專利名稱：一種酶溶性膠原蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種膠原蛋白的制備方法，特別是一種酶溶性膠原蛋白的制備方法。
背景技術：
膠原蛋白是動物支持結構最主要的組成部分，在人體中是皮膚、血管、骨骼、軟骨 及結締組織最主要的蛋白質。膠原蛋白是一大類蛋白質，從不同組織中分離得到的膠原蛋 白在肽鏈、氨基酸組成、物化性質、膠原蛋白構型等方面有非常顯著的差異，本發明主要針 對的是數量最豐富的I型膠原蛋白。目前我國膠原蛋白生產主以豬、牛等的皮、腱等為原料 經過提取、純化得到。現有技術中膠原蛋白的提取過程基本都是將原料經過氫氧化鈉脫除雜蛋白后直 接采用低溫長時間浸泡提取的工藝，一般以0. 5M醋酸在4°C左右浸泡72-96小時，在提取 過程中加入胃蛋白酶，然后過濾得到粗酶溶性膠原蛋白。在粗酶溶性膠原蛋白溶液中加入 Tris使其最終的濃度為0. 5M，然后再加入氯化鈉使其最終濃度為2. 5M，使膠原蛋白會不 斷的析出。再次進行冷凍離心，取其沉淀，用0. 5M醋酸將沉淀溶解，然后裝入透析袋中，用 0. 02M磷酸氫二鈉和蒸餾水分別進行透析；透析以后得到的膠原蛋白經過冷凍干燥工藝， 得到酶溶性膠原蛋白。其缺陷在于該方法成本高，制備的酶溶性膠原蛋白的熱穩定性差， 制備工藝復雜。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種工藝更為簡單、可 同時提高產品熱穩定性與得率的酶溶性膠原蛋白的制備方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種酶溶 性膠原蛋白的制備方法，其特點是，其步驟如下
(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于0-40°C用0.05-5. Omol/L的NaOH溶液浸泡1_50小時，在浸泡過程中，每隔1_5小時，換浸泡液一次，得去除 雜蛋白的原料；然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡1-50小時，再用0-30°C水清洗，得去除脂肪 的原料；
(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加0.05— lOmol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶 液作提取劑進行浸提2-72h，浸提溫度為0-40°C，同時加入原料重量的0. 05-10%的胃蛋白 酶，原料與提取劑的重量比為1 :5—100，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；
(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入 0. 5-5. 0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至7. 0-12，0-40°C靜置2_72小時，得蛋白質凝膠， 然后取蛋白質凝膠用0. 05-10mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液， 再用蒸餾水透析1-8天，冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。本發明所述的酶溶性膠原蛋白的制備方法的步驟(1)中所述的有機溶劑可以為現 有技術中可適用于本發明用于去除原料中的脂肪的有機溶劑，優選為丙酮、四氯化碳或己烷。所述的洗滌劑為常規的日用品洗滌劑，優選安利公司生產的碟新洗滌劑。本發明所采用的原料可以為水產加工過程中產生的下腳料一魚皮，如鯉魚皮、鰱 魚皮、鱈魚皮等等；所述的其它動物組織可以為豬、牛等的皮、腱等。本發明的優選技術方案是一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其特點是，其步驟如 下
(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于4-5°C用0. 5-2. Omol/L的NaOH溶液浸泡20—30小時，在浸泡過程中，每隔3_5小時，換浸泡液一次，得去 除雜蛋白的原料；然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡20-30小時，再用0-5°C水清洗，得去除脂 肪的原料；
(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加0.1-1. Omol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶 液作提取劑進行浸提48-7池，浸提溫度為3-10°C，同時加入原料重量的0. 5-2. 0%的胃蛋白 酶，原料與提取劑的重量比為1 :20—50，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；
(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入 0. 5-2. 0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至10. 0-12. 0，0_4°C靜置40-50小時，得蛋白質 凝膠，然后取蛋白質凝膠用0. 1-1. 0mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠 溶液，再用蒸餾水透析2-3天，冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。本發明所要解決的技術問題還可以通過以下的技術方案來進一步實現。以上所述 的酶溶性膠原蛋白的制備方法，其特點是取步驟(3)所制得的酶溶性膠原蛋白，重復步驟 (3)所述的提純步驟1-2次，得到進一步純化以及酶進一步鈍化的酶溶性膠原蛋白。與現有技術相比，本發明利用了胃蛋白酶對堿性條件敏感的特性，用氫氧化鈉溶 液對得到的酶溶性膠原蛋白進行處理，可以較好的提高酶溶性膠原蛋白的熱穩定性，達到 與一般不加胃蛋白酶所得膠原蛋白同樣的穩定性。本發明方法更為簡單合理，它不使用 Tris，除低了生產成本。該方法通過加入胃蛋白酶，大大提高了酶溶性膠原蛋白的得率，但 蛋白酶的存在也降低了蛋白質的熱穩定性。
圖1為用現有技術方法得到的酶溶性膠原蛋白40°C熱穩定性電泳圖。圖中1 標 準樣品，2 0 min，3 :30min，4 :lh，5 :2h, 6 :3h，7 :5h。圖2為本發明方法得到的酶溶性膠原蛋白40°C熱穩定性電泳圖。圖中1 0 min, 2 :30min,3 :lh，4 :2h，5 :3h，6 :5h。
具體實施例方式以下參照附圖，進一步描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進 一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。實施例1。一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其步驟如下
(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于0°c用0.05mol/L的 NaOH溶液浸泡1小時，在浸泡過程中，每隔1小時，換浸泡液一次，得去除雜蛋白的原料 ’然 后用洗滌劑或有機溶劑浸泡1小時，再用0°C水清洗，得去除脂肪的原料；
