轉基因水稻事件17314及其使用方法

專利名稱：轉基因水稻事件17314及其使用方法
技術領域：
本發明涉及轉基因水稻事件17314。包含該事件的植物顯示對于草甘膦除草劑的耐受性。本發明還涉及核酸分子、植物、植物部分、植物種子、植物細胞、農產品及涉及事件 17314的方法。本發明提供該事件獨特的核苷酸分子，且所述核苷酸分子是通過轉基因DNA 插入水稻基因組中而產生的。
背景技術：
水稻是世界許多地區的一種重要的作物。生物技術方法已應用于水稻，以生產具有改良性狀的水稻。一種這樣的改良的性狀是除草劑耐受性。除草劑耐受性轉基因在植物中的表達可用于生產具有理想的除草劑耐受性的性狀的植物。轉基因在植物中的表達可能會受轉基因的染色體位置影響，可能是由于染色質結構(如異染色質)或靠近整合位點的轉錄調控元件(如增強子)的接近性。基于這個原因，通常需要篩選大量的單個植物轉化事件，以判斷具有轉基因的最佳表達的事件，進而判斷特定的需要的特征。例如，在植物中已觀察到轉基因的表達水平在事件之間差異很大。在表達的空間或時間模式上也有差異，例如，在不同植物組織中的相對轉基因表達水平的差異，這可能不符合從引入的基因構建體中存在的轉錄調控元件預期的模式。基于這個原因，可能必須產生數百至數千個不同的轉基因事件，并對這些事件進行篩選，以選擇具有所需轉基因表達水平和用于商業目的的模式的事件。這種具有理想的轉基因表達水平或模式的事件然后可以用于使用植物育種方法通過有性雜交將轉基因滲入其他遺傳背景中。這種雜交的后代具有原轉化體的轉基因表達特征。這可以用來確保適當地適應當地特定生長條件的許多不同品種中的可靠的基因表達。發明概述本發明提供包含事件17314的轉基因水稻，其顯示商業上可接受的對于草甘膦除草劑的應用的耐受性，其代表性種子以保藏號PTA-9844保藏于美國典型培養物保藏中心 (ATCC)。本發明還提供包含事件17314的水稻的種子、后代、植物部分、細胞和商品。本發明還提供與包含事件17314的水稻的基因組相關的新的DNA分子及使用這些分子的方法。 本發明還提供使用轉基因水稻事件17314和包含該事件的植物的方法及生產耐受草甘膦的水稻的方法。
本發明提供與水稻事件17314相關的DNA分子。這些DNA分子可以包含代表或衍生自以下的核苷酸序列水稻事件17314的轉基因插入與側翼基因組DNA之間的連接點，和 /或位于插入DNA側翼的基因組DNA的區域，和/或位于插入位點側翼的整合轉基因DNA的區域，和/或整合轉基因表達盒的區域，和/或任何這些區域的連續序列。本發明還提供用作判斷水稻事件17314的引物和探針的DNA分子。本發明還公開包含這些分子的水稻、植物細胞、植物部分、商品、后代和種子。本發明提供用于檢測由水稻事件17314衍生的DNA的存在的方法、組合物和試劑盒。本發明提供一種檢測事件17314的方法，該方法包括將包含DNA的樣品與引物組接觸， 所述引物組在用于來自水稻事件17314的基因組DNA的核酸擴增反應時，產生能夠判斷水稻事件17314的擴增的DNA，進行核酸擴增反應，從而產生擴增的DNA，并檢測擴增的DNA。 本發明還提供一種檢測事件17314的方法，該方法包括將包含DNA的樣品與探針接觸，所述探針在用于來自水稻事件17314的基因組DNA的雜交反應時，與水稻事件17314特異性的 DNA分子雜交，進行雜交反應，并檢測探針與DNA分子的雜交。本發明還提供包括本發明的方法和組合物的試劑盒，用于檢測衍生自水稻事件17314的DNA的存在。本發明提供包含事件17314的水稻、種子、植物細胞、后代植物、植物部分或衍生自水稻的植物、植物細胞或種子的商品。本發明還提供包含具有選自SEQ ID NO :1-6及其互補序列和片段的核苷酸序列的DNA分子或包含與SEQ ID NO :6至少90%序列一致的DNA 分子的水稻、種子、植物細胞、后代植物、植物部分或商品。本發明還提供包含事件17314并且包含一種DNA分子的水稻、種子、植物細胞、后代植物、植物部分或衍生自該植物或種子的商品，所述DNA分子例如在DNA擴增方法中產生包含SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2 的擴增的DNA分子。本發明提供用于在田地中控制雜草的方法，該方法是通過種植包含事件17314的水稻，然后應用有效劑量的能夠控制雜草而不損害包含事件17314的植物的草甘膦除草劑。本發明提供生產耐受草甘膦除草劑的應用的水稻和/或種子的方法，該方法是通過有性雜交包含事件17314或包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的水稻與第二水稻，從而產生種子，種植種子以產生后代植物，用草甘膦處理后代植物，并選擇耐受草甘膦的后代植物。該方法也可以包括使選定的后代植物自交以產生多個第二代后代植物，并從其中選擇耐受草甘膦的植物。該方法還可以包括有性雜交選定的后代植物與另一種水稻以產生種子，種植種子以產生第二代后代植物，用草甘膦處理第二代后代植物，并選擇耐受草甘膦的第二代后代植物。本發明提供生產耐受草甘膦除草劑的應用的水稻和/或種子的方法，該方法是通過自交包含事件17314和包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的耐受草甘膦的植物， 從而產生種子，種植種子以產生后代植物，用草甘膦處理后代植物，并選擇耐受草甘膦的后代植物。通過下面的詳細描述，本發明的上述和其他方面將變得更加明顯。


圖1為水稻事件17314的圖解表示[A]對應于5，連接區(提供為SEQ ID NO 1) 的相對位置，這是水稻基因組和插入的轉基因DNA的5’部分之間的連接區域；[B]對應于3，連接區(提供為SEQ ID NO 2)的相對位置，這是水稻基因組和插入的轉基因DNA的3， 部分之間的連接區域；[C]對應于插入的轉基因DNA的5’側翼區域和5’末端一部分(提供為SEQ ID NO 3)的相對位置，這包括位于事件17314的整合表達盒側翼的5’水稻基因組序列和轉基因DNA的5’端的區域；[D]對應于插入的轉基因DNA的3’側翼區域和3’末端一部分(提供為SEQ ID NO 4)的相對位置，這包括位于事件17314的整合表達盒側翼的 3’水稻基因組序列和轉基因DNA的3’端的區域；[E]代表插入到事件17314的基因組中的轉基因表達盒(提供為SEQ ID NO 5) ； [F]代表包含如圖中從左至右示出的SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 4的側翼序列和轉基因表達盒(提供為SEQ ID NO 6)的連續序列，其中，如上所示，包含有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，因為這些序列代表事件17314 的連接序列。序列簡要說明SEQ ID NO 代表水稻基因組DNA與整合的表達盒之間的5，連接序列的20個核苷酸的序列。該核苷酸序列對應于SEQ ID NO :3([C]，見圖1)的283至302位和SEQ ID NO 6 的 283 至 302 位。SEQ ID NO :2_代表整合的表達盒與水稻基因組DNA之間的3，連接序列的20個核苷酸的序列。該核苷酸序列對應于SEQ ID N0:4([D]，見圖1)的666至685位，SEQ ID NO 2的反向互補序列對應于SEQ ID NO 6的3397至；3416位。SEQ ID NO :3_位于事件17314的插入DNA側翼的5，序列直至并包括轉基因DNA 的區域。SEQ ID NO 3的核苷酸283至302位對應于SEQ ID NO 1的核苷酸1至20位，SEQ ID NO 3的核苷酸293至302位對應于SEQ ID NO 5的核苷酸1至10位。SEQ ID NO :4_位于事件17314的插入DNA側翼的3，序列直至并包括轉基因DNA 插入的區域。SEQ ID NO :4的核苷酸666至685位對應于SEQ ID NO :2的核苷酸1至20 位，SEQ ID NO 4的核苷酸666至685位的反向互補鏈對應于SEQ ID NO 5的核苷酸3105 至3114位。SEQ ID NO :5-賦予草甘膦除草劑耐受性的整合的表達盒的序列。SEQ ID N0:5對應于SEQ ID NO 6的核苷酸293至3046位。SEQ ID NO :6_代表位于事件17314的插入DNA側翼的5，序列(SEQ ID NO 3)、整合的表達盒的序列(SEQ ID NO 5)和位于事件17314的插入DNA側翼的3，序列(SEQ ID NO :4的反向互補序列)的疊連群的核苷酸序列。SEQ ID NO :7_引物SQ4183，用來識別事件17314。引物SQ4183與位于插入表達盒的5’區域側翼的基因組區域互補，接近右側轉基因DNA插入邊界。使用引物SQ4183和 SQ4191(SEQ ID NO 8)的組合產生的擴增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :8_引物SQ4191，用來識別事件17314。引物SQ4191與插入表達盒的 5，區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。使用引物SQ4183(SEQ ID NO :7)和SQ4191的組合產生的擴增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :9_PB1491探針，用來識別事件17314，且與5，連接序列的片段互補。 該探針可以連接可檢測的標簽，如6FAMTM。使用引物(如SQ4183和SQ4191)在TAQMAN (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA)檢測中釋放熒光信號，與探針(如 6FAMTM 標記的探針PB1491)組合，用于判斷事件17314的存在。
