一種抗菌蛋白及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：一種抗菌蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學和分子生物學領域，涉及抗菌蛋白，具體涉及抗菌蛋白的氨 基酸序列及其制備方法和應用。
背景技術：
抗生素人類抵御細菌感染類疾病的主要武器，在醫學發展史上發揮著重要的作 用。但隨著抗生素長期使用及濫用，導致許多細菌耐藥性增加，如臨床上耐甲氧西林金黃色 葡萄球菌(MRSA)、銅綠假單孢菌等。最近出現的“超級細菌”能夠耐受幾乎所有的抗生素， 已有多起致死病例，引起了世界性恐慌。尋找無細菌耐藥性、能夠替代抗生素的藥物迫在眉睫。抗菌蛋白是生物體經免疫誘導產生的小蛋白，有抑殺細菌、真菌、原蟲和腫瘤細胞 等多種功能。 由于抗菌蛋白主要通過破壞細胞膜機制殺死細胞，不易誘導產生耐藥菌株，容 易被降解，不在微生物體內富集，因此被認為是能夠替代抗生素的首選藥物。已有報道來自 青蛙皮的抗菌蛋白能夠對抗“超級細菌”，但對人體細胞也有潛在毒性。尋找高效、無藥物抗 性、對人體細胞無毒害的新型抗菌蛋白是目前研究的熱點。天然抗菌蛋白的含量很低，提取步驟復雜；化學合成法制備蛋白的成本很高，遠不 能滿足應用需要；抗菌蛋白對細菌有殺傷作用，不宜在原核系統中直接表達。畢赤酵母真 核表達系統是目前最為成功的外源蛋白表達系統之一，具有許多優點(1)利用受甲醇誘 導的醇氧化酶(AOXI)啟動子，可嚴格控制外源基因的表達，在胞外和胞內都可表達外源基 因；(2)畢赤酵母生長速度快，培養條件簡單，適合高密度發酵，有利于提高目的蛋白產量； (3)畢赤酵母作為真核細胞生物，可進行翻譯后的蛋白加工，使其表達的蛋白得到正確的折 疊和修飾，避免活性損失。國內外已有抗菌蛋白在畢赤酵母中成功分泌表達的報道。只要 設計出適合酵母表達的抗菌蛋白基因序列，就能通過畢赤酵母大規模生產目的蛋白，降低 生產成本，為抗菌藥物的生產提供大量原料。

發明內容
本發明的任務是提供一種抗菌蛋白，同時提供這種抗菌蛋白的制備方法和應用。實現本發明的具體方案是本發明提供的這種抗菌蛋白具有序列表中序列1或序列15所示的氨基酸序列。本發明還提供了編碼本發明抗菌蛋白的基因，該基因具有序列表中序列2所示的 核苷酸序列或依照遺傳密碼簡并性而衍生于序列2所示的核苷酸序列。本發明還提供了制備本發明抗菌蛋白的重組表達載體，該重組表達載體含有編碼 本發明抗菌蛋白的基因。進一步說，該重組表達載體是在表達載體的多克隆位點中插入了 編碼本發明抗菌蛋白的基因，在所插入的編碼本發明抗菌蛋白的基因的5’端加入了酶切位 點和甲硫氨酸密碼子，在所插入的編碼本發明抗菌蛋白的基因的3’端加入了終止密碼子和 酶切位點。制備該重組表達載體的表達載體可以是PPIC9K質粒。
表達本發明抗菌蛋白的PPIC9K重組質粒的構建方法，包括以下步驟(I)DNA聚合酶進行延伸反應反應條件為序列表中序列3所示的引物Pl和序列表中序列 4 所示的引物 Rl(10ymol/L)各 5yL，2Xpfu PCR MasterMix 10yL，94°C 變性 3min，72°C延伸 lOmin，得到 DNA 產物；(2) PCR(聚合酶鏈反應)擴增DNA片段PCR反應條件為上述步驟(1)中的DNA 產物lyL，序列表中序列5所示的引物P2(10ymol/L)和序列表中序列6所示的引物 R2(10ymol/L)各 lyL，2Xpfu PCR MasterMix 10 μ L，超純水 7 μ L，94°C 變性 3min 后，按 94°C 30sec，55°C 30sec，72°C Imin 共 30 次循環，再 72°C延伸 5min，得到擴增的 DNA 產物；(3)用上述步驟⑵的DNA產物lyL，序列表中序列7所示的引物P3(10ymOl/L) 和序列表中序列8所示的引物R3(10ymol/L)各lyL，PCR條件與上述步驟⑵相同，得到 進一步擴增的DNA產物；(4)用上述步驟(3)中的DNA產物lyL，序列表中序列9所示的引物Ρ4(10μπιΟ1/ L)和序列表中序列10所示的引物R4(10ymol/L)各1 μ L，PCR條件與上述步驟(2)相同， 合成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本發明抗菌蛋白基因的DNA產物；(5)上述步驟(4)中的DNA產物用EcoRI酶切，pPIC9K質粒用EcoRI酶切并用CIAP 堿性磷酸酶去磷酸化，電泳并回收酶切后的DNA產物和pPIC9K，經T4DNA連接酶16°C連接 4h，得到的混合溶液體系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質粒和反向插入抗 菌蛋白基因的PPIC9K重組質粒；(6)將上述步驟(5)中含有混合重組質粒的溶液體系轉化感受態大腸桿菌TOPlO 菌株，在含氨芐青霉素抗性的LB培養基上挑選單菌落，擴大培養后提取質粒；(7)用序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引 物R4，利用PCR方法篩選正向插入抗菌蛋白基因的PPIC9K重組質粒，PCR反應條件是 以IyL上述步驟(6)中的質粒作為模板，α-Factor和R4(10ymol/L)引物各lyL， 2 XPCRMasterMixlO μ L,超純水 7 μ L，94°C變性 3min，按 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C Imin 共30次循環，再72°C延伸5min ；經電泳檢測，將能擴增出約370bp片段的質粒進一步進行 EcoRI酶切鑒定；酶切后的質粒經電泳檢測，將得到約290bp酶切片段的質粒進行DNA序列 測定，在EcoRI酶切位點上正向插入了序列表中序列2的質粒，即為表達本發明抗菌蛋白的 PPIC9K重組質粒。