抗人epo受體的抗體的制作方法

專利名稱：抗人epo受體的抗體的制作方法
抗人EPO受體的抗體
背景技術：
人紅細胞生成素(EPO)是涉及祖紅細胞的增殖和分化的166-aa糖蛋白。這些細胞反應由人EPO受體(EPO-R)——508-aa糖蛋白——介導。人EPO受體(EPO-R)是508個氨基酸長度的蛋白質(Swiss Prot P19235)，其含有單個跨膜結構域且已被分類為I型細胞因子受體的生長激素亞家族成員。EPO-R在例如Winkelmann，J. C.等人，Blood 76(1990)24-30 m Jones, S. S.等人，Blood 76(1990)31-35)中有描述。EPO-R的活化通過二聚化發生 (Matthews, D.J.，PNAS 93(1996)9471-9476)。EPO-R 包含 8 個細胞質酪氨酸位點，其在用 EPO刺激后被磷酸化(Li,K.等人，J. Biol. Chem. 278(2003)40702-40709 ；Wu,H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 1806-1810)，導致“活化的 EP0-R”。抗EPO-R 抗體記載于例如 Andrea，A. D.，Blood 82(1993)46-52 ；Elliott, S.， Blood 107(2006) 1892-1895 ；Kirkeby，A.，J. Nerosci. 164(2007)50-58 ；Miura, 0.，Arch. Biochem. 306(1993)200-208 ；和 EP 1 146 056，EP 1 327 681，EP 0 773 962，EP 0 776 370， US 2002/0031806， US 2003/0215444， US 2004/0058393， US 2004/0071694， US 2004/0175379， US 2005/0227289， US 2005/0244409， US 2006/0018902， US 6,998,124， US 7，053，184，US 7, 081,523, WO 1995/005469, WO 1996/003438, WO 2000/061637， WO 2004/035603A2, WO 2005/100403A2。然而在目前已知的技術水平中，針對EPO-R的已知抗體不能夠區分非活化的和活化的EPO-R(見Jelkmann，W.等人，Crit. Rev. One/ Hematol. 67(2008)39-61 ；Li, K.等人，J. Biol. Chem. 278 口00；3) 40702-40709，和 Wu, H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 1806-1810)。發明_既述本發明包含特異性結合活化的人EPO受體和區分非活化的和活化的EPO-R的抗體，其允許對EPO-R活化的特定分析，尤其是在來自人組織的細胞和活組織(biopsy)中。本發明包含抗體，其特征在于特異性結合在第430位(下劃線)包含磷酸酪氨酰殘基的TPPHLKILYLVVSD(SEQ ID NO :25)，在第461位(下劃線)包含磷酸酪氨酰殘基的GLSDGPISNPYENSLIP (SEQ ID NO 26)，或在第465位(下劃線)包含磷酸酪氨酰殘基的 GLSDGPYSNPYENSLIP (SEQ ID NO 26)人 EPO 受體片段。編號涉及不含信號肽的UniProtKB/Swiss-Prot P19235的EPO受體氨基酸序列。根據本發明的抗體不結合在第430位沒有磷酸酪氨酰殘基的TPPHLKYLYLVVSD (SEQ ID NO 25)，在第461位沒有磷酸酪氨酰殘基的 GLSDGPYSNPYENSLIP (SEQ ID NO :26)，或在第465位沒有磷酸酪氨酰殘基的 GLSDGPYSNPYENSLIP (SEQ ID NO :26) EPO 受體片段。根據本發明的抗體在UT7細胞裂解物中特異性結合磷酸化的(活化的)EPO受體， 所述細胞以100. 000至500. 000受體/細胞(EP0-R表達細胞)的量表達EPO-R并用500pM EPO處理以活化。根據本發明的抗體在表達EPO受體但不用EPO處理的UT7細胞裂解物中不結合EPO受體。可通過蛋白質印跡測量這些結合。優選地本發明包含與人EPO-R結合的抗體，其特征在于包含SEQ ID NO :1，9或17的⑶R3區作為重鏈可變結構域⑶R3區。優選地所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID N0:1的⑶R3區、SEQ ID NO 2 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 3 的 CDRl 區，或 SEQ ID NO 9 的 CDR3 區、SEQ ID NO 10 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 11 的 CDRl 區，或 SEQ IDNO 17 的 CDR3 區，SEQ ID NO 18 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 19 的 CDRl 區。