。這類宿主細胞另外包括α 1，2-甘露糖苷酶催化結構域(其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將α ， 2-甘露糖苷酶活性靶向宿主細胞的ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含Man5GlcNAc2糖形的重組糖蛋白，例如包含主要Man5GlcNAc2糖形的重組糖蛋白組合物。例如，美國專利號7, 029，872和美國公開的專利申請號2004/0018590和 2005/0170452公開了能夠產生包含Man5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主細胞。 這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源。緊接前述宿主細胞另外包括GIcNAC轉移酶I (&ιΤ I)催化結構域(其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將GlcNAc轉移酶I活性靶向宿主細胞的 ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含GlcNAcMan5GlcNAc2 糖形的重組糖蛋白，例如包含主要GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重組糖蛋白組合物。美國專利號7，029，872和美國公開的專利申請號2004/0018590和2005/0170452公開了能夠產生包含GlcNAcMan5GlcNAc2的糖蛋白的低等真核生物宿主細胞。上述細胞產生的糖蛋白可以體外用氨基己糖苷酶處理以產生包含Man5GlcNAc2糖形的重組糖蛋白。這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-ι-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源。然后，緊接前述宿主細胞另外包括甘露糖苷酶II催化結構域(其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將甘露糖苷酶II活性靶向宿主細胞的ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白，例如包含主要GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白組合物。美國專利號 7，029，872和美國公開的專利申請號2004/0230042公開了表達甘露糖苷酶II酶和能夠生產糖蛋白具有主要GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的低等真核生物宿主細胞。上述細胞產生的糖蛋白可以體外用氨基己糖苷酶處理以產生包含Man3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白。這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向
28異構酶活性、半乳糖-ι-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源。然后，緊接前述宿主細胞另外包括GIcNAc轉移酶II (GnT II)催化結構域(其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將the GlcNAc轉移酶II活性靶向宿主細胞的ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2(GO)糖形的重組糖蛋白，例如包含主要GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白組合物。美國專利號7，029，872和美國公開的專利申請號2004/0018590和 2005/0170452公開了能夠產生包含GlCNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主細胞。上述細胞產生的糖蛋白可以體外用氨基己糖苷酶處理以產生包含Man3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白。這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源。最后，緊接前述宿主細胞另外包括半乳糖基轉移酶催化結構域(其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將半乳糖基轉移酶活性靶向宿主細胞的ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 (Gl)或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G2)糖形或其混合物的重組糖蛋白，例如包含主要 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Gl)糖形或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(G2)糖形或其混合物的重組糖蛋白組合物。美國專利號7,0 ，872和美國公開的專利申請號2006/0040353公開了能夠產生包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主細胞。上述細胞產生的糖蛋白可以體外用半乳糖苷酶處理以產生包含 GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白，例如包含主要GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白組合物。這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、 UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源并能夠生產這樣的糖蛋白，其中含有半乳糖的N-聚糖的比例大于未被基因工程化為包括上述Leloir途徑酶的宿主細胞中的比例。在另一實施方案中，緊接前述宿主細胞(其如本文所公開的能夠產生具有半乳糖末端的復合N-聚糖并能夠同化半乳糖作為碳源)可另外包括唾液酸轉移酶催化結構域 (其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將唾液酸轉移酶活性靶向宿主細胞的ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含主要 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 糖形或 NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 糖形或其混合物的重組糖蛋白。對于低等真核生物宿主細胞例如酵母和絲狀真菌，有用的是宿主細胞另外包括提供CMP-唾液酸用于轉移至N-聚糖的方法。美國公開的專利申請號2005/(^607 公開了基因工程化低等真核細胞以具有CMP-唾液酸合成途徑的方法，和美國公開的專利申請號 2006/(^86637公開了基因工程化低等真核細胞以產生唾液酸化的糖蛋白的方法。這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-ι-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源并能夠生產這樣的糖蛋白，其中含有半乳糖的N-聚糖的比例大于未被基因工程化為包括上述Leloir途徑酶的宿主細胞中的比例。在另一實施方案中，產生主要具有GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主細胞另外包括半乳糖基轉移酶催化結構域(其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將半乳糖基轉移酶活性靶向宿主細胞的ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含主要fedGlcNAcMar^GlcNAq糖形的重組糖蛋白。這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源。在另一實施方案中，緊接前述宿主細胞(其如本文所公開的能夠產生具有半乳糖末端的雜合N-聚糖并能夠同化半乳糖作為碳源)可另外包括唾液酸轉移酶催化結構域(其融合至通常不與催化結構域結合的細胞靶向信號肽并被選擇將唾液酸轉移酶活性靶向宿主細胞的ER或高爾基體)。重組糖蛋白經過宿主細胞的ER或高爾基體產生包含 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重組糖蛋白。這些宿主細胞當進一步如本文所教導的被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性時，能夠利用半乳糖作為碳源。多種前述宿主細胞另外包括一個或多個糖轉運蛋白，例如UDP-GlcNAc轉運蛋白 (例如乳酸克魯維酵母和小家鼠(Mus musculus)UDP-GlcNAc轉運蛋白)、UDP-半乳糖轉運蛋白(例如黑腹果蠅UDP-半乳糖轉運蛋白)和CMP-唾液酸轉運蛋白(例如人唾液酸轉運蛋白)。因為低等真核生物宿主細胞例如酵母和絲狀真菌缺乏上述轉運蛋白，優選的是低等真核生物宿主細胞例如酵母和絲狀真菌被基因工程化為包括上述轉運蛋白。宿主細胞另外包括這樣的細胞，其通過刪除或破壞一個或多個甘露糖基轉移酶基因(例如ΒΜΤ1，ΒΜΤ2, ΒΜΤ3和ΒΜΤ4)被基因工程化為消除具有α -甘露糖苷酶-抗性的N-聚糖的糖蛋白(參見，美國公開的專利申請號2006/0211085)和通過刪除或破壞磷酸甘露糖基轉移酶基因PNOl和ΜΝΝ4Β之一或二者被基因工程化為消除具有磷酸甘露糖殘基的糖蛋白(參見例如，美國專利號7，198，921和7，259，007)，在另外的方面，還可包括刪除或破壞ΜΝΝ4Α基因。破壞包括破壞編碼特定酶的開放讀碼框或利用干擾RNA、反義RNA或類似物破壞編碼一種或多種β-甘露糖基轉移酶和/或磷酸甘露糖基轉移酶的開放讀碼框的表達或消除編碼一種或多種β -甘露糖基轉移酶和/或磷酸甘露糖基轉移酶的RNA的翻譯。宿主細胞可另外包括任意一種修飾為產生特定N-聚糖結構的前述宿主細胞。宿主細胞另外包括這樣的低等真核細胞(例如酵母例如巴斯德畢赤酵母)，其通過刪除或破壞一個或多個蛋白0-甘露糖基轉移酶(Dol-P-Man 蛋白(kr/Thr)甘露糖基轉移酶基因)(PMT)被基因修飾以控制糖蛋白的0-糖基化(參見美國專利號5，714，377) 或如公開的國際申請號WO 2007061631中公開的在Riitp抑制劑和/或α -甘露糖苷酶存在下生長，或二者。破壞包括破壞編碼Pmtp的開放讀碼框或利用干擾RNA、反義RNA或類似物破壞編碼一個或多個Riitp的開放讀碼框的表達或消除編碼一個或多個Riitp的RNA的翻譯。宿主細胞可另外包括任意一種修飾為產生特定N-聚糖結構的前述宿主細胞。Pmtp抑制劑包括但不限于苯亞甲基噻唑烷二酮類。可以利用的苯亞甲基噻唑烷二酮的實例是5-[[3，4_雙(苯基甲氧基)苯基]亞甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸； 5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亞甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸和5-[[3-(1_苯基-2-羥基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亞甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸.
