一種以貝殼為原料制備多肽的方法

專利名稱：一種以貝殼為原料制備多肽的方法
技術領域：
本發明涉及貝殼利用領域，特別是一種以貝殼為原料制備多肽的方法。
背景技術：
貝類是我國海水養殖的主要品種，占全國海水養殖總產量的70%以上，總產量達 1200萬噸/年，占世界總產量的60%強，居世界第一位。貝類養殖的快速發展，產生了大量貝殼廢棄物。長期以來，大量的貝殼資源未能得 到充分利用，作為廢棄物傾倒于海岸、沙灘，造成了嚴重的海岸帶污染。貝殼污染已成為沿 海地區亟待解決的環境問題，且逐年堆積所造成的環境問題越來越嚴重。貝殼處理問題成 為制約貝類養殖產業進一步發展的瓶頸之一，貝殼廢棄物的資源化開發利用勢在必行。當傳染性疾病對現有的藥品逐漸產生和發展出抗藥性時，海洋環境則提供了抗真 菌、寄生蟲、細菌和濾過性毒菌引起的疾病的新辦法。海洋藥物研究經歷近半個世紀的探索 和發展，已經獲得了許多寶貴的經驗積累和豐富的研究資料。我國有1. 8萬多公里長的海 岸線，海域面積約500萬平方公里，海洋藥用資源蘊藏十分豐富。大量的開發研究成果增強 了人們開發海洋藥物的信心，發展前景廣闊。農產品的生長過程中使用大量的殺菌劑和農藥，在加工過程中使用合成保鮮劑和 表面上光劑，這些物質中大多為具有苯環、雜環結構、有機硫結構、有機重金屬結構的有機 化合物，長期施用，在土壤及果實中殘留十分明顯。現今農藥等有害物質對蔬菜水果及其它 食物的污染已嚴重威脅到人類的生存和健康。因此，使用天然原料、開發非化學合成、可以 入口的殺菌劑、農藥、保鮮劑和表面上光劑顯得十分迫切。近年來，各種生物利用抗菌肽作為固有防御體系，用來抵御微生物侵襲的觀點得 到公認。抗菌肽是各類生物普遍表達的由10 40個氨基酸組成的小分子多肽，被稱之為 “全能性肽”，對細菌、真菌、病毒、腫瘤細胞、癌實體瘤和原蟲均有抑制或殺滅作用，具有抗 菌譜廣、熱穩定性強、分子量小及無免疫原性等特點，其殺菌機制獨特，不易產生耐藥菌，有 望開發為新一代肽類抗生素。從植物、昆蟲到人類，所有的生物都能產生抗菌肽。它作為生 物體內及時有效的、非特異性的防御屏障，具有抵抗感染的能力。抗菌肽作為一類抗菌能力強、抗菌譜廣、種類多、可供選擇范圍廣、靶菌株小易產 生抗性突變的功能肽，在醫藥、化妝、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑和動植物抗病基因 工程方面將有廣闊的應用前景。目前，貝殼研究主要集中在貝殼的化學成分、形成機理、結構特征以及仿生材料等 方面，對貝殼的藥用價值研究較少。貝殼是重要的中藥材，可以治療多種疾病，如用鮑魚殼為原料制成的石決明有平 肝明目之效，主治肝風眩暈、青盲內障等癥；烏賊的內殼可治療外傷、癲病、心臟病和胃病， 并可用來止血；文蛤殼能主治咳血、吐血，有清熱化痰的功能，能治療慢性氣管炎、淋巴結 核、胃及十二指腸潰瘍；紅螺殼可治療胃痛；硨磲殼具有鎮靜、安神、解毒的作用；以龜板為 原料制成的龜板散，是一種外用藥，治潰爛，有消炎止痛效果等。
貝殼是由納米碳酸鈣和生物大分子組成的復合礦物，典型的貝殼結構可分為角質 層、棱柱層和珍珠層。角質層位于貝殼的最外層，是硬蛋白質的一種，為碳酸鈣質晶體的沉 積提供框架，能耐酸的腐蝕。棱柱層位于珍珠層與角質層之間，淡水貝殼的棱柱層一般為文 石相，海水貝殼棱柱層中的無機相為方解石相。角質層和棱柱層只能由外套膜背面邊緣分 泌而成。珍珠層位于貝殼最里層，無機相為文石相。由外套膜的全表面分泌形成，并隨著 貝類的生長而增厚，富有光澤。貝殼雖然種類繁多，形態各異，顏色不同，但化學組成相似， 主要有占全殼95%的碳酸鈣和少量的貝殼素(又稱殼基質，是由多種有機基質形成的混合 物)。不同種類貝殼或同一種類貝殼在不同環境，不同生長期，不同殼層，其有機基質均有差 別，但都主要為蛋白質和多糖。