優選的所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID N0:1的⑶R3區、SEQ ID NO 2的⑶R2區和SEQ ID NO 3的⑶Rl區，和輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO 4的⑶R3 區，SEQ ID NO 5 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 區。優選的所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID NO 9的⑶R3區、SEQ ID NO :10的CDR2區和SEQ ID NO 11的⑶Rl區，和輕鏈可變結構域包含SEQ ID N0:12的CDR3 區，SEQ ID NO 13 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 14 的 CDRl 區。優選的所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID NO :17的⑶R3區，SEQ ID NO 18的CDR2區和SEQ ID NO 19的CDRl區和輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO 20的 CDR3 區，SEQ ID NO 21 的 CDR2 區和 SEQ IDNO 22 的 CDRl 區。優選地所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID NO :7，15或23。優選地所述抗體的特征在于輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO :8，16或24。優選地所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID NO :7和輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO :8ο優選地所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID NO 15和輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO :16ο優選地所述抗體的特征在于重鏈可變結構域包含SEQ ID NO 23和輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO :24ο優選地根據本發明的抗體的特征在于以至少10ΛΓ1至10_12M_i的結合親和力結合 EPO-R0本發明的另一個實施方案是編碼根據本發明的抗體的重鏈和輕鏈的核酸。人和其他恒定鏈是目前技術水平中熟知的并由例如Kabat (見例如J0hnS0n，G.和 ffu, T.T.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)描述。抗體進一步優選地為小鼠來源并包含根據Kabat的小鼠抗體的抗體可變序列框(見例如Johnson, G.和ffu, Τ. T.，Nucleic Acids Res. 28(2000)214-218)。根據本發明的抗體優選為小鼠、兔或人來源的。在人抗體中優選IgGl同種型。本發明還提供了包含本發明的核酸、能夠在原核或真核宿主細胞中表達所述核酸的表達載體，和用于重組生產這樣的抗體的包含這些載體的宿主細胞。本發明還包含含有根據本發明的載體的原核或真核宿主細胞。本發明還包含制備根據本發明的重組人或人源化抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細胞中表達根據本發明的核酸，和從所述細胞或細胞培養上清中回收所述抗體。本發明還包含可通過這樣的重組方法得到的抗體。本發明還包含根據本發明的抗體在測定/檢測具有/表達活化的EPO受體的哺乳動物細胞中的用途。優選地使用根據本發明的抗體測定人組織樣品的活組織裂解物中的活化的EPO受體。優選地通過蛋白質印跡進行這樣的檢測。發明詳述術語“抗體”包含抗體結構的多種形式，包括但不限于整個抗體和抗體片段。“抗體片段”包含全長抗體的一部分，優選其可變結構域，或至少其抗原結合位點。 抗體片段的示例包括雙抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。在例如 Houston, J. S. ,Methods Enzymo 1. 203(1991)46-88 中描述了 scFv 抗體。