專利名稱：突變體羥基苯丙酮酸雙加氧酶多肽及其使用方法
技術領域：
本發明涉及向植物賦予除草劑抗性或耐受性的突變體羥基苯丙酮酸雙加氧酶 (HPPD)多肽以及編碼它們的核酸序列。本發明的方法涉及表達這些突變體HPPD多肽并且對于HPPD除草劑具有抗性的植物的產生和用途。
背景技術：
羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)是催化對羥基苯丙酮酸(HPP)被轉化成尿黑酸鹽/ 尿黑酸(homogentisate)的反應的酶。這個反應在酶結合的鐵(Fe2+)和氧的存在下發生。 通過抑制HPPD而起作用的除草劑是所熟知的，并且包括異噁唑類、二酮腈類、三酮類、以及口比唑啉鹽類(pyrazolinates) (Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) -The Herbicide Target. ” In Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer and Schirmer. Weinheim，Germany =Wiley-VCH, 2007. Ch. 4. 2,pp. 211-220)。HPPD 的抑制作用阻斷了從酪氨酸生物合成質體醌(PQ)。PQ在類胡蘿卜素色素的生物合成中是一種必需的輔因子，這些類胡蘿卜素色素對于光合中心的光防護是必需的。抑制HPPD的除草劑是韌皮部可移動的漂白劑，它們引起暴露于光的新的分生組織和葉子顯現出白色。在缺乏類胡蘿卜素下，葉綠素是光破壞性的并且通過單線態氧的光生作用而自身變成一種光化裂解劑。用于提供耐受HPPD除草劑的植物的方法同樣是已知的并且包括1)將HPPD酶過量表達從而在植物中產生大量的HPPD酶，這些HPPD酶與一種給定的除草劑是充分有關的從而具有足夠的可供使用的功能性酶(盡管存在它的抑制劑)；并且幻將目標HPPD酶突變成一種功能性HPPD，該功能性HPPD對于除草劑是較不敏感的。關于突變體HPPD類， 雖然一種給定的突變體HPPD酶可以提供一個有用水平的對于一些HPPD抑制劑除草劑的耐受性，相同的突變體HPPD可能不足以提供商業水平的對于一種不同的、更希望的HPPD 抑制劑除草劑的耐受性(參見例如美國申請公開號2004/0058427 ；以及PCT申請公開號 WO 98/20144和WO 02/46387 ；還參見美國申請公開號2005/(^46800，它涉及作為相對耐受 HPPD的大豆品種的鑒定和標記)。例如，HPPD抑制劑除草劑可以在它們控制的雜草范圍、 它們的制造成本、以及它們的環境益處方面是不同的。因此，需要用于向不同的作物和作物品種賦予HPPD除草劑耐受性的新的方法和組合物。發明概述在此提供了用于向植物賦予羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)除草劑抗性或耐受性的組合物和方法。這些組合物包括對于突變體HPPD多肽的核苷酸和氨基酸序列。本發明的這些多肽是突變體HPPD，這些突變體HPPD具有HPPD酶活性并且在植物中賦予對于某些類別的抑制HPPD的除草劑的抗性或耐受性。在一個實施方案中，本發明的這些組合物包括一種突變體HPPD多肽，該多肽具有與SEQ ID NO 27至少80%的序列同一性，其中該多肽具有HPPD酶活性，并且其中該多肽包含選自下組的一個或多個氨基酸添加、置換、或缺失， 該組由以下各項組成1)R(K，A，R)SQI(Q，E)T(SEQ ID NO :28)，其中第一個Q被任何其它的氨基酸、特別是被A、G、Μ、T、S、C、R、F并且更特別是被P所代替；2)R(K,A,R) SQI(Q,E) T (SEQ ID NO :28)，其中I被任何其它的氨基酸、特別是被V、 S、A、P、T、L或G所代替;3) (P，A，S)G(V, L)QH(I，L，Μ) (SEQ ID NO』9)，其中 Q 被任何其它的氨基酸、特別是被N、R、G、A、S、Τ、E或C并且更特別是被A或H所代替；4)G(I，V) LVD (R，K)D (SEQ ID NO :30)，其中L被任何其它的氨基酸、特別是被M或 A所代替；5)ESGLN(S,G) (SEQ ID NO :31)，其中L被任何其它的氨基酸、特別是被M、H、G、F、 C或I并且更特別是被M所代替；6)F(A，S) EF (Τ, V) (SEQ ID NO :3 ，其中(A, S)被任何氨基酸、特別是被 W、G、Μ、 F、Y或H所代替；7)G(I, V)LVD(R, K)D (SEQ ID NO :30)禾口 ESGLN(S，G) (SEQ IDNO :31)，其中 L 在兩個序列中都被M所代替；8)EVELYGDVV(SEQ ID NO :37)，其中Y被任何其它的氨基酸、特別是被D、V、E、K、或 A所代替；9)RFDHVVGNV(SEQ ID NO :38)，其中第一個V被任何其它的氨基酸如I、A、M、或C 所代替；10)DHVVGNVPE(SEQIDNO:39，其中G被任何其它的氨基酉堯如H或C所代替；
ι Dhvvgnvpem (SEQIDNO:40，其中N被任何其它的氨基酉堯如C所代替；
12)NVPEMAPVI(SEQIDNO:41，其中M被任何其它的氨基酉堯如L所代替；
13)GFHEFAEFT(SEQIDNO:42，其中F被任何其它的氨基酉堯如M、I、或L所代替；
14)GTTESGLNS(SEQIDNO:43，其中S被任何其它的氨基酉堯如T所代替；
15)TTESGLNSV(SEQIDNO:44，其中G被任何其它的氨基酉堯如R、S、或A所代替；
16)ESGLNSVVL(SEQIDNO:45，其中N被任何其它的氨基酉堯如R或M所代替；
17)GLNSVVLAN(SEQIDNO:46，其中第一個V被任何其它的氨基酸如Μ、I、A、或K所代替
