專利名稱：使用TGF-β的基因治療的制作方法
使用TGF-β的基因治療本申請是2000年5月3日提交的CN 00807074. 1，題為“使用TGF-β的基因治療” 的分案申請。
背景技術：
1.發明領域本發明涉及將編碼轉化生長因子β超家族成員的至少一種基因引入至少一種哺 乳動物結締組織中，用于哺乳動物宿主中結締組織再生的方法。本發明還涉及一種結締組 織細胞系，它攜帶一種DNA載體分子，該載體含有編碼轉化生長因子β超家族成員的基因。2.相關領域的簡述在矯形外科領域，變性關節炎或骨關節炎是最常見的伴有軟骨損傷的疾病。幾乎 機體的每個關節，如膝、髖、肩、甚至是腕都會患。該疾病的發病機理是透明關節軟骨的變性 (Mankin等，J.Bone Joint Surg, 52A =460-466,1982) 關節的透明軟骨變形、形成原纖維， 最終凹陷。如果變性的軟骨能以某種方式再生，大多數病人將能重新享受生活，而沒有令人 虛弱的疼痛。迄今尚未報道過能再生損傷透明軟骨的方法。藥物遞送的傳統途徑(如口服、靜脈內或肌肉內給藥)對于將藥物攜帶到關節是 無效的。關節內注射藥物的半衰期通常較短。關節內注射藥物的另一個缺點是需要頻繁重 復注射，以在關節腔獲得可接受的藥物水平，用于治療慢性病如關節炎。因為迄今的治療藥 物不能選擇性的靶向關節，必需使哺乳動物宿主接觸全身性高濃度的藥物，來實現持續的、 關節內治療劑量。而非靶器官接觸高濃度的藥物加重了抗關節炎藥物產生嚴重副作用(如 哺乳動物宿主的胃腸道不適、和血液學、心血管、肝腎系統的變化)的傾向。在矯形外科領域，已考慮將一些細胞因子作為治療矯形外科疾病的候選藥物。認 為骨形態發生蛋白質是骨形成的有效刺激劑(Ozkaynak等，EMBO J，9 =2085-2093,1990 ； Sampath和 Rueger,Complication in Ortho，101-107，1994)，并已報道TGF-β 可作為骨發 生和軟骨形成的刺激劑(Joyce 等，J Cell Biology, 110 =2195-2207,1990) 0認為轉化生長因子- β (TGF- β )是一種多功能細胞因子(Sporn和Roberts， Nature (London)，332 =217-219,1988)，并在細胞生長、分化和胞外基質蛋白合成中起調節 作用(Madri 等，J Cell Biology, 106 1375-1384，1988)。TGF-β 在體外抑制表皮細胞和 成骨樣細胞的生長(Chenu等，Proc. Natl. Acad. Sci，85 :5683_5687，1988)，但它在體內刺 激軟骨內骨化和最終形成骨(Critchlow 等，Bone，521-527，1995 ；Lind 等，A Orthop Scand 64(5) :553-556，1993 ；和 Matsumoto 等，In vivo, 8 :215_220，1994)。TGF-β 誘導的骨 形成是通過它對骨膜下多能細胞的刺激所介導的，這些細胞最終分化成軟骨細胞(Joyce 等，J Cell Biology,110 :2195-2207，1990 ；和 Miettinen 等，J Cell Biology,127-6 2021-2036，1994)。已報道了 TGF- β在矯形外科中的生物學作用(Andrew等，Calcif Tissue In. 52 74-78,1993 ；Borque 等，Int J Dev Biol,37 573-579,1993 ；Carrington 等，J Cell Biology，107 :1969-1975，1988 ;Lind 等，A Orthop Scand. 64(5) :553_556，1993 ；Matsumoto等，In vivo 8:215-220,1994)。在小鼠胚胎中，染色顯示TGF-β與衍生自間充 質的組織(如結締組織、軟骨和骨)緊密相關。除了胚胎學的發現外，TGF-β還存在于骨 形成和軟骨形成部位。它還能增強家兔脛骨骨折愈合。近來，報道了 TGF-β的治療價值 (Critchlow 等，Bone，521-527，1995 ；和 Lind 等，A OrthopScand 64(5) :553_556，1993)，但 其短期作用和高成本限制了廣泛的臨床應用。TGF-β關節內注射用于治療關節炎不理想，因為注射的TGF-β作用持續時間短， 因為TGF在體內降解成無活性形式。因此，需要一種長期釋放TGF-β的新方法，用于透明 軟骨再生。報道了自身移植軟骨細胞再生關節軟骨(Brittberg等，New Engl J Med 331 889-895，1994)，但該方法包括兩次廣泛切除軟組織的手術。