制備本發明抗菌蛋白的方法用SalI酶切按上述方法構建的PPIC9K重組質粒，電泳回收線性化的pPIC9K重 組質粒，用電轉化法將回收的線性化的PPIC9K重組質粒轉入畢赤酵母中，將轉入了 PPIC9K 重組質粒的畢赤酵母菌株接種到適合的培養基，在適合的條件下培養誘導抗菌蛋白基因表 達，離心收集培養基上清液，經純化得到本發明抗菌蛋白。所述的用電轉化法將回收的線 性化的PPIC9K重組質粒轉入畢赤酵母中的具體方法是取100 μ L新鮮制備的畢赤酵母 GSl 15感受態細胞，加入20 μ L線性化的pPIC9K重組質粒充分混合后，1. 5KV，25 μ F，200 Ω， 電擊5ms，迅速加入Iml預冷的山梨醇混勻，取200 μ L酵母懸液涂布于匪平板，30°C培養 3-4天，挑選生長出的菌落到含有0. 25mg/mL G418的YPD培養基中進行培養，將生長出的 菌落接種到YPD液體培養基中擴大培養，離心收集菌體并重懸于蒸餾水中，超聲破碎后離 心收集上清液進行PCR鑒定，PCR反應條件為上清液1 μ L，序列表中序列9所示的引物Ρ4和序列表中序列10所示的引物R4(10ymol/L)各lyL，2XPCR Master Mix 10yL，超純 水 7μ L，94°C變性 5min，按 94°C 30sec,55°C 30sec,72°C Imin 共 30 次循環，再 72°C延伸 5min。所述的將轉入了 PPIC9K重組質粒的畢赤酵母菌株接種到適合的培養基，在適合的條 件下培養誘導抗菌蛋白基因表達，離心收集培養基上清液，經純化得到本發明抗菌蛋白的 具體方法是將轉入了 PPIC9K重組質粒的畢赤酵母菌株接種到BMGY培養基，250rpm搖床 培養24h后，更換BMMY培養基，并添加0. 5%甲醇繼續培養，此后每24h補加0. 5%甲醇誘 導抗菌蛋白基因的表達，培養72小時后，離心收集培養基上清液，80°C加熱處理20min并冷 卻，真空濃縮到1/10體積，經70%硫酸胺沉淀過夜，抽濾收集蛋白沉淀，冷凍干燥得到重組 抗菌蛋白，用0. 2mol/L鹽酸(含6mo l/L鹽酸胍)溶解該重組抗菌蛋白，再加入50mg/mL溴 化氰定向切割增加的N端融合肽段，室溫避光作用24h后，緩慢加入去離子水稀釋20倍終 止反應，用截流分子質量7000Da的透析袋透析除鹽，冷凍干燥得到本發明抗菌蛋白。本發明的抗菌蛋白對革蘭氏陽性菌有抑菌活性，對人紅細胞無溶血活性，安全性 好。本發明通過選擇適合酵母表達的優化密碼子，構建的抗菌蛋白基因能夠在畢赤酵母中 高效表達，可以實現工業化，降低生產成本。帶有組氨酸標簽抗菌蛋白能夠通過鎳柱快速純 化蛋白，簡化制備方案。本發明抗菌蛋白可用于制備抗菌藥物和消毒殺菌劑。將本發明抗 菌蛋白用于抗菌和消毒殺菌，可以克服由于濫用抗生素帶來的不良后果，達到預防和治療 感染類疾病和消毒殺菌效果，并能降低生產成本。


圖1 含有抗菌蛋白基因的DNA片段合成示意圖，圖中Pl，P2，P3，P4 上游引物； Rl，R2，R3，R4 下游引物；PCR 聚合酶鏈反應。圖2 含有抗菌蛋白基因片段的PPIC9K重組質粒構建示意圖，圖中pPIC9K 穿梭 質粒；pPIC9K重組質粒含有抗菌蛋白基因片段的酵母表達重組質粒；AOX 甲醇氧化酶基 因J4DNAligase =T4DNA連接酶；Amplr 氨芐青霉素抗性基因^MSlr :G418抗性基因。圖3 蛋白質電泳檢測在不同培養時間重組抗菌蛋白在培養基上清液和酵母菌體 中的表達量，圖中(A)酵母上清液；(B)酵母細胞沉淀。結果表明，畢赤酵母菌經甲醇誘導 12小時后，酵母菌即開始分泌分子量約IOkDa的重組抗菌蛋白到培養基上清液中，酵母菌 體內也存在大量抗菌蛋白。圖4 蛋白質電泳檢測在不同培養時間帶組氨酸標簽的重組抗菌蛋白在培養基上 清液和酵母菌體中的表達量，圖中(A)酵母上清液；(B)酵母細胞沉淀。結果表明，畢赤酵 母菌經甲醇誘導12小時后，酵母菌即開始分泌分子量約IOkDa的帶組氨酸標簽的重組抗菌 蛋白到培養基上清液中，酵母菌體內也存在大量帶組氨酸標簽的抗菌蛋白。圖5 畢赤酵母菌分泌到培養基上清液中帶組氨酸標簽的重組抗菌蛋白對枯草桿 菌的抗菌活性檢測。圖中顯示30°C培養48h后，加入IOOul無菌水的(A)孔周圍的抑菌圈 直徑為零；加入100 μ L培養基上清液的⑶孔的抑菌圈直徑約18mm，清晰；加入100 μ L氨 芐青霉素(0.5yg/yL)的(C)孔的抑菌圈直徑約18mm，但比較模糊。結果說明IOOyL酵 母培養基上清液中帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白的抑菌活性相當于50μ g氨芐青霉素的抑 菌活性，但枯草桿菌不會對帶有組氨酸標簽重組抗菌蛋白產生抗性，該蛋白的抗菌活性強 于氨芐青霉素。