此外，抗體片段包含具有Vh結構域(即能夠與\結構域共同組裝)或結合EPO-R的\結構域(即能夠與Vh 結構域共同組裝為功能性抗原結合位點)的特征的單鏈多肽，由此提供具有特異性結合人 EPO-R特性的抗體。術語“人源化抗體”指這樣的抗體，其框架和/或“互補決定區”(CDR)被修飾以包含與親本免疫球蛋白的CDR相比不同物種的免疫球蛋白的CDR。在優選的實施方案中，將小鼠⑶R移植到人抗體的框架區以制備“人源化抗體”。見例如Riechmarm，L.等人，Nature 332(1988)323-327 ；和 Neuberger，Μ· S.等人，Nature 314(1985068-270。術語“包含SEQ ID NO 1的重鏈⑶R3區”表示抗體包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列作為其重鏈CDR3區的序列。用相同的方式表示抗體的其他5個CDR區。如此處使用的術語“結合活化的EP0-R”指抗體與人的活化EPO-R在通過蛋白質印跡測量的生化結合測定中的結合。如果抗體在ι μ g/ml抗體濃度下引起400或更高的S/ N(信號/噪音)比，則認為結合。如此處使用的術語“不結合EP0-R”指抗體與人EPO-R在通過蛋白質印跡測量的生化結合測定中的結合。如果抗體在1 μ g/ml抗體濃度下引起低于 400的S/N(信號/噪音)比，則認為不結合。在蛋白質印跡中檢測不到根據本發明的抗體與非活化EPO R的結合，因此S/N比甚至低于10和優選低于約1或更低。如此處使用的術語“ΕΡ0與EPO受體的結合”指EPO與人的活化EPO-R在通過蛋白質印跡測量的生化結合測定中的結合。如果EPO在1 μ g/ml的EPO濃度下引起不超過10 的S/N(信號/噪音)比，則認為不結合。如此處使用的術語“pW30”指對應成熟人紅細胞生成素受體的第424-437位殘基的在第430位包含磷酸酪氨酰殘基的17個氨基酸的合成肽(TPPHLKYLYLVVSD，SEQ ID NO
25)。如此處使用的術語“pW61”指對應成熟人紅細胞生成素受體的第455-471位殘基的在第461位包含磷酸酪氨酰殘基的17個氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO:
26)。如此處使用的術語“pW65”指對應成熟人紅細胞生成素受體的第455-471位殘基的在第465位包含磷酸酪氨酰殘基的17個氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO: 26)。根據本發明的抗體的特征在于在0. 1 μ g/ml的抗體濃度下在ELISA中以10或更高的S/N比特異性結合pY430，pY461或pY465。如此處使用的術語“可變結構域”(輕鏈的可變結構域(VJ，重鏈的可變結構域 (Vh))表示輕鏈和重鏈結構域中的每對結構域，其直接參與抗體與抗原的結合。可變輕鏈和重鏈結構域具有相同的大體結構，每個結構域包含4個序列高度保守的框架(FR)區，FR區通過3個“高變區”(或互補決定區，OTR)連接。框架區采用β-折疊構象，⑶R可能形成連接折疊結構的環。在每條鏈中的CDR通過框架區維持其三維結構并與來自其他鏈的 CDR共同形成抗原結合位點。抗體的重鏈和輕鏈CDR3區在根據本發明的抗體的結合特異性
5/親和力中發揮特別重要的作用，因此提供了本發明的另一個目的。如此處使用的術語“抗體的抗原結合部分”指負責抗原結合的抗體的氨基酸殘基。抗體的抗原結合部分包含來自“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基。“框架”或“FR” 區是除了如此處定義的高變區殘基以外的那些可變結構域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變區從N-到C-端包含FRl，CDRl，FR2, CDR2, FR3, CDR3和FR4結構域。特別地，重鏈的CD3 是對抗原結合貢獻最大并定義抗體性能的區域。⑶R和FR區根據Kabat等人，kquences of Proteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)的標準定義確定，和/或為來自“高變環”的那些殘基。如此處使用的術語“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優選雙鏈DNA。在本申請中使用的術語“氨基酸”表示天然存在的羧基α -氨基酸組，包含丙氨酸 (三字母編碼ala單字母編碼A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp,D), 半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，Ε)，甘氨酸(gly，G)，組氨酸(his，H)， 異亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，賴氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，Μ)，苯丙氨酸(phe， F)，脯氨酸(pro，P)，絲氨酸(ser，S)，蘇氨酸(thr，Τ)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。