其中的蛋白質含有人體能合成的和不能合成的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸 等，角殼蛋白經酸水解成氨基酸，大部分可參與人體酶系統的新陳代謝。碳酸鈣能與胃酸中 和，鈣離子能使血液中的蛋白纖維原形成蛋白纖維而使血液凝固，鈣離子進入人體能促進 人體細胞中ATP酶的活力，調節血液酸堿性，對人體健康十分有益，尤其能延遲衰老。珍珠 層粉在醫學上具有安神定驚、清熱益陰、明目解毒、消炎生津、止咳祛痰的功能，適用于胃及 十二指腸潰瘍、失眠、神經衰弱、肝炎、咽喉腫痛等癥，對高血壓、癲癇、風濕性心臟病等有一 定療效，現已制成六神丸、小兒回春丹、復方哮喘散等20余種成藥。珍珠層粉可以制珍珠 酒、珍珠銀耳等高級滋補品，以及珍珠美容油，珍珠香水等化妝品，另外，已有人報道用貝殼 制人體補鈣劑，以海洋貝殼為原料研制成與人體機能相溶，成左旋結構的可溶性海洋鈣，其 性能與珍珠粉相似，人體對其鈣的吸收率為64. 3%,比普通珍珠粉(吸收率為)高得
多ο大量的資料表明，貝殼中的蛋白質以富含Gly、ASX(ASp+ASn)、Glx(Glu+Gln)及 Ser為特征，不同種類及同一種類不同結構殼層中，Gly都具有較高的含量，總體有以下特 點①可溶有機質(SM)中酸性氨基酸含量較高，富含親水基團，其中尤其以方解石殼中的 Asx含量χ最高，可達40%上，文石殼層中的酸性氨基酸含量χ相對較低，但都皆為酸性的 多陰離子蛋白質，可能來自膜蛋白。②不可溶有機質(IM)與SM相比富含疏水基團，趨堿性， 其Asx+Glx含量比SM低得多，Gly、VaUAla及Lys含量χ增高，屬絲蛋白類蛋白質。由于技術上的原因直接測定蛋白質的氨基酸序列較困難，通常只能測定到20個 左右的氨基酸長度，為研究蛋白質的結構和功能帶來了很大的困難。因此只能間接地推斷。 例如Worms根據紅外光譜研究推斷SM與鈣結合后呈反平行β _片層結構，不與鈣結合時為 隨機卷曲結構。通過現代分子生物學可獲得較完整的蛋白質氨基酸序列，使人們對軟體動 物貝殼中的有機質有了更深入的了解。現代分子生物學研究表明，貝殼中的蛋白質常常是多功能的蛋白質。例如紅鮑魚 Haliotis rufescens中的光亮蛋白A的GS域具有塑性功能，使大分子具延展性，賦予珍珠 層優異的力學性能；C域(C1-Cltl)富含Cys殘基，該域通過二硫鍵可控制蛋白質分子內及分 子間的自組裝；堿性域可與其它含陰離子的大分子(如酸性SM)相互作用C端域為類蛋白 酶抑制劑的域，它可保護殼中的蛋白質組分免遭降解。方解石殼中的SM(MSP-I)中含氨基 酸殘基最多的酸性域D-I和D-2可含Ca2+，對貝殼的形成有重要意義，其堿性域和GS域可 能和光亮蛋白中的堿性域和GS域具有同樣的功能。Pictada fucata珍珠層中的珍珠蛋白 中的酸性Gly-X-Asn =Gly-X-Asn重復域(x = Asp、Asn或Glu)可結合Ca2+ ；類碳酸酐酶域(CA域)具碳酸酐酶的功能，它可催化以下反應Η20+ω2 — HCO3_+H+，即可為貝殼的形成提 供碳酸根離子。此外，合浦珠母貝Pinctada fucata珍珠層中的不溶有機質MSI60中富含的13個 聚(富)Ala域和39個富聚Gly域的結構特點和蜘蛛絲蛋白的氨基酸序列非常相似，因而具 有結晶的反平行片層結構。而同一種類的方解石層中的不溶有機質MSI30無聚(富) Ala域，但含聚Gly域，它同樣參與β-片層結構的形成。兩種蛋白質中N-端和C-端均含 Cys殘基，它可能在分子內(和分子間)形成二硫鍵，參與分子的自組裝。貽貝防衛素等抗微生物肽主要由其血細胞進行生產、儲存、分泌、轉運和抗殺菌 等活動。目前發現的防衛素大多是一類小分子量、陽離子、富含半胱氨酸、α-螺旋的、具 抗特定微生物活性的短肽。