在具體實施方案中，至少一個內源PMT基因的功能或表達被降低、破壞或缺失。例如，在具體的實施方案中，至少一個選自PMT1、PMT2、PMT3和PMT4基因的內源PMT基因的功能或表達被降低、破壞或缺失；或在一個或多個PMT抑制劑存在下培養宿主細胞。在另外的實施方案中，宿主細胞包括一個或多個PMT基因缺失或破壞以及在一個或多個Riitp抑制劑存在下培養宿主細胞。在這些實施方案的具體方面，宿主細胞還表達分泌的α-1，2-甘露糖苷酶。PMT缺失或破壞和/或Rntp抑制劑通過降低0_糖基化占據(occupancy)即通過降低在糖蛋白上被糖基化的0-糖基化位點的總數來控制0-糖基化。進一步添加細胞分泌的α-1，2-甘露糖苷酶降低糖蛋白上0-聚糖的甘露糖鏈長度來控制0-糖基化。因此，將 PMT缺失或破壞和/或Riitp抑制劑與分泌的α -1，2-甘露糖苷酶的表達組合通過降低占據和鏈長度來控制0-糖基化。在具體的情況中，確定PMT缺失或破壞、Riitp抑制劑和α-1， 2-甘露糖苷酶的具體組合，經驗上是因為具體的異源糖蛋白(例如Fab和抗體)可通過具有不同效率程度的高爾基體被表達和轉運，因此可需要PMT缺失或破壞、Pmtp抑制劑和 α-1，2-甘露糖苷酶的具體組合。在另一方面，編碼一個或多個內源甘露糖基轉移酶的基因被缺失。該缺失可以與提供分泌的α-1，2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制劑組合或可以代替提供分泌的α -1，2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制劑。因此，0-糖基化的控制可以用于在本文公開的宿主細胞中以更高的總產量或適當組裝的糖蛋白的產量生產具體糖蛋白。0-糖基化的降低或消除看起來具有組裝和轉運完整抗體和Fab片段的優勢效果，因為它們穿越分泌途徑和被轉運至細胞表面。因此，在0-糖基化被控制的細胞中，適當組裝的抗體或Fab片段的產率比在0-糖基化未被控制的宿主細胞中得到的產率增加。因此，預期的是已被基因修飾的宿主細胞，以產生糖蛋白，其中在糖蛋白上的主要 N-聚糖包括但不限于 Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2、Man3GlcNAc2, GlcNAc(1_4)Man2GlcNAc2、Gal (1_4)GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2、NANA(1_4)Gal (1_4)GlcNAc(1_4) Man3GlcNAc2。另外包括的是這樣的宿主細胞，其產生具有前述N-聚糖的具體混合物的糖蛋白。本文中的宿主細胞和方法用于產生廣泛的重組蛋白和糖蛋白。可以在本文公開的宿主細胞中產生的重組蛋白和糖蛋白的實例包括但不限于紅細胞生成素(EPO)，細胞因子例如干擾素α、干擾素β、干擾素Y和干擾素ω，和粒細胞集落刺激因子(GCSF)，GM_CSF， 凝固因子例如因子VIII、因子IX和人蛋白C，抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受體α -鏈， 免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合體和IgM，免疫粘附素和其它Fc融合蛋白例如可溶性TNF受體-Fc融合蛋白，RAGE-Fc融合蛋白，白細胞介素，尿激酶，糜蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制劑，IGF-結合蛋白，表皮生長因子，生長激素釋放因子，膜聯蛋白V融合蛋白，制管張素，血管內皮生長因子_2，骨髓樣前體抑制因子-1，骨保護蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白，DNA酶II，人纖溶酶原的三環3，葡糖腦苷脂酶，TNF結合蛋白1，促卵泡激素，細胞毒性 T淋巴細胞相關抗原4-Ig，跨膜激活劑和鈣調節劑和親環蛋白配體，胰高血糖素樣蛋白1和 IL-2受體激動劑。本文公開的本發明的重組宿主細胞特別用于生產抗體、Fc融合蛋白等，期望的是與在進行如本文所教導的修飾之前的宿主細胞中獲得的抗體組合物的半乳糖百分比相比， 在重組宿主細胞中提供增加的含有半乳糖的N-聚糖的百分比的抗體組合物。一般而言，宿主細胞能夠使得這樣的抗體組合物產生，其中所述GO G1/G2糖形的比值小于2 1。可以在本文中的宿主細胞中產生并具有GO G1/G2的比值小于2 1的抗體的實例包括但不限于人抗體、人源化的抗體、嵌合抗體、重鏈抗體(例如駱駝(camel或llama))。具體抗體包括但不限于以其通用名稱(靶)引用的以下抗體莫羅單抗_CD3(抗-CD3受體抗體)、阿昔單抗(抗-⑶417E3抗體)、利妥昔單抗(抗-⑶20抗體)、達珠單抗(抗-⑶25抗體)、巴利昔單抗(抗-CD25抗體)、帕利珠單抗(抗_RSV(呼吸道合胞病毒)抗體)、英夫利昔單抗(抗-TNF α抗體)、曲妥珠單抗(抗-Her2抗體)、吉姆單抗奧佐米星(抗-CD33抗體)、 阿侖單抗(抗-⑶52抗體)、替伊莫單抗(抗-⑶20抗體)、阿達木單抗(抗-TNF α抗體)、 奧馬珠單抗(抗-IgE抗體)、托西莫單抗-131I (抗-CD20抗體的碘化的衍生物)、依法利珠單抗(抗-CDlla抗體)、西妥昔單抗(抗-EGF受體抗體)、戈利木單抗(抗-TNF α抗體)、 貝伐單抗(抗VEGF-A抗體)及其變體。可以在本文中的宿主細胞中產生的Fc-融合蛋白的實例包括但不限于依那西普(TNFR-Fc融合蛋白)、FGF-21-Fc融合蛋白、GLP-I-Fc融合蛋白、RAGE-Fc融合蛋白、EPO-Fc融合蛋白、ActRI IA-Fc融合蛋白、ActRI IB-Fc融合蛋白、 胰高血糖素-Fc融合物、泌酸調節肽-Fe-融合物及其類似物和變體。本文公開的重組細胞可用于產生適合于化學綴合異源的肽或藥物分子的抗體和 Fc 片段。例如 W02005047334、W02005047336、W02005047337 和 W020061071M 公開了將月太或藥物分子與Fc片段化學綴合。EPl 180121、EPl 105409和US6593295公開了將血液組分與肽等化學綴合，其包括完整抗體。如本文所教導的宿主細胞和/或編碼Leloir途徑酶的多種組合的質粒載體可以作為試劑盒提供，其提供用于產生表達異源蛋白的重組巴斯德畢赤酵母的選擇系統。巴斯德畢赤酵母宿主細胞被基因工程化為表達選自半乳糖激酶、UDP-半乳糖-4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶的Leloir途徑酶中的一種或兩種。任選地，宿主細胞也可表達半乳糖通透酶。克隆載體包括多克隆位點和編碼宿主細胞中未提供的Leloir途徑酶的表達盒。載體可另外包括在多克隆位點兩側的巴斯德畢赤酵母可操縱的啟動子和轉錄終止序列以及可另外包括用于將載體靶向到宿主細胞基因組中的具體位置的靶向序列。在一些實施方案中，試劑盒提供這樣的載體，其編碼所有三個Leloir途徑酶(半乳糖激酶、 UDP-半乳糖-4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶)和包括多克隆位點和缺乏三種Leloir途徑酶的宿主細胞。試劑盒應另外包括說明書、載體圖譜等。以下實施例意圖是促進對本發明的進一步理解。實施例1在該實施例中，通常根據Davidson等人在美國公開的申請號2006/0040353中公開的方法構建能夠產生含有半乳糖的N-聚糖的巴斯德畢赤酵母宿主細胞。本文的方法可用于將其他物種的通常不能利用半乳糖作為碳源的重組宿主細胞變成能夠利用半乳糖作為單一碳源的重組宿主細胞。半乳糖基轉移酶I嵌合酶。利用PCR引物RCD192 (5’ -GCCGCGACCTGAGCC GCCTGCCCCAAC-3，(SEQ ID NO :1))和 RCD186 (5，-CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGT-3，(SEQ ID NO 2))從人腎臟 cDNA (Clontecti) PCR 擴增智人(Homo sapiens) β_1，4_ 半乳糖基轉移酶 I 基因(hGalTI，Genbank AH003575)。該 PCR 產物被克隆至 pCR2. 1 載體 Qnvitrogen) 并測序。從該克隆進行PCR重疊突變發生用于三個目的1)去除開放讀碼框內的NotI位點同時維持野生型蛋白序列，2)在內源跨膜結構域的立即下游截短蛋白以僅提供催化結構域和3)在5’和3’端分別引入AscI和I^acI位點用于克隆。為了進行PCR重疊突變發生， 利用 PCR 引物 RCD198(5，-CTTAGGCGCGCCGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC-3，(SEQ ID NO :3)) 和 RCD201(5，-GGGGCATATCTGCCGCCCATC-3，(SEQ ID NO :4))PCR 擴增基因的 5，端直至 NotI 位點和利用 PCR 引物 RCD200(5，-GATGGGCGGCAGATATGCCCC-3，(SEQ ID NO :5)) ^P RCD 199( 5，-CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3，(SEQ ID NO :6))PCR 擴增 3，端。用引物 RCD198和RCD199將產物在一起重疊以重合成具有野生型氨基酸序列同時去除NotI位點的截短的編碼半乳糖基轉移酶的開放讀碼框(ORF)。新的hGalTIi3PCR催化結構域產物被克隆至pCR2. 1載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)并測序。引入的AscI和PacI位點用它們識別的限制酶切割并將DNA片段亞克隆進質粒PRCD259的PpGAPDH啟動子下游以產生質粒 PRCD260.