如果關節內注射足以治療變性 關節炎，這將對病人經濟上和生理上有極大的好處。基因治療是一種將特定蛋白轉移到特定部位的方法，它可以解決這個問題(Wolff 禾口 Lederberg，Gene Therapeutics, Jon A. Wolff 編，3—25，1994 ；禾口 Jerk，JNatl Cancer Inst,89(16) :1182_1184，1997)。美國專禾Ij 5，858，355和5，766，585公開了制造一種IRAP (白細胞介素_1受體拮 抗蛋白)基因的病毒或質粒構建物；用該構建物轉染滑膜細胞(5，858，355)和骨髓細胞 (5，766，585)；和將轉染細胞注射到家兔關節中，但未公開用屬于TGF-β超家族的基因再 生結締組織。美國專利號5，846，931和5，700, 774公開了注射含有骨形態發生蛋白(BMP)(屬 于TGF β “超家族”)和截短的甲狀旁腺激素相關肽的組合物，來影響軟骨組織形成的維持 并誘導軟骨組織。然而，未公開使用BMP基因作基因治療的方法。盡管這些現有技術公開的內容，對于將編碼產物的至少一種基因在體外或體內引 入哺乳動物宿主結締組織的至少一種細胞，用于治療哺乳動物宿主的方法仍然有非常現實 和基本的需要。另外，還需要一種方法，即采用編碼轉化生長因子β超家族成員的一種基 因在哺乳動物宿主中再生結締組織。更具體說，需要一種方法，在體內宿主結締組織細胞中 表達編碼蛋白質TGF-β超家族的基因。發明簡述本發明滿足了本文上述需要。本發明提供了一種將至少一種編碼產物的基因引入 哺乳動物結締組織的至少一種細胞中，用于治療哺乳動物宿主的方法。該方法包括用重組 技術產生含有編碼該產物的基因的DNA載體分子，并將含有編碼該產物的基因的DNA載體 分子引入結締組織細胞中。該DNA載體分子可以是任何能被傳遞并在靶細胞或組織中維持 的DNA分子，從而編碼該感興趣產物的基因能穩定表達。優選用于本發明的DNA載體分子 是病毒或質粒DNA載體分子。該方法優選包括將編碼該產物的基因引入哺乳動物結締組織 的細胞，用于治療。本發明涉及一種治療關節炎的方法，包括a)產生一種重組病毒或質粒載體，該載體包含編碼蛋白質轉化生長因子超家族成 員的DNA序列，該序列與一啟動子可操縱性連接；b)用所述重組載體體外轉染培養的結締組織細胞群，得到一群轉染的結締組織細 胞；和
c)將轉染的結締組織細胞通過關節內注射移植到哺乳動物宿主的關節腔中，從而 該DNA序列在關節腔內的表達導致結締組織再生。該重組載體可以是但不限于逆轉錄病毒載體，優選逆轉錄病毒載體，載體還可以 是質粒載體。本發明的方法包括在移植前儲藏一群轉染的結締組織細胞。細胞可在移植前液氮 下儲藏在10% DMSO中。結締組織細胞包括但不限于成纖維細胞、間充質細胞、成骨細胞或軟骨細胞。成纖 維細胞可以是NIH 3T3細胞或人包皮成纖維細胞。結締組織包括但不限于軟骨、韌帶或腱。軟骨可以是透明軟骨。本發明的方法使用轉化生長因子超家族的成員，包括轉化生長因子β (TGF-β)。 轉化生長因子超家族的成員可以是TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、 ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6 或 ΒΜΡ-7。優選，TGF- β 是人或豬的 TGF- β 1、TGF- β 2 或 TGF- β 3。本發明還涉及一種透明軟骨再生的方法，包括a)產生一種重組病毒或質粒載體，該載體中包含編碼蛋白質轉化生長因子超家族 成員的DNA序列，該序列與啟動子可操縱性連接；b)用該重組載體體外轉染一群培養的結締組織細胞，得到一群轉染的結締組織細 胞；和c)通過關節內注射將轉染的結締組織細胞移植到哺乳動物宿主的關節腔中，從而 該DNA序列在關節腔內的表達導致透明軟骨再生。轉染的方法可通過脂質體包裹、磷酸鈣共沉淀、電穿孔和DEAE-葡聚糖介導等方 法進行。本發明的方法包括使用優選的質粒ρπιΤβ 1。本發明還涉及一種結締組織細胞系，它含有一種重組病毒或質粒載體，該載體含 有編碼轉化生長因子超家族成員的DNA序列。該結締組織細胞系可包括但不限于，成纖維 細胞系、間充質細胞系、軟骨細胞系、成骨細胞系或骨細胞系。成纖維細胞系可以是人包皮 成纖維細胞系或NIH 3Τ3細胞系。本發明的結締組織細胞系包含轉化生長因子超家族的成員。優選的，轉化生長 因子超家族的成員是 TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6 或 ΒΜΡ-7。