專利名稱：一種抗Cry1c晶體蛋白兔單克隆抗體的制備方法
技術領域：
本發明涉及抗Crylc晶體蛋白抗體，尤其涉及一種抗Crylc晶體蛋白兔單克隆抗 體的制備方法。
背景技術：
自1996年，第一例轉基因食品——保鮮番茄在美國出現以來，轉基因食品的研究 與推廣得到了全世界的廣泛關注。人們對轉基因的不斷研究、吸收、推廣使得轉基因作物的 多樣性越趨豐富，同時轉基因作物的種植面積也大幅增加。據農業生物技術應用國際服務 組織(ISAAA)報道，全球共有144項轉基因項目，代表M種作物得到了世界范圍的認可，截 止到2008年，全世界已經有25個國家種植轉基因作物，同時另有30個國家允許進口轉基 因作物作為食品和種子。轉基因作物中，尤以對Bt-Cry轉基因蛋白的研究最多，Crylc蛋 白是Bt-Cry系列蛋白中的一種。目前轉基因的農作物主要有玉米、土豆、水稻、棉 花等。轉基因技術的發展與進步推動了生物學的發展，也促進了先進科學生產力的發 展。轉基因食品雖然能夠滿足人們對食品營養、產量、抗蟲性、甚至藥用價值等方面的要求， 但同時也對人類的生活帶來了一些潛在的威脅，如某些基因導入宿主之后會使食品產生毒 性，轉基因食物產生過敏原，使人產生抗藥性，食品的營養價值發生改變等。在進行轉基因 食品研究開發和商業化的同時，為了對轉基因食品的安全性給予綜合評估，使消費者能夠 快速區分轉基因食品與天然食品，建立合適的方法對轉基因食品中轉基因成分進行鑒定與 檢測，能夠促進農業轉基因生物安全管理，保障人和動物以及微生物的安全，同時能夠保護 生態環境，促進農業轉基因生物技術的進一步研究。為了對轉基因作物或者其衍生物中 Crylc蛋白進行快速的定量或定性分析，研究并得到一株抗Crylc蛋白的單克隆抗體具有 非常大的意義。兔單克隆抗體較常規的鼠單克隆抗體具有更多優點。首先，兔比鼠能識別更多免 疫抗原的表位抗原決定簇。其次，由于兔脾臟較大，可以進行更多的融合實驗，使得高通量 篩選陽性融合細胞成為可能。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種抗Crylc晶體蛋白的兔單克隆抗 體的制備方法。抗Crylc晶體蛋白的兔單克隆抗體的制備方法，的步驟如下
1)兔子免疫
將40(Γ600μβ的免疫抗原Crylc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采 用背部皮下;Γ6點注射2 3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用 15(T250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，8 10天后取無菌 脾臟，制備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數生長期的脾細胞與處于對 數生長期的骨髓瘤細胞相融合，質量百分比為48% 52%的聚乙二醇為融合劑，體積 百分比為189Γ22%的HAT作為選擇性培養基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為 0. 8 X 10_6 1. 2Χ lO—mol/L的次黃嘌呤，A是濃度為3. 5X10^4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤， T是濃度為1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷； 3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第壙12天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯免疫吸附進 行預篩，確定是否需要更換細胞培養液；第15 19天通過間接酶聯免疫吸附進行初篩，初 步確定是陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉移到M孔培養板中傳代培養一周； 第2216天通過間接酶聯免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3飛株生長狀態 最好且表達特異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存， 經重組獲得的細胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經體外培養， Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。本發明制備的抗Crylc晶體蛋白兔單克隆抗體可用于ELISA、Western Blotting 等免疫學手段對Crylc蛋白的定性或定量研究。具體的實施方式 實施例1
1)兔子免疫
將400μβ的免疫抗原Crylc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部皮 下3點注射2只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用15(T250mg的免 疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，8天后取無菌脾臟，制備 單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數生長期的脾細胞與處于對數生長期的骨 髓瘤細胞相融合，質量百分比為48%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為18%的HAT作為選 擇性培養基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為0. 8X 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃度 為3. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 4X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第8天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯免疫吸附進行預 篩，確定是否需要更換細胞培養液；第15天通過間接酶聯免疫吸附進行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉移到M孔培養板中傳代培養一周；第22天 通過間接酶聯免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3株生長狀態最好且表達特 異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存，經重組獲得的細 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經體外培養，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。經分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對Crylc蛋白的親和常數為2. 33 X ΚΛΤ1，其分子量為150KDa。實施例21)兔子免疫