已被闡明的貽貝防衛素根據其初級結構中共有的半肽氨酸 序列，分為4類(1)貽貝防衛素(MDA和MDB)和地中海貽貝防衛素(MGD1和MGD2)⑵ Myticins(Myticin A 禾口 Myticin B) (3)Mytilins ； (4)Mytimycin。分離自食用貽貝Μ. edulis血漿的防衛素，一個被命名為貽貝防衛 A(Mytilusdefensin A，縮寫為 MDA)，另一個被命名為貽貝防衛素 B(Mytilus defensin B, 縮寫為MDB)。MDA的分子量為4314. 3Da，含37個氨基酸殘基，其中包括6個半胱氨酸殘基 (Cys-)，構成3個分子內二硫鍵。MDB的分子量為4392. 4Da,有35個氨基酸殘基，也含6個 半胱氨酸殘基。在其COOH-端可能有少數幾個額外的殘基，與MDA類似。地中海貽貝防衛素是分離自地中海貽貝(Mytilus galloprovimcialis血漿和血 細胞的防衛素或防衛素樣肽，即Mytilus galloprovimcialis defensein，縮寫為MGDs，它 分為MGDl和MGD2。MGDs是節肢動物防衛素家族的一個原始新成員。MGDl分子量為4kD， 最初由Hubert等在1996年發現自地中海貽貝的酸性無細胞血淋巴上清液，后來從血細胞 中的富細胞器的片段中也分離得到。MGDl含39個氨基酸殘基。第39位上有甘氨酸殘基，C-端酰胺化。MGDl存在于血 細胞的富含細胞器的片段中。MGD2最初分離自地中海貽貝，后來在食用貽貝中也測到MGD2 的mRNA。MGD2分子含39個氨基酸殘基及8個Cys-，與MGDl的氨基酸序列相比，有6個不
同的氨基酸殘基。1999年，Mitta等分離地中海貽貝血細胞和血漿得出一類新的富半胱氨酸的抗微 生物肽，即Myticin。它共有A、B兩個同工型。Myticin A分子量為4. 43kD (4437. 28 士 2. 46) Da,含40個殘基，包括8個半胱氨酸殘基或4個二硫鍵。Myticin B分子量為0563. 45 士 1. 32)Da，有8個半胱氨酸殘基。部分N-端序列獲得包含1個烷基半胱氨酸的7個殘基。Mytilins分子富含半朧氨酸(8個Cys-)，共34個殘基，分子量約為3877. 79Da。 Mytilins的三維結構高度束縛，一級結構中的二硫鍵的連接和半胱氨酸列陣不同于迄今已 知節肢動物、蛙、哺乳動物或植物的富半胱氨酸的抗微生物肽。Mytilins在貽貝血中的濃度約22 μ M，這是所試多數細菌的MIC。它們抗G—細菌的 活性強于抗G+細菌。Mytilin包括5個同工型，它們分別是Mytilin A、Mytilin B、Mytilin C, Mytilin D 和 Mytilin G1。Mytimvcin分離自未經病原誘導的食用貽貝血漿，分子量為6. 3KD，有32個殘基， 包括12個Cys-。Mytimycin是專抗真菌的貽貝肽，已獲得含32個殘基的NH2-端的部分序 列，它約相當于全序列的一半。在蛋白質資料庫中未搜索到與此有任何同源的肽。該肽對
5一些真菌的生長有延滯作用。此外，2005年Jung等從牡蠣鰓中得到A0D，分子量為4205. ODa,由38個氨 基酸組成，含有6個半胱氨酸，對革蘭式陽性菌Lactococcus lactis subsp. actis和 Staphylococcus aureus 的 MIC 分別是 2. 4 和 3. 0 μ g/mL,對革蘭式陰性菌 Escherichia coli D31 和 Vihrio parahemolyticus 的 MIC 是 7. 6 和 15. 0 μ g/mL。這是首次從牡蠣這種 雙殼貝類中發現抗菌肽。目前來源為貝類的抗菌多肽主要是從貝類的肉體或血液中提取的，幾乎沒有關于 來自貝類殼體的抗菌多肽的研究。