當將核酸置于與另一種核酸的功能性關系中時，核酸為“有效連接的”。例如，如果前序列或分泌前導DNA被表達為參與多肽分泌的前蛋白，則其與多肽DNA是有效連接的；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則其與編碼序列是有效連接的；或如果核糖體結合位點處于有助于翻譯的位置，則其與編碼序列是有效連接的。通常，“有效連接”指連接的DNA序列是共線的，在分泌前導的情況下，連接的DNA序列是連續的且依讀框的。然而， 增強子不需要是連續的。通過在方便的限制位點的連接反應完成連接。如果這樣的位點不存在，則依照傳統做法是使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。如此處使用的，表達“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用并且所有這些名稱包括子代。因此，措辭“轉化體”和“轉化細胞”包括原代對象細胞和來源于其的培養物，不考慮轉移次數。也應當理解，所有后代在DNA內容中可能不完全相同，由于無意或無意突變。也包括與篩選的原始轉化細胞具有相同功能或生物學活性的突變后代。有用的人重鏈恒定區示例包含SEQ ID NO :23的氨基酸。有用的人輕鏈恒定區示例包含SEQ ID NO 24的κ -輕鏈恒定區的氨基酸序列。本發明包含檢測或測定人細胞組織和活組織中的活化EPO-R的方法。本發明包含根據本發明的抗體在診斷人細胞組織和活組織中的活化EPO-R的用途。本發明包含根據本發明的抗體在準備用于檢測或測定人細胞組織和活組織中的活化EPO-R的診斷測定中的用途。根據本發明的抗體另外包括這樣的抗體，其具有“保守序列修飾”(變體抗體)，不影響或改變根據本發明的抗體的上述特征的核苷酸和氨基酸序列修飾。可通過本領域已知的標準技術例如定點突變和PCR介導的突變引入修飾。保守氨基酸取代包括這樣的氨基酸取代，其中氨基酸殘基被替換為具有類似側鏈的氨基酸殘基。本領域已定義了具有類似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)，無電荷極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、 蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，在人抗EPO-R抗體中的預測的非必需氨基酸殘基可優選的替換為來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基。因此此處的 “變體”抗EPO-R抗體指這樣的分子，其氨基酸序列與“親本”抗EPO-R抗體的氨基酸序列在親本抗體的一個或多個可變區具有多達10個，優選從約2至約5個添加、缺失和/或取代的差異。可通過基于 Riechmann，L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 和 Queen，C.等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033描述的分子建模突變進行氨基酸取代。優選地通過重組方法制備根據本發明的抗體。這些方法在目前的技術水平中是廣泛已知的，包含在原核和真核細胞中的蛋白質表達和之后的抗體多肽的分離以及通常純化至可藥用的純度。用于蛋白質表達，將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸通過標準方法插入表達載體。在合適的原核或真核宿主細胞例如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌細胞中進行表達，并從細胞中(從上清中或在細胞裂解以后) 回收抗體。抗體的重組制備在目前的技術水平中是熟知的并在例如Makrides， S. C. , Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse, S.等 K, Protein Expr. Purif. 8(1996) 271—282 ；Kaufman, R.J.，Mol.Biotechnol. 16(2000) 151 — 161 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 的綜述文章中描述。抗體可在整個細胞、細胞裂解物中或以部分純化的或基本純化的形式存在。通過標準技術包括堿/SDS處理、CsCl梯度離心(banding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領域熟知的其他技術進行純化以去除其他細胞成分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質。 