專利名稱：用于質譜分析法的調整的合成樹枝狀聚合物校準物的制作方法
用于質譜分析法的調整的合成樹枝狀聚合物校準物相關申請案本項非臨時專利申請要求2009年2月3日提交的美國臨時專利申請第 61/149，506號、2009年4月8日提交的美國臨時專利申請第61/167，708號以及2009年6 月10日提交的美國臨時專利申請第61/185，665號的權益，各申請以引用方式全文并入。
背景技術：
本發明涉及具有連續分支結構的樹枝狀分子，其中至少一個分支具有第二分支結構。本發明還包括制備所述樹枝狀分子的方法，其作為飛行時間基質輔助激光解吸/離子化(MALDI-T0F)質譜分析(MS)、電噴霧離子化(ESI-MS)、大氣壓力化學離子化(APCI-MS)、 快速原子轟擊(FAB-MS)及其它用于分析分子量大于1000道爾頓的化合物的MS技術的校準物的用途。質譜分析法(MQ是用于測定樣品(例如蛋白質、化合物等)的元素組成的分析技術。它還可用于測定所述樣品的化學結構。一般來說，MS包括使樣品離子化以產生帶電分子(及其片段)及測量其質荷比。飛行時間質譜法(TOF-MS)是一種離子被電場加速，以動能qV進入無場漂移區的方法，其中q是離子電荷，V是外加電壓。因為每個離子的動能是l/2mv2，其中m是質量，ν 是速度，所以較輕離子具有比較重離子更快的速度。因此，較輕離子比較重離子更快到達漂移區末端的檢測器。基質輔助激光解吸/離子化(MALDI)是一種用于質譜分析的離子化技術，其便于分析生物分子(例如蛋白質、肽和糖)及有機大分子(例如聚合物及其它大分子)。電噴霧離子化(ESI)是一種大氣壓力離子化技術，借此技術迫使溶于揮發性溶劑 (例如乙腈、CH30H、CH3C1、水等)的分析物通過小型帶電毛細管(通常為金屬)。分析物在溶液中以離子形式存在，且當樣品被從毛細管逐出時，其成煙霧狀散開。這樣增大了帶同樣電荷的分析物顆粒之間的距離。中性氣體載體(例如氮氣)常用于自液滴蒸發溶劑。隨著溶劑的蒸發，帶電分析物分子被聚攏得更近。但同時，分析物分子上的相同電荷迫使其分開。此收縮和擴張過程重復進行，直到樣品不含溶劑，成為孤離子。孤離子隨后轉入質量分析器。大氣壓力化學離子化(APCI)也是一種大氣壓力離子化技術，借此使經過加熱管 (例如大于400°C)的樣品溶液揮發，并借助于氮噴霧作用使之經受電暈放電。APCI是ESI 的變化形式，可在改進的ESI源中進行。由放電產生的離子被引入質譜儀。這項技術對于相對極性的半揮發性樣品來說是最好的，并且可用作液相色譜-質譜分析法(LC/MQ的界面，這是由于其能適應極高的液體流速(例如lmL/min)。APCI-MS的波普通常含有準分子離子[M+H] +。快速原子轟擊(FAB)使用高能中性原子束，通常為氙或氬，其在真空下撞擊固體樣品(與基質混合的分析物)，從而引起解吸和離子化。常用基質包括甘油、硫代甘油、3-硝基芐醇(3-NBA)、18-冠-6醚、2-硝基苯基辛基醚、環丁砜、二乙醇胺及三乙醇胺。FAB用于難以進入氣相的大生物分子。通過將來自離子源的離子加速穿過電荷交換單元產生高能束。這些離子通過與中性原子碰撞而積累電子，從而形成高能原子束。因為FAB波普往往僅含有少量片段和偽分子離子(例如[M+H]+、[M+Na]+)的信號，所以其適用于測定分子量。 但低m/z區通常充滿來自基質的信號。為了對一系列分析工作(包括蛋白質、肽、寡核苷酸及合成聚合物的表征及結構測定)校準質譜儀，需要多種分子量的已知校準物。通常來說，已使用的是蛋白質和肽，這是因為它們具有單分散性(純樣品中只有單一且精確的分子量)，并且它們具有有效的生物來源。實例包括血管舒緩激肽、促腎上腺皮質激素、胰島素B鏈、細胞色素C、脫輔基肌紅蛋白、白蛋白、醛縮酶及血管緊張素II。然而，生產(且特別是純化)這種標準物是費時的，并且在技術上很復雜，導致克數量的費用相當高。此外，這種標準物由于酶不穩定性和酸敏感性的原因而固有地具有較差的保存期限。