更優選的，該成員是人或豬的TGF-β l、TGF-0 2或TGF-3 3。本發明的結締組織細胞系還可以含有攜帶重組載體ρπιΤβ 1的細胞。本發明的這些和其他目的將從本發明下面的描述、附圖和權利要求中獲得更全面 的了解。附圖簡述圖I-TGF- β ImRNA的表達。從NIH 3Τ3細胞或用pmT β 1 ( —種TGF- β 1表達載 體)穩定轉染的NIH 3Τ3細胞分離得到總RNA。這些細胞在鋅存在或不存在情況下生長。 用TGF-β IcDNA或β肌動蛋白cDNA作為對照探測總RNA (15毫克)。圖2A-2B-再生軟骨的大體觀察2A.在股骨踝上制造矩形部分軟骨缺損，用未經TGF-β 1轉染的NIH 3Τ3細胞注射 膝關節。該缺損沒能被覆蓋。
2B.注射NIH 3T3_TGF_i3 1細胞6周后缺損被新形成的組織覆蓋。再生組織的顏 色幾乎與周圍軟骨相同。圖3A-3D-再生軟骨的顯微鏡觀察(X 200)3A和3B.用對照細胞注射4和6周后缺損部分的蘇木精-伊紅(H&E)分析。無組 織覆蓋最初的缺損區域。3C和3D.注射TGF- β 1_轉染細胞4和6周后缺損區域的蘇木精-伊紅(Η&Ε)分 析。在4周時，注射TGF-β 1轉染的細胞后，部分缺損區域已被透明軟骨覆蓋。注射4周和 6周后，再生組織變厚，6周時其高度幾乎與正常軟骨相同。在組織學上，再生的軟骨(箭 頭)與周圍的透明軟骨相同。圖4Α-4Β-家兔關節中/TGF- β 1表達的免疫組織化學分析(χ200)。棕色(Brown)免疫過氧化物酶反應產物表明在NIH 3T3TGF_i3 1細胞中有高水平 的重組TGF-β 1表達(4Β)。4Α顯示了注射對照細胞的家兔關節中的透明軟骨。圖5Α-5Β-用Η&Ε染色(A)和safranin-O染色(B)的再生組織的顯微鏡觀察 (X200)。5A.在部分損傷區域，H&E染色(黑色箭頭)顯示了再生的透明軟骨。5B.在完全的剝離軟骨的區域，再生組織(白色箭頭)是纖維狀膠原。圖6-ρπιΤβ 1的質粒圖。圖7A-7D-注射TGF- β 1轉染細胞的家兔跟腱的總體形態學。7Α.注射對照細胞的腱。7Β.注射TGF-β 1轉染細胞的腱，注射后6周。7C.7A中的腱的橫切面圖。7D.7B中的腱的橫切面圖。圖8A-8F-H&E染色家兔跟腱中的再生組織的顯微鏡觀察。8Α、8Β和8C顯示了注射對照細胞6周的腱。8Α.放大50倍。8Β.放大200倍。 8C.放大600倍。8D、8E和8F顯示了注射TGF-β 1轉染細胞后6周的腱。8D.放大50倍。8Ε.放大 200倍。8F.放大600倍。注射入該腱的TGF-βΙ轉染細胞看來比內源性腱細胞更圓。通 過作用的自分泌和旁分泌模式產生纖維狀膠原，腱增大。注射TGF-β 1轉染細胞后腱增大。圖9Α-9Β-對用Η&Ε染色(A)和用TGF- β 1抗體免疫組織化學染色(B)的家兔跟 腱中的再生組織的顯微鏡觀察。棕色免疫過氧化物酶反應產物表明，在NIH3T3-TGF-i3 1細 胞中高水平的重組TGF-β 1表達。發明詳述本文所用的術語“病人”指動物王國的成員，包括但不限于人類。本文所用的術語“哺乳動物宿主”包括動物王國的成員，包括但不限于人類。本文所用的術語“結締組織”是連接或支持其他組織或器官的組織，包括但不限于 哺乳動物宿主的韌帶、軟骨、腱、骨和滑膜。本文所用的術語“結締組織細胞”或“結締組織的細胞”包括在結締組織中發現的 細胞，如成纖維細胞、軟骨細胞(chondrocyte)、和骨細胞(成骨細胞和骨細胞)，它們像脂
6肪細胞(adipocyte)和平滑肌細胞一樣分泌膠原性胞外基質。優選的結締組織細胞是成纖 維細胞、軟骨細胞和骨細胞。更優選的結締組織細胞是成纖維細胞。結締組織細胞還包括 間充質細胞，它們也稱為未成熟成纖維細胞。應認識到本發明可采用結締組織細胞的混合 培養物和單種類型細胞來實施。本文所用的術語“結締組織細胞系”包括起源于共同親本細胞的多種結締組織細 胞。本文所用的術語“透明軟骨”指覆蓋關節表面的結締組織。僅作為舉例，透明軟骨 包括但不限于關節軟骨、肋軟骨和鼻軟骨。具體的，已知透明軟骨是自我更新的，對變化起反應的，并使運動減少摩擦而穩 定。發現甚至在同一關節內或關節之間厚度、細胞密度、基質組成和機械性質都不同，但保 持著相同的總體結構和功能。透明軟骨的某些功能包括對壓縮驚人的剛性、彈性，和突出的 分散重量負荷的能力、最大程度減小軟骨下骨的高峰應力的能力，以及強大的耐久性。總體從組織學上說，透明軟骨看起來是能抵抗變形的一種光滑堅固表面。軟骨的 胞外基質含有軟骨細胞，但缺少血管、淋巴管和神經。