18)LNSVVLANN(SEQIDNO:47，其中V被任何其它的氨基酉堯如I所代替；
19)SEAVLLPLN(SEQIDNO:48，其中L被任何其它的氨基酉堯如V或K所代替；
20)EAVLLPLNE(SEQIDNO:49，其中L被任何其它的氨基酉堯如M或F所代替；
21)VLLPLNEPV(SEQIDNO:50，其中第三個L被任何其它的氨基酸如I、M、或V所代替；
22)LLPLNEPVH(SEQIDNO:51，其中N被任何其它的氨基酉堯如A所代替；
23)HGTKRRSQI(SEQIDNO:52，其中R被任何其它的氨基酉堯如G所代替；
24)SQIQTYLEY(SEQIDNO:53，其中T被任何其它的氨基酉 13堯如E所代替；
25)QIQTYLEYH(SEQ26)GVQHIALAS (SEQ27)GFEFMAPPQ(SEQ28)FEFMAPPQA(SEQ N、Y、K、或H所代替；
替；
H所代替；
29)FMAPPQAKY(SEQ
30)QAKYYEGVR(SEQ
31)GVRRIAGDV(SEQ
32)VLLQIFTKP(SEQ
33)LLQIFTKPV(SEQ
34)LQIFTKPVG(SEQ
代替;
替； 替；
35)IFTKPVGDR(SEQ
36)RPTFFLEMI(SEQ
37)FLEMIQRIG(SEQ
38)GGCGGFGKG(SEQ
IDNO :54)，其中Y被任何其它的氨基酸如F所代替；
IDNO :55)，其中I被任何其它的氨基酸如M、L、或V所代替；
IDNO :57)，其中M被任何其它的氨基酸如Q或L所代替；
IDNO :58)，其中第一個A被任何其它的氨基酸如S、P、D、R、
IDNO :59)，其中P被任何其它的氨基酸如A或R所代替；
IDNO 60)，其中Y被任何其它的氨基酸如K、R、D、Q、或E所代
IDNO :61)，其中I被任何其它的氨基酸如R或L所代替；
IDNO :6 ，其中I被任何其它的氨基酸如V所代替；
IDNO :6；3)，其中F被任何其它的氨基酸如L所代替；
IDNO :64)，其中T被任何其它的氨基酸如S、P、D、R、N、Y、或
IDNO :6 ，其中P被任何其它的氨基酸如N所代替；
IDNO :66)，其中F被任何其它的氨基酸如L所代替；
IDNO :67)，其中I被任何其它的氨基酸如V或C所代替；
IDNO 68)，其中第四個G被任何其它的氨基酸如A、S、或T所
39)GGTOKGNFS (SEQ ID NO :69)，其中K被任何其它的氨基酸如L、A、E、或V所代
40)GFGKGNFSE(SEQ
41)FGKGNFSEL(SEQ
42)KGNFSELFK(SEQ
ID NO :70)，其中G被任何其它的氨基酸如I所代替； ID NO :71)，其中N被任何其它的氨基酸如I所代替； ID NO 72)，其中S被任何其它的氨基酸如N、G、K、或Q所代
ID NO :7；3)，其中E被任何其它的氨基酸如Q所代替； ID NO :74)，其中S被任何其它的氨基酸如A所代替； ID NO :7 ，其中I被任何其它的氨基酸如L或F所代替； ID NO 40)，其中N被任何其它的氨基酸、特別是被C所代替，個L被任何其它的氨基酸特別是M所
43)GNFSELFKS(SEQ
44)ELi7KSIEDY (SEQ
45)LFKSIEDYE(SEQ
46)HVVGNVPEM(SEQ 以及氨基酸序列ELGVLVDRD(SEQ ID NO :76)，其中第代替；47)LNSVVLANN(SEQ ID NO :47)，其中第二個V被任何其它的氨基酸、特別是被I所代替，以及氨基酸序列ELGVLVDRD(SEQ ID NO :76)，其中第二個L被任何其它的氨基酸、特別是被M所代替；48)VLLPLNEPV(SEQ ID NO :50)，其中第三個L被任何其它的氨基酸、特別是被M所代替，以及氨基酸序列VLLQIFTKP (SEQ ID NO :6 ，其中I被任何其它的氨基酸、特別是被V 所代替；49) GGCGGFGKG (SEQ ID NO :68)，其中第四個G被任何其它的氨基酸、特別是T所代替，以及氨基酸序列ELGVLVDRD(SEQ ID NO :76)，其中第是被M所代替；
個L被任何其它的氨基酸、特別
50)FHEFAEFTAED(SEQ ID NO :76)，其中第一個Α、第二個Ε、以及第二個F被任何其它的氨基酸所代替，特別是其中A被S或W所代替，E被T所代替、和/或F被A或V所代替；51)HGTKRRSQIQ(SEQ ID NO :77)，其中第R被任何其它的氨基酸、特別是被K所代
替，并且第二個R是缺失的；52)GTKRRSQIQ(SEQ ID NO :78)，其中第二個 R 是缺失的;53) FMAPPQAKY (SEQ ID NO :59)，其中第二個 P 是缺失的；54)GNFSELFKS (SEQ ID NO :73)，其中 E 是缺失的；55)GVRRIA⑶V(SEQ ID NO :61)，其中 I 是缺失的；56)DQGVLLQIFTKP(SEQ ID NO :79)，其中第一個L和I被任何其它的氨基酸所代替，特別是其中A被M所代替和/或I被L所代替；57) GKGNFSELFK (SEQ ID NO 80)，其中F和S被任何其它的氨基酸所代替，特別是其中F被G所代替和/或S被A所代替；58)KGNFSELFKS(SEQ ID NO :56)，其中第一個S和E被任何其它的氨基酸所代替， 特別地其中S被N、G、或K所代替和/或E被S或A所代替；59)GGCGGi7GKG(SEQ ID NO :68)，其中 K 被任何其它的氨基酸如 T、S、Q、L、A、I、H、