合成聚合物則提供了便宜得多的替代物，但其存在的分子量分布寬，這是因為它們的制備采用了在單個單體單元之間的相對未介導的反應(與生物合成相比)，這不可避免地導致分子量的統計分布。這種寬分子量分布在質譜中通常觀察到的是高斯(Gaussian) 系列峰，以單體質量的倍數均勻間隔。然而，有效樹枝狀聚合物合成的進展使合成材料的廉價可測量成本同傳統上與生物合成材料相關的精確分子量相結合。制備“真正”樹枝狀聚合物(具有高度結構規整性的高支化分子)的兩種截然不同的合成路線是已知的。第一種方法(發散法)首先涉及將支化單體偶合至核分子，產生中間體，然后“活化”中間體以產生表面官能團數量增加的新的更大的分子。重復這兩個步驟導致尺寸成指數增長的樹枝狀分子向外逐層生長。第二種方法(收斂法)涉及經由一個單體單元束縛的周邊基團，產生“楔形物”或“樹狀突”。這些樹狀突中的兩個可與另外的單體分子偶合，產生更大的樹狀突，并向內繼續逐層生長，直到偶合至核。通常，發散技術在技術上較為簡單大量過剩的小分子與生長中的分子反應，然后 (例如通過蒸餾)被移除，提供相對合算且可測量的合成。然而，采用發散技術，偶合反應的數量呈指數方式逐代增加。因此，些許結構雜質在樹枝狀聚合物中幾乎是不可避免的，且不能輕易移除(例如當η為大數時，η個偶合反應的產物的物理性質與η-1個偶合反應的產物的物理性質幾乎一致)。結果是，用于諸如MS校準之類的應用的材料確定性較差。收斂技術具有的獨特優點在于，每一偶合涉及數量少且數量恒定的反應(通常2 或3個反應)。因此，采用收斂技術可促使反應完成，且可輕易檢測到由副反應產生的任何雜質(由于η較小)并移除之。不過，雖然用收斂技術產生的材料確定性良好，但它們的合成要求很高。這就妨礙了它們在除了特殊應用以外的用途的經濟性。因此，本發明的基本技術問題是要通過提供保存期限改善、成本較低且分子量范圍寬的單分散校準物克服這些現有技術的難點。此技術問題的解決方案由描述權利要求的實施方案提供。
發明概要本發明涉及樹枝狀分子(樹枝狀聚合物)，其適用于校準質譜分析儀器，特別是適用于MALDI-TOF、ESI、APCI及FAB質譜分析技術以及用于對分子量高于1，000道爾頓的材料進行質量分析的任何其它技術。本發明還涉及合成所述樹枝狀聚合物的方法以及它們的使用方法。在一方面中，本發明涉及合成校準物。本發明的合成校準物是經由羥基封端的核分子的“樹枝化”及任選隨后的“脫保護”步驟合成(“產生”)的樹枝狀分子(樹枝狀聚合物)。還任選地，樹枝化和脫保護步驟可進行多次(其中每一脫保護步驟繼樹枝化步驟之后進行，且其中在第一次樹枝化步驟之后的每一次樹枝化步驟繼脫保護步驟之后進行)，以產生具有已知且適用的尺寸的樹枝狀聚合物。每一輪樹枝化/脫保護的樹枝狀聚合物產物屬于同一“代”。例如，以核分子進行的第一次樹枝化步驟產生第一代或“G-1”樹枝狀聚合物。同樣，在所得G-I樹枝狀聚合物上進行的下一個脫保護步驟也產生第一代樹枝狀聚合物。然而，在G-I脫保護步驟之后的樹枝化步驟產生第二代或“G-2”樹枝狀聚合物。因此，每一輪樹枝化和脫保護產生同一 “代”樹枝狀聚合物產物。在一優選實施方案中，本發明涉及不同分子量的樹枝狀聚合物的混合物，特別是涉及所述樹枝狀聚合物的特定比例的混合物(例如等摩爾混合物)。特別來說，本發明涉及平行合成的樹枝狀聚合物的混合物， 其中將等摩爾量的具有不同醇官能團數目的核分子混合在一起，并使之經受至少一輪樹枝化。任選地，可使所得混合物經受若干輪樹枝化和脫保護，以得到在廣譜分子量范圍上具有已知且適用的尺寸的樹枝狀聚合物混合物。在這些混合物的每一者中，樹枝狀聚合物為同一代，且都適用于質譜分析法。另外，因為端基可經樹枝化和脫保護而改性，所以本發明的樹枝狀聚合物在適用于MS的幾乎全系列的溶劑、基質和分析物中具有高溶解度。因此，本發明的樹枝狀聚合物適合用作內部校準物(也就是，在樣品制備期間它們可直接與分析物和基質混合)。在一個實施方案中，提供一種樹枝狀聚合物組合物，其包含至少一種式(核x) (DrM) x的化合物，或其互變異構形式，或其鹽或其溶劑合物，其中χ是3到6的整數，且其中A)核 x 表示Α. 1) A. 2)