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SEQ ID NO 10-引物SQ1875，用來識別事件17314。引物SQ1875與插入表達盒的 3，區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。使用引物SQ1875和SQ36^(SEQ ID NO :11)的組合產生的擴增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :11_引物SQ3628，用來識別事件17314。引物SQ36^與位于插入表達盒的3’末端側翼的基因組區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。使用引物SQ1875(SEQ ID NO 10)和SQ36^的組合產生的擴增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :12_引物SQ1871，用來識別位于基因組DNA側翼的事件17314。引物 SQ1871與插入表達盒的5’區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。SEQ ID NO 13-引物SQ1869，用來識別位于基因組DNA側翼的事件17314。引物 SQ1869與插入表達盒的5，區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。SEQ ID NO :14-引物SQ1880，用來識別位于基因組DNA側翼的事件17314。引物 SQ1880與插入表達盒的3，區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。SEQ ID NO :15-引物SQ36^，用來識別位于基因組DNA側翼的事件17314。引物 SQ3626與位于插入表達盒的5’末端側翼的基因組區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。SEQ ID NO 16-引物SQ3627，用來識別位于基因組DNA側翼的事件17314。引物 SQ3627與位于插入表達盒的3’末端側翼的基因組區域互補，接近轉基因DNA插入邊界。發明詳述提供下面的定義和方法以更好地定義本發明并指導本領域普通技術人員實施本發明。除非另有說明，應當根據相關領域的普通技術人員的常規用法來理解術語。本文使用的術語“包括(包含)”指“包括但不限于”。本發明提供事件17314和包含17314事件的轉基因水稻，其顯示商業上可接受的對于草甘膦除草劑應用的耐受性。該事件包括轉基因DNA單插入到水稻種質的染色體/基因組內。包含事件的植物可以通過以下步驟產生(i)用包括目標轉基因的核酸構建體轉化植物細胞；(ii)再生由向植物基因組中插入轉基因而產生的植物群體；和(iii)選擇以在植物基因組中的特定位置插入轉基因為特征的特定植物。術語“事件”指目標基因向基因組中特定位置的特定的轉基因插入。包含事件的植物可以指原始的轉化體，其包括插入到植物基因組中的特定位置的轉基因。包含事件的植物也可以指轉化體的后代，該轉化體包括插入到植物的基因組中的特定位置的轉基因。這種后代可以通過該轉化體或其后代與另一種植物之間的有性遠交產生。這樣的其他植物可以是包含相同或不同的轉基因的轉基因植物和/或非轉基因植物，如不同的品種中的一種。即使經過與回交親本的反復回交，來自轉化的親本的插入DNA和側翼DNA仍然存在于雜交后代中的相同的基因組位置。本文使用的術語“水稻”是指水稻(Oryza sativa)，包括所有可與水稻繁殖的植物品種，包括野生稻種以及那些屬于稻屬的允許物種間繁殖的植物。術語“事件”也指來自包含插入DNA和緊鄰插入DNA任一側的側翼水稻基因組DNA 的原始轉化體的DNA分子。這種DNA分子通過將轉基因DNA插入水稻的基因組(即轉化) 來產生。因此，這種DNA分子包含對于事件為特異性的且對于已向其中插入轉基因DNA的水稻基因組獨特的核苷酸序列，因為這種核苷酸序列包含水稻基因組DNA和轉基因DNA插入的特定區域的序列。插入DNA在水稻事件17314中相對于周圍水稻基因組DNA的排列因此對于水稻事件17314是特異性且獨特的。這種DNA分子也是包含事件17314的植物的水稻染色體的組成部分，因此在植物中是靜態的，并且可以傳遞到該植物的后代。事件17314賦予對應用于水稻的草甘膦除草劑的耐受性。“草甘膦”指N-磷酰基甲基甘氨酸及其鹽。N-磷酰基甲基甘氨酸是一種對于廣譜植物種類具有活性的除草劑。當施用到植物表面時，草甘膦可在整個植物中移動。由于它抑制可提供用于合成芳族氨基酸的前體的莽草酸途徑，草甘膦具有植物毒性。本文使用的術語“重組”指通常在自然界不被發現的DNA和/或蛋白質和/或有機體的形式，其是通過人工干預創造的。這種人工干預可以產生重組DNA分子和/或重組植物。本文使用的“重組DNA分子”是包含在自然界不會一起出現的DNA分子的組合的DNA分子，是人工干預的結果，例如，包括至少兩個彼此異源的DNA分子的組合的DNA分子，和/或包含與在自然界通常存在的多核苷酸序列不同的多核苷酸序列的人工合成DNA分子，和/ 或包含人工摻入宿主細胞基因組DNA內的轉基因和宿主細胞基因組的相關側翼DNA的DNA 分子。重組DNA分子的一個例子是本文所述的由轉基因插入水稻基因組產生的DNA分子， 這可能最終導致重組RNA和/或蛋白質分子在該生物體中的表達。本文使用的“重組植物” 是一種植物，其通常不會存在于自然界，是人工干預的結果，并包含摻入其基因組中的轉基因和/或異源DNA分子。由于這種基因組改變，重組植物與相關的野生型植物明顯不同。重組植物的一個例子是本文所述的包含事件17314的水稻。本文使用的術語“轉基因”指人工摻入宿主細胞基因組的多核苷酸分子。這種轉基因可以對于宿主細胞是異源的。術語“轉基因植物”指包括這種轉基因的植物。本文使用的術語“異源的”指在自然界中通常不會與第二分子一同出現的第一分子。例如，分子可以來自第一物種，并插入到第二物種的基因組內。該分子因此對于宿主是異源的，且人工摻入宿主細胞的基因組內。本文使用的術語“嵌合的”指通過將第一 DNA分子與第二 DNA分子融合產生的單個DNA分子，其中，第一 DNA分子和第二 DNA分子通常不會以該構型出現，即與另一個融合。 因此嵌合DNA分子是通常不會在自然界中發現的新的DNA分子。本發明提供DNA分子及其相應的核苷酸序列。本文使用的術語“DNA”、“DNA分子”、 “多核苷酸分子”指基因組或合成來源的雙鏈DNA分子，S卩，脫氧核糖核苷酸堿基的聚合物或多核苷酸分子，從5’(上游)末端向3’(下游)末端閱讀。本文使用的術語“DNA序列”、 “核苷酸序列，，或“多核苷酸序列，，指DNA分子的核苷酸序列。本文使用的命名法是按照美國聯邦法規§ 1.822第37條的規定和WIPO標準ST. 25(1998)附錄2的表1和3所要求的。 本發明的公開只是關于插入轉基因DNA位置處轉基因事件17314的基因組中存在的兩個核苷酸序列鏈中的一條鏈，特別是SEQ ID NOS 1-60因此，通過隱含和推導，互補序列(在本領域中也被稱為完整的互補序列或反向互補序列)也在本發明的范圍之內，因此也意圖在要求保護的主題的范圍內。對應于插入轉基因DNA的完整核苷酸序列和位于插入轉基因DNA任一端側翼的水稻基因組DNA的大部分片段的核苷酸序列在此以SEQ ID N0:6提供。該序列的小部分為以 SEQ ID NO 5提供的插入轉基因DNA。通過磷酸二酯鍵物理連接至插入轉基因DNA (SEQ ID NO 5)的5，末端因而位于其側翼的水稻基因組DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。通過磷酸二酯鍵物理連接至插入轉基因DNA (SEQ ID NO 5)的3’末端因而位于其側翼的水稻基因組DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