貝類殼中的蛋白質的結構與抗菌多肽的結構有相似處， 如都富含丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸等氨基酸，都有折疊等結構特征。根據結構決定性 質，結合前期初步研究，發現廢棄貝殼綜合利用后的處理液具有抑制霉菌生長的功效，預示 處理液中含有抗菌物質，主要是貝殼里面提取出來的蛋白質或其降解產物。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉 淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起 對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段， 如層析、電泳等。氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色 譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用于多肽類物質的結果鑒定、 分析檢測之中。上述成熟的蛋白質、多肽的提取、分離、純化技術可供選擇。專利《多種貝殼混合燒制而成的抗菌劑、表面剝離劑及其應用》(公開號為CN 101116449A)公開了一種用多種貝殼混合燒制而成的抗菌劑、表面剝離劑，選用牡蠣、文 蛤、青蛤、九孔鮑、厚殼貽貝、北極貝和扇貝中至少兩種貝殼混合，在電爐內加熱，最終溫度 為600°C 1200°C，經過同時燒制、粉碎后得到顆粒大小為0. Ιμπι 150μπι，平均粒徑為 2 μ m 60 μ m的抗菌劑、表面剝離劑具有比現有技術更好的抑菌作用，具有去除農產品表 面殘留農藥和上光劑等作用。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種以貝殼為原料制備多肽的方法。以貝殼為原料制備多肽的方法的步驟如下1)將貝殼用清洗液清洗，常溫下或40 200°C干燥、粉碎，得到貝殼粉體；2)將貝殼粉體用堿溶液浸泡10 120小時，并用超聲波或微波處理5 300分 鐘，得到液固比為2 100ml/g的固液混合體；3)將固液混合體過濾得到過濾液；4)過濾液用有機溶劑提取、分離、純化得到多肽。所述的貝殼是厚殼貽貝殼、紫貽貝殼、珍珠貝殼、扇貝殼、蛤蜊殼、河蛘殼或犢蠣 殼。所述的清洗液是質量百比為0.1 10%的稀鹽酸、稀硫酸、稀硝酸、稀醋酸、稀乳酸或氫 氧化鈉、次氯酸鈉或過氧化氫水溶液。所述貝殼粉體的粒度為2 10000目。所述的堿溶 液是質量百比為0.1 10%的氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。所述的有機溶劑為丙酮、甘 油、乙二醇、甲醇、乙醇、乙丙醇、正丙醇、醋酐、正丁醇、甲乙酮、醋酸戊脂或醋酸乙酯。本發明的優點是操作條件溫和，工藝簡單，設備投資和能耗小；原料來源廣泛，價 格低廉；制備的產品具有較高的潛在市場價值，可廣泛應用于抗菌多肽藥物和農用殺菌劑、
6農藥、保鮮劑和表面上光劑等產品開發中，具有良好的經濟和社會效益。
具體實施例方式本發明結合以下實例作進一步的說明，但本發明的內容不僅限于實施例中所涉及 的內容。實施例1 1)將貝殼用10%稀鹽酸清洗，在常溫下干燥、粉碎至2目；2)將粉碎的貝殼粉體用0. 的氫氧化鈉溶液浸泡10小時(提取貝殼蛋白質)， 液固比為100ml/g (L/Kg)，并用超聲波處理300分鐘；3)將上述固液混合體過濾得濾液；4)過濾液用丙酮提取、分離、純化得到多肽。實施例2 1)將貝殼用0. 稀硫酸清洗干凈，而后在200°C下干燥、粉碎至10000目；2)將粉碎的貝殼粉體用10%的氫氧化鉀溶液浸泡120小時(提取貝殼蛋白質)， 液固比為2ml/g (L/Kg)，并用微波處理300分鐘；3)將上述固液混合體過濾得濾液；4)過濾液用乙醇提取、分離、純化得到多肽。