E、G、M、C或V、優選T所代替；60)GGCGGFGKG(SEQ ID NO :68)，其中第六個G被任何其它的氨基酸如R、E、D、H、 M、F、W、N、或C、優選H或C所代替；61) ESGLN(S,G) (SEQ ID NO :31)，其中第一個G被任何其它的氨基酸、特別是被R、 S、或A所代替；以及62)VLLPLNEPV(SEQ ID NO :50)，其中第二個L被任何其它的氨基酸，如Μ、F、或V 所代替；在另一個實施方案中，本發明的組合物包括突變體HPPD多肽，該多肽具有與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO :27至少80%的序列同一性，其中該多肽具有HPPD酶活性，并且其中該多肽包含選自下組的一個或多個氨基酸置換，該組由以下各項組成1)R(K，A，R)SQI(Q，E)T(SEQ ID NO :28)，其中I被任何其它的氨基酸、特別是被V、 S、A、P、T、L或G所代替;2) (P，A，S)G(V, L)QH(I，L，Μ) (SEQ ID NO』9)，其中 Q 被任何其它的氨基酸、特別是被N、R、G、A、S、Τ、E或C并且更特別被A或H所代替；3)G(I，V) LVD (R，K)D (SEQ ID NO :30)，其中L被任何其它的氨基酸、特別是被M或 A所代替；4)ESGLN(S,G) (SEQ ID NO :31)，其中L被任何其它的氨基酸、特別是被M、H、G、F、 C或I并且更特別是被M所代替；5)F(A，S) EF (Τ, V) (SEQ ID NO :3 ，其中(A, S)被任何氨基酸、特別是被 W、G、Μ、
F、Y或H所代替；6)RFDHVVGNV(SEQ ID NO :38)，其中第一個V被任何其它的氨基酸，如I、A、M、或C 所代替；7)GLNSVVLAN(SEQ ID NO :46)，其中第一個V被任何其它的氨基酸，如Μ、I、A、或K所代替；8)VLLPLNEPV(SEQ ID NO :50)，其中第三個L被任何其它的氨基酸，如I、M、或V所代替；9)GFEFMAPPQ(SEQ ID NO :57)，其中M被任何其它的氨基酸，如Q或L所代替；10)FEFMAPPQA(SEQ ID NO :58)，其中第一個A被任何其它的氨基酸，如S、P、D、R、 N、Y、K、或H所代替；11)GGCGGFGKG(SEQ ID NO :68)，其中第四個G被任何其它的氨基酸，如A、S、或T 所代替；12) GGCGGi7GKG (SEQ ID NO :68)，其中 K 被任何其它的氨基酸，如 T、S、Q、L、A、I、H、 Ε、G、Μ、C或V、優選T所代替；13)GGCGGFGKG(SEQ ID NO :68)，其中第六個G被任何其它的氨基酸，如R、Ε、D、H、 M、F、W、N、或C、優選H或C所代替；14) ESGLN(S,G) (SEQ ID NO :31)，其中第一個G被任何其它的氨基酸、特別是被R、 S、或A所代替；以及15)VLLPLNEPV(SEQ ID NO :50)，其中第二個L被任何其它的氨基酸，如Μ、F、或V 所代替；根據本發明的示例性突變體HPPD多肽相應于SEQ ID NOS :14- 中所列出的氨基酸序列，及其變體和片段。進一步提供了包括編碼本發明的突變體HPPD多肽的多核苷酸序列的核酸分子，例如SEQ ID N0S:1-13。組合物還包括表達盒，該表達盒包括可操作地連接到編碼本發明的突變體HPPD多肽的核苷酸序列上的啟動子，該表達盒是單獨的或與一種或多種另外的編碼賦予所希望的性狀的多肽的核酸分子進行組合。進一步提供了包括本發明的一種表達盒的轉化的植物、植物細胞、以及種子。在針對向植物賦予除草劑抗性或耐受性、特別是對某些類別的抑制HPPD的除草劑的抗性或耐受性的方法中，本發明的這些組合物是有用的。在具體實施方案中，這些方法包括向一種植物中引入至少一種表達盒，該表達盒包括可操作地連接到編碼本發明的突變體HPPD多肽的核苷酸序列上的啟動子。其結果是，該突變體HPPD多肽被表達于該植物中， 并且該突變體HPPD對于抑制HPPD的除草劑是較不敏感的，由此導致了對于抑制HPPD的除草劑的抗性或耐受性。本發明的方法還包括選擇性地控制在作物場所的大田中的雜草。在一個實施方案中，此類方法涉及在作物場所的大田中過多的苗前或苗后(over-the-top pre-or postemergence)施用雜草控制量的HPPD除草劑，該作物場所含有表達本發明的突變體 HPPD多肽的植物。在其他實施方案中，還提供了用于測定、表征、鑒定、以及選擇本發明的突變體HPPD的方法。附圖簡要說明
圖1顯示了來自燕麥屬的HPPD多肽(對應于在SEQ ID NO 14中列出的氨基酸序列)的Km和Vmax值。圖2A-2B顯示了結構B與該HPPD多肽(對應于SEQ ID NO 14中列出的氨基酸序列)的一種絡合物的結合速率(on rate)(圖2A)和解離速率(off rate)(圖2B)的測定。圖3顯示了結構D與該HPPD多肽(對應于SEQ ID NO 14中列出的氨基酸序列)的一種絡合物的的解離速率的測定。圖 4A-4C 顯示了結構 B 與 HPPD 多肽(對應于 SEQ ID NO :14(圖 4A)、24(圖 4B)、 以及沈(圖4C)中列出的氨基酸序列)的絡合物在冰溫下的解離速率的測定。圖5顯示了通過表達HPPD的不同變體的大腸桿菌BL21，甲基磺草酮(mesotrione) 抑制了黑膿素(pyomelanin)形成。左條=(誤差范圍對于η = 3)平均A 430nm，其中沒有甲基磺草酮存在于培養基中，并且右條=(n = 3)平均A 430nm，其中12. 5ppm甲基磺草酮存在于培養基中。對照物是PETM空載體，其中沒有表達HPPD。圖6顯示了用于大豆轉化的二元載體17146的圖示，用編碼SEQ ID NO :24的一種大豆密碼子優化的燕麥HPPD基因賦予了 HPPD抗性。對于草丁膦(glufosinate)選擇，這種二元載體還包含雙重PAT選擇標記。