事件17314還包括兩個多核苷酸序列，一個跨越5’位置，一個跨越3’位置，其中轉基因DNA被插入到基因組DNA，在本文被稱為連接序列。“連接序列”或“連接區域”指跨越插入轉基因DNA和相鄰的側翼基因組DNA的DNA序列和/或相應的DNA分子。連接序列任意地由兩個20核苷酸序列代表，提供為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，分別代表連接至插入DNA的10個核苷酸的緊鄰側翼基因組DNA的10個核苷酸。這些核苷酸通過磷酸二酯鍵連接。在水稻中，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2不會在基因組中天然地出現，且對于轉基因事件17314是特異的和獨特的，在源自水稻的任何核苷酸序列中鑒定到這些序列或者這些序列中每一個的至少約11、至少約13、或至少約15個連續核苷酸可以確定該DNA是從水稻事件17314中獲得的，并且判斷樣品中存在來自水稻事件17314的DNA。SEQ ID N0:1是跨越水稻基因組DNA和插入DNA的5，末端之間的連接區的20個核苷酸的序列。SEQ ID NO 2是跨越水稻基因組DNA和插入DNA的3’末端之間的連接區的20個核苷酸的序列。因此， 本發明提供至少包含由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的任一個或兩者所示的核苷酸序列的 DNA分子。足以包括SEQ ID NO=I的至少約11、至少約13或至少約15個連續核苷酸的源自轉基因水稻事件17314的DNA的任何片段在本發明的范圍之內。足以包括SEQ ID NO 2 的至少約11、至少約13或至少約15個連續核苷酸的源自轉基因水稻事件17314的DNA的任何片段在本發明的范圍之內。此外，包含與本段所述的任何序列互補的序列的任何多核苷酸在本發明的范圍內。圖1說明SEQ ID N0:l-5相對于SEQ ID NO :6從5，至3，排列的物理排列。本發明還提供包括SEQ ID NO :6的至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%的核酸分子。本發明提供可以作為引物或探針用于判斷樣品中源自事件17314的DNA的存在的示例DNA分子。這樣的引物或探針對于靶核酸序列是特異性的，因而可用于通過本文所述的本發明的方法鑒定水稻事件17314。“引物”通常是高度純化的、分離的多核苷酸，其被設計用于包括熱擴增的特定的退火或雜交方法。一對引物可以與模板DNA(如水稻基因組DNA的樣品)用于熱擴增，如聚合酶鏈反應(PCR)，以產生擴增子，其中，由這種反應所產生的擴增子具有對應于位于兩個位點之間的模板DNA序列的DNA序列，在這兩個位點處引物與模板雜交。本文使用的“擴增子”是已經使用擴增技術合成的DNA的一段或片段。在本發明的一個實施方式中，判斷 17314事件的擴增子包括不在水稻基因組中自然地存在的序列。本發明的擴增子包括至少約11個連續的核苷酸、至少約13個連續的核苷酸、或SEQ ID NO =USEQ ID NO :2的至少約 11、至少約13或至少約15個連續核苷酸和/或其互補物。引物通常被設計為與互補靶DNA 鏈雜交以形成引物和靶DNA鏈之間的雜種，引物的存在是聚合酶的識別點，以使用靶DNA鏈作為模板開始引物延伸(即，另外的核苷酸聚合成為加長多核苷酸分子)。用于本發明中的引物對意指使用兩個結合雙鏈核苷酸片段的相反鏈的引物，其目的是通常在熱擴增反應或其他常規核酸擴增方法中，線性擴增位于將被引物對的各個成員所結合的位點之間的多核苷酸片段。用作引物的示例的DNA分子提供為SEQ ID NO :7_8和10-11。SEQ ID NO :7和 SEQ ID NO 8所示的引物對作為第一 DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二 DNA分子，且這兩種分子的每一個具有SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的足夠長度的連續核苷酸或其互補序列，以作為DNA引物發揮功能，當在熱擴增反應中與源自水稻事件17314 的模板DNA —起使用時，產生包括SEQ ID NO 1的至少約11個連續的核苷酸、至少約13個連續的核苷酸、或至少約11、至少約13或至少約15個連續核苷酸的擴增子。提供示例的 DNA分子對，即SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11，作為第一 DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二 DNA分子，這兩種分子的每一個具有SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的足夠長度的連續核苷酸或其互補序列，以作為DNA引物發揮功能，當在熱擴增反應中與源自水稻事件17314的模板DNA —起使用時，產生包括SEQ ID NO :2的至少約11個連續的核苷酸、至少約13個連續的核苷酸、或至少約11、至少約13或至少約15個連續核苷酸的擴增子。“探針”是與靶核酸的鏈互補的分離的核酸。本發明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特異性地結合靶DNA序列的聚酰胺和其他探針材料，并且這種結合的檢測可用于判斷、區別、確定或確認特定樣品中靶DNA序列的存在。探針可以附著至常規可檢測的標記或報告分子，如放射性同位素、配體、化學發光劑或酶。在本發明的一個實施方式中，用于判斷事件17314的探針包括不在水稻基因組中自然存在的序列。用作探針的示例的DNA分子提供為SEQ ID NO :9。本發明的探針和引物可以具有與靶序列的完全序列一致性，雖然可以通過常規方法設計不同于靶序列而保留優先與靶序列雜交的能力的引物和探針。為了使核酸分子用作引物或探針，只需要它們在序列上充分互補以能夠在所采用的特定的溶劑和鹽濃度下形成穩定的雙鏈結構。任何常規的核酸雜交或擴增方法可以用于鑒定樣品中來自水稻事件 17314的轉基因DNA的存在。探針和引物的長度一般為至少約11個核苷酸，至少約18個核苷酸，至少約M個核苷酸，或至少約30個核苷酸或更長。這種探針和引物在嚴格雜交條件下特異性地與目標DNA序列雜交。Sambrook等人，1989和Haymes等人，In =Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC(1985) ffii^T胃夫 1 白勺嚴格性條件。如本文所用，如果兩個核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結構，那么這兩個分子被認為能夠特異性地彼此雜交。如果兩個核酸分子表現出完全的互補性，則一核酸分子被認為是另一核酸分子的“互補物”。如本文所用，當一個分子的每個核苷酸都與另一分子的核苷酸互補時，這兩個分子被認為顯示出“完全的互補性”。如果兩個分子能夠以足夠的穩定性互相雜交從而允許它們在至少常規的“低嚴格”條件下保持彼此退火，那么這兩個分子被認為是“最低限度互補的”。類似地，如果分子能夠以足夠的穩定性互相雜交從而允許它們在常規的“高嚴格”條件下保持彼此退火，那么這兩個分子被認為是“互補的”。因而偏離完全互補性是允許的，只要這種偏離沒有完全消除該分子形成雙鏈結構的能力。本文使用的術語“分離的”指至少部分分離一種分子與在天然或自然狀態下通常與其關聯的其他分子。在一個實施方式中，術語“分離的”指與在天然或自然狀態下通常位于DNA分子側翼的核酸至少部分分離的DNA分子。因此，例如通過重組技術融合至與它們通常不相關的調控或編碼序列的DNA分子在本文被認為是分離的。甚至在被整合到宿主細胞的染色體中或存在于具有其他DNA分子的核酸溶液中時，這種分子被認為是分離的。