編碼hGalTI43催化結構域(缺乏最先的43個氨基酸；SEQ ID NO 50)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :49ο來自釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和乳酸克魯維酵母的將蛋白靶向到高爾基體中的各種位置的酵母引導序列文庫被連接到該載體NotI和AscI位點之間，從而將這些引導編碼序列符合讀框地與編碼hGalTI β 43催化結構域的開放讀碼框融合。上述felT融合蛋白的組合文庫在YSH44中表達并通過從來自各個轉化子的純化的K3釋放N-聚糖和用 MALDI-TOF MS測定它們各自分子量分析得到的轉化子。巴斯德畢赤酵母菌株YSH44表達人纖溶酶原的三環3結構域(K3)，其為實質上均一的具有雙觸角末端GIcNAC殘基的復合糖形 (G1 cNAc2Man3GlcNAc2，參見圖1)。活性構建體之一是Mnn2-h(;alTI β 43，其編碼融合蛋白， 所述融合蛋白包含釀酒酵母Mrm2靶向肽的的N-末端(氨基酸1_36 (53) SEQ ID NO 20)融合至hGalTI β 43催化結構域的N-末端(氨基酸44-398 ;SEQ ID NO :50)。引導序列含有釀酒酵母MNN2基因最先的108bp并且該序列確實已被插入pRC擬60的NotI和AscI位點之間以產生質粒PXB53。用^CbaI線性化質粒pXB53并轉化至酵母菌株YSH44以產生菌株 YSH71。菌株YSH44已描述在美國公開的申請號20070037對8、20060040；353、20050208617 和20040230042中以及菌株YSH71已描述在美國公開的申請號20060040353中。如圖3C所示，菌株YSH71產生的一小部分(約10 % ) N-聚糖具有與單個半乳糖添加到K3上的GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO) N-聚糖底物一致的質量以產生 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 (Gl)N-聚糖，而其余的N-聚糖與母本菌株YSH44產生的N-聚糖相同(圖;3B)。圖3A顯示野生型酵母中產生的N-聚糖。我們認為對于不完全的半乳糖轉移存在幾種解釋。這些解釋包括較差的UDP-半乳糖轉運、較低的內源水平UDP-半乳糖或亞最適的(suboptimaDfeilT活性。看起來半乳糖轉移到N-聚糖上可能較低，因為菌株可能需要轉運蛋白以將UDP-半乳糖從細胞質轉位至高爾基體(Ishida 等人，J. Biochem. 120 1074-1078 (1996) ；Miura 等人， J. Biochem(Tokyo) 120 :236-241 (1996) ；Tabuchi 等人，Biochem. Biophys. Res. Com. 232 121-125(1997) Jegawa 等人，FEBS Letts. 451 :295-298 (1999))。轉運蛋白是具有多個跨膜結構域的復合蛋白，其可以不適當地定位于異源宿主。但是，幾種糖核苷酸轉運蛋白，包括UDP-半乳糖轉運蛋白已在異源系統中活躍表達(Sun-Wada等人，J. Biochem.(Tokyo) 123 :912-917(1998) ；Segawa 等人 Eur. J. Biochem. 269 :128-138(2002) ；Kainuma 等人，Glycobiol. 9 :133-141(1999) ；Choi 等人，Proc Natl Acad Sci U S A 100(9) 5022-5027 (2003) ) 0為確保UDP-半乳糖有效轉運至高爾基體，編碼UDP-半乳糖轉運蛋白的黑腹果蠅基因DmUGT (GenBank登記號AB05M93)被克隆并將該克隆如下轉化至表達 MNN2-hGalTI β 43 構建體的菌株 YSH71。UDP-半乳糖轉運蛋白的克隆。利用 PCR 引物 DmUGT-5，(5，-GGCTCGAGCGGCCGCCA CCATGAATAGCATACACATGAACGCCAATACG-3，(SEQ ID NO :7))禾口 DmUGT-3，(5，-CCCTCGAGTTAA TTAACTAGACGCGCGGCAGCAGCTTCTCCTCATCG-3，(SEQ ID NO :8))，從黑腹果蠅 cDNA 文庫(UC Berkeley Drosophila基因組Project，卵巢λ -ZAP文庫GM) PCR擴增編碼UDP半乳糖轉運蛋白的黑腹果蠅基因(GenBank AB055493)，稱為DmUGT，并將PCR擴增的DNA片段克隆至 pCR2. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)并測序。然后利用NotI和PacI位點將該開放讀碼框亞克隆至質粒PRCD393的PpOCHl啟動子下游NotI和I^acI位點之間以產生質粒pS!E63。 編碼DmUGT的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO 37和DmUGT的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO 38。將該質粒用AgeI線性化并轉化至菌株YSH71以產生菌株YSH80。但是，當編碼DmUGT 的質粒被轉化至YSH71時，發現K3的N-聚糖分布情況沒有顯著變化。因此，我們決定將精力集中于增強UDP-半乳糖細胞內庫(pool)。因為巴斯德畢赤酵母不能同化半乳糖作為碳源(Kurtzman Pichia. The Yeasts A Taxonomic Study.C.P. a. F. Kurtzman, J. W. Amsterdam, Elsevier Science Publ. 273-352 (1998))，我們推測菌株中的UDP-半乳糖庫可能不充分。在半乳糖同化生物包括細菌和哺乳動物中保守的UDP-半乳糖4-差向異構酶催化Leloir途徑的第三步。該酶通常位于真核細胞的細胞質并負責UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的可逆轉換(Allard等人，細胞.Mol. Life Sci. 58 1650-1665 (2001)) 0我們推論異源UDP-半乳糖4-差向異構酶的表達將產生細胞質UDP-半乳糖庫，去轉運至高爾基體后，將使得半乳糖轉移酶將半乳糖轉移到N-聚糖上。UDP-半乳糖4-差向異構酶的克隆。從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)克隆之前未表征的基因，以下命名為SpGALE，其編碼與已知的UDP-半乳糖4-差向異構酶具有顯著同一'性的蛋白。利用PCR引物GALE2-L (5，-ATGACTGGTGTTCATGAAGGG -3，(SEQ ID NO 9))禾Π GALE2_R(5，-TTACTTATA TGTCTTGGTATG-3，((SEQ ID NO :10))， 從粟酒裂殖酵母(ATCC2484;3)基因組DNA PCR擴增編碼預測的UDP半乳糖_4_差向異構酶(GenBank NC_003423)的1. 1Kb粟酒裂殖酵母基因，稱為SpGALE。PCR擴增的產物被克隆至PCR2. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)并測序。測序顯示在+66位存在內含子(175bp)。為了消除內含子，設計上游 PCR 引物 GD1 (5 ’ -GCGGCCGCATGA CTGGTGTTCA TGAAGGGACT GTGTTGGTTACTGGCGGCGC TGGTTATATA GGTTCTCATA CGTGCGTTGTTTTGTTAGAA AA-3’ ((SEQ ID NO 11))，其具有NotI位點，位于內含子上游第66個堿基處，然后在內含子之前 20 個堿基和下游 PCR 引物 GD2(5，-TTAATTAATT ACTTATATGT CTTGGTATG-3，((SEQ ID NO :12))具有I^acI位點。利用引物⑶1和⑶2以從pCR2. 1亞克隆擴增SpGALE內含子缺少的基因并將產物再克隆至PCR2. 1并測序。然后將SpGALE在NotI和I3acI位點之間分別亞克隆至質粒PRCD402和pRCD403以產生質粒pRCD406 (Prai-SpGALE-CYClTT)和 PRCD407 (Psec4-SpGALE-CYC 1TT)。這些質粒已在之前的美國公開的申請號20060040353中