維持軟骨細胞和基質之間的相互作用 的精巧而高度有序的結構起到了維持透明軟骨結構和功能的作用，同時保持著低水平的代 謝活動。0' Driscoll, J. Bone Joint Surg.，80A :1795_1812，1998 詳細描述了透明軟骨的 結構和功能，在此引入以供參考。本文所用的術語“轉化生長因子-β (TGF-β)超家族”包含了一組結構相關的 蛋白質，在胚胎發育過程中影響各式各樣的分化過程。該家族包括MUllerian抑制物質 (MIS)，它是正常雄性發育必需的(Behringer等，Nature，345 :167，1990)，果蠅十五褶 (DPP)基因產物，它是背腹軸線形成和器官芽形態發生所必需的(Padgett等，Nature，325 81-84，1987)，非洲爪蟾Vg-I基因產物，它位于卵子的植物極(Weeks等，Cell，51 =861-867, 1987)，肌動蛋白(Mason 等，Biochem, Biophys. Res. Commun.，135 :957_964，1986)，它能 誘導非洲爪蟾胚胎的中胚層和前結構的形成(Thomsen等，Cell,63 :485，1990)，和骨形 態發生蛋白(BMP’ s，如BMP-2、3、4、5、6和7，成骨素，0P-1)，它能誘導軟骨和骨從頭形成 (Sampath等，J. Biol. Chem.，265 13198，1990)。TGF-β基因產物可影響各種分化過程，包 括脂肪形成、肌生成、軟骨生成、血細胞生成和表皮細胞分化(對于綜述，見Massague，Cell 49 :437，1987)，在此引入以供參考。最初合成了作為大前體蛋白質的TGF-β家族蛋白質，然后經過在離C-端約110 =140個氨基酸的一簇堿性殘基處進行蛋白水解切割。這些蛋白質的C-端區域都是結構相 關的，不同家族成員可根據其同源性程度分成不同亞組。雖然具體亞組內的同源性范圍氨 基酸序列相同性在70% -90%之間，但亞組之間的同源性明顯低得多，通常僅20% -50%。 在各種情況下，活性種類看來是C-末端片段二硫鍵連接的二聚體。對于該家族大多數 已研究過的成員，發現同二聚體具有生物活性，但對于其他家族成員，如抑制素(Ung等， Nature，321 :779，1986)和 TGF-β (Cheifetz 等，Cell，48 :409，1987)，也已檢測到異二聚 體，這些異二聚體似乎與各個同二聚體具有不同的生物學性質。TGF- β 基因超家族的成員包括 TGF- β 3、TGF- β 2、TGF- β 4 ( )、TGF- β 1、 TGF- β 5 (非洲爪蟾)、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、果蠅 DPP、BMP-5、BMP-6、Vgrl、0P-l/BMP_7、果蠅 60A、 GDF-I、非洲爪蟾Vgf、抑制素-β Α、抑制素-β B、抑制素-α和MIS。在Massague, Ann. Rev.Biochem. 67 :753_791，1988中描述了這些基因，在此引入以供參考。優選TGF-β超家族的成員是TGF-β。更優選的成員是TGF-β 1、TGF-β 2、 TGF- β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6或ΒΜΡ-7。甚至更優選的成員是人或豬的 TGF-β。更優選的成員是人或豬TGF-i3 1、TGF-i3 2或TGF-i3 3。最優選的成員是人或豬 TGF- β 1 ο本文所用的術語“可選擇標記”包括細胞表達的基因產物，該細胞能穩定維持引入 的DNA，該DNA導致細胞表達改變的表型如形態學的轉化或酶活性。分離表達某轉染基因的 細胞可通過將第二種編碼可選擇標記的基因引入同一細胞來實現，例如引入具有能賦予對 抗生素或其他藥物抗性的酶活性的標記。選擇性標記的例子包括但不限于胸腺嘧啶激酶、 二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉移酶，它賦予對氨基糖苷抗生素(如卡那霉素、新霉素和 遺傳霉素)的抗性、潮霉素B磷酸轉移酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、CAD(—種蛋白 質，具有尿嘧啶從頭生物合成的前三種酶活性-氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉氨基甲 酰酶和二氫乳清酸酶(dihydroorotase))、腺嘌呤脫氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等， MolecularCloning, 16章，1989)，在此引入以供參考。