本領域的技術人員公知的任何方法可以用來分離和操作本發明公開的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶鏈反應)技術可用于擴增特定的起始DNA分子和/或產生原始分子的變體。DNA分子或其片段也可以通過其他技術來獲得，如通過化學方法直接合成片段，通常通過使用自動化的寡核苷酸合成儀來實現。因此，本文提供的DNA分子和相應的核苷酸序列尤其可用于鑒定水稻事件17314，選擇包含水稻事件17314的植物品種或雜種，檢測樣品中源自水稻事件17314的DNA的存在，和監測樣品中水稻事件17314的存在和/或缺乏或包含水稻事件17314的植物和植物部分。 本發明提供水稻、后代、種子、植物細胞、植物部分(如花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織、纖維和葉)和商品。這些植物、后代、種子、植物細胞、植物部分和商品含有可檢測量的本發明的多核苷酸，即，如具有至少一種如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列的多核苷酸。本發明的植物、后代、種子、植物細胞和植物部分也可以包含一種或多種另外的轉基因。這種轉基因可以是任何編碼賦予理想性狀的蛋白質或RNA分子的核苷酸序列，該理想性狀包括但不限于增強的抗蟲性、提高的水利用效率、增加的產量表現、增強的抗旱性、提高的種子質量、改善的營養品質和/或增強的除草劑耐受性，其中相對于缺乏這種額外的轉基因的水稻，測量該理想性狀。本發明提供水稻、后代、種子、植物細胞和源自包含事件17314的轉基因水稻的植物部分，如花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織和葉。為了使本發明能夠實施，包含事件17314 的種子的代表性的樣品已根據“布達佩斯條約”保藏。選擇的接受保藏物的保藏機構是美國典型培養物保藏中心(ATCC)，地址為美國弗吉尼亞州馬納薩斯University Boulevard 10801，郵編20110。ATCC保藏機構為事件17314種子分配的保藏號為PTA-9844。本發明提供一種包含具有存在于基因組中的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的DNA 分子的微生物。這樣的微生物的一個例子是轉基因植物細胞。微生物如本發明的植物細胞用于許多工業應用，包括但不限于(i)用作科學探究或工業研究的研究工具；(ii)在培養中用于生產內源性或重組碳水化合物、脂類、核酸或蛋白質產品或小分子，可用于后續的科研或作為工業產品；和(iii)利用現代植物組織培養技術生產轉基因植物或植物組織培養物，然后可以用于農業研究或生產。微生物如轉基因植物細胞的生產和使用利用現代微生物技術和人工干預，以產生人造的獨特的微生物。在這種方法中，重組DNA被插入植物細胞的基因組，以產生與天然存在的植物細胞不同且獨特的轉基因植物細胞。然后可以利用現代微生物技術培養這種轉基因植物細胞(非常類似于細菌和酵母細胞)，其可以以未分化的單細胞的狀態存在。新的植物細胞的遺傳組成和表型是通過將異源DNA整合到細胞的基因組中創建的技術效果。本發明的另一個方面是使用本發明的微生物的方法。使用本發明的微生物(如轉基因植物細胞)的方法包括(i)通過將重組DNA整合到細胞的基因組中產生轉基因細胞，然后使用這種細胞衍生具有相同異源DNA的其他細胞的方法；(ii)利用現代微生物技術培養含有重組DNA的細胞的方法；(iii)由培養的細胞產生和純化內源性或重組的碳水化合物、脂類、核酸或蛋白質產品的方法；和(iv)利用現代植物組織培養技術用轉基因植物細胞生產轉基因植物或轉基因植物組織培養物的方法。本發明的植物可以向后代傳遞事件DNA (包括轉基因)。本文使用的“后代，，包括任何包含源自祖先植物的事件DNA和/或具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的至少一種序列的多核苷酸的植物、種子、植物細胞和/或可再生的植物部分。植物、后代和種子對于轉基因而言可以是純合的或雜合的。后代可以從由包含事件17314的水稻產生的種子長成和/或從用來自包含事件17314的水稻的花粉授粉的植物產生的種子長成。后代植物可以自花授粉(又稱“自交”)，以產生植物的純育種系，即對于轉基因而言純合的植物。合適的后代的自交可以產生對于添加的外源基因而言純合的植物。
另外，后代植物可以遠交，例如，與另一種無關的植物繁殖，以產生變種或雜交種子或植物。其他無關的植物可以是轉基因或非轉基因的。本發明的變種或雜交種子或植物因此可以通過雜交缺乏水稻事件17314的特異和獨特DNA的第一親本與包含水稻事件 17314的第二親本而產生，產生包含水稻事件17314的特異和獨特的DNA的雜種。只要雜交或繁殖產生本發明的植物或種子，即具有至少一個含有包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 2的水稻事件17314的特異和獨特DNA的等位基因的種子，每個親本可以為雜種或自交系/ 變種。因此，兩種不同的轉基因植物可以雜交以產生包含兩個獨立分隔、添加的外源基因的雜種后代。例如，包含事件17314的耐受草甘膦的水稻可以與其他轉基因水稻雜交以產生具有兩個轉基因親本的特征的植物。這樣的一個例子是包含事件17314的耐受草甘膦的水稻與具有額外的一種或多種性狀的水稻的雜交，導致產生耐受草甘膦并且具有額外的一種或多種性狀的后代植物或種子。例如，顯示膦絲菌素或草丁膦除草劑耐受性的水稻可以與包含事件17314的水稻雜交以產生耐受草甘膦和膦絲菌素或草丁膦除草劑的后代植物或種子。用于本文公開的方法的植物和種子因此還可以包含一個或多個額外的轉基因。這樣的轉基因可以是任何編碼賦予理想性狀的蛋白質或RNA分子的核苷酸序列，該理想性狀包括但不限于增強的抗蟲性、提高的水利用效率、增加的產量表現、增強的抗旱性、提高的種子質量、改善的營養品質、改善的應激耐受性和/或增強的除草劑耐受性，其中相對于缺乏這種額外的轉基因的水稻，測量該理想性狀。已經證明轉基因植物對其耐受并且本發明的方法可以應用的除草劑包括但不限于草甘膦、草丁膦、磺酰脲類、咪唑啉酮類、溴苯腈、茅草枯(delapon)、環己烯二酮、原卟啉原(protoporphyrionogen)氧化酶抑制劑和異噁氟草(isoxasflutole)除草劑。編碼與除草劑耐受性有關的蛋白質的多核苷酸分子是本領域已知的，且包括但不僅限于編碼以下的多核苷酸分子草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS ；參見， 例如，美國專利 5，627，061 ；5，633，435 ；6，040，497 ；5，094，945 ；5，804，425 ；6，248，876 ； 7，183, 110 ；RE39, 247)；草甘膦氧化還原酶(G0X ；參見，例如，美國專利5，776，760)；草甘膦-N-乙酰基轉移酶(GAT)；耐受磺酰脲類、咪唑啉酮類、三唑嘧啶類、嘧啶氧苯甲酸酯類和/或雜芳基醚類的耐受除草劑的乙酰乳酸合酶(ALS，也稱為乙酰羥酸合酶)；耐受芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)(如吡氟氯禾靈(haloxyfop)、喹禾靈(quizalofop)、dichlorofop 和禾草靈(diclofop))的耐受除草劑的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)或R_2，4_ 二氯苯氧丙酸酯雙加氧酶(rdpA)；耐受合成生長素除草劑的解毒蛋白，如2，4-D雙加氧酶(tfdA)、 R-2，4-二氯苯氧丙酸酯雙加氧酶(rdpA)、芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶(AAD)和/或S-2， 4-滴丙酸雙加氧酶(sdpA)；耐受溴苯腈的溴苯腈腈水解酶(Bxn)(參見，例如，美國專利號 4，810，648)；耐受氟草敏(norflurazon)的八氫番茄紅素去飽和酶(crtl)；耐受草丁膦和雙丙胺磷(bialaphos)的雙丙胺磷抗性(bar)或膦絲菌素乙酰轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase)蛋白質(參見，例如，美國專利5，646，0 和5，276，268)；和三酮類 (硝磺草酮(mezotrione)、tembotrione、topromezone、異噁唑))除草劑耐受的蛋白質，如耐受性的4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)、解毒細胞色素P450或HPPD途徑旁路如球形節桿菌(Artbrobacter globiformis)HPP 氧化酶(HPPO)和食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorans)4-HPA 1_ 羥化酶(HPAH)和 NADH 氧化還原酶(HPAC)。編碼用于轉基因植物的其他蛋白質的多核苷酸分子是本領域已知的，包括