(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加0.05mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液作提取劑進行浸提池，浸提溫度為0°C，同時加入原料重量的0. 05%的胃蛋白酶，原料與提取 劑的重量比為1 :5，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；
(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至7. 0，0°C靜置2小時，得蛋白質凝膠，然后取蛋白質凝膠 用0. 05mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液，再用蒸餾水透析1天， 冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。實施例2。一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其步驟如下
(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于40°C用5.Omol/L的 NaOH溶液浸泡50小時，在浸泡過程中，每隔5小時，換浸泡液一次，得去除雜蛋白的原料； 然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡50小時，再用30°C水清洗，得去除脂肪的原料；
(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加lOmol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液作提 取劑進行浸提72h，浸提溫度為40°C，同時加入原料重量的10%的胃蛋白酶，原料與提取劑 的重量比為1 100，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；
(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入5.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至12，40°C靜置72小時，得蛋白質凝膠，然后取蛋白質凝 膠用lOmol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液，再用蒸餾水透析8天， 冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。實施例3。一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其步驟如下
(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于4°C用0.5mol/L的 NaOH溶液浸泡20小時，在浸泡過程中，每隔3小時，換浸泡液一次，得去除雜蛋白的原料； 然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡20小時，再用2°C水清洗，得去除脂肪的原料；
(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加0.lmol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液作提 取劑進行浸提48h，浸提溫度為3°C，同時加入原料重量的0. 5%的胃蛋白酶，原料與提取劑 的重量比為1 :20，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；
(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至10. 0，2°C靜置40小時，得蛋白質凝膠，然后取蛋白質凝 膠用0. lmol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液，再用蒸餾水透析2天， 冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。實施例4。一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其步驟如下
(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于5°C用2.0mol/L的 NaOH溶液浸泡30小時，在浸泡過程中，每隔5小時，換浸泡液一次，得去除雜蛋白的原料； 然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡30小時，再用5°C水清洗，得去除脂肪的原料；
(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加1.0mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液作提 取劑進行浸提72h，浸提溫度為10°C，同時加入原料重量的2. 0%的胃蛋白酶，原料與提取劑 的重量比為1 :50，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；
(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入2.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至12. 0，4°C靜置50小時，得蛋白質凝膠，然后取蛋白質 凝膠用1. Omol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液，再用蒸餾水透析3 天，冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。
實施例5。一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其步驟如下
(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于4°C用1.Omol/L的 NaOH溶液浸泡M小時，在浸泡過程中，每隔4小時，換浸泡液一次，得去除雜蛋白的原料； 然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡M小時，再用4°C水清洗，得去除脂肪的原料；
(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加0.5mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液作提 取劑進行浸提60h，浸提溫度為4°C，同時加入原料重量的1. 0%的胃蛋白酶，原料與提取劑 的重量比為1 :30，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；