本文所用的術語“啟動子”可以是能控制真核生物中轉錄的有活性的任何DNA序 列。啟動子可以在真核細胞或原核細胞中具有活性。優選啟動子在哺乳動物細胞中具有活 性。啟動子可以是組成型表達或可誘導的。優選的啟動子是可誘導的。優選的啟動于是可 被外源刺激誘導的。更優選的啟動子是被激素或金屬誘導的。最優選的啟動子是金屬硫蛋 白基因啟動子。類似的，可以將也能控制轉錄的“增強子元件”插入該DNA載體構建物中， 用于本發明的構建物來增強感興趣基因的表達。本文所用的術語“DC-chol”意味著一種含有陽離子膽固醇衍生物的陽離子脂質 體。“DC-chol”分子包括叔氨基，中等長度的空間臂(兩個原子)和氨基甲酰基接頭鍵(Gao 等，Biochem. Biophys. Res, Commun.，179 :280_285，1991)。本文所用的術語“SF-chol”定義為一類陽離子脂質體。本文所用的與脂質體相關的術語“生物學活性”指在靶細胞中引入功能性DNA和 /或蛋白質的能力。本文所用的與核酸、蛋白質、蛋白質片段或其衍生物有關的術語“生物學活性”指 核酸或氨基酸序列模仿野生型的核酸或蛋白質引起的已知生物學功能的能力。本文所用的術語“維持”當和脂質體傳遞一起使用時，指引入的DNA保持在細胞內 的能力。當用于其他情況時，它指靶向DNA保持在靶細胞或組織中，從而賦予治療效果的能 力。本發明公開了在體外和體內將感興趣的DNA序列傳遞到哺乳動物宿主的結締組 織細胞的技術。活體外技術涉及培養靶結締組織細胞，在體外將DNA序列、DNA載體或其他 感興趣的傳遞載體轉染入結締組織細胞，然后將修飾的結締組織細胞移植到該哺乳動物宿 主的靶關節中，從而影響該感興趣基因產物的體內表達。作為體外成纖維細胞操縱的另選方法，將編碼感興趣的產物的基因引入脂質體， 直接注射到關節區域，其中脂質體與結締組織細胞融合，導致體內基因表達屬于TGF-β超 家族的基因產物。作為體外結締組織細胞操縱的另選方法，將編碼感興趣產物的基因作為裸露DNA引入關節區域。裸露DNA進入結締組織細胞，導致體內基因表達屬于TGF-β超家族的基因產物。本說明書公開的一種治療結締組織疾病的活體外方法包括首先產生一種重組病 毒或質粒載體，它含有編碼蛋白質或其生物活性片段的DNA序列。然后用該重組載體感染 或轉染一群體外培養的結締組織細胞，得到一群含有該載體的結締組織細胞。然后將這些 結締組織細胞移植在哺乳動物宿主的靶關節腔中，影響該蛋白或蛋白片段在關節腔內的隨 后表達。該感興趣的DNA序列的表達對于減輕與結締組織疾病相關的有害關節病理變化是 有用的。本領域普通技術人員應理解，治療人類患者的細胞的優選來源是病人自己的結締 組織細胞，如自身的成纖維細胞。更具體的，作為基因，本方法包括使用一種能編碼轉化生長因子β超家族成員， 或其生物活性衍生物或其片段，和一可選擇標記或其生物活性衍生物或片段的基因。作為基因，本發明的另一個實施例包括使用能編碼至少一個轉化生長因子β超 家族的成員，或其生物活性衍生物或片段的基因，和作為DNA質粒載體，使用本領域普通技 術人員已知的、能在靶細胞或組織內，不論使用什么傳遞方法，都能在傳遞后穩定維持的任 何DNA質粒載體。一種方法是直接傳遞DNA載體分子到靶細胞或組織，不論它是病毒或質粒DNA載 體分子。作為基因，該方法還包括使用能編碼轉化生長因子β超家族成員或生物活性衍生 物或其片段的基因。本發明的另一個實施例提供了一種方法，將至少一種編碼產物的基因引入至少一 種結締組織細胞，用于治療哺乳動物宿主。本發明方法包括使用非病毒物質，將編碼該產 物的基因引入結締組織細胞。更具體的，該方法包括脂質體包裹、磷酸鈣共沉淀、電穿孔或 DEAE-葡聚糖介導，以及作為基因，包括使用能編碼轉化生長因子超家族成員或生物活性衍 生物或其片段，和一可選擇標記或生物活性衍生物或其片段的基因。本發明的另一個實施例提供了另一種方法，來將至少一個編碼產物的基因引入至 少一種結締組織細胞，用于治療哺乳動物宿主。該另一種方法包括使用能利用病毒將DNA 載體分子傳遞給靶細胞或組織的生物學方法。優選的，該病毒是一種擬病毒，其基因組已經 改變，使該擬病毒僅能傳遞并在靶細胞內穩定維持，但沒有在靶細胞或組織中復制的能力。 用重組DNA技術進一步操縱改變的病毒基因組，使病毒基因組起到DNA載體分子的作用，它 含有要在靶細胞或組織中表達的感興趣的異源基因。本發明的優選例是一種將TGF-β傳遞給靶關節腔的方法，該方法通過將TGF-β 基因用逆轉錄病毒載體和本說明書中公開的活體外技術傳遞給哺乳動物宿主的結締組織。 