13但不限于編碼以下的多核苷酸分子大腸桿菌cspA (PCT公開W02005/033318)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)cspB(PCT公開W02005/033318)、玉米鎂轉運蛋白(美國公開 20040034888,20070011783,20070294782)、玉米 nfb2 (又名 hap3)(美國公開 20050022266 和 20080104730、PCT 公開 W02008/002480)、棉花 csp-樣(美國系列號 11/980，758、美國公開 20050097640、PCT 公開 W02005/033318)、小麥 csp 樣(美國專利 7，214，786 ；美國公開 20050097640)、G1988 (美國系列號 09/474，435、PCT 公開 W004/031349)、G1073 (美國專利 6，717，034 和美國公開 20050097631)、G1274(美國公開 20090265813)和 CGPG 2117 (美國公開20080090998)。編碼用于轉基因植物的蛋白質的其他多核苷酸分子是本領域已知的， 該蛋白質包括那些用于病蟲害控制的蛋白質，如殺線蟲劑、殺真菌劑和殺蟲劑。殺蟲劑包括但不限于Bt毒素和/或來自致病桿菌屬(Xenhorabdus)、光桿狀菌屬(Photorhabdus)、芽孢桿菌屬(如側孢芽孢桿菌屬(Bacillus Iaterosporous))、沙雷菌屬(Serratia)、克雷白桿菌屬(Klebsiella)、歐文氏菌屬(Erwinia)等的毒素。Bt毒素包括但不限于VIP毒素類、 Cryl' s、Cry2’ s、Cry3’ s、Cry4’ s、Cry5’ s、Cry7’ s、Cry8’ s、Cry9’ s 和二元殺蟲毒素，如那些衍生自Bt的毒素等。也考慮與親本植物回交以及與非轉基因植物遠交，以及無性繁殖。常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可以在許多參考文獻之一中找到，例如Fehr，in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed.，American Society of Agronomy, Madison WI(1987)。本發明提供源自包含事件17314的水稻的植物部分。本文所用的“植物部分”指植物的任何部分，其包括源自包含事件17314的水稻的材料。植物部分包括但不限于花粉、 胚珠、莢果、花、根或莖組織、纖維和葉。植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和 /或不可再生的。本發明提供源自包含事件17314的水稻的商品。本文使用的“商品”指任何包括源自包含事件17314的水稻、種子、植物細胞或植物部分的材料的組合物或產品。商品可以出售給消費者，且可以是能存活的或不能存活的。不能存活的商品包括但不限于不能存活的種子和谷粒；加工的種子、種子部分和植物部分；脫水的植物組織、冷凍的植物組織和加工的植物組織；加工的用于陸生和/或水生動物消耗的動物飼料的種子和植物部分、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、纖維、乳液、奶酪、紙、奶油、酒和任何供人類食用的其他食物；以及生物質和燃料產品。能存活的商品包括但不限種子和植物細胞。包含事件17314的水稻因此可以用于制造任何通常由水稻獲得的商品。源自包含事件17314的植物的任何此類商品可以包含至少可檢測量的對應于水稻事件17314的特異性和獨特的DNA，特別可以包含可檢測量的含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的至少15個連續核苷酸的多核苷酸。可以使用任何核苷酸分子的標準檢測方法，包括本文所公開的檢測方法。如果商品中存在任何可檢測量的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2，則該商品在本發明的范圍內。因此，本發明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(如花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織和葉)和商品尤其可用于以產生用于農業的包含事件17314的種子和/或植物部分 為目的種植植物，生產包含事件17314的后代用于植物育種和研究目的，使用微生物技術用于工業和研究應用，和出售給消費者。本發明提供控制雜草的方法和使用草甘膦除草劑產生植物和包含事件17314的植物的方法。本發明提供在田地中控制雜草的一種方法，且該方法包括在田地中種植包含事件17314的變種或雜種植物，和以控制田地中的雜草而不損害包含事件17314的植物為目的向田地應用除草有效劑量的草甘膦。草甘膦除草劑的這種應用可以在出苗前(即種植包含事件17314的種子之后和包含事件17314的植物出苗之前的任何時間)或出苗后(即包含事件17314的植物出苗后的任何時間)。本發明還提供在田地中控制雜草的另一種方法，且該方法包括應用有效劑量的草甘膦除草劑以控制田地中的雜草，然后在田地中種植包含事件17314的水稻。草甘膦除草劑的這種應用在種植前(即種植包含事件17314的種子之前)，且可以在種植前的任何時間(包括但不限于種植前約14天至種植前約1天)進行。用于田地中的除草有效劑量的草甘膦應包括一個生長季節每英畝約0.5磅草甘膦至多達每英畝約4.5磅草甘膦。一個生長季節可以多次應用草甘膦，例如，兩次應用(如種植前的應用和出苗后的應用，或出苗前的應用和出苗后的應用)或三次應用(如種植前的應用、 出苗前的應用和出苗后的應用)。本發明提供生產包含對于本發明轉基因事件17314特異性和獨特的DNA序列的抗除草劑耐受性水稻的方法。用于這些方法的轉基因植物對于轉基因可以為純合的或雜合的。通過這些方法所產生的后代植物可以是變種或雜種植物；可以從由植物產生的種子長成和/或從通過用來自包含事件17314的水稻的花粉授粉的植物產生的包含事件17314的種子長成；且對于轉基因可以是純合的或雜合的。后代植物可以隨后自花授粉以產生植物純育種系(即，對于轉基因為純合的植物)，或者可以遠交，例如，與另一無關的植物雜交， 以產生變種或雜交種子或植物。通過包含具有序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的多核苷酸分子、包含事件17314 的植物與另一種水稻有性雜交從而產生種子，可以產生耐受草甘膦除草劑的應用的水稻， 其然后生長為后代植物。這些后代植物然后可以用草甘膦除草劑處理來選擇耐受草甘膦除草劑的后代植物。或者，這些后代植物可以經使用判斷方法分析以選擇包含事件17314DNA 的后代植物。用于雜交的其他植物可能耐受或可能不耐受草甘膦除草劑，可能是或可能不是轉基因的。產生的后代植物和/或種子可以是變種或雜種種子。在實行這種方法中，一種植物與另一種植物有性雜交(即異花授粉)的步驟可以通過人工干預完成或協助，例如手工收集一種植物的花粉，將此花粉與第二植物的花柱或柱頭接觸；手工和/或用動作除去、破壞或覆蓋植物的雄蕊或花藥(例如，通過去雄或應用化學殺配子劑)使得自然的自花授粉被阻止，且為了授粉，必需進行異花授粉；在“定向授粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，在果園或田地放置蜂箱或將傳粉昆蟲放于植物周圍)；人工打開或除去花的部分，以使得外源性花粉放置于或接觸花柱或柱頭(例如，在天然具有妨礙或阻止異花授粉的花的水稻中，使其自然地發生自花授粉，無需人工干預)；選擇性放置植物(例如，有意授粉靠近地種植植物)；和/或應用化學物質以促成開花或促進 (柱頭對于花粉的)可接受性。通過包含具有序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的多核苷酸分子、包含事件17314 的植物自交從而產生種子，可以產生耐受草甘膦除草劑的應用的水稻，其然后生長為后代植物。