權利要求
1. 一種樹枝狀聚合物組合物，其包含至少一種式(核x) (D^)x的化合物，或其互變異構形式，或其鹽或其溶劑合物，其中χ是3到6的整數，且其中 A)核x表示 Α. 1)A. 2)當χ = 4時A. 3)當x=5時；A. 4)當χ = 6時；以及A. 5)它們的組合； B) D表示C)M表示R1p或R2p，其中 CDR1 是
2. —種樹枝狀聚合物組合物，其包含至少一種式(核x) (D^)x的化合物，或其互變異構形式，或其鹽或其溶劑合物，其中χ是3到6的整數，且其中 A)核x表示
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中A.1、A. 2、A. 3及A. 4以約等摩爾量存在。
4.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中A.1、A. 2、A. 3、A. 4、B、C或其任意組合是同位素富集的。
5.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中B和C是同位素富集的。
6.根據權利要求5或6所述的組合物，其中所述同位素富集是12C同位素富集、lfiO同位素富集或12C和16O同位素富集。
7.—種制造樹枝狀聚合物組合物的方法，包括以下步驟A)提供至少一種選自1，1，1_三羥乙基甲烷、季戊四醇、木糖醇、二季戊四醇及其任意組合的核；B)使所述至少一種核經受一輪樹枝化；C)任選且隨后使所述至少一種核經受一輪脫保護；D)任選且隨后重復步驟B)和C)；及E)根據需要，任選且隨后重復步驟D)，由此獲得所述樹枝狀聚合物組合物。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述至少一種核是1，1，1-三羥乙基甲烷、季戊四醇、木糖醇及二季戊四醇的組合。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其中步驟B)包括使用雙(5-甲基-2-苯基-1， 3-二噁烷-5-羧)酸酐單體。
10.根據權利要求7或8所述的方法，其中步驟B)包括使用式1的化合物。
11.一種校準質譜儀的方法，所述方法包括A)提供至少一種根據權利要求1-6中任一項所述的樹枝狀聚合物，其中所述至少一種樹枝狀聚合物具有某些物理性質；B)使所述至少一種樹枝狀聚合物離子化，以提供所述至少一種樹枝狀聚合物的一種或多種離子；C)收集所述一種或多種離子的數據；及D)使所述數據與所述某些物理性質相關聯。
12.一種測定樣品的物理性質的方法，所述方法包括A)提供至少一種根據根據權利要求1-6中任一項所述的樹枝狀聚合物，其中所述至少一種樹枝狀聚合物具有某些物理性質；B)提供樣品；C)將所述樣品的至少一部分與所述至少一種樹枝狀聚合物的至少一部分合并；D)相繼使所述樣品和所述至少一種樹枝狀聚合物離子化，以提供所述至少一種樹枝狀聚合物的一種或多種離子和所述樣品的一種或多種離子；E)收集所述至少一種樹枝狀聚合物的所述一種或多種離子和所述樣品的一種或多種離子的數據；及F)使所述數據與所述至少一種樹枝狀聚合物的所述某些物理性質相關聯，由此測定所述樣品的物理性質。
全文摘要
提供用于質譜分析法的單分散合成樹枝狀聚合物校準物。所述校準物具有以下特征合成相對便利及快速、成本比較低、保存期限長、純度高以及以混合物形式批量合成的可控制性。后一特征使得能夠平行制備呈現不連續分子量的有用分布的較高分子量化合物，從而提供多點質譜分析校準標準物。還提供制造和使用所述校準物的方法。
文檔編號C07D319/06GK102325760SQ201080008821
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月3日 優先權日2009年2月3日
發明者S·M·格雷森 申請人:圖蘭恩教育基金管理人