具體實施例方式實施例1 合成含有抗菌蛋白基因的DNA產物根據抗菌蛋白的氨基酸序列設計基因序列(如序列表中序列2所示)，用DNA合成 儀合成四對引物序列表中序列3所示的引物Pl和序列表中序列4所示的引物R1、序列表 中序列5所示的引物P2和序列表中序列6所示的引物R2、序列表中序列7所示的引物P3 和序列表中序列8所示的引物R3、序列表中序列9所示的引物P4和序列表中序列10所示 的引物R4。引物P4引入EcoRI酶切位點(GAATTC)和蛋氨酸密碼子(ATG)，引物R4引入終 止密碼子和EcoRI酶切位點。引入蛋氨酸是為了用溴化氰定向切割以除去融合蛋白中增加 的N端融合肽段。利用四對引物合成含有本發明抗菌肽基因的DNA產物(見圖1)，具體過 程為(1)引物Pl和引物Rl用DNA聚合酶進行延伸反應。延伸反應條件為Pl和 Rl(10ymol/L)各5μ L，2Xpfu PCR MasterMix 10 μ L，94°C 變性 3min，72°C 延伸 lOmin，得 到DNA產物；(2)PCR(聚合酶鏈反應)擴增。反應條件為上述步驟(1)中的DNA產物IyLdI 物 P2 和引物R2(10ymol/L)各 lyL，2Xpfu PCR MasterMix 10 μ L，超純水 7 μ L，94°C 變 性 3min 后，按 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C Imin 共 30 次循環，再 72°C延伸 5min,得到擴增 的DNA產物；(3)用上述步驟(2)中的DNA產物lyL，引物P3和引物R3(10ymol/L)各lyL， PCR條件與上述步驟(2)相同，得到進一步擴增的DNA產物；(4)用上述步驟(3)中的DNA產物lyL，引物P4和引物R4(10ymol/L)各lyL， PCR條件與上述步驟⑵相同，合成得到含有本發明抗菌蛋白的基因的DNA產物(見序列表 中序列11)。實施例2 構建含有抗菌蛋白基因的PPIC9K重組質粒。具體過程為(1)將實施例1步驟(4)中的DNA產物用EcoRI酶切。(2) pPIC9K質粒用EcoRI酶切并用CIAP堿性磷酸酶去磷酸化。(3)電泳并回收酶切后的DNA產物和pPIC9K，用T4DNA連接酶16°C連接4h，將連 接產物轉化大腸桿菌TOPlO菌株，在含氨芐青霉素抗性的LB培養基上挑選單菌落，擴大培 養后提取質粒。(4)PCR方法篩選正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質粒。PCR反應條件是 待檢測質粒1 μ L，序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引 物 R4(10ymol/L)各 lyL，2XPCR MasterMix 10 μ L，超純水 7 μ L，94 °C 變性 3min，按 94°C 30sec，55°C 30sec，72°C Imin共30次循環，再72°C延伸5min，將得到的DNA產物進行 電泳，挑選能擴增出約370bp片段的質粒進一步進行酶切鑒定。(5)將步驟(4)中的質粒用EcoRI酶切，電泳，將能得到約290bp酶切片段的質粒 進行DNA序列測定，測序結果與序列表中序列2完全一致，得到正向插入抗菌蛋白基因的 PPIC9K重組質粒，構建過程見圖2所示。 LB培養基配方酵母提取物，5g;蛋白胨，10g;NaCl，10g;加水到IOOOmL,調整pH 到7. O。固體培養基添加瓊脂粉15g，需要時添加50mg/L氨芐青霉素。
實施例3 合成帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白基因的DNA產物。具體過程為與實施例1步驟相同，只是在步驟⑷中用序列表中序列13所示的引物R5代 替序列10所示的引物R4進行PCR擴增，得到帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白基因的DNA 產物(見序列表中序列14)，過程如圖1所示。引物R5引入編碼六個組氨酸的密碼子 (CATCACCATCACCATCAC)、終止密碼子(TAA)和 EcoRI 酶切位點(GAATTC)。實施例4 構建含有帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白PPIC9K重組質粒。具體過程為只是在步驟(1)中將實施例3得到的帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白基因的DNA產物 用EcoRI酶切，其余與實施例2步驟相同。得到正向插入帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白PPIC9K 重組質粒，構建過程見圖2所示。實施例5 制備重組抗菌蛋白。具體過程為(1)將實施例2中構建的含有抗菌蛋白基因的PPIC9K重組質粒用Mil酶切，電泳 回收線性化的PPIC9K重組質粒。(2)取100 μ L新鮮制備的畢赤酵母GS115感受態細胞，加入20 μ L線性化的 卩比91(重組質粒，充分混合后，1.51^，25 4 ，200 0，電擊5ms，迅速加入Iml預冷的山梨 醇混勻，取200 μ L涂布于匪平板，30°C培養3-4天，挑選生長出的菌落到含有0. 25mg/mL G418的YPD培養基中進行培養。(3)將生長出的菌落接種到YPD液體培養基中擴大培養，離心收集菌體并重懸于 蒸餾水中，超聲破碎后離心收集上清液進行PCR鑒定。PCR反應條件為上清液lyL，P4和 R4(10ymol/L)引物各 lyL，2XPCR Master Mix 10 μ L，超純水 7 μ L，94°C 變性 5min，按 94°C 30sec,55°C 30sec,72°C Imin 共 30 次循環，再 72°C延伸 5min，電泳檢測 PCR 產物，能 擴增出約370bp片段的樣品所對應的菌落，即是成功地將外源抗菌蛋白基因整合到酵母基 因組中的酵母菌株。