換言之，將編碼功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的感興趣的DNA序列亞克隆入所選的逆轉錄 病毒載體中，然后使重組的病毒載體長到足夠的滴度，用于體外感染培養的結締組織細胞， 并優選通過關節內注射將轉導的結締組織細胞移植到感興趣的關節中，優選自身移植的細 胞。本發明的另一種優選方法涉及將TGF-β超家族基因通過使用腺病毒載體、腺相 關病毒(AAV)載體或單純皰疹病毒(HSV)載體直接體內傳遞給哺乳動物結締組織。換言之， 將感興趣的編碼功能性TGF-β蛋白質或蛋白片段的DNA序列亞克隆入各病毒載體。然后使含TGF-β的病毒載體生長到足夠的滴度，優選通過關節內注射直接進入關節腔。直接在關節內注射含有感興趣基因的DNA分子導致受者結締組織細胞轉染，從而 繞過了回收、體外培養、轉染、選擇和移植含該DNA載體的成纖維細胞，以促進感興趣的異 源基因穩定表達的要求。將DNA分子遞呈給靶關節結締組織的方法包括但不限于將DNA分子包裹在陽離 子脂質體中，將感興趣的DNA序列亞克隆入逆轉錄病毒或質粒載體，或將DNA分子本身直接 注射入關節。不論DNA分子遞呈給膝關節的形式，DNA分子優選以DNA載體分子(重組病 毒DNA載體分子或重組DNA質粒載體分子)的形式遞呈。將在真核細胞中有活性的啟動子 片段插入到異源基因編碼區的直接上游，來確保感興趣的異源基因的表達。本領域普通技 術人員可利用載體構建的已知方法和技術來確保在DNA分子進入結締組織后的合適的表 達水平。在優選例中，將從膝關節回收的成纖維細胞在體外培養，然后用作基因治療的傳 遞系統。顯然申請人不限于使用已公開的特定結締組織。可能使用其他組織來源，用于體 外培養技術。使用本發明基因的方法可用于關節炎的預防或治療。應明白申請人不限于僅 治療膝關節的預防和治療用途。可能利用本發明預防性或治療性治療任何易感關節中的關 節炎。在本發明的另一個實施例中，提供了以治療有效量胃腸外給藥的一種化合物，它 含有編碼TGF-超家族蛋白的基因和合適的藥物載體。本發明的另一個實施例提供了胃腸外施給病人預防有效量的化合物，它含有編碼 TGF-超家族蛋白的基因和合適的藥物載體。本發明的另一個實施例包括本文前述的方法，包括體外將基因引入細胞。該方法 還包括然后將感染的細胞移植入哺乳動物宿主。該方法包括在有效轉染結締組織細胞后， 但在將感染細胞移植入哺乳動物宿主前，儲藏轉染的結締組織細胞。本領域技術人員應理 解感染的結締組織細胞可在液氮下凍存于10% DMSO中。本方法包括使用基本上能防止高 度易感關節炎的哺乳動物宿主中發生關節炎的方法。本發明的另一個實施例包括一種方法，將至少一種編碼產物的基因引入哺乳動物 宿主的至少一種結締組織細胞中，用于治療如前所述哺乳動物宿主，包括通過將含有編碼 該產物基因的病毒載體直接引入哺乳動物宿主，實現體內細胞的感染。優選該方法包括通 過關節內注射實現直接引入哺乳動物宿主。該方法包括使用基本上能防止在高度易感關節 炎的哺乳動物宿主發生關節炎的方法。該方法還包括將該方法用于治療患關節炎的哺乳動 物宿主。另外該方法還包括如本文前述的使用該方法修復和再生結締組織。本領域技術人員應理解，使用脂質體的病毒載體不限于如逆轉錄病毒所需的細胞 分裂的限制，來實現結締組織細胞的感染和整合。作為基因，使用如本文前述的非病毒物質 的方法，包括使用編碼屬于TGF-β超家族成員的基因和可選擇標記基因(如抗生素抗性基 因)。本發明的另一個實施例是將編碼TGF-β超家族的成員的DNA序列通過本說明書 公開的任一方法傳遞給哺乳動物宿主的結締組織，從而實現膠原的體內表達，使結締組織 (如軟骨)再生。在作為例子公開的，而不是對本發明限制的具體方法中，將含有TGF-β編碼序列
10的DNA質粒載體連接到金屬硫蛋白啟動子的下游。結締組織是治療上難于靶向的器官。本領域已知的靜脈內和口腔途徑的藥物傳遞 很難到達這些結締組織，并有使哺乳動物宿主全身性接觸治療藥物的缺點。更具體的說，已 知在關節內注射蛋白質能直接到達關節。然而，以包裹蛋白質形式注射的藥物大部分在關 節內半衰期短。本發明通過將編碼可用于治療哺乳動物宿主的蛋白質的基因引入哺乳動物 宿主的結締組織解決了這些問題。更具體說，本發明提供了一種方法，將編碼具有抗-關節 炎性質的蛋白質的哺乳動物宿主基因引入結締組織。在本發明中，應用基因治療解決了與TGF-β給藥相關的作用持續時間短和成本 高的問題。轉染細胞可在組織培養物中存活6周以上而沒有形態變化。為了確定作用的耐 久性和持續時間，將細胞注射到家兔跟腱中。