圖7顯示了用于大豆轉化的二元載體17147的圖示，用編碼SEQ ID NO :24的一種大豆密碼子優化的燕麥HPPD基因賦予了 HPPD抗性，并且還賦予了對草甘磷(glyphosate) 的耐受性(選擇標記)。圖8顯示了含有大豆密碼子優化的燕麥HPPD基因(編碼SEQ ID NO 14)的二元載體15764的圖示，該基因由TMV Ω增強子和TATA盒所驅動。圖9顯示了用于賦予對于HPPD除草劑和草丁膦的耐受性的大豆轉化的二元載體 17149的圖示，該二元載體含有表達HPPD變體(SEQ ID NO 26)的表達盒連同兩個PAT基因盒。圖10A-10D描述了通過除草劑化合物B (圖10Α-10Β)和C (圖10C-10D)抑制HPPD 的突變體(G408A)的時間依賴性。發明詳細說明本發明提供了針對向植物賦予羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)除草劑抗性和耐受性的組合物和方法。組合物包括對于具有HPPD酶活性的突變體HPPD多肽的氨基酸序列， 及其變體和片段。還提供了編碼本發明的突變體HPPD多肽的核酸。進一步提供了用于向植物賦予除草劑抗性或耐受性、特別是對某些類別的抑制HPPD的除草劑的抗性或耐受性的方法。還提供了用于在作物場所的大田中選擇性地控制雜草以及用于測定、表征、鑒定和選擇提供了除草劑耐受性的本發明的突變體HPPD的方法。在本發明的上下文中，術語羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)、4_羥基苯丙酮酸雙加氧酶G-HPPD)以及對羥基苯丙酮酸雙加氧酶(p-HPPD)是同義的。“ HPPD除草劑”是漂白劑的除草劑，并且它們的主要作用位點是HPPD。許多是熟知的并且在此別處被描述并且在文獻(Hawkes "Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD)-The Herbicide Target. " In Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer and Schirmer. ffeinheim, Germany :ffiley-VCH, 2007. Ch. 4. 2, pp. 211-220 ； Edmunds "Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(HPPD) Inhibitors :Triketones. ” In Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer and Schirmer. ffeinheim, Germany ffiley-VCH,2007. Ch. 4. 2，pp. 221-242)中。如在此所使用的，術語“HPPD除草劑”是指直接或間接地抑制HPPD的除草劑，其中這些除草劑是漂白劑，并且其中HPPD的抑制是除草劑的對于植物的作用模式的至少一部分。如在此所使用的，當與由類似經受的非耐受樣植物所展示的進行比較時，實質上(基本上)“耐受”除草劑的植物當用所述除草劑進行處理時展示出一個移到右邊(right) 的劑量/反應曲線。此類劑量/反應曲線具有標繪在χ軸上的“劑量”以及標繪在y軸上的“殺死或破壞百分比”、“除草效果”等。為了產生一種給定的除草效果，耐受性植物典型地需要非耐受樣植物的差不多至少兩倍的除草劑。當經受典型地被農業社會采用的為了殺死大田中的雜草的濃度和速率的除草劑時，基本上“抵抗”除草劑的植物展示出很少的(如果有的話)壞死、溶解、萎黃病或其他損傷或至少沒有一個在產量上有顯著影響。如在此所使用的，“非轉基因樣植物”是與轉基因植物類似或相同的但是不包含一種賦予除草劑抗性的轉基因的植物。如在此所使用的，術語“賦予”是指向植物提供特征或性狀，如除草劑耐受性或抗性和/或其他所希望的性狀。如在此別處所使用的，術語“異源的”是指來自另一個來源。在DNA的背景下，“異源的”是指任何外來的“非自身，，DNA，包括來自相同種類的另一個植物的DNA。例如，在本申請中，轉基因地表達回到大豆植物中的大豆HPPD基因將仍被描述為“異源的” DNA。在此使用的冠詞“一種”和“一個”是指一個(一種)或多于一個(一種)(即， 至少一個)的該冠詞的合乎語法的對象。作為舉例，“一種要素”表示一種或多種要素(元件)。貫穿本說明書，單詞“包括”或其變體例如“包括了，，或“包括”應被理解為是指包括一種所述要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟，但是不排除任何其他要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟。在此定義了或另外表征了許多種額外的術語。HPPD 序列本發明的這些組合物包括分離的或實質上純化的突變體HPPD多核苷酸和多肽連同包括突變體HPPD多核苷酸的宿主細胞。具體地，本發明提供了突變體HPPD多肽，這些突變體HPPD多肽具有HPPD酶活性并且在植物中賦予對于某些類別的抑制HPPD的除草劑的抗性和耐受性，以及它們變體和片段。還提供了編碼本發明的突變體HPPD多肽的核酸。本發明的突變體HPPD多肽相對于它們從其衍生的初始野生型序列在一個或多個位置處具有氨基酸變化，并且展示出對于一種或多種HPPD抑制劑除草劑的增強的耐受性。 相對于同樣的未突變的初始酶，展示出對于一種HPPD除草劑的增強的耐受性的HPPD酶可以如此實行，因為這些HPPD酶展示出a)對于自然底物(4-羥基苯丙酮酸)較低的Km值；b)對于將4-羥基苯丙酮酸轉化成尿黑酸鹽的較高的kcat值；c)較低的速率常數值kon，它管理形成一種酶HPPD抑制劑除草劑復合體；(d)增加的速率常數值koff，它管理解離一種酶HPPD抑制劑除草劑復合體；和/ 或e)由于C)和d)中的一個或兩者的變化，增加的平衡常數值Ki(也稱為Kd)，它管理解離一種酶=HPPD抑制劑除草劑復合體。