(4)將步驟(3)的酵母菌株接種到BMGY培養基，250rpm搖床培養Mh后，更換BMMY 培養基，并添加0.5%甲醇繼續培養。此后每24h補加0.5%甲醇誘導抗菌蛋白基因的表達。 培養72小時后，離心收集菌體和培養基上清液，上清液80°C加熱處理20min并冷卻。(5)真空濃縮培養基上清液到1/10體積，經70%硫酸胺沉淀過夜，抽濾收集蛋白 沉淀，冷凍干燥得到重組抗菌蛋白。MM固體培養基配方無菌蒸餾水，800ml ；瓊脂粉，15g ；高壓滅菌。使用前加熱并冷 卻到 60°C，依次加入以下試劑10X YNB, IOOml ；500XB，2ml ；10XM, IOOml010XYNB配方酵母氮源堿(YNB)，34g ；硫酸銨，IOOg ；蒸餾水，IOOOml ；過濾除菌。500 XB配方生物素，20mg ；蒸餾水，IOOml ；過濾除菌。IOXM配方甲醇，5ml ；蒸餾水，95ml ；過濾除菌。YPD液體培養基配方酵母提取物，20g;蛋白胨，IOg;葡萄糖，20g;加水到 IOOOmL,固體培養基添加瓊脂粉20g。BMMY溶液配方酵母提取物，IOg ；蛋白胨P印tone，20g ；蒸餾水，700ml ；高壓滅 菌后保存。使用前加入以下試劑1M磷酸鉀緩沖液，IOOml ； 10XYNB, IOOml ；500XB,2ml ； 10XM, IOOml0BMGY溶液配方酵母提取物，IOg ；蛋白胨P印tone，20g ；蒸餾水，700ml ；高壓滅 菌后保存。使用前加入以下試劑1M磷酸鉀緩沖液，IOOml ； 10XYNB, IOOml ；500XB,2ml ；10XGY,100ml。IM 磷酸鉀緩沖液配方=K2HPO4 · 3H20，3. Olg ；KH2PO4,11. 8g ；調整 pH 至 6. 0，加水至 100ml。10 X GY溶液配方甘油，IOOml ；蒸餾水，900ml ；高壓滅菌。實施例6 制備帶有組氨酸標簽的重組抗菌蛋白。具體過程為只是在步驟(1)中將實施例4得到的帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白PPIC9K重組質 粒用MlI酶切，電泳回收線性化的帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白PPIC9K重組質粒，其余與實 施例5步驟( (3) (4) (5)相同，得到帶有組氨酸標簽的重組抗菌蛋白，如序列表中序列15 所示。實施例7 蛋白質電泳檢測在不同培養時間重組抗菌蛋白在培養基上清液和酵母 菌體中的表達量。具體過程為(1)將實施例5步驟(3)得到的酵母菌株接種到IOOmL BMGY培養基中，250rpm搖 床培養Mh。(2)離心收集菌體，并重懸到250mL含0. 5%甲醇的BMMY培養基中繼續搖床培養。 取出ImL培養液，離心收集上清液和酵母菌體，經處理后進行蛋白質電泳。(3)此后每24h補加0.5%甲醇，每隔1 取出ImL培養液，離心收集上清液和酵 母菌體，加入電泳上樣緩沖液處理后進行蛋白質電泳。電泳結果見圖3。結果表明樣品中存在大量分子量約IOkDa的重組抗菌蛋白，經甲 醇誘導12小時后，酵母菌即開始分泌重組抗菌蛋白到培養基上清液中，酵母菌體內也存在 大量抗菌蛋白。實施例8 蛋白質電泳檢測在不同培養時間帶有組氨酸標簽的重組抗菌蛋白在培 養基上清液和酵母菌體中的表達量。具體過程為只是在步驟(1)中將實施例7步驟(3)得到的酵母菌株接種到IOOmL BMGY培養 基中，250rpm搖床培養24h。其余與實施例7步驟(2) (3)相同。電泳結果見圖4。結果表明樣品中存在大量分子量約IOkDa的帶有組氨酸標簽的 重組抗菌蛋白，經甲醇誘導12小時后，酵母菌即開始分泌帶有組氨酸標簽的重組抗菌蛋白 到培養基上清液中，菌體內也存在大量帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白。實施例9 制備抗菌蛋白。具體過程為(1)用0. 2mol/L鹽酸(含6mol/L鹽酸胍)溶液溶解實施例5得到的重組抗菌蛋白。(2)加入50mg/mL溴化氰定向切割增加的N端融合肽段，室溫避光作用24h后，緩 慢加入去離子水稀釋20倍終止反應。(3)將步驟(2)得到的溶液裝入截流分子質量7000Da的透析袋，透析除鹽，冷凍干 燥得到抗菌蛋白。(4)將步驟(3)得到的抗菌蛋白進行蛋白質電泳，并電轉到PVDF膜上，用化學測序 法測定抗菌蛋白的全部氨基酸序列，結果與序列表中序列1所示的氨基酸序列完全相同。實施例10 制備高純度的帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白。具體過程為實施例6得到的帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白溶于lOmmol/L咪唑溶液，經鎳柱純 化，收集150mmol/L咪唑溶液的洗脫峰，透析脫鹽并凍干，得到高純度的帶組氨酸標簽的重組抗菌蛋白。實施例11 抗菌蛋白的最低抑菌濃度(MIC)檢測。具體過程為將細菌或真菌搖床培養到對數生長期，再調整菌體濃度為IO4CfuAiL作為待測菌 液。抗菌蛋白用無菌水配制成lmmol/L母液，取適量抗菌蛋白母液到不同的待測菌液中達 到不同的終濃度，37°C培養Mh，用分光光度計檢測菌液在600nm的光吸收值。對照組用 無菌水代替抗菌蛋白溶液。最低抑菌濃度(MIC)即是能抑制細菌生長的最低抗菌蛋白濃 度。