如果對于體內細胞營養供應充足，該細胞可存 活足夠長的時間，并產生TGF-β，來刺激周圍的細胞。該細胞在腱內和關節內兩種環境中都 具有功能。轉染細胞的濃度是局部作用的重要因素。在先前的實驗(Joyce等，見上，1990) 中，TGF-β的劑量確定了形成的組織類型。特別是，軟骨形成與膜內骨形成的比例隨著劑 量的降低而下降。TGF-β在刺激原代成骨細胞和MC3T3細胞中還有二相性(Centrella等， Endicrinology, 119 =2306-2312,1986) 0即，根據濃度，它可以是刺激性的也可以是抑制性 的(Chenu 等，Proc. Natl. Acad. Sci，85 :5683_5687，1988)。在本文提供的實施例中，NIH 3T3-TGF-i3 1細胞以IO4UO5和IO6細胞/毫升的不同濃度刺激膠原合成。腱在IO6細胞/ 毫升的濃度下增大最多。在實施例中，用0. 3毫升IO6細胞/毫升濃度注射關節。收集注射后2-6周的標 本。關節的環境與跟腱的不同。細胞可在關節內自由移動。它們可移動到對該細胞具有特 定親和力的區域。滑膜、半月板和軟骨缺損區域是細胞粘著的可能部位。注射6周后，在部 分或完全損傷的軟骨缺損區域觀察到再生組織，但在滑膜和半月板處未觀察到。對于損傷 區域的特異親和力是臨床應用的另一個優點。如果變性關節炎可僅用關節內注射細胞而可 治愈，那么可方便的治療病人，不用大手術。注射細胞分泌的TGF-β可能以兩種方式刺激透明軟骨再生。一種是留在受傷區 域的軟骨細胞在其細胞表面產生TGF-β受體(Brand等，J Biol Chem, 270 =8274-8284, 1995 ；Cheifetz 等，Cell,48 :409_415，1987 ；Dumont 等，M CellEndo, 111 57~66,1995 ； Lopez-Casillas 等，Cell, 67 :785_795，1991 ；Miettinen 等，J Cell Biology,127 :6， 2021-2036，1994 ；和 Wrana 等，Nature，370 :341_347，1994)。這些受體可能受到粘著在損傷 區域的注射細胞分泌的TGF-β刺激。因為TGF-β在體內以潛在形式分泌(Wakwfield等， J Biol Chem，263，7646-7654，1988)，潛在的TGF-β需要激活過程。另一種方式是潛在的 TGF-β或轉染細胞分泌的TGF-β可能與TGF-β結合蛋白(LTBT)在部分損傷的軟骨層的 胞外基質上結合(Dallas 等，J Cell Biol, 131 :539_549，1995)。不論作用機制如何，透明軟骨合成的發現表明長時期的高TGF-β能刺激透明軟 骨再生。局部高濃度的該載體可能不是局部刺激的關鍵因素，但是理論上軟骨細胞可能 是最合適的將TGF-β傳遞給軟骨受損區域的載體(Brittberg等，New Engl JMed 331 889-895,1994)。膠原雙層基質是局部分布轉染細胞的另一種可能的載體(Frenkel等，J Bone J Surg(Br)79-B :831-836，1997)。
用組織學方法確定了新形成的組織性質。在H&E染色中，新形成的組織與周圍的 透明軟骨相同(圖4)。為了評估新形成組織的性質，用Safranin-O染色組織(Rosenburg， J Bone Joint Surg，53A :69_82，1971)。與白色的纖維狀膠原相反，新形成的組織染成紅 色，提示它是透明軟骨(圖5)。完全損傷區域中的細胞產生了纖維狀膠原。由于存在對TGF-β刺激的骨樣基質 屏障，周圍成骨細胞可能未被刺激。NIH 3T3-TGF-i3 1細胞不刺激周圍細胞，而是通過自分 泌刺激產生纖維狀膠原。自分泌和旁分泌激活刺激細胞的事實增加了用TGF-β 1表達構建 物穩定轉染的軟骨細胞治療變性關節炎的可能性。用TGF-β 1表達構建物穩定轉染的細胞系能在腱和膝關節內存活。該細胞系在腱 和完全損傷軟骨區域內產生纖維狀膠原。然而，該細胞系在部分損傷的關節軟骨中產生透 明軟骨。該作用的自分泌和旁分泌模式的刺激機制表明，用TGF-β超家族基因的成員進行 基因治療是一種新的治療透明軟骨損傷的方法。本發明通過轉染TGF-β 1表達構建物制備了穩定的成纖維細胞 (NIH3T3-TGF-0 1，和人包皮成纖維細胞TGF-β 1)細胞系。這些產生TGF-β的細胞在體內 長時間的維持了高濃度的活性TGF-β。要回答的關于基因治療，特別是細胞介導的基因治療的可能性的第一個問題是細 胞在體內的存活率。盡管TGF-β在體外能抑制免疫細胞，但細胞在具有高效免疫監視系統 的其他物種組織中可能不能存活。