34描述。編碼不含內含子的SpGALE的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :35和氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :36。人UDP半乳糖-4-差向異構酶(hGalE)具有SEQ ID NO :48所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO 47所示的核苷酸序列編碼。可以利用hfeilE代替SpGALE。雙feilT/半乳糖-4-差向異構酶構建體的構建。含有kMNN2-hfeilTI β 43融合基因的質粒ρΧΒ53用B10I線性化并用T4DNA聚合酶產生平端。然后用BioI和SphI并將末端用T4DNA聚合酶產生平端從質粒pRCD406去除PppraiSpGALE_CYCITT表達盒，并將片段插入上述pXB53質粒以產生質粒pRCD425。將該質粒用)(bal線性化并轉化至菌株YSH44以產生菌株RDP52，其已在之前的美國公開的申請號20060040353中描述。通過MALDI-T0F MS分析從幾種轉化子分離的純化的K3上的N-聚糖。如圖3D所示，發現相當比例的N-聚糖已獲得與兩個(約20% G2 =Gal2GlCNAC2Man3GlcNAc2)或單個半乳糖部分(約40% Gl Gal1GlcNAc2Man3GlcNAc2)添加到 G0(GlcNAc2Man3GlcNAc2)底物上的一致的質量，而其余的 N-聚糖保持與YSH44母本中發現的質量沒有改變(圖:3B)，即GO。三feilT/半乳糖-4-差向異構酶/UDP半乳糖轉運蛋白構建體的構建。通過用Mcl 消化將含有Prai-DmUGT-CYClTT的G418K質粒pSH263線性化并用T4 DNA聚合酶進行末端平端化。通過用》ιοΙ和SphI消化將PSEe4-SpGALE-CYCITT表達盒從質粒pRCD407去除并用 T4 DNA聚合酶進行末端平端化。然后將平末端的SpGALE片段插入上述pSH263以產生質粒 PRCD446。通過用 Bglll/BamHI 消化從質粒 pXB53 釋放 PeAPDI^cMNN2-hGalTI β 43-CYC1TT 表達盒并用T4 DNA聚合酶進行末端平端化。然后將平末端的hfelTI-53插入pRCD446的平端的EcoRI位點以產生質粒pRCD465，其是含有hGalTI_53、SpGALE和DmUGT的三G418R質粒。 用AgeI線性化質粒pRCD465并轉化至菌株YSH44以產生菌株RDP80，其如美國公開的申請號20060040353中描述的。通過MALDI-TOF MS分析從菌株產生的分泌的K3釋放的N-聚糖。發現N-聚糖具有定量添加兩個半乳糖殘基到GO底物上一致的質量以產生人半乳糖基化、雙觸角復合N-聚糖G2 (Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)(圖3E)。該N-聚糖的體外β -半乳糖苷酶消化產生對應于去除兩個半乳糖殘基的降低的質量，得到GO (GlcNAc2Man3GlcNAc2)(圖 3F)。另外，在CMP-唾液酸存在下用大鼠α-2，6-Ν-唾液酸轉移酶體外處理從菌株 RDP80純化的Κ3產生幾乎均一地轉換成NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (圖3G)。這些結果表明通過(1)充分的細胞內UDP-半乳糖庫的代謝工程，(2)活性的和適當定位的feilT的表達和( 通過活性UDP-半乳糖轉運蛋白的UDP-半乳糖至高爾基體的易位，可獲得在巴斯德畢赤酵母產生的復合N-聚糖高效延伸。但是，半乳糖轉移的效率通過進一步包括將 Leloir途徑的酶引入宿主細胞來改進，如實施例2所示。菌株和培養基。大腸桿菌菌株T0P10或DH5 α用于重組DNA工作。來源于菌株 JC308 (J. Cregg, Claremont, CA)的巴斯德畢赤酵母菌株 YSH44 (Hamilton 等人，Science 301 :1244-1246(2003))用于產生多種酵母菌株。酵母菌株的轉化通過如前報道的電穿孔進行(Cregg，等人，Mol. Biotechnol. 16 :23-52 (2000))。在室溫在96孔板形式中進行蛋白表達(除了生物反應器實驗)，使用緩沖的甘油-復合培養基(BMGY)，由酵母提取物， 2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀緩沖液，pH 6. 0，1. 34%酵母氮源，4X10_5(%生物素和1 %甘油組成，作為生長培養基；以及緩沖的甲醇-復合培養基(BMMY)，由1 %甲醇替代甘油的BMGY組成作為誘導培養基。YPD是酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和2%瓊脂。限制和修飾酶來自New England BioLabs (Beverly, ΜΑ)。寡核苷酸獲自 Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ) β -半乳糖苷酶獲自 QAbio (San Mateo, CA)。96 孔裂解物清除板(lysate-clearing plate)來自 Promega (Madison，WI)。蛋白-結合 96 孔板來自 Millipore (Bedford, ΜΑ)。鹽和緩沖劑來自 Sigma (St. Louis, MO)。MALDI 基質來自 Aldrich(Milwaukee，WI)。蛋白純化和N-聚糖分析。K3純化如前述(Choi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 100 :5022-5027 (2003)) 利用獲自 New England BioLabs (Beverly, MA)的 N-糖苷酶F從K3釋放N-聚糖，如前述(Choi等人，ibid.)。利用Applied Bio系統(Foster City, CA)的Voyager DE PRO線性MALDI-TOF質譜儀測定聚糖的分子量，如前述(Choi等人，ibid.) ο生物反應器培養。用ImL的種子培養物(參見搖瓶培養)接種含有150mL BMGY 培養基的500mL帶擋板的容量瓶。在將接種物培養至0D600為4_6 (大約18小時)。 然后將來自接種培養物的細胞離心并重懸至50mL發酵培養基(每升培養基CaS04. 2H20 0. 30g, K2S046. OOg, MgSO4. 7H20 5. OOg,甘油 40. Og, PTM1 鹽 2. OmL,生物素 4x10、， H3PO4 (85 % ) 30mL, PTMl 鹽每升=CuSO4. H2O 6. OOg, NaIO. 08g, MnSO4. 7H20 3. OOg, NaMoO4. 2H20 0. 20g, H3BO3 0. 02g, CoCl2. 6H20 0. 50g, ZnCl2 20. Og, FeSO4. 7H20 65. Og,生物素 0. 20g, H2SO4 (98% )5. OOmL)。在3升碟形底(1. 5升初始進料體積)Applikon生物反應器中進行發酵。發酵罐在的溫度下以分批補料模式運行，并將pH控制在4. 5士0. 1利用30%氫氧化銨。通過調
整攪拌速率G50-900rpm)和純氧提供，將溶解氧維持在40%以上，相對于在Iatm下用空氣飽和。空氣流動速率維持在lvvm。當在分批培養期(the batch phase)初始甘油(40g/L) 被耗盡時，這是DO增加的指示，將含有12ml/L PTMl鹽的50%甘油溶液以12mL/L/h的進料速率補料直到達到所期望的生物質濃度。在半小時饑餓期后，起始甲醇補料(含有12mL/L PTMl的100%甲醇)。甲醇進料速率用于控制發酵罐中甲醇濃度在0. 2-0. 5%之間。利用位于發酵罐的排出氣中TGS氣體傳感器(TGS822，來自Figaro Engineering Inc.)在線測量甲醇濃度。每8小時對發酵罐中進行取樣和分析生物質(0D600，濕細胞重和細胞計數)，剩余碳源水平(利用Aminex 87H通過HPLC測量甘油和甲醇)和細胞外蛋白含量(通過SDS page和Bio-Rad蛋白測定)。體外β-半乳糖苷酶消化。來自RDP80的N-聚糖與β 1，4_半乳糖苷酶(QA bio, San Mateo, CA)在 50mM NH4HCO3, pH6. O 中在 37°C孵育 16-20 小時。體外唾液酸轉移。從菌株RDP80純化的K3用作唾液酸轉移的底物。將200 μ g 該蛋白與50 μ g CMP-唾液酸和15mU大鼠重組α - (2，6) - (N)-唾液酸轉移酶(來自EMD Biosciences (San Diego, CA, formerly Calbiochem))在 5OmM NH4HCO3, ρΗ6· O 中在 37°C孵育16-20小時。然后通過PNGaseF消化釋放N-聚糖并通過MALDI-TOF MS檢測。實施例2UDP-半乳糖4-差向異構酶催化Leloir途徑的第三步(圖4)。如實施例1所示， 在糖工程化的巴斯德畢赤酵母菌株中編碼該酶的基因的異源表達引起UDP-半乳糖細胞內庫的產生，如表達該異源基因的菌株中半乳糖轉移顯著增加所證實的。但是，還如所示的，
36僅添加該酶不能賦予巴斯德畢赤酵母菌株在半乳糖(作為單一碳源)上生長的能力(參見圖7，菌株RDP578-1)。因此，將釀酒酵母中Leloir途徑的其余酶引入實施例1的各種菌株中。因此，在該實施例中，構建了能夠利用半乳糖作為單一碳源的巴斯德畢赤酵母宿主細胞。本文的方法可用于將通常不能利用半乳糖作為碳源的其他物種的重組宿主細胞制備成能夠利用半乳糖作為單一碳源的重組宿主細胞。釀酒酵母GALl 的克隆。利用 PCR 引物 PB158 (5，-TTAGCGGCCGCAGGAATGACTAAATCTC ATTCA-3' (SEQ ID NO:i;3))*PB159(5，-AACTTAATTAAGCTTATAATTCATATAGACAGC-3，(SEQ ID NO 14)),從釀酒酵母基因組DNA (菌株W303，標準smash和grab基因組DNA制備)PCR擴增編碼半乳糖激酶(GenBank NP_009576)的釀酒酵母基因(稱為&GAL1)，將PCR擴增的DNA 片段克隆至PCR2. l(Invitrogen，Carlsbad, CA)并測序。得到的質粒命名為pRCD917。用 NotI和I^cI將編碼半乳糖激酶的DNA片段從質粒釋放并將DNA片段亞克隆進質粒pGLY894 的巴斯德畢赤酵母HHTl強組成型啟動子下游NotI和I^cI位點之間以產生質粒pGLY939。 半乳糖激酶具有SEQ ID NO :40所示的氨基酸序列并由SEQ ID NO :39所示的核苷酸序列編碼。釀酒酵母GAL2 的克隆。利用 PCR 引物 PB156 (5，-TTAGCGGCCGC-3，(SEQ ID NO: 15))和 PB157(5，-AACTTAATTAA-3' (SEQ ID NO :16))從釀酒酵母基因組 DNA (菌株 W303， 標準“smash and grab”基因組DNA制備)PCR擴增編碼半乳糖通透酶(GenBankNP_013182) 的釀酒酵母基因(稱為&GAL2)，將PCR擴增的DNA片段亞克隆進pCR2. ldnvitrogen， Carlsbad, CA)并測序。得到的質粒命名為pPB290。