供試菌株為革蘭氏陽性菌如蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)、金黃色葡 萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)；革蘭氏陰性菌如大腸 桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；真菌如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) ,{[x^if^fij (Candida albicans)。結果表明，抗菌蛋白的抗菌譜為對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，對革蘭 氏陰性菌和釀酒酵母、假絲酵母無抑菌活性。具體的最低抑菌濃度為枯草桿菌(MIC 0. 4ymol/L)、蘇云金芽胞桿菌(MIC 0. 8ymol/L)、金黃色葡萄球菌(MIC 13. 3ymol/L) 實施例12 帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白的最低抑菌濃度(MIC)檢測。具體過程 為將實施例10中得到的高純度的帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白按實施例9的方法檢 測最低抑菌濃度，結果表明，它和抗菌蛋白的抗菌譜和最低抑菌濃度相同。實施例13 帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白的溶血活性測定。具體過程為收集健康人血液lmL，1500rpm，4°C離心lOmin，棄上清液，血細胞用0. OlM磷酸鹽 緩沖液(PBQ洗三次后，按10%體積比重懸。將實施例10中得到的帶有組氨酸標簽的抗菌 蛋白用PBS溶解成母液，取適量添加到紅細胞懸液中達到不同的終濃度，37°C孵育lh。樣品 4000rpm離心5min，用分光光度計檢測上清液在567nm的光吸收值(A#)。負對照中用PBS 代替抗菌蛋白溶液測得Ail，正對照用0.2% Ttiton X-100代替抗菌蛋白溶液測得A1,樣品 溶血率=(A樣-A負)/(A正-A負)X100%。溶血實驗結果表明，20 μ mol/L帶有組氨酸標簽的 抗菌蛋白對人紅細胞的溶血率為1.四％，5 μ mol/L帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白對人紅細 胞的溶血率為0. 5%，表明該抗菌蛋白對人的紅細胞無明顯的溶血活性，具有藥物開發的可 行性。實施例14 對比分泌帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白的酵母的培養基上清液和氨芐 青霉素對枯草桿菌的抑菌活性。具體過程為(1)采用抑菌圈法測定樣品的抗菌活性，具體方法是接種枯草桿菌到50mL液體 LB培養基中，37°C，150rpm搖瓶培養16小時，得到對數生長期的細菌懸液。加熱融化LB固 體培養基，冷卻到55-60°C，每IOmL培養基中加入20 μ L細菌懸液，快速混勻后倒入培養皿 冷卻，制備成含菌固體培養基，用打孔器打出直徑IOmm的上樣孔，每個孔內加入待測樣品 30-100 μ L，待溶液充分吸收后，37°C倒置培養12-1 ，測定抑菌圈直徑。抑菌圈越大、越清 晰，說明樣品的抗菌活性越強。(2)取實施方案6步驟中經甲醇誘導培養72小時的酵母菌培養液，離心收集 培養基上清液，80°C加熱處理20min并冷卻。(3)分別取100 μ L步驟⑵的培養基上清液和100 μ L 0. 5 μ g/ μ L的氨芐青霉 素(共含有50 μ g氨芐青霉素)溶液添加到含有枯草桿菌的固體培養基平板的上樣孔中，30°C培養。24h后兩者都能形成約18mm的清晰抑菌圈，但培養4 后，氨芐青霉素形成的抑菌 圈變模糊，但培養基上清液形成的抑菌圈依然清晰，見圖5。結果說明100yL酵母培養基 上清液中帶有組氨酸標簽的抗菌蛋白的抑菌活性相當于50 μ g氨芐青霉素的抑菌活性，但 枯草桿菌不會對帶有組氨酸標簽重組抗菌蛋白產生抗性，該蛋白的抗菌活性強于氨芐青霉素。實施例15 用帶有組氨酸標簽的重組抗菌蛋白制備抗菌消毒劑和抗菌漱口水等 外用藥物。具體過程為(1)將實施例10得到的帶組氨酸標簽的重組抗菌蛋白分裝、加蓋、包裝。(2)制備溶媒將下列各組份混合，充分溶解，超濾除菌，分裝、加蓋、包裝。(3)抗菌消毒劑按以下配方(重量百分比)制備丙三醇，1. 0 ；氮酮，0. 2 ；海藻糖， 2. 0 ；透明質酸，0. 05 ；生理鹽水，加至100. 0。(4)抗菌漱口水按以下配方(重量百分比)制備丙三醇，10.0 ；薄荷香精，Ippm; 生理鹽水，加至100.0。(5)將混合制得的水溶液單獨保存，使用時由使用者抽取小量，注入含有帶組氨酸 標簽的抗菌蛋白凍干粉的另一無菌容器中，達到2%的抗菌蛋白終濃度。待帶組氨酸標簽的 抗菌蛋白充分溶解后，該溶液用于皮膚外用或漱口。實施例16 含抗菌蛋白的畢赤酵母飼料添加劑制備。具體過程為按照實施例5和實施例6的(1) (2) (3) (4)步驟，離心收集表達重組抗菌蛋白的畢 赤酵母菌作為飼料添加劑。將此酵母按0. (即0. Ig酵母/kg飼料)的劑量混入飼料中
飼喂動物。
以下為序列表，各序列分別為
序列1為抗菌蛋白的氨基酸序列；
序列2為編碼序列1的抗菌蛋白基因的核苷酸序列；
序列3為引物Pl的核苷酸序列；
序列4為引物Rl的核苷酸序列；
序列5為引物P2的核苷酸序列；