見 Ausubel,F.,等人，ed. Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)。例如 Barnes，L. Μ.,等人，Cytotechnology 32(2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.， 等人，Biotech. Bioeng. 73(2001)261-270 描述了在 NSO 細胞中的表達。例如 Durocher, Y.，等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 描述了瞬時表達。Orlandi，R.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289 ；Norderhaug, L.，等人，J. Immunol. Methods 204(1997)77-87 描述了可變區的克隆。Schlaeger，E.-J.和 Christensen，K.，in Cytotechnology 30(1999)71-83 和 Schlaeger, E. -J.，inj. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 描述了優選的瞬時表達系統(HEK 293)。通過傳統免疫球蛋白純化程序例如蛋白質A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養基中適當地分離單克隆抗體。使用傳統程序可容易的分離和測序編碼單克隆抗體的DNA和RNA。雜交瘤細胞可作為這些DNA和RNA的來源。一旦被分離， DNA可被插入表達載體，然后將其轉染進原本不產生免疫球蛋白的宿主細胞例如HEK 293 細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞，以獲得重組單克隆抗體在宿主細胞中的合成。通過引入合適的核苷酸改變至抗體編碼DNA或通過肽合成產生人EPO-R抗體的氨基酸序列變體。可進行這些修飾，然而僅在非常有限的范圍內，例如如上述的那些。例如， 修飾不改變上述抗體的特征例如IgG同種型和表位結合，但可改進重組生產的產量、蛋白質的穩定性或易化純化。也可取代與維持抗EPO-R抗體的適當構象無關的任意半胱氨酸殘基，通常將其取代為絲氨酸以改進分子的氧化穩定性和避免異常交聯。相反地，可在抗體中加入半胱氨酸鍵以改進其穩定性(特別是當抗體為抗體片段例如Fc片段時)。通過本領域已知的多種方法制備編碼抗EPO-R抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于從天然來源(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)分離或通過以前制備的人源化抗EPO-R抗體的變體或非變體形式的寡核苷酸介導的(或定點)突變、PCR突變和盒式突變制備。根據本發明的重鏈和輕鏈可變結構域與啟動子、翻譯起點、恒定區、3’非翻譯區、 多聚腺苷酸化和轉錄終止序列組合以形成表達載體構建體。重鏈和輕鏈表達構建體可組合為單個載體，共轉染、連續轉染或分別轉染至宿主細胞，然后其融合以形成表達2種鏈的單個宿主細胞。在另一個方面，本發明提供了診斷組合物，例如用于在人細胞組織和活組織中的活化EPO-R的測定。序列描述
SEQIDNO1 1■鏈 CDR3，Mab Cl. 16. 7.5
SEQIDNO2 1■鏈 CDR2，Mab Cl. 16. 7.5
SEQIDNO3 1■鏈 CDRl，Mab Cl. 16. 7.5
SEQIDNO:4 輕鏈 CDR3，Mab Cl. 16. 7.5
SEQIDNO5 輕鏈 CDR2，Mab Cl. 16. 7.5
SEQIDNO6 輕鏈 CDRl，Mab Cl. 16. 7.5
SEQIDNO7 1■鏈可變區，Mab Cl. 167. 5
SEQIDNO8輕鏈可變區，Mab Cl. 167. 5
SEQIDNO9 1■鏈 CDR3，Mab Cl. 8. 7.16
SEQIDNO10重鏈 CDR2，Mab Cl. 8. 7.16
SEQIDNO11重鏈 CDRl，Mab Cl. 8. 7.16
SEQIDNO12輕鏈 CDR3，Mab Cl. 8. 7.16
SEQIDNO13輕鏈 CDR2，Mab Cl. 8. 7.16
SEQIDNO14輕鏈 CDRl，Mab Cl. 8. 7.16
SEQIDNO15重鏈可變區，Mab Cl. 87. 16
SEQIDNO16輕鏈可變區，Mab Cl. 87. 16
SEQIDNO17重鏈 CDR3，Mab Cl. 24.11. 31
SEQIDNO18重鏈 CDR2，Mab Cl. 24.11. 31
SEQIDNO19重鏈 CDRl，Mab Cl. 24.11. 31