編碼此類改進的突變的HPPD的DNA序列用于提供本發明的HPPD植物、作物、植物細胞以及種子，它們相比于同樣表達未突變的初始酶的同樣的植物提供了對于一種或多種HPPD除草劑的增強的耐受性或抗性。在koff值方面的增加是在改進HPPD的賦予對于一種HPPD除草劑的耐受性的能力方面的特定值。作為一個實例，化合物B和C相對于SEQ ID NO: 14的HPPD變體展示出相似的Kd值，但是不同之處在于化合物B的koff值相比于化合物C的koff值約大10倍， 并且表達了 SEQ ID NO 14的植物對化合物B顯示出比對化合物C更優越的抗性。選擇了編碼植物衍生的HPPD的基因的定點突變從而編碼選自以下列表的氨基酸變化(單獨地或組合地)。編碼此類突變形式的植物HPPD的基因對于制造抵抗抑制HPPD 的除草劑的作物植物是有用的。如此修飾的植物HPPD基因特別適合用在轉基因植物中，以便向作物植物賦予除草劑耐受性或抗性。許多HPPD序列在本領域中是已知的并且通過進行在此所述的相應的氨基酸置換、缺失和添加可以用來產生突變體HPPD序列。在SEQ ID N0:27中列出了燕麥(Avena sativa)的HPPD氨基酸序列。在SEQ ID NO 14中列出了燕麥HPPD的單一缺失變體。因此，一種已知的或懷疑的HPPD序列可以使用標準的序列比對工具與例如SEQ ID NO 14或 SEQ ID NO :27進行比對，并且在此所述的相對于SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :27的相應的氨基酸置換、缺失、和/或添加可以在參比序列中進行。在一個實施方案中，本發明的這些組合物包括一種突變體HPPD多肽，該突變體HPPD多肽具有與SEQ ID NO :27 (燕麥的HPPD氨基酸序列)至少大約40 %、45 %、 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%,98%,99%或更多的序列同一性或其中該HPPD氨基酸序列來自植物，其中該多肽具有HPPD酶活性，并且其中該多肽包含相應于在表1的第1欄中列出的氨基酸位置的一個或多個氨基酸序列添加、置換、或缺失，任選地進一步與已知的突變進行組合(參見例如 W02009/144079)。在不同的實施方案中，在表1的第1欄中列出的一個或多個位置處的氨基酸被任何其它的氨基酸所代替。在另一個實施方案中，該多肽包括一個或多個氨基酸置換、 添加、或缺失，相應于表1的第2欄中列出的氨基酸置換或添加。在又一個實施方案中，該多肽包括一個或多個置換，相應于在表1的第2欄中列出的氨基酸的保守性變體。例如，該多肽可以包括相應于SEQ ID NO: 14的氨基酸位置217 (SEQ ID NO :27的氨基酸位置218)的一種突變，其中該氨基酸被丙氨酸或丙氨酸的保守置換所代替；或該多肽可以包括相應于 SEQ ID NO 14的氨基酸位置241 (SEQ ID NO 27的氨基酸位置M2)的突變，其中該氨基酸被色氨酸或一種色氨酸的保守置換所代替；或該多肽可以包括相應于SEQ ID N0:14的氨基酸位置408(SEQ ID NO :27的氨基酸位置409)的突變，其中該氨基酸被丙氨酸或丙氨酸的保守置換所代替。在具體的實施方案中，本發明的突變體HPPD多肽的氨基酸序列是選自下組，該組由以下各項組成:SEQ ID NO :14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、以及洸。表1.示例性的HPPD突變
權利要求
1.包括選自下組的氨基酸序列的多肽a)包括在SEQID NO :14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或洸中列出的氨基酸序列的多肽；b)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列R(K，A，R) SQI (Q，E) T (SEQ ID NO :28)，其中該第一個Q被任何其它的氨基酸替換；c)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列R(K，A, R) SQI (Q，Ε) T (SEQ ID NO : )，其中I被任何其它的氨基酸替換；d)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列(P,A,S)G(V,L)QH(I,L,M) (SEQ IDNO : )，其中Q被任何其它的氨基酸替換；e)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列G(I，V)LVD(R，K)D(SEQ ID NO :30)，其中L被任何其它的氨基酸替換；f)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列ESGLN(S，G) (SEQ ID NO :31)，其中L被任何其它的氨基酸替換；g)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列F(A，S)EF(Τ, V) (SEQ ID NO :32)，其中A被任何其它的氨基酸替換；h)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列 G(I，V) LVD (R，K)D (SEQ ID NO 30)以及ESGLN(S，G) (SEQ ID NO :31)， 