序列6為引物R2的核苷酸序列；
序列7為引物P3的核苷酸序列；
序列8為引物R3的核苷酸序列；
序列9為引物P4的核苷酸序列；
序列10為引物R4的核苷酸序列；
序列11為含有序列2的DNA的核苷酸序列；
序列12為引物α -Factor的核苷酸序列；
序列13為引物R5的核苷酸序列；
序列14為含有序列2和組氨酸標簽的DNA的核苷酸序列；
序列15為含有序列1和組氨酸標簽的重組抗菌蛋白的氨基酸序列。
序列表
<110>華中科技大學0113]<120> 一種抗菌蛋白及其制備方法和應用0114]<130>/0115]<160>120116]<170>PatentIn version 3.30117]<210>10118]<211>840119]<212>PRT0120]<213>人工0121]<400>10122]Ser Gln Leu GlyAsp LeuGly SerGly Ala Gly LysGly Gly Gly Gly0123]1510150124]Gly Gly Ser IleArg GluAla GlyGly Ala Phe GlyLys Leu Glu Ala0125]2025300126]Ala Arg Glu GluGlu TyrPhe TyrArg Lys Gln LysGlu Gln Leu Glu0127]3540450128]Arg Leu Lys AsnAsp Glnlie HisGln Ala Glu PheHis His Gln Gln0129]5055600130]lie Lys Glu HisGlu GluAla IleGln Arg His LysLys Phe Leu Glu0131]657075800132]AsnLeu ThrLys0133]840134]<210>20135]<211>2520136]<212>DNA0137]<213>人工0138]<400>20139]tctcaattgggtgatttggg ttctggtgctggtaagggtg gtggtggtgg tggttcaatt600140]agagaagctggtggtgcttt tggtaaattggaagctgcta gagaagaaga atacttttac1200141]agaaagcaaaaggaacaatt ggaaagattgaagaacgacc aaattcacca agctgaattt1800142]catcatcaacaaattaagga acatgaagaagctattcaaa gacataagaa gttcttggag2400143]aacttgactaag2520144]<210>30145]<211>590146]<212>DNA0147]<213>人工0148]<400>30149]tggtaaattggaagctgcta gagaagaagaatacttttac agaaagcaaa aggaacaat590150]<210>40151]<211>590152]<212>DNA
0153]<213> 人工
0154]<400>4
0155]attcagcttg gtgaatttgg tcgttcttca atctttccaa ttgttccttt tgctttctg 59
0156]<210>5
0157]<211>59
0158]<212>DNA
0159]<213> 人工
0160]<400>5
0161]tggtggtggt ggttcaatta gagaagctgg tggtgctttt ggtaaattgg aagctgcta 59
0162]<210>6
0163]<211>59
0164]<212>DNA
0165]<213> 人工
0166]<400>6
0167]gaatagcttc ttcatgttcc ttaatttgtt gatgatgaaa ttcagcttgg tgaatttgg 59
0168]<210>7
0169]<211>59
0170]<212>DNA
0171]<213> 人工
0172]<400>7
0173]tcaattgggt gatttgggtt ctggtgctgg taagggtggt ggtggtggtg gttcaatta 59
0174]<210>8
0175]<211>56
0176]<212>DNA
0177]<213> 人工
0178]<400>8
0179]acttagtcaa gttctccaag aacttcttat gtctttgaat agcttcttca tgttcc56
0180]<210>9
0181]<211>33
0182]<212>DNA
0183]<213> 人工
0184]<400>9
0185]aagaattcat gtctcaattg ggtgatttgg gtt33
0186]<210>10
0187]<211>30
0188]<212>DNA
0189]<213> 人工