這些后代植物然后可以用草甘膦除草劑處理來選擇耐受草甘膦除草劑的后代植物。 或者，這些后代植物可以經使用判斷方法分析以選擇包含事件17314DNA的后代植物。在實行這種方法中，一種植物與自身有性雜交(即自花授粉或自交)的步驟可以通過人工干預完成或協助，例如手工收集植物的花粉，將此花粉與同一植物的花柱或柱頭接觸，然后任選地防止該植物的進一步的授粉；手工和/或通過動作除去、破壞或覆蓋其他附近植物的雄蕊或花藥(例如，通過去雄或應用化學殺配子劑)使得自然的異花授粉被阻止，且為了授粉，必需進行自花授粉；在“定向授粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，將傳粉昆蟲放于單獨的植物周圍)；人工處理花或其部分，以允許自花授粉；選擇性放置植物(例如，有意種植植物遠離授粉距離)；和/或應用化學物質以促成開花或促進(柱頭對于花粉的)可接受性。 這些方法所包含的以及使用這些方法產生的后代水稻和種子有別于其他水稻，例如，因為后代水稻和種子是重組的，因而是通過人工干預產生的；耐受草甘膦除草劑；包含至少一個由本發明的轉基因DNA組成的等位基因；和/或包含可檢出量的選自SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的多核苷酸序列。只要種子包括SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，該種子可以選自單個后代植物，這在本發明的范圍內。在實行本發明中，兩種不同的轉基因植物可以雜交以產生包含兩個獨立分離的異源基因的雜種后代。適當后代的自交能夠產生對于這兩個基因均為純合的植物。也考慮與親本植物回交和與非轉基因植物遠交，以及無性繁殖。常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可以在許多參考文獻之一中找到，例如Fehr，in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed.，American Society of Agronomy, Madison WI (1987)。用于本文公開的方法的植物和種子也可以包含一種或多種另外的轉基因。這種轉基因可以是任何編碼賦予理想性狀的蛋白質或RNA分子的核苷酸序列，該理想性狀包括但不限于增強的抗蟲性、提高的水利用效率、增加的產量表現、增強的抗旱性、提高的種子質量、改善的營養品質和/或增強的除草劑耐受性，其中相對于缺乏這種額外的轉基因的水稻，測量所述理想性狀。因此，本發明的方法尤其可以用于控制田地中的雜草同時生長植物以產生包含事件17314的種子和/或植物部分用于農業或研究目的，選擇包含事件17314的后代用于植物育種或研究目的，和產生包含事件17314的后代植物和種子。可以對本發明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(如花粉、胚珠、莢果、花、 根或莖組織和葉)和商品評估DNA組成、基因的表達和/或蛋白質的表達。這種評估可以通過以下方法來進行使用標準方法，如PCR、northern印跡、southern印跡、免疫印跡、免疫沉淀和ELISA ；或使用本文提供的檢測方法和/或檢測試劑盒。本發明提供檢測樣品中水稻事件17314特異性材料的存在的方法。一種方法包括檢測特異于和源自包含水稻事件17314的水稻細胞、組織或植物的DNA的存在。該方法提供待與引物對接觸的模板DNA樣品，所述引物對在經受適于熱擴增的條件時能夠從事件 17314DNA產生擴增子，尤其是包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的至少15個連續核苷酸或其互補序列的擴增子。只要模板DNA分子包含如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的特異性和獨特的核苷酸序列，擴增子由源自水稻事件17314的模板DNA分子產生。根據用于產生擴增子所選定的聚合酶，擴增子可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。該方法提供檢測在任何這樣的熱擴增反應中產生的擴增子分子，并確定對應于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2或其互補序列的核苷酸在擴增子序列中的存在。在擴增子中檢測到對應于SEQ ID NO :1或SEQID NO :2或其互補序列的核苷酸能夠確定和/或判斷樣品中存在事件17314特異性DNA，因而存在包含事件17314的生物材料。本發明提供另一種方法，用于檢測由源自水稻或水稻組織的材料組成的樣品中對應于SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的DNA分子的存在。該方法包括(i)從水稻或一組不同的水稻中提取DNA樣品；(ii)將該DNA樣品與顯示SEQ ID NO :1或SEQ ID N0:2所示的至少15個連續核苷酸的DNA探針分子接觸；(iii)允許探針和DNA樣品在嚴格的雜交條件下雜交；然后(iv)檢測探針和靶DNA樣品之間的雜交事件。檢測到雜合組成可判斷DNA樣品中存在SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4，視具體情況而定。沒有雜交可判斷樣品中沒有轉基因事件。或者，確定特定的水稻中包含一個或兩個對應于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 的序列或其互補序列可以確定該水稻包含至少一個對應于事件17314的等位基因。因此，可以通過任何公知的核酸檢測方法(如聚合酶鏈反應(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交)檢測本發明的核酸分子的存在。例如，Taverniers等人(J. Agric. Food Chem. ,53 =3041-3052,2005)討論了事件特異性的PCR分析方法，其中證明了用于轉基因玉米株系Btll、Btl76和GA21及用于油菜(canola)事件RT73的事件特異性追蹤系統。 在這項研究中，事件特異性的引物和探針基于各事件的基因組/轉基因連接區的序列進行設計。轉基因植物事件特異性的DNA檢測方法也已在美國專利6，893，826,6, 825，400、 6，740，488,6, 733，974,6, 689，880,6, 900，014 和 6，818，807 中描述。本發明提供DNA檢測試劑盒。其中一類試劑盒包含至少一種具有足夠長度的與 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6相似或互補的連續核苷酸的DNA分子，其作為特異性DNA引物或探針用于檢測樣品中源自轉基因水稻事件17314的DNA的存在。用該試劑盒檢測的DNA分子包含SEQ ID NO 1所示的至少15個連續核苷酸或其互補序列。或者， 該試劑盒可以包含至少一種具有足夠長度的與SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6相似或互補的連續核苷酸的DNA分子，其作為特異性DNA引物或探針用于檢測生物樣品中源自轉基因水稻事件17314的DNA的存在。用該試劑盒檢測的DNA分子包含SEQ ID NO 2 所示的至少15個連續核苷酸或其互補序列。可選擇的試劑盒采用以下方法其中用上文所述的引物對接觸靶DNA樣品，然后進行足以產生包含SEQ ID NO :2所示的至少15個連續核苷酸或其互補序列的擴增子的核酸擴增反應。檢測到擴增子以及確定擴增子序列內存在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的不少于15個連續核苷酸或其互補序列可以確定，或者說，能夠判斷靶DNA樣品中存在17314 事件特異性的DNA。本發明提供足以用作DNA探針的DNA分子，所述DNA探針用于確定、檢測或判斷樣品中存在或甚至不存在事件17314DNA特異性和獨特的DNA。DNA分子含有SEQ ID N0:1的至少15個連續核苷酸或其互補序列，或SEQ ID NO 2的至少15個連續核苷酸或其互補序列。可以通過本領域已知的各種核酸擴增方法中的任何一種(包括熱擴增方法)實現核酸擴增。可以通過使用源自本發明提供的序列的引物擴增來自所述事件的這種序列， 接著對擴增子或克隆的DNA進行標準DNA測序，來驗證(如果必要，校正)來自水稻事件 17314 (包含事件17314的代表性的種子樣品已經作為ATCC PTA-9844保藏)的異源DNA插入序列、連接序列或側翼序列。
可以通過多種技術檢測由這些方法產生的擴增子。一種這樣的方法是遺傳位分析 (Genetic Bit Analysis) (Nikiforov等人，Nucleic Acid Res. 22 :4167_4175，1994)，其中設計了與相鄰的側翼基因組DNA序列和插入的DNA序列重疊的DNA寡核苷酸。將該寡核苷酸固定在微孔板的孔中。繼目標區域的熱擴增(對插入序列使用一個引物，對相鄰的側翼基因組序列使用另一個引物)之后，可以將單鏈的擴增子(熱擴增產物)與固定的寡核苷酸雜交，并用作單堿基延伸反應的模板，該反應使用DNA聚合酶和對于預期的下一堿基特異性的標記ddNTP。讀數可以是熒光或基于ELISA的。檢測到熒光或其他信號表明由于成功的擴增、雜交和單堿基延伸而存在插入/側翼序列。

另一種方法是Winge(Innov. Pharma. Tech. 00 18-24, 2000)所描述的焦磷酸測序技術(Pyrosequencing technique)。在該方法中，寡核苷酸設計為與相鄰的基因組DNA 和插入DNA連接區重疊。將寡核苷酸與來自目標區域的單鏈熱擴增產物(單鏈擴增子) (插入序列使用一個引物，側翼基因組序列使用另一個引物)雜交，并在DNA聚合酶、ATP、 硫酸化酶(sulfurylase)、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5，磷酰硫酸 (adenosine 5' phosphosulfate)和螢光素的存在下孵育。單個地加入ddNTP，摻入產生光信號，對產生的光信號進行測量。光信號表明由于成功的擴增、雜交和單-或多-堿基延伸而存在轉基因插入/側翼序列。如Chen等人(Genome Res. 9 =492-498,1999)所述的熒光偏振是一種可用于檢測擴增子的方法。使用此方法，設計與基因組側翼DNA和插入DNA連接區重疊的寡核苷酸。 將該寡核苷酸與目標區域的單鏈擴增產物(插入DNA使用一個引物，側翼基因組序列使用另一個引物)雜交，并在DNA聚合酶和熒光標記的ddNTP的存在下孵育。單堿基延伸導致 ddNTP的摻入。可以使用熒光計作為偏振的變化而測定摻入。偏振的改變表明由于成功的擴增、雜交和單堿基延伸而存在轉基因插入/側翼序列。也可以根據制造商提供的說明書，利用TAQMAN (PE Applied Biosystems， Foster City, CA)檢測和定量DNA序列的存在。簡單地說，設計與基因組側翼和插入DNA連接區重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針和擴增引物(插入DNA序列使用一個引物，側翼基因組序列使用另一個引物)在熱穩定聚合酶和dNTP的存在下循環。FRET探針的雜交導致熒光部分從FRET探針上的猝滅部分裂解和釋放。熒光信號表明由于成功的擴增和雜交而存在側翼/轉基因插入序列。如Tyangi 等人(Nature Biotech. 14 =303-308,1996)所述，已描述分子信標用于序列檢測。簡單地說，設計與側翼基因組和插入DNA連接區重疊的FRET寡核苷酸探針。 FRET探針的獨特結構導致它含有保持熒光部分和猝滅部分緊密接近的二級結構。FRET探針和擴增引物(插入DNA序列使用一個引物，側翼基因組序列使用另一個引物)在熱穩定聚合酶和dNTP的存在下循環。繼成功進行擴增之后，FRET探針與靶序列的雜交導致探針二級結構喪失及熒光和猝滅部分的空間分離，導致熒光信號的產生。熒光信號表明由于成功的擴增和雜交而存在側翼/轉基因插入序列。本領域已知的其他方法可以用于實行本發明的方法如微流體技術(參見，例如，美國專利公開2006068398和美國專利6，544，734)， 其提供分離和擴增DNA樣品的方法和設備；檢測和測量特定的DNA分子的光染料(參見， 例如，W0/05017181)；包含用于檢測DNA分子的電子傳感器的納米管裝置(參見，例如， TO/06024023)；和/或結合特定的DNA分子然后可以檢測該DNA分子的納米珠。
可以使用本文公開的組合物和DNA檢測領域已知的方法開發DNA檢測試劑盒。該試劑盒用于鑒定樣品中的事件17314，且可以應用于培育含有適當的事件DNA的水稻植物的方法。試劑盒可以包含與SEQ ID NO :1-6或其片段類似或互補的DNA引物或探針。因此， 本發明的試劑盒和檢測方法尤其可用于鑒定水稻17314事件，選擇包含事件17314的植物變種或雜種，檢測樣品中源自水稻事件17314的DNA的存在，和對樣品監測水稻事件17314 的存在和/或不存在或包含水稻事件17314的植物、植物部分或商品。本文包括下面的實施例來證明本發明的某些優選實施方案的實施例。本領域的技術人員應該理解，下面的實施例中公開的技術代表了本發明人發現在實施本發明中運用良好的技術，因此可以被認為是構成實施本發明的優選方式的實施例。然而，本領域的技術人員根據本公開內容應該理解，在不背離本發明的精神和范圍的情況下，可以對公開的具體實施方案進行許多改變，而且仍然獲得相同或類似的結果。
實施例實施例1 水稻的轉化和事件選擇本實施例說明如何產生轉基因水稻的事件和如何選擇事件17314。通過用如圖1 所示的轉基因DNA片段(其序列如SEQ ID NO 5所示)對水稻細胞進行粒子槍介導的轉化，產生轉基因的耐受草甘膦的事件17314。轉基因DNA片段包括包含源自花椰菜花葉病毒的啟動子(P-CaMV. e35S)分子、包含復制的增強子的表達盒，該表達盒可操作地連接至源自水稻肌動蛋白1基因的內含子分子(I-Os. Actl)，可操作地連接至編碼葉綠體轉運肽 (CTP2，擬南芥EPSPQ的DNA分子，可操作地連接至編碼草甘膦抗性EPSPS (AGRtu. EPSPS CP4)的DNA分子，可操作地連接至源自根癌土壤桿菌胭脂堿合成酶基因的3’轉錄終止區 DNA 分子(T-AGRtu. nos)。首先，使用粒子槍方法，用4個表達盒中的一個轉化來自水稻品種M-202的外植體。然后在含有草甘膦的培養基上選擇轉化的細胞，并將存活細胞再生為植物。轉化過程產生擬8株RO植物，每株RO植物為單獨的、個別的事件。在RO階段通過PCR和Southern 分析篩選這9 個事件，以消除多拷貝和/或分子復雜事件。對于PCR分析，最初對提取的 DNA進行端點TAQMAN 檢測。基于PCR篩選，選出565個RO事件。然后通過Southern分析篩選這565個RO事件。對于Southern分析，從水稻組織提取DNA，用NcoI和EcoRI或 SSPI消化，并利用Southern印跡雜交分析技術與互補于CaMV 35S啟動子和EPSPS編碼序列的放射性DNA探針進行雜交。這些數據被用于確定插入水稻基因組中的轉基因盒拷貝數，并選擇240個具有單一插入的RO事件。這240個選定的事件然后被轉到生長室用于表型和能育性分析，以確定非型植物。從生長室的表型和能育性篩選中選出170個事件進行下一步。然后在生長室中，對這 170個Rl事件篩選草甘膦耐受性。也通過次級Southern分析，對這些植物分析完整的轉基因插入。使用從這些分析收集的數據，選出19個事件進行下一步。隨后，選出其中13個事件的R2植物用于田間試驗。對于這13個事件中的每一個在一個生長季節，對于這些事件中的5個在兩個生長季節，收集植物的多個特征的田間試驗數據。在第一年的田間試驗中， 在多重復田間試驗設計中的最少3個地點，測試這13個事件的草甘膦耐受性和農藝學等效性。結果列于表1中。
表1 第一季田間試驗程序的田間試驗結果
權利要求
1.DNA分子，包括(a)具有選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的序列的多核苷酸分子；(b)具有SEQID NO 3核苷酸位置觀3_302的至少15個連續核苷酸的序列的多核苷酸分子；(c)具有SEQID NO 4核苷酸位置666-685的至少11個連續核苷酸的序列的多核苷酸分子；或(d)與(a)、(b)或(c)互補的序列。
2.根據權利要求1所述的DNA分子，包含與SEQID NO 6具有至少90%—致性的核苷酸序列。
3.根據權利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子源自事件17314，包含事件17314 的種子的代表性的樣品已經以ATCC保藏號PTA-9844保藏。