實施例3 1)將貝殼用2%稀硝酸清洗干凈，而后在80°C下干燥、粉碎至100目；2)將粉碎的貝殼粉體用2%的氫氧化鉀溶液浸泡M小時(提取貝殼蛋白質)，液 固比為10ml/g (L/Kg)，并用超聲波處理60分鐘；3)將上述固液混合體過濾得濾液；4)過濾液用乙丙醇提取、分離、純化得到多肽。實施例4 1)將貝殼用3%稀硝酸清洗干凈，而后在100°C下干燥、粉碎至200目；2)將粉碎的貝殼粉體用3%的氫氧化鈉溶液浸泡48小時(提取貝殼蛋白質)，液 固比為30ml/g (L/Kg)，并用微波處理120分鐘；3)將上述固液混合體過濾得濾液；4)過濾液用正丙醇提取、分離、純化得到多肽。實施例5 1)將貝殼用5%稀醋酸清洗干凈，而后在120°C下干燥、粉碎至2000目；2)將粉碎的貝殼粉體用5%的氫氧化鉀溶液浸泡72小時(提取貝殼蛋白質)，液 固比為60ml/g (L/Kg)，并用微波處理180分鐘；3)將上述固液混合體過濾得濾液； 4)過濾液用正丁醇提取、分離、純化得到多肽。實施例6 1)將貝殼用7%的過氧化氫溶液清洗干凈，而后在160°C下干燥、粉碎至5000目；2)將粉碎的貝殼粉體用7%的氫氧化鉀溶液浸泡96小時(提取貝殼蛋白質)，液 固比為90ml/g (L/Kg)，并用超聲波處理240分鐘；
3)將上述固液混合體過濾得濾液；4)過濾液用乙二醇提取、分離、純化得到多肽。
權利要求
1.一種以貝殼為原料制備多肽的方法，其特征在于它的步驟如下1)將貝殼用清洗液清洗，常溫下或40 200°C干燥、粉碎，得到貝殼粉體；2)將貝殼粉體用堿溶液浸泡10 120小時，并用超聲波或微波處理5 300分鐘，得 到液固比為2 100ml/g的固液混合體；3)將固液混合體過濾得到過濾液；4)過濾液用有機溶劑提取、分離、純化得到多肽。
2.如權利要求1所述的一種以貝殼為原料制備多肽的方法，其特征在于所述的貝殼是 厚殼貽貝殼、紫貽貝殼、珍珠貝殼、扇貝殼、蛤蜊殼、河蛘殼或犢蠣殼。
3.如權利要求1所述的一種以貝殼為原料制備多肽的方法，其特征在于所述的清洗液 是質量百比為0.1 10%的稀鹽酸、稀硫酸、稀硝酸、稀醋酸、稀乳酸或氫氧化鈉、次氯酸鈉 或過氧化氫水溶液。
4.如權利要求1所述的一種以貝殼為原料制備多肽的方法，其特征在于所述貝殼粉體 的粒度為2 10000目。
5.如權利要求1所述的一種以貝殼為原料制備多肽的方法，其特征在于所述的堿溶液 是質量百比為0.1 10%的氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。
6.如權利要求1所述的一種以貝殼為原料制備多肽的方法，其特征在于所述的有機溶 劑為丙酮、甘油、乙二醇、甲醇、乙醇、乙丙醇、正丙醇、醋酐、正丁醇、甲乙酮、醋酸戊脂或醋 酸乙酯。
全文摘要
本發明公開了一種以貝殼為原料制備多肽的方法。它的步驟如下1)將貝殼用清洗液清洗，常溫下或40～200℃干燥、粉碎，得到貝殼粉體；2)將貝殼粉體用堿溶液浸泡10～120小時，并用超聲波或微波處理5～300分鐘，得到液固比為2～100ml/g的固液混合體；3)將固液混合體過濾得到過濾液；4)過濾液用有機溶劑提取、分離、純化得到多肽。本發明的以貝殼為原料制備多肽的方法，工藝簡單，操作條件溫和，制備的產品在抗菌多肽藥物和農用殺菌劑、農藥、保鮮劑和表面上光劑等產品開發中具有潛在的應用。
文檔編號C07K1/14GK102115487SQ201010572989
公開日2011年7月6日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者葉瑛, 夏枚生, 張路, 李海晏 申請人:浙江大學