0190]<400>100191]ttgaattcttacttagtcaagttctccaag300192]<210>110193]<211>2740194]<212>DNA0195]<213>人工0196]<400>110197]aagaattcatgtctcaattgggtgatttgggttctggtgctggtaagggtggtggtggtg600198]gtggttcaattagagaagctggtggtgcttttggtaaattggaagctgctagagaagaag1200199]aatacttttacagaaagcaaaaggaacaattggaaagattgaagaacgaccaaattcacc1800200]aagctgaatttcatcatcaacaaattaaggaacatgaagaagctattcaaagacataaga2400201]agttcttggagaacttgactaagtaagaattcaa2740202]<210>120203]<211>210204]<212>DNA0205]<213>人工0206]<400>120207]tactattgccagcattgctgC210208]<210>130209]<211>480210]<212>DNA0211]<213>人工0212]<400>130213]ttgaattcttagtgatggtgatggtgatgcttagtcaagttctccaag480214]<210>140215]<211>2920216]<212>DNA0217]<213>人工0218]<400>140219]aagaattcatgtctcaattgggtgatttgggttctggtgctggtaagggtggtggtggtg600220]gtggttcaattagagaagctggtggtgcttttggtaaattggaagctgctagagaagaag1200221]aatacttttacagaaagcaaaaggaacaattggaaagattgaagaacgaccaaattcacc1800222]aagctgaatttcatcatcaacaaattaaggaacatgaagaagctattcaaagacataaga2400223]agttcttggagaacttgact aagcatcacc atcaccatca ctaagaattc aa2920224]<210>150225]<211>900226]<212>PRT0227]<213>人工0228]<400>15
Ser Gln Leu Gly Asp Leu Gly Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly151015Gly Gly Gly Ser lie Arg Glu Ala Gly Gly Ala Phe Gly Lys Leu202530Glu Ala Ala Arg Glu Glu Glu Tyr Phe Tyr Arg Lys Gln Lys Gl354045u Gln Leu Glu Arg Leu Lys Asn Asp Gln lie His Gln Ala Glu Phe505560His His Gln Gln lie Lys Glu His Glu Glu Ala lie Gln Arg His657075Lys Lys Phe Leu Glu Asn Leu Thr Lys His His His His His His808590
權利要求
1.一種抗菌蛋白，具有序列表中序列1或序列15所示的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述的抗菌蛋白的基因，具有序列表中序列2所示的核苷酸序列或 依照遺傳密碼簡并性而衍生于序列2所示的核苷酸序列。
3.—種重組表達載體，其特征在于，含有權利要求2所述的編碼權利要求1所述的抗菌 蛋白的基因。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，它是在表達載體的多克隆位點 中插入了權利要求2所述的基因，在所插入的權利要求2所述基因的5’端加入了酶切位點 和甲硫氨酸密碼子，在所插入的權利要求2所述基因的3’端加入了終止密碼子和酶切位點ο
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述的表達載體是pPIC9K質粒。
6.表達權利要求1所述抗菌蛋白的PPIC9K重組質粒的構建方法，包括以下步驟(1)DNA聚合酶進行延伸反應反應條件為序列表中序列3所示的引物Pl和序列表中 序列 4 所示的引物Rl(10ymol/L)各 5yL，2Xpfu PCR MasterMix 10 μ L，94°C 變性 3min， 72°C延伸lOmin，得到DNA產物；(2)PCR(聚合酶鏈反應)擴增DNA片段PCR反應條件為上述步驟(1)中的DNA 產物lyL，序列表中序列5所示的引物P2(10ymol/L)和序列表中序列6所示的引物 R2(10ymol/L)各 lyL，2Xpfu PCR MasterMix 10 μ L，超純水 7 μ L，94°C 變性 3min 后，按 94°C 30sec，55°C 30sec，72°C Imin 共 30 次循環，再 72°C延伸 5min，得到擴增的 DNA 產物；(3)用上述步驟O)的DNA產物lyL，序列表中序列7所示的引物P3(10ymol/L)和 序列表中序列8所示的引物R3(10ymol/L)各lyL，PCR條件與上述步驟(2)相同，得到進 一步擴增的DNA產物；(4)用上述步驟(3)中的DNA產物lyL，序列表中序列9所示的引物P4(10ymol/L) 和序列表中序列10所示的引物R4(10ymol/L)各1 μ L，PCR條件與上述步驟(2)相同，合 成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本發明抗菌蛋白基因的DNA產物；(5)上述步驟(4)中的DNA產物用EcoRI酶切，pPIC9K質粒用EcoRI酶切并用CIAP堿 性磷酸酶去磷酸化，電泳并回收酶切后的DNA產物和pPIC9K，經T4DNA連接酶16°C連接4h， 