用NotI和I3acI將編碼半乳糖通透酶的DNA片段從質粒釋放并將DNA片段亞克隆進質粒PJN664的PpPMAl啟動子下游NotI和 I^acI位點之間以產生質粒pPB292。半乳糖通透酶具有SEQ ID NO :44所示的氨基酸序列并由SEQ ID NO 43所示的核苷酸序列編碼。釀酒酵母GAL7的克隆。利用 PCR 弓丨物 PB160 (5，-TTAGCGGCCGCAGGAATGAC TGCTGAAGAA TT-3，(SEQ ID NO 17))禾口 PB161(5，-AACTTAATTA AGCTTACAGT CTTTGTAGAT AATC-3，(SEQ ID NO: 18)從釀酒酵母基因組DNA (菌株W303，標準smash and grab基因組 DNA制備)PCR擴增編碼半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶(GenBank NP_009574)的釀酒酵母基因(稱為 &GAL7)，將 PCR 擴增的 DNA 片段克隆至 pCR2. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)并測序。得到的質粒命名為PRCD918。用NotI和I^acI將編碼半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶的DNA片段從質粒釋放并將DNA片段亞克隆進質粒PGLY143的PpPMAl強組成型啟動子下游NotI和I^acI位點之間以產生質粒pGLY940。個別地，NotI和I^acI位點還用于亞克隆該 ORF至質粒pRCD830巴斯德畢赤酵母TEFl強組成型啟動子下游的Notl/PacI處以產生質粒PRCD929。半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶具有SEQ ID NO :42所示的氨基酸序列并由SEQ ID NO :41所示的核苷酸序列編碼。三&GALl/ScGAL7/ScGAL2構建體的構建。將來自pGLY917的&GAL1開放讀碼框亞克隆至PJN702，一種巴斯德畢赤酵母hisl敲除載體，具有巴斯德畢赤酵母ARGl選擇標記(hisl: :ARG1，參見美國專利號7，479，389)且還含有Pmpdh-啟動子表達盒；含有 Pgapdh-ScGALI融合的這種新的載體命名為pRCD928。將來自pGLY^9的PTEF14cGAL7表達盒亞克隆至PGLY928，新的載體命名為pGLY946a。下一步，將來自pRCD634的Prai-DmUGT (高爾基體UDP-半乳糖轉運蛋白)表達盒亞克隆至pGLY946a以產生pGLY956b。最后，將來自PPB292的PeAPDH4cGAL2表達盒亞克隆至pRCD956b以產生質粒pRCD977b (參見圖6)。質粒 pRCD977b含有DmUGT、ScGALU ScGAL7和&GAL2表達盒并具有ARGl顯性選擇標記盒。|&GALl/ScGAL7構建體的構建。將來自pGLY939的Ptefi-ScGALI表達盒亞克隆至 PGLY941，一種敲入載體，具有巴斯德畢赤酵母ARGl選擇標記、TRPl基因座敲入區、還含有 PGAPDH-hGalTI β表達盒，該新的載體命名為pGLY952。將來自pGLY940的Ppma14cGAL7表達盒亞克隆至PGLY952，新的載體命名為pGLY955。最后，將諾爾絲菌素抗性表達盒(NATR)從 pGLY597(最初來自 pAG25，來自 EROSCARF，Scientif ic Research and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a, D-61352 Bad Homburg, Germany,參見 Goldstein 等人，1999, Yeast 15 :1541)亞克隆至pGLY952以產生質粒pGLY1418 (參見圖12)，其含有hGalTI β、ScGALl 和&GAL7表達盒并具有NATk顯性選擇標記盒。具有所有三個基因的單一整合質粒pRCD977b(圖6)被轉化至巴斯德畢赤酵母菌株RDP578-1以產生菌株RDP635-1、-2和-3。菌株RDP578-1已含有異源基因和基因敲除用于產生含有末端β-1，4-半乳糖殘基的人N-聚糖(參見圖5和實施例3用于構建體)。 菌株RDP578-1也包括編碼釀酒酵母UDP-半乳糖4-差向異構酶編碼基因&GAL10的表達盒并表達測試蛋白人三環3。得到的菌株RDP635-1、_2和-3具有兩個拷貝的DmUGT半乳糖轉運蛋白。母本菌株RDP578-1和具有&GAL1、ScGAL2, ScGAL7和&GAL10基因的轉化子 (RDP635-l、-2和- 在含有葡萄糖、半乳糖或無碳源的最低培養基生長五天然后拍照。有意思的是，盡管具有分泌具有半乳糖末端的N-聚糖的蛋白的能力，RDP578-1顯示出不能同化半乳糖，同時在葡萄糖上正常生長，如野生型巴斯德畢赤酵母所期望的。但是，表達 ScGALU ScGAL2和&GAL7基因的轉化子能夠同化半乳糖，如圖7所示。如期望的，在缺乏碳源的平板上觀察到最低生長。這些結果表明可以構建重組巴斯德畢赤酵母，當與Leloir 半乳糖同化途徑的基礎結構(但不是調節)元件重構時其可同化半乳糖作為碳源。在糖工程化的巴斯德畢赤酵母中表達的Fc第297位Asn殘基上N-聚糖的測定。 人IgG的Fc部分在每個重鏈二聚體上含有單個N-聚糖位點(Asr^97，Kabat numbering), 其通常含有不同于其他分泌的人蛋白的N-聚糖分布情況。通常地，天然存在的人抗體含有具有末端GIcNAC和一定量末端半乳糖的N-聚糖，其基于多種因素而不同，并很少含有顯著量的末端唾液酸。在證明N-聚糖的高水平末端β-1，4-半乳糖后，我們試圖測定在這類糖工程化的酵母菌株產生的抗體上觀察到的N-聚糖分布情況。因此，用在AOXl啟動子的控制下編碼人免疫球蛋白Gl (IgGl)重鏈的Fc結構域或C-末端半部分的質粒(ρΒΚ138)轉化已被基因工程化為產生具有末端半乳糖的N-聚糖的巴斯德畢赤酵母菌株(YGB02 ；參見圖8 和實施例4)。由PCR鑒定的選擇的陽性克隆命名為ΡΒΡ317-36 (圖8和實施例4)。該菌株在搖瓶中生長并用甲醇作為單一碳源誘導。通過離心收獲上清并通過蛋白A親和層析進行純化。純化的蛋白在SDS-PAGE上分離并進行考馬斯染色。觀察到具有期望大小的標記的條帶。然后將純化的蛋白進行PNGase消化并通過MALDI-TOF MS分析釋放的N-聚糖。得到的N-聚糖(圖10Α)顯示與具有末端GlcNAc的復合人核心結構(GO GlcNAc2Man3GlcNAc2) 一致的主要質量，較少種類具有單個末端半乳糖(G1 =GalGlCNAC2Man3GlcNAc2)和次要種類 (minor物種)具有用半乳糖加帽復合種類的兩個臂(G2 KaI2GlcNAc2Man3GlcNAc2)。這些種類的質量不同于預測的文獻中報道的規范值，原因在于缺乏單個果糖殘基。糖工程化的酵母菌株不含有內源巖藻糖基轉移酶，因此缺乏將果糖添加至核心人N-聚糖結構的內在性質。還觀察到與Man5GlcNAc2 —致的另一次要種類。然后將上述菌株PBP317-36 (其表達組裝具有末端半乳糖的人樣N-聚糖所需的糖基化活性和還表達SpGALE(UDP-半乳糖4-差向異構酶))基因工程化為能夠利用外源半乳糖作為碳源并以代謝工程化的方式控制N-糖基化。構建在組成型啟動子控制下表達&GAL1和&GAL7的整合質粒pGLY954 (圖9)并將其轉化至巴斯德畢赤酵母菌株 PBP317-36。質粒pGLY卯4賦予菌株PBP317-36 (其已含有SpGALEUDP-半乳糖差向異構酶， 圖8)在半乳糖(作為單一碳源)上生長的能力。該gal+菌株命名為RDP783。因為盡管我們沒有將半乳糖通透酶引入至細胞，細胞仍能夠利用半乳糖作為碳源，我們得出結論對巴斯德畢赤酵母是內源的一般己糖轉運蛋白能夠充分穿過細胞膜轉運半乳糖。巴斯德畢赤酵母菌株PBP317-36和RDP783具有在甲醇-誘導型AOXl啟動子控制下編碼人Fc結構域作為分泌的報告子蛋白的整合質粒構建體。菌株PBP317-36和RDP783 在標準培養基中在搖瓶中培養，所述標準培養基含有甘油和在甲醇作為單一碳源存在下誘導或用甲醇與不同濃度葡萄糖或半乳糖組合誘導。收獲的上清蛋白通過蛋白A被親和純化，進行PNGase消化通過MALDI-TOF MS分析。從菌株RDP783的人Fc釋放的N-聚糖產生與用甲醇單獨誘導或在葡萄糖或甘露糖存在下誘導后在PBP317-36中觀察到的分布情況類似的N-聚糖，具有主要糖形GO (GlcNAc2Man3GlcNAc2)(圖10)。但是，外源半乳糖給料后， 菌株RDP783 (但不是母本菌株PBP317-36)產生在人Fc上的含有半乳糖的N-聚糖的劑量依賴增加，其主要糖形現在轉移到Gl (GalGlcNAc2Man3GlcNAc2)且在完全地β -1，4-半乳糖加帽的糖形G2 (Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)中污染增加(圖10)。最后，為證明用人Fc觀察到的利用外源半乳糖控制糖基化的能力可應用于全長單克隆抗體，產生糖工程化的酵母菌株YDX477 (圖11，實施例幻，其表達抗-Her2單克隆抗體。該菌株還工程化為轉移G2形的人N-聚糖(GaI2GlcNAc2Man3GlcNAc2)到分泌的糖蛋白上。在mAb-A的表達后N-聚糖的釋放顯示N-聚糖模式(圖13A)，其由與 GO (GlcNAc2Man3GlcNAc2) 一致的主要峰組成，具有與 Gl(GalGlcNAc2Man3GlcNAc2) —致的次主要峰，以及G2 (Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)禾Π M5 (Man5GlcNAc2)的次要峰。該數據與對于人 IgGl的截短的Fc部分觀察到的相似并且是期望的，因為在相同殘基處(Asn-297)N-糖基化。構建具有&GAL1和&GAL7的整合質粒pGLY1418 (圖1 和轉化至巴斯德畢赤酵母菌株YDX477以制備菌株RDP968-1。該質粒賦予菌株YDX477 (其已含有SpGALE UDP-半乳糖差向異構酶，圖11)在半乳糖(作為單一碳源)上生長的能力。菌株YDX477和RDP968-1在標準培養基中在搖瓶中培養，所述標準培養基含有甘油和在甲醇作為單一碳源存在下誘導或用甲醇與不同濃度半乳糖組合誘導。收獲的上清蛋白通過蛋白A被親和純化，進行PNGase消化通過MALDI-TOF MS分析。兩種菌株產生與之前用甲醇單獨誘導或在葡萄糖或甘露糖存在下誘導后在PBP317-36中觀察到的分布情況類似的N-聚糖，具有主要糖形GO (GlcNAc2Man3GlcNAc2)(圖IOA相對于圖13A和13D)。但是，外源半乳糖給料后，菌株RDP968-1 (但不是母本菌株YDX477)產生在抗體上的含有半乳糖的N-聚糖的劑量依賴增加，其主要糖形現在轉移到Gl (GalGlcNAc2Man3GlcNAc2)且在完全地β-1，4-半乳糖加帽的糖形G2 (GaI2GlcNAc2Man3GlcNAc2)中污染增加(圖13Ε和F)。實施例3