其中在兩個序列中的L被M替換；i)具有與SEQID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列EVELYGDVV(SEQ ID NO :37)，其中Y被任何其它的氨基酸替換；j)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列RFDHVVGNV(SEQ ID NO :38)，其中第一個V被任何其它的氨基酸替換； k)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列DHVVGNVPE(SEQ ID NO :39)，其中G被任何其它的氨基酸替換；1)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列HVVGNVPEM(SEQ ID NO :40)，其中N被任何其它的氨基酸替換；m)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列NVPEMAPVI (SEQ ID NO :41)，其中M被任何其它的氨基酸替換；η)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GFHEFAEFT(SEQ ID NO :42)，其中第二個F被任何其它的氨基酸替換； ο)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GTTESGLNS(SEQ ID NO :43)，其中第一個S被任何其它的氨基酸替換； P)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列TTESGLNSV(SEQ ID NO :44)，其中G被任何其它的氨基酸替換；q)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列ESGLNSVVL(SEQ ID NO :45)，其中N被任何其它的氨基酸替換；r)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GLNSVVLAN(SEQ ID NO :46)，其中V被任何其它的氨基酸替換；s)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列LNSVVLANN(SEQ ID NO :47)，其中第二個V被任何其它的氨基酸替換； t)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列SEAVLLPLN(SEQ ID NO :48)，其中第一個L被任何其它的氨基酸替換； u)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列EAVLLPLNE(SEQ ID NO :49)，其中第二個L被任何其它的氨基酸替換； ν)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列VLLPLNEPV(SEQ ID NO :50)，其中第三個L被任何其它的氨基酸替換； w)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列LLPLNEPVH(SEQ ID NO :51)，其中N被任何其它的氨基酸替換；χ)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列HGTKRRSQI (SEQ ID NO 52)，其中第一個R被任何其它的氨基酸替換； y)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列SQIQTYLEY(SEQ ID NO :53)，其中T被任何其它的氨基酸替換；ζ)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列QIQTYLE^KSEQ ID NO力4)，其中Y被任何其它的氨基酸替換；aa)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GVQHIALAS(SEQ ID NO :55)，其中I被任何其它的氨基酸替換；bb)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GFEFMAPPQ(SEQ ID NO :57)，其中M被任何其它的氨基酸替換；cc)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列FEFMAPPQA(SEQ ID NO 58)，其中第一個A被任何其它的氨基酸替換；dd)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列FMAPPQAKY(SEQ ID NO 59)，其中第二個P被任何其它的氨基酸替換；ee)具有與SEQ ID NO 27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列QAKYYEGVR(SEQ ID NO :60)，其中第二個Y被任何其它的氨基酸替換；ff)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GVRRIAGDV(SEQ ID NO :61)，其中I被任何其它的氨基酸替換；gg)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列VLLQIFTKP(SEQ ID NO :62)，其中I被任何其它的氨基酸替換；hh)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列LLQIFTKPV(SEQ ID NO :63)，其中F被任何其它的氨基酸替換；ii)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列LQIFTKPVG(SEQ ID NO :64)，其中T被任何其它的氨基酸替換；jj)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列IFTKPVGDR(SEQ ID NO :65)，其中P被任何其它的氨基酸替換；kk)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列RPTFFLEMI (SEQ ID NO 66)，其中第二個F被任何其它的氨基酸替換；11)具有與SEQ ID NO 27至少80 %序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列FLEMIQRIG(SEQ ID NO :67)，其中第一個I被任何其它的氨基酸替換；mm)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GGCGGFGKG(SEQ ID NO :68)，其中第四個G被任何其它的氨基酸替換；nn)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GGFGKGNFS(SEQ ID NO :69)，其中K被任何其它的氨基酸替換；00)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GFGKGNFSE (SEQ ID NO 70)，其中第三個G被任何其它的氨基酸替換；PP)具有與SEQ ID NO 27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列FGKGNFSEL(SEQ ID NO :71)，其中N被任何其它的氨基酸替換；qq)具有與SEQ ID NO 27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列KGNFSELFK(SEQ ID NO :72)，其中S被任何其它的氨基酸替換；rr)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GNFSELFKS(SEQ ID NO :73)，其中E被任何其它的氨基酸替換；ss)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列ELFKSIEDY(SEQ ID NO :74)，其中S被任何其它的氨基酸替換；tt)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列LFKSIEDYE(SEQ ID NO :75)，其中I被任何其它的氨基酸替換；uu)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列HVVGNVPEM(SEQ ID NO :40)，其中N被任何其它的氨基酸替換，以及氨基酸序列ELGVLVDRD (SEQ IDNO 76)，其中第二個L被任何其它的氨基酸替換；vv)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列LNSVVLANN(SEQ ID NO :47)，其中第二個V被任何其它的氨基酸替換，以及氨基酸序列ELGVLVDRD (SEQ IDNO :76)，其中第二個L被任何其它的氨基酸替換；ww)具有與SEQ ID NO 27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列VLLPLNEPV(SEQ ID NO 50)，其中第三個L被任何其它的氨基酸替換，以及氨基酸序列VLLQIFTKP(SEQ IDNO :62)，其中I被任何其它的氨基酸替換；xx)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GGCGGFGKG(SEQ ID NO :68)，其中第四個G被任何其它的氨基酸替換，以及氨基酸序列ELGVLVDRD (SEQ IDNO :76)，其中第二個L被任何其它的氨基酸替換； yy)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列FHEFAEFTAED(SEQ ID NO :76)，其中第一個Α、第二個Ε、以及第二個 F被任何其它的氨基酸替換；ζζ)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列HGTKRRSQIQ(SEQ ID NO :77)，其中第一個R被任何其它的氨基酸替換并且第二個R是缺失的；aaa)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GTKRRSQIQ(SEQ ID NO :78)，其中第二個R是缺失的；bbb)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列FMAPPQAKY(SEQ ID NO :59)，其中第二個P是缺失的；ccc)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GNFSELFKS(SEQ ID NO :73)，其中E是缺失的；ddd)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GVRRIAGDV(SEQ ID NO :61)，其中I是缺失的；eee)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列DQGVLLQIFTKP (SEQ IDNO 79)，其中第一個L以及I被任何其它的氨基酸替換；fff)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列GKGNFSELFK(SEQ ID NO :80)，其中F以及S被任何其它的氨基酸替換；以及ggg)具有與SEQ ID NO :27至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽具有HPPD酶活性并且包括氨基酸序列KGNFSELFKS (SEQ ID NO 56)，其中第一個S以及E被任何其它的氨基酸替換；