SEQIDNO20輕鏈 CDR3，Mab Cl. 24.11. 31
SEQIDNO21輕鏈 CDR2，Mab Cl. 24.11. 31
SEQIDNO22輕鏈 CDRl，Mab Cl. 24.11. 31
SEQ ID NO 23 重鏈可變區，Mab Cl. 24. 11. 31SEQ ID NO 24 輕鏈可變區，Mab Cl. 24. 11. 31SEQ ID NO 25 合成肽SEQ ID NO 26 合成肽附圖簡述

圖1 人EPOR在UT_7_EP0R細胞中的時間依賴性磷酸化。使用針對磷酸化人EPOR的不同單克隆抗體染色的UT7-EP0R細胞裂解物的蛋白質印跡分析。(a) pY430(Cl. 16. 7. 5)，(b) pY461 (Cl. 8. 7. 16)，(c) pY465 (Cl. 24. 11.31)。僅在用 EPO 刺激細胞后，所有單克隆抗體特異性檢測EP0R，未刺激的細胞㈠不被抗體標記。使用GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)作為上樣對照。實施例1磷酸-特異性EPOR單克隆抗體的生成pY430 (Cl. 16. 7. 5)使用對應成熟人紅細胞生成素受體的第424-437位殘基的在第430位包含磷酸-酪氨酰殘基的17個氨基酸的合成肽(TPPHLKYLYLVVSD，SEQ ID NO :25) 作為免疫原。pY461 (Cl. 8. 7. 16)使用對應成熟人紅細胞生成素受體的第455-471位殘基的在第461位包含磷酸-酪氨酰殘基的17個氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO: 26)作為免疫原。pY465(Cl. 24. 11. 31)使用對應成熟人紅細胞生成素受體的第455-471位殘基的在第465位包含磷酸-酪氨酰殘基的17個氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO:26)作為免疫原。用于免疫，將肽通過C端半胱氨酸與KLH偶聯。用免疫原每4周免疫Balb/c小鼠 1次，免疫3次，然后在融合前4天通過靜脈注射加強免疫，收獲脾細胞并與AgS骨髓瘤細胞融合。使用肽包被的ELISA微滴定板根據標準程序通過對肽的磷酸-對非-磷酸(否則與磷酸肽相同)形式的差別檢驗完成磷酸特異性抗體的篩選。選擇抗體克隆，因為其在用 EPO刺激的細胞裂解物的蛋白質印跡中檢測到一條對應EPOR的特異條帶(實施例2)。SDS-PAGE和蛋白質印跡根據標準程序和hvitrogen的Nupage 凝膠系統進行SDS-PAGE和蛋白質印跡。 將對應5. IO4-IO5細胞的裂解物上樣至Nupage Novex 4-12% Bis-Tris凝膠的各道中。 然后將蛋白質轉移至PVDF (聚偏氟乙烯)膜上并與抗體和抗GAPDH抗體(Abeam m9484, Abeam pic Μ)孵育，室溫2小時或4°C過夜。清洗后，將膜與抗小鼠IgG-POD綴合物孵育并用 ECL試劑(Lumi-LightPLUS 蛋白質印跡底物，Roche Applied Science#2015218)顯色。根據僅特異性結合活化EPO受體且不結合非活化EPO受體選擇Cl. 24. 11. 31， Cl. 16. 7. 5 和 Cl. 8. 7. 16 抗體(圖 1)。實施例2UT-7細胞的活化UT-7細胞系是人因子-依賴性紅白血病細胞系(人骨髓急性髓細胞白血病細胞系DSMZ=ACC 137)，需要EPO用于長期生長。在另外包含L-谷氨酰胺QmM)，非必需氨基酸 (Ix)和丙酮酸鈉(ImM)(饑餓培養基)和添加10%胎牛血清和10U/ml GM-CSF的RPMI培養基中維持UT-7細胞。在與未轉導細胞05U/ml GM-CSF而不是10U/ml)相同的培養基中維持轉導細胞(UT7/EP0R)，另外加入0. 4mg/ml博來霉素(zeocine)。在每次刺激前，將細胞在添加L-谷氨酰胺OmM)，非必需氨基酸(Ix)，丙酮酸鈉(ImM)和0. 胎牛血清的RPMI 培養基中孵育過夜使其饑餓。轉導用編碼hEPOR和PVSV-G的逆轉錄病毒表達載體(編碼彈狀病毒水皰性口炎病毒G糖蛋白的表達載體)瞬間轉染的GP2493 (Clontech Laboratories, Inc)細胞上清轉導UT-7細胞。轉導后2天將培養基替換為新鮮補充的包含0. 4mg/ml博來霉素和25U/ml GM-CSF的RPMI。在選擇后得到在其表面穩定表達EPOR的UT-7細胞的細胞系。刺激血清饑餓的細胞用在饑餓培養基(補充0. 胎牛血清)中的500pM紅細胞生成素于指示的時候在37°C刺激1、3和5分鐘。刺激后離心細胞，丟棄培養基并將沉淀孵育在冰冷的裂解緩沖液[Tris 20mM(pH7. 4), NaC1137mM，甘油 10%，Nonidet P-401 %，蛋白酶抑制劑Ix (Pierce, #78410)，磷酸酶抑制劑Ix (Pierce#78420)]中，4°C 30分鐘，然后在 40C 13000rpm離心10分鐘。