(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至11.0，3°C靜置48小時，得蛋白質凝膠，然后取蛋白質凝 膠用0. 5mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液，再用蒸餾水透析2天， 冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。實施例6。實施例1-5任何一項所述的酶溶性膠原蛋白的制備方法的步驟(1)中 所述的有機溶劑為丙酮、四氯化碳或己烷。實施例7。實施例1-6任何一項所述的酶溶性膠原蛋白的制備方法中，取步驟(3) 所制得的酶溶性膠原蛋白，重復步驟(3)所述的提純步驟1-2次，得到進一步純化以及酶進 一步鈍化的酶溶性膠原蛋白。實施例8。參照圖1-2。鯉魚魚皮酶溶性膠原蛋白的制備方法實驗。提取工藝步驟如下
1.取新鮮鯉魚魚皮或冷凍鯉魚魚皮，同一批原料做好厚薄均勻，大小一致，原料無腐 爛、霉變的現象。2、原料預處理
2.1清洗凍結原料首先用自來水流水解凍，解凍后的原料用自來水清洗，除去原料表 面的血污、粘液、鱗片等雜質，洗滌水溫度4 V。2. 2除雜蛋白雜蛋白的去除采用NaOH溶液浸泡，堿液濃度0. 5mol/L,浸泡時間 24小時，浸泡溫度4°C，在浸泡過程中，不斷攪拌，每隔4小時，換水一次。2. 3、除脂肪采用有機溶劑丙酮4°C浸泡6小時，脫除脂肪。3、提取
3.1去除部分脂肪的原料皮按照1 :25的比例加入提取劑，提取劑為0. 5mol/L的醋酸 溶液，溫度為4°C，時間為48小時，同時加入胃蛋白酶，添加量為魚皮重量的2. 0%。3. 2、4°C過濾后，得酶溶性膠原蛋白粗提液。3. 3、向酶溶性膠原蛋白粗提液中，緩緩加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液，使其pH值 為11，然后靜置12小時，得膠原蛋白凝膠。3. 4、用提取劑0. 5mol/L的醋酸溶液溶解膠原蛋白凝膠，用蒸餾水進行透析，大約 48h ；
3. 5、將被透析蛋白質冷凍干燥，到的酶溶性膠原蛋白。將本實驗得到的酶溶性膠原蛋白進行檢測，發現其熱穩定性明顯提高，基本可以 達到不加胃蛋白酶時膠原蛋白的熱穩定性，結果參照圖1-2。電泳方法可參見文章段蕊， 張俊杰，杜修橋，姚興存，今野久仁彥鯉魚(Cyprinus carpio)魚皮、魚鱗和魚骨膠原蛋白的 性質.食品化學(112)，702-706 (英)。
權利要求
1.一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其特征在于，其步驟如下(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于0-40°C用0.05-5. Omol/L的NaOH溶液浸泡1_50小時，在浸泡過程中，每隔1_5小時，換浸泡液一次，得去除 雜蛋白的原料；然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡1-50小時，再用0-30°C水清洗，得去除脂肪 的原料；(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加0.05— lOmol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶 液作提取劑進行浸提2-72h，浸提溫度為0-40°C，同時加入原料重量的0. 05-10%的胃蛋白 酶，原料與提取劑的重量比為1 :5—100，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入 0. 5-5. 0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至7. 0-12，0-40°C靜置2_72小時，得蛋白質凝膠， 然后取蛋白質凝膠用0. 05-10mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液， 再用蒸餾水透析1-8天，冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。
2.根據權利要求1所述的酶溶性膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的 有機溶劑為丙酮、四氯化碳或己烷。
3.根據權利要求1所述的酶溶性膠原蛋白的制備方法，其特征在于，其步驟如下(1)原料處理以魚皮或者其它動物組織為原料，用水清洗后，于4-5°C用0. 5-2. 0mol/L的NaOH溶液浸泡20—30小時，在浸泡過程中，每隔3_5小時，換浸泡液一次，得去 除雜蛋白的原料；然后用洗滌劑或有機溶劑浸泡20-30小時，再用0-5°C水清洗，得去除脂 肪的原料；(2)膠原蛋白提取向處理后的原料中添加0.1-1. 0mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶 液作提取劑進行浸提48-7池，浸提溫度為3-10°C，同時加入原料重量的0. 5-2. 0%的胃蛋白 酶，原料與提取劑的重量比為1 :20—50，浸提后過濾，所得濾液為酶溶性膠原蛋白粗提液；(3)膠原蛋白純化并鈍化酶的活性在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入 0. 5-2. 0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節其pH至10. 0-12. 0，0_4°C靜置40-50小時，得蛋白質 凝膠，然后取蛋白質凝膠用0. 1-1. 0mol/L的醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠 溶液，再用蒸餾水透析2-3天，冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。
4.根據權利要求1或2或3所述的酶溶性膠原蛋白的制備方法，其特征在于取步驟 (3)所制得的酶溶性膠原蛋白，重復步驟(3)所述的提純步驟1-2次，得到進一步純化以及 酶進一步鈍化的酶溶性膠原蛋白。
全文摘要
本發明是一種酶溶性膠原蛋白的制備方法，其特征在于原料經處理去除雜蛋白和脂肪后，添加醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液作提取劑進行浸提，同時加入胃蛋白酶，浸提后過濾得酶溶性膠原蛋白粗提液；然后在攪拌條件下向酶溶性膠原蛋白粗提液中加入氫氧化鈉溶液調節其pH至7.0-12，靜置得蛋白質凝膠，然后取蛋白質凝膠用醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液溶解，得蛋白質凝膠溶液，再用蒸餾水透析，冷凍干燥，即得酶溶性膠原蛋白。本發明方法更為簡單合理，它不使用Tris，除低了生產成本。該方法不僅大大提高了酶溶性膠原蛋白的得率，也保持了蛋白質的熱穩定性。
文檔編號C07K1/14GK102146117SQ20101056110
公開日2011年8月10日 申請日期2010年11月26日 優先權日2010年11月26日
發明者張俊杰, 段蕊, 秦松, 蔡學東 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所, 淮海工學院, 連云港金水灣食品有限公司