2.如權利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括相應于表1或表2中列出的氨基酸取代和缺失的一個或多個氨基酸取代或缺失。
3.編碼根據權利要求1所述肽的多核苷酸。4.根據權利要求3所述的選自下組的多核苷酸a)包括在SEQID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中列出的序列的多核苷酸；b)具有與在SEQID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中列出的序列至少約 85%序列同一性的多核苷酸；c)編碼在SEQ ID NO :14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或洸中列出的氨基酸序列的多核苷酸；d)編碼具有與在SEQ ID NO :14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或 26 中列出的氨基酸序列至少80%序列同一性的多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述多肽具有 HPPD酶活性。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，該多肽包括相應于在表1或表2中列出的氨基酸取代、添加以及缺失的一個或多個氨基酸取代、添加、或缺失。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其中該核苷酸序列被優化用于在植物中進行表達。
6.表達盒，該表達盒包括可操作地連接到啟動子上的如權利要求3所述的多核苷酸， 該啟動子在植物或植物細胞中驅動表達。
7.如權利要求6所述的表達盒，進一步包括編碼多肽的可操作地連接的多核苷酸序列，該多肽賦予希望的性狀。
8.如權利要求7所述的表達盒，其中所述希望的性狀是對除草劑的抗性或耐受性。
9.如權利要求8所述的表達盒，其中所述希望的性狀是對HPPD抑制劑、草甘磷、或草銨膦的抗性或耐受性。
10.如權利要求9所述的表達盒，其中賦予希望的性狀的所述多肽是細胞色素P450或它的變體。
11.如權利要求9所述的表達盒，其中賦予希望性狀的所述多肽是EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)。
12.如權利要求9所述的表達盒，其中賦予希望性狀的所述多肽是膦絲菌素乙酰轉移酶。
13.載體，該載體包括根據權利要求6-12中任何一項所述的表達盒。
14.如權利要求13所述的載體，其中所述載體包括多核苷酸，該多核苷酸包括在SEQ ID NO :33、34、35、或36中列出的序列。
15.用于在植物中賦予對HPPD抑制劑的抗性或耐受性的方法，所述方法包括將根據權利要求6-12中任何一項所述的至少一種表達盒引入到所述植物中。
16.轉化的植物細胞，該植物細胞包括根據權利要求6-12中任何一項所述的至少一種表達盒。
17.如權利要求16所述的植物細胞，其中所述植物細胞是水稻、大麥、馬鈴薯、甘薯、低芥酸菜籽、向日葵、黑麥、燕麥、小麥、玉米(corn)、大豆、糖甜菜(sugar beet)、煙草、芒草 (Miscanthus grass)、柳枝稷(Switch grass)、紅花、樹類、棉花、木薯、番茄、高粱、苜蓿、糖甜菜、以及甘蔗植物細胞。
18.如權利要求17所述的植物細胞，其中所述植物細胞是大豆植物細胞。
19.包括如權利要求16所述的植物細胞的植物、植物部分、或種子。
20.控制在場所(locus)的雜草的方法，所述方法包括對所述場所施用雜草控制量的一種或多種HPPD抑制劑，其中所述場所包括根據權利要求19所述的植物。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述HPPD抑制劑選自下組 a)式(Ia)的化合物
22.如權利要求21所述的方法，其中所述HPPD抑制劑是甲基磺草酮(mesotrione)。
全文摘要
在此提供了用于向植物賦予羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)除草劑抗性或耐受性的組合物和方法。這些組合物包括對于突變體HPPD多肽的氨基酸序列、以及它們的變體和片段。還提供了編碼這些突變體HPPD多肽的核酸。進一步提供了用于向植物賦予除草劑抗性或耐受性、特別是對某些類別的抑制HPPD的除草劑的抗性或耐受性的方法。還提供了用于在作物場所的大田中選擇性地控制雜草以及用于測定、表征、鑒定和選擇提供了除草劑耐受性的本發明的突變體HPPD的方法。
文檔編號C07H21/04GK102348802SQ201080010957
公開日2012年2月8日 申請日期2010年1月22日 優先權日2009年1月22日
發明者B.T.M.弗努伊杰, M.P.朗福德, R.C.維納, R.達爾, T.R.霍克斯 申請人:先正達參股股份有限公司