菌株RDP578-1的構建顯示于圖5并涉及以下步驟。菌株JC308是起始菌株。該菌株已在 Choi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 :5022-5027(2003)中描述，但簡言之， 菌株是ura3，adel，arg4，his4。通過利用質粒pJN329破壞OCHl基因并根據Choi等人 (ibid.)和美國專利號7，449，308中描述的方法，使得該菌株缺乏α_1，6甘露糖基轉移酶活性以產生菌株YJN153。質粒pJN3^攜帶PPURA3顯性選擇標記，在反選擇ura-活性后， 通過利用質粒載體pJN50!3b和pAS19破壞PN01、MMN4A和MNN4B基因并根據美國專利號 7，259，007中描述的方法，使得得到的菌株YJN156缺乏磷酸甘露糖基轉移酶活性以產生菌株YAS180-2。包含本文中的融合蛋白的分泌途徑靶向前導肽定位催化結構域，其被融合至 ER、高爾基體或反式高爾基體網絡。在反選擇ura-活性后，通常如美國專利號7，465，577中描述的利用質粒 pAS24(參見圖14)使得得到的菌株YAS187-2缺乏β _甘露糖基轉移酶活性以制備菌株 YAS218-2。質粒pASM是巴斯德畢赤酵母BMT2敲除質粒，其含有PpURA3選擇標記和在 PpOCHl啟動子的下游含有編碼全長小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白(MmSLC35A;3)的表達盒。MmSLC35A3具有SEQ ID NO 34所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO ;33所示的核苷酸序列編碼。可以如美國專利號7，465，577所示獲得在序列兩側的5’和3’BMT2用于去除 β-甘露糖基轉移酶活性(其歸因于bmt2p)。在對于ura-活性反選擇菌株YAS218-2后，得到的菌株YAS269-2是ura-并具有插入BMT2基因的小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白。然后用質粒pRCD742b(參見圖1 轉化菌株YAS269-2，質粒pRCD7^b包括編碼嵌合小鼠^-1，2-甘露糖基轉移酶1爾88 MarmI)、嵌合人GIcNAc轉移酶I(CONAlO)和全長基因編碼小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白(MmSLC35A3)的表達盒并將質粒靶向 ADEl基因座(參見PCT/US2008/13719)。質粒pRCD7^b是敲入敲除(KINKO)質粒，其已在TO2007/136865和W02007136752中描述。質粒整合進巴斯德畢赤酵母ADEl基因而不刪除編碼Adelp的開放讀碼框。質粒還含有PpURA5選擇標記。編碼分泌途徑靶向融合蛋白 (FBSMannI)的表達盒包括在PpGAPDH啟動子的控制下融合至小鼠α-1，2-甘露糖基轉移酶 I 催化結構域(FB MannI =SEQ ID NO 54)的 N-末端的前導肽(ScSecl2(8) =SEQ ID NO 32的最先的103個氨基酸)。編碼分泌途徑靶向融合蛋白C0NA10的表達盒包括在 PpPMAl啟動子的控制下融合至人GIcNAc轉移酶I (GnT I)催化結構域(SEQ ID NO 52)的 N-末端的Ppkcl2前導肽(PpSecl2(10) =SEQ ID NO 的最先的四個氨基酸)。質粒另外包括在PpSEC4啟動子的控制下編碼全長小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白(MmSLC35A3) 的表達盒。將質粒pRCD742b轉染進菌株YAS269-2產生菌株RDP307。該菌株能夠產生具有 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白。SEQ ID NO :53和51是分別編碼小鼠α-1，2_甘露糖基轉移酶I和人GIcNAC轉移酶I (&ιΤ I)催化結構域的核苷酸序列。編碼人GnT I的核苷酸序列被密碼子最優化用于在巴斯德畢赤酵母中表達。SEQ ID NO :27和31是分別編碼 PpSEC12(10)和 ScSEC12(8)的核苷酸序列。菌株RDP361如下構建用質粒pDMG47轉化菌株RDP307以產生菌株RDP361。質粒pDMG47(參見圖16)是KINKO質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母TRPl基因座而不刪除編碼Trplp的開放讀碼框。質粒還含有PPURA3選擇標記并包括編碼分泌途徑靶向融合蛋白 (KD53)的表達盒，其包含在PpGAPDH啟動子的控制下融合至黑腹果蠅甘露糖苷酶II (KD SEQ ID NO :63)催化結構域的N-末端的&Μηη2引導靶向肽6cMnn2(53) =SEQ ID NO :19
40最先的36個氨基酸)。質粒還含有編碼分泌途徑靶向融合蛋白(TC54)的表達盒，其包含在PpPMAl啟動子的控制下融合至大鼠GIcNAc轉移酶II (TC :SEQ ID NO :58)的催化結構域的N-末端的ScMnn2引導靶向肽(ScMnn2 (54) =SEQ ID NO :22的最先的97個氨基酸)。 &Mrm2前導區53和討的核酸序列分別顯示于SEQ ID N0:19和21。編碼黑腹果蠅甘露糖苷酶II和大鼠GIcNAC轉移酶II (GnTII)的催化結構域的核酸序列分別顯示于SEQ ID NO 62 禾口 57。上述菌株RDP361用質粒pRCD823b轉化以產生菌株RDP415-1。質粒pRCD823b (參見圖17)是KINKO質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母HIS4基因座(參見美國專利號 7，479，389)而不刪除編碼His4p的開放讀碼框，并含有PpURA5選擇標記(參見美國公開的申請號200402^306)以及編碼分泌途徑靶向融合蛋白(TAM)的表達盒，其包含大鼠 GlcNAc轉移酶II催化結構域(TA =SEQ ID NO 61)，如上述在它的N-末端與&Mnn2 (54)的最先的97個氨基酸融合但在PpGAPDH啟動子的控制下。質粒還含有在PpOCHl啟動子的控制下編碼全長黑腹果蠅高爾基體UDP-半乳糖轉運蛋白(DmUGT)和在PpPMAl啟動子的控制下編碼全長釀酒酵母UDP-半乳糖4-差向異構酶(&GAL10)的表達盒。&GAL10具有SEQ ID NO :46所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO :45所示的核苷酸序列編碼。大鼠GIcNAC轉移酶II (TA)的核苷酸序列顯示于SEQ ID N0:60。上述菌株RDP415-1用質粒pRCD893a轉化以產生菌株RDP523-1。質粒 pGLY893a(參見圖18)是巴斯德畢赤酵母hisl敲除質粒，其含有PpARG4選擇標記(參見美國專利號7，479，389)。質粒包括編碼分泌途徑靶向融合蛋白(KDlO)的表達盒，其包含在PpPMAl啟動子的控制下融合至黑腹果蠅甘露糖苷酶II (KD :SEQ ID NO :63)的催化結構域的N-末端的PpSEC12引導靶向肽(PpSEC12(10) =SEQ ID NO :28的最先的四個氨基酸)。質粒還含有編碼分泌途徑靶向融合蛋白(TA33)的表達盒，其包含在PpTEFl啟動子的控制下融合至大鼠GIcNAC轉移酶II (TA :SEQ ID NO :61)的催化結構域的N-末端的 ScMntIp (ScKre2p)引導靶向肽 GcMntIp (ScKre2p) (33) =SEQ ID NO :30 的最先的 53 個氨基酸)。質粒還含有編碼分泌途徑靶向融合蛋白(XB53)的表達盒，其包含融合至人半乳糖基轉移酶I (hGalTI β 43 ；SEQ ID NO 50)的催化結構域的N-末端的&Mrm2p前導肽(53) 的最先的36個氨基酸。PpSEC12和kMNTI (ScKRE2)前導區的核酸序列分別顯示于SEQ ID 而27和四。編碼黑腹果蠅甘露糖苷酶II、大鼠GIcNAc轉移酶II (GnT II)和人feilTI的催化結構域的核酸序列分別顯示于SEQ ID N0:62、60和49。該菌株可產生具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖具有末端半乳糖殘基。菌株編碼兩個拷貝的黑腹果蠅甘露糖苷酶II 催化結構域和三個拷貝的大鼠&1TII催化結構域。最后，上述菌株RDP523-1用質粒pBK64轉化以產生菌株RDP578-1。質粒pBK64編碼人三環 3 測試蛋白并已在 Choi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 :5022-5027 (2003) 中描述。實施例4菌株PBP317-36的構建顯示于圖8。