在還原劑存在下在樣品緩沖液(Nupage , Invitrogen)中煮沸裂解物上清或者直接用于SDS-PAGE。根據如實施例1中描述的標準程序在用對應的生物素化肽包被的微滴定板上通過ELISA檢測Mab的特異性結合。在1分鐘以內已經可顯示人EPOR的明顯活化，而未刺激的細胞沒有顯示任何可檢測的基礎水平的活化。實施例3用于Mab與EPO活化的UT-7/EP0R細胞的結合的蛋白質印跡測定如上述刺激UT7/EP0R細胞并通過蛋白質印跡分析。在蛋白質印跡中，Mab在用 0. 5nM EPO刺激1_5分鐘的細胞中識別一條麗的對應EPOR的條帶(圖1)。在1分鐘以內已經可顯示人EPOR的明顯活化，而未刺激的細胞沒有顯示任何可檢測的基礎水平的活化(圖1)。使用GAPDH作為上樣對照。因此，這些抗體特異性分析了 ESA (紅細胞生成素刺激劑)對EPOR的活化。
權利要求
1.結合EPO受體的抗體，其特征在于特異性結合在第430位包含磷酸酪氨酰殘基的TPPHLKYLYLVVSD(SEQ ID NO :25)，在第461位包含磷酸酪氨酰殘基的GLSDGPYSNPYENSLIP (SEQ ID NO 26)或在第465位包含磷酸酪氨酰殘基的 GLSDGPYSNPYENSLIP (SEQ ID NO :26) EPO 受體片段。
2.根據權利要求1的抗體，其特征在于包含SEQID NO :1、9或17的⑶R3區作為重鏈可變結構域⑶R3區。
3.根據權利要求1的抗體，其特征在于重鏈可變結構域包含SEQID NO 1的⑶R3區、 SEQ ID NO 2 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 3 的 CDRl 區，或 SEQ IDNO 9 的 CDR3 區、SEQ ID NO 10 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 11 的 CDRl 區，或 SEQ ID NO 17 的 CDR3 區，SEQ ID NO 18 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 19 的 CDRl 區。
4.根據權利要求1或2的抗體，其特征在于在重鏈可變結構域中包含SEQID N0:7和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO :8，或在重鏈可變結構域中包含SEQ ID N0:15和在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 16，或在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO :23和在輕鏈可變結構域中包含SEQ IDNO :24。
5.編碼根據權利要求3的抗體的重鏈的核酸，所述重鏈的特征在于包含SEQID NO 1 的 CDR3 區、SEQ ID NO 2 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 3 的 CDRl 區，或 SEQ ID NO 9 的 CDR3 區、SEQ ID NO :10 的 CDR2 區和 SEQ ID NO 11 的 CDRl 區，或 SEQ ID NO 17 的 CDR3 區、SEQ ID NO 18 的 CDR2 區和 SEQID NO 19 的 CDRl 區。
6.編碼根據權利要求4的抗體的重鏈的核酸，所述重鏈的特征在于包含SEQID NO 7, SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 19作為可變結構域。
7.制備包含根據權利要求1至4的抗體的診斷試劑盒的方法。
8.表達載體，其特征在于包含根據權利要求5或6的核酸。
9.原核或真核宿主細胞，其特征在于包含根據權利要求8的載體。
10.制備根據權利要求3或4的重組人或人源化抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細胞中表達根據權利要求5或6的核酸，并從所述細胞或細胞培養上清中回收所述抗體。
11.根據權利要求1至4的抗體在測定人細胞組織和活組織中的活化EPO受體中的用途。
12.根據權利要求11的用途，其特征在于樣品為人組織裂解物。
13.根據權利要求12的用途，其特征在于通過蛋白質印跡或ELISA進行測定。
14.根據權利要求1至4的抗體，用于測定人細胞組織和活組織中的活化EPO受體。
全文摘要
以特異性結合pY461，pY430或p465為特征的結合人EPO-R的抗體用于測定活化的EPO受體。
文檔編號C07K16/28GK102282174SQ201080004518
公開日2011年12月14日 申請日期2010年1月13日 優先權日2009年1月15日
發明者M·庫比斯, M·雅爾斯, N·托萊斯-納格爾, O·穆恩迪格爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司