4.根據權利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子包含在水稻、植物細胞、種子、后代植物、植物部分或商品中。
5.根據權利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子是由事件17314的模板分子產生的擴增子。
6.用于判斷事件17314的存在的多核苷酸探針，其中，所述探針具有足夠的長度以結合選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列的至少11個連續核苷酸的序列或其互補序列。
7.由第一DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二 DNA分子組成的DNA分子對，其中，所述這些DNA分子具有SEQ ID NO 6的足夠長度的連續核苷酸的核苷酸序列或其互補序列， 從而在與來自水稻事件17314的模板一起在擴增反應中使用時，作為DNA引物發揮功能，以產生用于判斷樣品中的水稻事件17314的擴增子。
8.根據權利要求7的DNA分子對，其中，所述擴增子包含選自SEQID NO=I和SEQ ID NO 2及其互補序列的核苷酸序列。
9.一種檢測來自水稻事件17314的DNA分子的存在的檢測方法，包括(a)使DNA樣品接觸權利要求7所述的DNA分子對；(b)進行擴增反應，該擴增反應足以產生一種擴增子，該擴增子包含具有選自SEQID NO :1和SEQ ID NO 2的序列的至少11個連續核苷酸的多核苷酸分子或其互補序列；和(c)檢測所述DNA擴增子，其中，檢測到所述DNA擴增子則判斷在所述DNA樣品中存在所述來自水稻事件17314 的DNA分子。
10.一種在樣品中檢測包含選自SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的核苷酸序列的DNA分子的存在的方法，包括(a)使樣品接觸包含選自SEQID NO :3或SEQ ID NO :4及其互補序列的多核苷酸序列的DNA探針，其中，所述DNA探針在嚴格雜交條件下與包含選自SEQ ID NO :3或SEQ ID NO: 4的核苷酸序列的DNA分子雜交，且在該嚴格雜交條件下不與不包含選自SEQ ID NO 3或 SEQ ID NO 4的核苷酸序列的DNA分子雜交；(b)使所述樣品和所述DNA探針經受嚴格的雜交條件；和(c)檢測所述DNA探針與包含選自SEQID NO :3或SEQ ID NO :4的核苷酸序列的所述DNA分子的雜交。
11.DNA檢測試劑盒，包含至少一個DNA分子，該DNA分子含有SEQ ID NO :6的足夠長度的連續核苷酸序列的核苷酸序列或其互補序列，作為對于檢測來自水稻事件17314的DNA 的存在特異性的DNA引物或探針，其中，檢測到所述DNA則判斷樣品中存在所述水稻事件 17314。
12.根據權利要求11的DNA檢測試劑盒，其中，所述DNA分子包含SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的至少15個連續核苷酸或其互補序列。
13.根據權利要求11的DNA檢測試劑盒，其中，所述試劑盒采用的方法包括(a)使樣品接觸權利要求7所述的DNA分子對；(b)進行核酸擴增反應，該核酸擴增反應足以產生包含SEQID NO :1或SEQ ID NO 2 的至少15個連續核苷酸或其互補序列的擴增子；和(c)檢測所述擴增子，
14.包含具有選自SEQID NO=USEQ ID NO :2及其互補序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的水稻、種子、細胞或其植物部分。
15.根據權利要求14所述的水稻、種子、細胞或其植物部分，其中，所述植物、種子、細胞或植物部分耐受草甘膦除草劑處理。
16.根據權利要求14所述的水稻、種子、細胞或其植物部分，其基因組在DNA擴增方法中檢測時產生用于判斷事件17314的擴增子。
17.包含事件17314的水稻、種子、細胞或其植物部分，其中，包含事件17314的種子的代表性的樣品已經以ATCC保藏號PTA-9844保藏。
18.根據權利要求17所述的水稻、種子、細胞或其植物部分，其中，所述植物或其部分耐受草甘膦除草劑處理。
19.根據權利要求17所述的水稻、種子、細胞或其植物部分，其中，所述水稻或種子是具有至少一個源自或包含事件17314的親本的雜種，包含事件17314的種子的代表性的樣品已經以ATCC保藏號PTA-9844保藏。
20.根據權利要求17所述的水稻、種子、細胞或其植物部分，定義為細胞、花粉、胚珠、 莢果、花、根組織、莖組織或葉組織。
21.根據權利要求17所述的水稻、種子、細胞或其植物部分，進一步定義為包含所述事件17314的任何一代水稻的后代植物。
22.包含選自SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的DNA分子的水稻商品。
23.根據權利要求22所述的水稻商品，進一步定義為選自完整的或加工的水稻種子、 動物飼料、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、膨化稻米、乳液、奶酪、紙、奶油、酒、醇、生物質和燃料產品的商品。
24.根據權利要求22所述的水稻商品，其中該商品包含事件17314，包含所述事件 17314的代表性的種子已經以ATCC保藏號PTA-9844保藏。
25.根據權利要求22所述的水稻商品，進一步定義為包含一種核酸，該核酸在DNA擴增方法中檢測時產生用于判斷事件17314的擴增子。
26.在DNA擴增方法中檢測時能夠產生用于判斷事件17314的擴增子的水稻或其部分， 包含所述事件17314的代表性的種子已經以ATCC保藏號PTA-9844保藏。
27.根據權利要求沈所述的水稻，其中，所述擴增子包含SEQID NO :1或SEQ ID NO 2。
28.在DNA擴增方法中檢測時能夠產生用于判斷事件17314的擴增子的水稻種子，包含所述事件17314的代表性的種子已經以ATCC保藏號PTA-9844保藏。
29.根據權利要求觀所述的水稻種子，其中，所述擴增子包含SEQID NO :1或SEQ ID NO :2。
30.一種產生耐受草甘膦除草劑的水稻的方法，包括向所述植物的基因組引入事件 17314，包含所述事件17314的代表性的種子已經以ATCC保藏號PTA-9844保藏。
31.根據權利要求30所述的方法，定義為包括以下步驟(a)雜交包含事件17314的第一水稻與缺乏事件17314的第二水稻以產生后代植物；和(b)選擇包含所述事件17314且耐受草甘膦的至少第一后代植物。
32.根據權利要求31所述的方法，還包括自交所述第一后代植物以產生第二代后代植物，并選擇所述事件17314為純合的至少第一植物。
33.一種產生水稻商品的方法，包括(a)獲得權利要求17所述的水稻或其部分；和(b)由所述水稻或其部分產生水稻商品。
34.根據權利要求33所述的方法，其中，所述商品選自完整的或加工的水稻種子、動物飼料、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、膨化稻米、乳液、奶酪、紙、奶油、酒、醇、生物質和燃料產品。
35.一種用于控制包括包含事件17314的水稻的田地中雜草生長的方法，所述方法包括用有效控制雜草生長的量的草甘膦處理田地，其中所述水稻顯示草甘膦耐受性。
36.根據權利要求35的方法，其中，所述草甘膦的有效量為每英畝約0.5磅至約4. 5磅。
37.包含選自SEQID NO =USEQ ID NO :2及其互補序列的DNA分子的無生命的植物材料。
38.包含具有選自SEQID NO=USEQ ID NO :2及其互補序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的微生物。
39.根據權利要求38的微生物，其中，所述微生物是植物細胞。
全文摘要
本發明提供轉基因水稻事件17314及源自事件17314的植物、植物細胞、種子、植物部分和商品。本發明還提供對于事件17314特異性的多核苷酸及包含對于事件17314特異性的多核苷酸的植物、植物細胞、種子、植物部分和商品。本發明還提供與事件17314相關的方法。
文檔編號C07H21/04GK102448288SQ201080009417
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月29日 優先權日2009年3月30日
發明者C·S·哈梅爾, C·杜昂, 祁幼林, 許少偉, 陳云佳 申請人:孟山都技術公司