起始菌株是YGLY16-3。這是具有OCHl，PNOl， MNN4A，Mnn4B和BMT2基因缺失的ura-菌株并可以根據實施例3所用方法制備。菌株 YGLY16-3 還在 W02007136752 中公開。菌株YGLY16-3用質粒pRCD742a(參見圖19)轉化以制備菌株RDP616-2。質粒pRCD742a(參見圖19)是KINKO質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母ADEl基因而不刪除編碼 Adelp的開放讀碼框。質粒還含有PpURA5選擇標記和包括編碼嵌合小鼠α-1，2_甘露糖基轉移酶(FB8MannI)、嵌合人GlcNAc轉移酶I (C0NA10)和全長小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白(MmSLC35A3)的表達盒。質粒與質粒pR⑶742b相同，除了編碼嵌合人GlcNAc轉移酶 I的表達盒的方向為相反方向。將質粒pRCD74h轉染進菌株YGLY16-3產生菌株RDP616-2。 該菌株能夠產生具有GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白。反選擇菌株RDP616-2以產生ura_菌株RDP641-3后，然后將質粒pRCD1006轉化至菌株以制備菌株RDP666。質粒pRCD1006(參見圖20)是巴斯德畢赤酵母hisl敲除質粒，其含有PpURA5基因作為選擇標記。質粒含有在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(XB33)的表達盒(其包含融合至人半乳糖基轉移酶I催化結構域(hGalTIi3 43) 的N-末端的kMntlp6CKre2p) (33)的最先的58個氨基酸)；在PpOCHl啟動子的控制下編碼全長黑腹果蠅高爾基體UDP-半乳糖轉運蛋白(DmUGT)的表達盒和在PpPMAl啟動子的控制下編碼粟酒裂殖酵母UDP-半乳糖4-差向異構酶(SpGALE)的表達盒。菌株RDP666用質粒pGLY167b轉化以制備菌株RDP696-2。質粒pGLY167b (參見圖21)是巴斯德畢赤酵母argl敲除質粒，其含有PpURA3選擇標記。質粒含有在PpGAPDH 啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(CO-KD5;3)的表達盒(其包含融合至黑腹果蠅甘露糖苷酶II催化結構域(KD)的N-末端&&Μηη2ρ(53)的最先的36個氨基酸)和在 PpPMAl啟動子的控制下表達分泌途徑靶向融合蛋白(C0-TC54)的表達盒(其包含融合至大鼠GIcNAC轉移酶II催化結構域(TC)的N-末端的&Mrm2p (54)的最先的97個氨基酸)。 得到的菌株RDP696-2進行恒化器選擇(參見Dykhuizen和Hartl，Microbiol. Revs. 47 150-168(1983)關于恒化器選擇的綜述)。恒化器選擇產生菌株YGB02。菌株YGB02可產生具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖具有末端半乳糖殘基。在該菌株中，甘露糖苷酶II催化結構域(KD)和^iTII(TC)被密碼子最優化為在巴斯德畢赤酵母中表達的核酸分子(分別為SEQ ID NO 64和59)編碼。菌株YGB02用質粒pBK138轉染以產生菌株PBP317-36。質粒pBK138 (參見圖22) 是滾入(roll-in)質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母AOXl啟動子同時復制啟動子。質粒含有編碼融合蛋白的表達盒，其包含融合至人Fc抗體片段(C-末端233-aa of a人IgGl重鏈， SEQ ID NO 66)的N-末端的釀酒酵母A交配因子前信號序列(SEQ ID NO :24)。編碼釀酒酵母A交配因子前信號序列的核酸序列顯示于SEQ ID NO :23和編碼人IgGl重鏈的C-末端233-aa的核酸序列顯示于SEQ ID NO 65)。實施例5菌株YDX477的構建顯示于圖11。起始菌株是YGLY16-3。菌株YGLY16-3用質粒 pRCD742a(參見圖19)轉化以制備菌株RDP616-2。質粒pRCD742a(參見圖19)是KINKO 質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母ADEl基因而不刪除編碼adelp的開放讀碼框。質粒還含有PpURA5選擇標記和包括編碼嵌合小鼠α-1，2-甘露糖基轉移酶(FBSMarmI)、嵌合人 GlcNAc轉移酶I(CONAlO)和全長小鼠高爾基體UDP-GlcNAc轉運蛋白(MmSLC35A3)表達盒。質粒與質粒pRCD742b相同，除了編碼嵌合人GIcNAC轉移酶I的表達盒的方向為相反方向。將質粒pRCD74h轉染進菌株YGLY16-3產生菌株RDP616-2。該菌株能夠產生具有 GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白。
反選擇菌株RDP616-2以產生ura_菌株RDP641-4后，然后將質粒pRCD1006轉化至菌株以制備菌株RDP667-1.質粒pRCD1006(參見圖20)是巴斯德畢赤酵母hisl敲除質粒， 其含有PpURA5基因作為選擇標記。質粒含有在PpGAPDH啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(XB33)的表達盒(其包含融合至人半乳糖基轉移酶I催化結構域(hGalTIi3 43) 的N-末端的kMntlp6CKre2p) (33)的最先的58個氨基酸)；在PpOCHl啟動子的控制下編碼全長黑腹果蠅高爾基體UDP-半乳糖轉運蛋白(DmUGT)的表達盒和在PpPMAl啟動子的控制下編碼粟酒裂殖酵母UDP-半乳糖4-差向異構酶(SpGALE)的表達盒。菌株RDP667-1用質粒pGLY167b轉化以制備菌株RDP697-1。質粒pGLY167b (參見圖21)是巴斯德畢赤酵母argl敲除質粒，其含有PpURA3選擇標記。質粒含有在PpGAPDH 啟動子的控制下編碼分泌途徑靶向融合蛋白(CO-KD5;3)的表達盒(其包含融合至黑腹果蠅甘露糖苷酶II催化結構域(KD)的N-末端&&Μηη2ρ(53)的最先的36個氨基酸)和在 PpPMAl啟動子的控制下表達分泌途徑靶向融合蛋白(C0-TC54)的表達盒(其包含融合至大鼠GIcNAC轉移酶II催化結構域(TC)的N-末端的&Mrm2p (54)的最先的97個氨基酸)。 編碼甘露糖苷酶II和&iT II催化結構域的核酸分子被密碼子最優化用于在巴斯德畢赤酵母中表達(分別為SEQ ID Ν0:64和59)。該菌株可產生具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖具有末端半乳糖殘基。用質粒pGLTOlO轉化菌株RDP697-1以制備菌株YDX414。質粒pGLY510(參見圖23)是滾入質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母TRP2基因座同時復制基因并含有AOXl啟動子-ScCYCl終止子表達盒以及PpARGl選擇標記。用質粒pDX459-l (mAb-A)轉化菌株YDX414以制備菌株YDX458。質粒pDX459_l (參見圖24)是滾入質粒，其靶向并整合進巴斯德畢赤酵母A0X2啟動子并含有koR同時復制啟動子。質粒含有編碼抗-HER2抗體重鏈和抗-HER2抗體輕鏈(分別為SEQ ID NO 68和 70)的分開的表達盒，其各個在N-末端融合黑曲霉α -淀粉酶信號序列(SEQ ID NO 26)并被巴斯德畢赤酵母AOXl啟動子控制。編碼重鏈和輕鏈的核酸序列分別顯示于SEQ ID NO 67和69，和編碼黑曲霉α -淀粉酶信號序列的核酸序列顯示于SEQ ID NO :25。用質粒pGLY1138轉化菌株YDX458以制備菌株YDX477。質粒pGLY1138 (參見圖 25)是滾入質粒，其整合進巴斯德畢赤酵母ADEl基因座同時復制基因。質粒含有^^1 3選擇標記基因盒。來自釀酒酵母的ARR3基因賦予細胞亞砷酸鹽抗性，使細胞可在亞砷酸鹽存在下生長(Bobrowicz 等人，Yeast, 13 :819-828 (1997) ；Wysocki 等人，J. Biol. Chem. 272 30061-30066(1997))。質粒含有在PpAOXl啟動子的控制下編碼分泌的融合蛋白的表達盒， 其包含融合至里氏木霉(MNSl)催化結構域(SEQ ID NO :56，由SEQ ID NO 55的核苷酸序列編碼)的N-末端的釀酒酵母α因子前信號序列(SEQ ID NO :24)。融合蛋白分泌至培
養基中。
權利要求
1.一種巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)宿主細胞，其已被基因工程化為表達半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性，其中所述宿主細胞能夠利用半乳糖作為單一碳能源。
2.根據權利要求1的宿主細胞，其中所述宿主細胞已進一步被基因工程化為能夠產生重組糖蛋白，所述重組糖蛋白具有包含半乳糖殘基的雜合或復合N-聚糖。
3.根據權利要求2的宿主細胞，其中所述UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性被提供在融合蛋白中，所述融合蛋白包含半乳糖基轉移酶的催化結構域和UDP-半乳糖-4-差向異構酶的催化結構域。
4.根據權利要求2的宿主細胞，其中所述宿主細胞產生具有復合N-聚糖的糖蛋白，其中復合N-聚糖的GO G1/G2比值小于2 1。