將600μβ的免疫抗原Crylc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部皮 下6點注射3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用250mg的免疫抗 原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，10天后取無菌脾臟，制 備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數生長期的脾細胞與處于對數生長期的 骨髓瘤細胞相融合，質量百分比為52%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為2 的HAT作為 選擇性培養基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為1. 2X 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃 度為4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第12天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯免疫吸附進行預 篩，確定是否需要更換細胞培養液；第19天通過間接酶聯免疫吸附進行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉移到M孔培養板中傳代培養一周；第26天 通過間接酶聯免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定5株生長狀態最好且表達特 異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存，經重組獲得的細 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經體外培養，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。經分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對Crylc蛋白的親和常數為2. 45 X ΚΛΤ1，其分子量為150KDa。實施例3
1)兔子免疫
將500μβ的免疫抗原Crylc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部皮 下5點注射3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用200mg的免疫抗 原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，10天后取無菌脾臟，制 備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數生長期的脾細胞與處于對數生長期的 骨髓瘤細胞相融合，質量百分比為50%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為20%的HAT作為 選擇性培養基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為1. OX 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃 度為4. OX 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 6X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第10天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯免疫吸附進行預 篩，確定是否需要更換細胞培養液；第17天通過間接酶聯免疫吸附進行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉移到M孔培養板中傳代培養一周；第M天 通過間接酶聯免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3株生長狀態最好且表達特 異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存，經重組獲得的細 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經體外培養，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。
經分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對Crylc蛋白的親和常數為2. 40 X ΚΛΤ1，其分子量為150KDa。
權利要求
1. 一種抗CrylC晶體蛋白的兔單克隆抗體的制備方法，其特征在于它的步驟如下1)兔子免疫將40(Γ600μβ的免疫抗原Crylc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后， 采用背部皮下3飛點注射2 3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用 15(T250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；2)細胞融合選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，8 10天后取無菌 脾臟，制備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數生長期的脾細胞與處于對 數生長期的骨髓瘤細胞相融合，質量百分比為48% 52%的聚乙二醇為融合劑，體積 百分比為189Γ22%的HAT作為選擇性培養基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為 0. 8 X 10_6 1. 2Χ lO—mol/L的次黃嘌呤，A是濃度為3. 5X10^4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤， T是濃度為1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；3)雜交瘤細胞的篩選細胞融合后第壙12天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯免疫吸附進 行預篩，確定是否需要更換細胞培養液；第15 19天通過間接酶聯免疫吸附進行初篩，初 步確定是陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉移到M孔培養板中傳代培養一周； 第2216天通過間接酶聯免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3飛株生長狀態 最好且表達特異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存， 經重組獲得的細胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經體外培養， Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種抗Cry1c晶體蛋白兔單克隆抗體的制備方法。它包括高純度Cry1c晶體蛋白作為免疫抗原免疫兔子、多抗血清效價的測定、兔子B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合、以選擇性培養基進行選擇性培養，經預篩、初篩、復篩過程選擇陽性克隆子并大量擴增，構建重組載體并體外培養，分離并純化獲得單克隆抗體。本發明可用于ELISA，WesternBlotting等免疫學手段對Cry1c蛋白的定性或定量檢測。
文檔編號C07K16/18GK102120771SQ201010601130
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者倪庚, 馮勁松, 劉娜, 沈金兒, 鄭曉冬, 陸蕾 申請人:浙江大學