得到的混合溶液體系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的PPIC9K重組質粒和反向插入抗菌 蛋白基因的PPIC9K重組質粒；(6)將上述步驟( 中含有混合重組質粒的溶液體系轉化感受態大腸桿菌TOPlO菌株， 在含氨芐青霉素抗性的LB培養基上挑選單菌落，擴大培養后提取質粒；(7)用序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引物 R4，利用PCR方法篩選正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質粒，PCR反應條件是 以IyL上述步驟(6)中的質粒作為模板，a-i^actor和R4(10ymol/L)引物各lyL， 2 XPCRMasterMixlO μ L,超純水 7 μ L，94°C變性 3min，按 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C Imin 共30次循環，再72°C延伸5min ；經電泳檢測，將能擴增出約370bp片段的質粒進一步進行 EcoRI酶切鑒定；酶切后的質粒經電泳檢測，將得到約290bp酶切片段的質粒進行DNA序列 測定，在EcoRI酶切位點上正向插入了序列表中序列2的質粒，即為表達本發明抗菌蛋白的 PPIC9K重組質粒。
7.一種制備權利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于用Mil酶切以權利要求6所述方法構建的PPIC9K重組質粒，電泳回收線性化的PPIC9K重組質粒，用電轉化法將回 收的線性化的PPIC9K重組質粒轉入畢赤酵母中，將轉入了 PPIC9K重組質粒的畢赤酵母菌 株接種到適合的培養基，在適合的條件下培養誘導抗菌蛋白基因表達，離心收集培養基上 清液，經純化得到本發明抗菌蛋白。
8.根據權利要求7所述的制備權利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于，所述的 用電轉化法將回收的線性化的PPIC9K重組質粒轉入畢赤酵母中的具體方法是取100 μ L 新鮮制備的畢赤酵母GS115感受態細胞，加入20 μ L線性化的pPIC9K重組質粒充分混合 后，1. 5KV, 25 μ F，200 Ω，電擊5ms，迅速加入Iml預冷的山梨醇混勻，取200 μ L酵母懸液涂 布于匪平板，30°C培養3-4天，挑選生長出的菌落到含有0. 25mg/mL G418的YPD培養基中 進行培養，將生長出的菌落接種到YPD液體培養基中擴大培養，離心收集菌體并重懸于蒸 餾水中，超聲破碎后離心收集上清液進行PCR鑒定，PCR反應條件為上清液1 μ L，序列表中 序歹丨J 9所示的引物Ρ4和序列表中序歹Ij 10所示的引物R4 (10 μ mol/L)各1 μ L，2 X PCRMaster Mix 1(^1^，超純水7 4 1^，941變性51^11，按941 30sec，55°C 30sec，72°C Imin 共 30 次循 環，再72°C延伸5min。
9.根據權利要求7所述的制備權利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于，所述的 將轉入了 PPIC9K重組質粒的畢赤酵母菌株接種到適合的培養基，在適合的條件下培養誘 導抗菌蛋白基因表達，離心收集培養基上清液，經純化得到本發明抗菌蛋白的具體方法是 將轉入了 PPIC9K重組質粒的畢赤酵母菌株接種到BMGY培養基，250rpm搖床培養24h后， 更換BMMY培養基，并添加0. 5%甲醇繼續培養，此后每24h補加0. 5%甲醇誘導抗菌蛋白基 因的表達，培養72小時后，離心收集培養基上清液，80°C加熱處理20min并冷卻，真空濃縮 到1/10體積，經70%硫酸胺沉淀過夜，抽濾收集蛋白沉淀，冷凍干燥得到重組抗菌蛋白，用 0. 2mol/L鹽酸(含6mol/L鹽酸胍)溶解該重組抗菌蛋白，再加入50mg/mL溴化氰定向切割 增加的N端融合肽段，室溫避光作用24h后，緩慢加入去離子水稀釋20倍終止反應，用截流 分子質量7000Da的透析袋透析除鹽，冷凍干燥得到本發明抗菌蛋白。
10.根據權利要求4或5所述的重組表達載體，其特征在于，在所插入的權利要求2所 述基因的3’端與所加入的終止密碼子之間增加了序列表中序列14所示的編碼六個組氨酸 的密碼子。
11.權利要求1所述抗菌蛋白在制備消毒殺菌劑中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種抗菌蛋白和編碼該抗菌蛋白的基因，同時提供了這種抗菌蛋白的制備方法和應用。本發明抗菌蛋白對革蘭氏陽性菌有抑菌活性，對人紅細胞無溶血活性，安全性好。本發明通過選擇適合酵母表達的優化密碼子，構建的抗菌蛋白基因能夠在畢赤酵母中高效表達，可以實現工業化，降低生產成本。帶有組氨酸標簽抗菌蛋白能夠通過鎳柱快速純化蛋白，簡化制備方案。本發明抗菌蛋白可用于制備抗菌藥物和消毒殺菌劑。將本發明抗菌蛋白用于抗菌和消毒殺菌，可以克服由于濫用抗生素帶來的不良后果，達到預防和治療感染類疾病和消毒殺菌效果，并能降低生產成本。
文檔編號C07K14/00GK102079778SQ20101055801
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月24日 優先權日2010年11月24日
發明者陸婕 申請人:華中科技大學