5.根據權利要求2的宿主細胞，其中所述宿主細胞產生糖蛋白，所述糖蛋白主要具有選自 GalGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan3GlcNAc2、 NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 和 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 的 N-聚糖。
6.根據權利要求2的宿主細胞，其中所述N-聚糖是具有半乳糖末端的N-聚糖，其選自 GalGlcNAcMan5GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 和 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
7.根據權利要求2的宿主細胞，其中所述N-聚糖是具有半乳糖末端的雜合N-聚糖。
8.根據權利要求2的宿主細胞，其中所述N-聚糖是唾液酸化的N-聚糖，其選自 NANAfeilGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 和 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
9.根據權利要求2的宿主細胞，其中所述重組糖蛋白選自紅細胞生成素(ΕΡ0)，細胞因子例如干擾素α、干擾素β、干擾素Y和干擾素ω，和粒細胞集落刺激因子(GCSF)， 61義5 ，凝固因子例如因子￥111、因子IX和人蛋白C，抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受體α -鏈，免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合體和IgM，免疫粘附素和其它Fc融合蛋白例如可溶性TNF受體-Fc融合蛋白，RAGE-Fc融合蛋白，白細胞介素，尿激酶，糜蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制劑，IGF-結合蛋白，表皮生長因子，生長激素釋放因子，膜聯蛋白V融合蛋白，制管張素，血管內皮生長因子-2，骨髓樣前體抑制因子-1，骨保護蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白，DNA酶II，人纖溶酶原的三環3，葡糖腦苷脂酶，TNF結合蛋白1，促卵泡激素， 細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4-Ig，跨膜激活劑和鈣調節劑和親環蛋白配體，胰高血糖素樣蛋白1和IL-2受體激動劑。
10.一種在巴斯德畢赤酵母宿主中產生具有N-聚糖的重組糖蛋白的方法，所述N-聚糖具有半乳糖殘基，所述方法包括a)提供重組宿主細胞，其已被基因工程化為表達(i)糖基化途徑，其使得所述宿主細胞能夠產生重組糖蛋白，所述重組糖蛋白具有包含半乳糖殘基的雜合或復合N-聚糖；( )半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶活性；和(iii)重組糖蛋白；和b)在含有半乳糖的培養基中培養所述宿主細胞以產生具有一個或多個N-聚糖的重組糖蛋白，所述N-聚糖具有半乳糖殘基。
11.根據權利要求10的方法，其中所述UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性被提供在融合蛋白中，所述融合蛋白包含半乳糖基轉移酶的催化結構域和UDP-半乳糖-4-差向異構酶的催化結構域。
12.根據權利要求10的方法，其中所述N-聚糖的GO G1/G2比值小于2 1。
13.根據權利要求10的方法，其中所述重組糖蛋白主要具有選自 GalGlcNAcMan5GlcNAc2、 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan3GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 和 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 的 N-聚糖。
14.根據權利要求10的方法，其中所述N-聚糖是具有半乳糖末端的N-聚糖，其選自 GalGlcNAcMan5GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 和 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
15.根據權利要求10的方法，其中所述N-聚糖是具有半乳糖末端的雜合N-聚糖。
16.根據權利要求10的方法，其中所述N-聚糖是唾液酸化的N-聚糖，其選自 NANAfeilGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 和 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
17.根據權利要求10的方法，其中所述重組糖蛋白選自紅細胞生成素(EPO)，細胞因子例如干擾素α、干擾素β、干擾素Y和干擾素ω，和粒細胞集落刺激因子(GCSF)，GM_CSF， 凝固因子例如因子VIII、因子IX和人蛋白C，抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受體α -鏈， 免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合體和IgM，免疫粘附素和其它Fc融合蛋白例如可溶性TNF受體-Fc融合蛋白，RAGE-Fc融合蛋白，白細胞介素，尿激酶，糜蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制劑，IGF-結合蛋白，表皮生長因子，生長激素釋放因子，膜聯蛋白V融合蛋白，制管張素，血管內皮生長因子_2，骨髓樣前體抑制因子-1，骨保護蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白，DNA酶II，人纖溶酶原的三環3，葡糖腦苷脂酶，TNF結合蛋白1，促卵泡激素，細胞毒性 T淋巴細胞相關抗原4-Ig，跨膜激活劑和鈣調節劑和親環蛋白配體，胰高血糖素樣蛋白1和 IL-2受體激動劑。
18.—種產生表達異源蛋白的重組巴斯德畢赤酵母宿主細胞的方法，其包括(a)提供已被基因工程化為表達一種或兩種酶活性的宿主細胞，所述酶活性選自半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性；(b)用編碼異源蛋白和在步驟(a)的宿主細胞中不表達的選自步驟(a)的酶或多種酶的一種或多種核酸分子轉化所述宿主細胞；和(c)在含有半乳糖作為單一碳能源的培養基中培養所述宿主細胞以提供表達異源蛋白的重組巴斯德畢赤酵母宿主細胞。
19.根據權利要求18的方法，其中所述宿主細胞被進一步基因工程化為表達半乳糖通透酶。
20.根據權利要求18的方法，其中所述宿主細胞被基因修飾以產生糖蛋白，所述糖蛋白具有一個或多個包含半乳糖的N-聚糖。
21.—種產生和選擇能夠利用半乳糖作為單一碳源的巴斯德畢赤酵母宿主細胞的方法，所述方法包括a)提供巴斯德畢赤酵母宿主細胞；b)用編碼半乳糖激酶活性、UDP-半乳糖-4-差向異構酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性以及任選地半乳糖通透酶的一種或多種核酸分子轉化所述宿主細胞；c)在含有半乳糖作為單一碳源的培養基上培養轉化的宿主細胞；和d)選擇可以在含有半乳糖作為單一碳源的培養基上生長的宿主細胞。
22.一種包含糖蛋白的組合物，其中在藥學上可接受的載體中糖蛋白上的GO G1/G2 糖形比值小于2 1。
23.根據權利要求22的糖蛋白組合物，其中所述糖蛋白是選自抗-Her2抗體、 抗-RSV (呼吸道合胞病毒)抗體、抗-TNF α抗體、抗-VEGF抗體、抗-⑶3受體抗體、抗-⑶41 7Ε3抗體、抗-⑶25抗體、抗-⑶52抗體、抗-⑶33抗體、抗-I gE抗體、抗-⑶11 a抗體、抗-EGF 受體抗體和抗-CD20抗體及其變體的抗體。
24.根據權利要求22的糖蛋白組合物，其中所述糖蛋白是Fc融合蛋白。
25.根據權利要求M的糖蛋白組合物，其中所述Fc融合蛋白是依那西普。
26.一種重組巴斯德畢赤酵母宿主細胞，其具有與重組巴斯德畢赤酵母菌株YDX477的基因型相同的基因型。
全文摘要
描述了通常不能利用半乳糖作為碳源但根據本文的方法已被基因工程化為利用半乳糖作為單一碳源的低等真核細胞例如巴斯德畢赤酵母。細胞被基因工程化為表達包含Leloir途徑的酶中的幾種。具體地，細胞被基因工程化為表達半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶，以及任選地半乳糖通透酶。另外，提供了用于改進在已被基因工程化為產生具有N-聚糖(其具有半乳糖殘基)的糖蛋白但通常缺乏包含Leloir途徑的酶的細胞中具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的產量的方法，所述方法包括用編碼半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向異構酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶的一種或多種核酸分子轉化細胞。描述的方法和宿主細胞使得同化半乳糖的能力的存在或缺乏作為用于制備重組細胞的選擇方法。所述方法和宿主細胞在本文顯示對于制備具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的免疫球蛋白和類似物是特別有用的。
文檔編號C07K16/18GK102333872SQ201080011713
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月24日 優先權日2009年2月25日
發明者P·波布羅維奇, R·C·戴維森, 查冬興 申請人:默沙東公司