第二，應評估基因在體內表達的最佳濃度。我們將細胞 以三種不同濃度注射到家兔的跟腱中，來回答這個問題。從腱內注射的最佳濃度確定了要 用的關節內注射的濃度。第三個問題是細胞如何在關節內刺激軟骨再生。注射的細胞有兩種作用模式。一種是通過分泌TGF-β激活周圍細胞(旁分泌激 活)(Snyder，Sci Am，253 (4) :132_140，1985)，另一種是自身激活(自分泌激活)。細胞濃 度可影響這些途徑，但周圍環境可能是決定作用模式的最重要因素。關節內關節液和韌帶 內部是兩種不同的環境，它們的血液供應、營養供應和圍繞的細胞都不同。將轉染的細胞注 射到兩種不同環境中，以尋找出細胞的作用模式。該研究的整個目的是評估對矯形外科疾 病的TGF- β _介導的基因治療，并明確體內作用的模式。提供下列實施例說明本發明，而不是限制。
實施例實施例I-材料和方法質粒構建為了產生金屬硫蛋白表達構建物(ρΜ)，用基因組DNA通過聚合酶鏈式擴增在 用于擴增的寡核苷酸中構建了 XbaI和Bam HI限制性位點，產生了金屬硫蛋白I啟動子 (-660/+63)。將擴增片段亞克隆入 pBluescript(Stratagene，La Jolla, CA)的 Xba I-Bam HI位點。通過將含有TGF-β 1編碼序列和3’末端含生長激素聚腺苷酸化位點的1. 2kb Bgl II片段亞克隆入ρΜ的Bam HI-Sal I位點，產生了質粒pmT β 1。細胞培養和轉染-將TGF- β cDNA轉染入成纖維細胞(NIH 3T3-TGF- β 1)或人包 皮成纖維細胞/TGF-β 1，在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基(GIBC0-BRL， Rockville,MD)中培養。將TGF-β IcDNA序列加入具有金屬硫蛋白基因啟動子的pmT β 1載
12體中。還將新霉素抗性基因序列插入該載體。用磷酸鈣沉淀法將該載體插入所用的細胞。為了選擇具有轉染的基因序列的細 胞，將新霉素(300微克/毫升)加到培養基中。然后，選擇存活的菌落并通過Northern分 析和TGF-β 1 ELISA (R&D系統)試驗確認TGF-β 1 mRNA的表達。將具有TGF-β 1表達的 細胞儲藏在液氮中，注射前進行培養。Northern印跡分析-用異硫氰酸胍/苯酚/氯仿從細胞中分離出總RNA。在含 有0. 66M甲醛的1. 0 %瓊脂糖凝膠上電泳10微克RNA，轉移到DURAL0N-UV膜上，并與UV STRATALINKER(STRATAGENE)交聯。預雜交印跡，并在牛血清清蛋白、7% (w/v) SDS,0. 5M 磷酸鈉和ImM EDTA的溶液中65V雜交。用0. SDS、IXSSC 50°C洗滌雜交印跡20分鐘， 然后曝光底片。使RNA印跡與用于人TGF- β 1的32P-標記的cDNA探針雜交。用β -肌動 蛋白探針作樣品負荷的對照。將細胞注射入家兔-選擇重2. 0-2. 5公斤的新西蘭白兔作為動物模型。用開他敏 和roumpon麻醉后，用消毒巾覆蓋白兔。暴露跟腱，將0. 2-0. 3毫升濃度為IO4UO5和IO6細 胞/毫升的細胞注射到腱的正中部位。將硫酸鋅加到家兔飲用水中，用于表達轉染的DNA。 用跟腱實驗確定最佳濃度后，進行關節內注射。暴露膝關節，用手術刀制造部分和完全軟骨 缺損。在透明軟骨層上制造部分缺損，注意不暴露軟骨下骨。除去所有透明軟骨后暴露軟 骨下骨制造完全缺損。縫合手術傷口后，關節內注射IO6細胞/毫升濃度的細胞，在飲用水 中加入硫酸鋅。組織學檢測_收集跟腱和膝關節后，用福爾馬林固定標本，用硝酸脫鈣。將它們包 埋在石蠟塊中，切成0. 8微米厚的切片。用蘇木精_伊紅和Safranin-O染色顯微鏡觀察再 生的組織。實施例II-結果穩定的細胞系_用磷酸鈣共沉淀法(
圖1)進行了轉染。大約80%存活的細胞集 落表達轉基因mRNA。將這些選出的產生TGF-β 1的細胞在硫酸鋅溶液中培育。當細胞在 100 μ M硫酸鋅溶液中培育時，它們產生mRNA。TGF-β分泌率是約32納克/IO6細胞/24小 時。家兔關節軟骨缺損的再生-觀察了家兔跟腱以核查NIH 3T3-TGF_i3 1細胞的存活 率。在IO6細胞/毫升濃度，跟腱比其他IO4和IO5兩種濃度都要厚。造成部分和完全軟骨 缺損后，將0.3毫升IO6細胞/毫升的NIH 3T3-TGF-i3 1細胞注射到膝關節中。注射后2_6 周檢查關節。在部分損傷的軟骨中，我們發現新形成的透明軟骨；注射后兩周，透明軟骨出 現，注射后6周，軟骨缺損被透明軟骨覆蓋(圖2)。再生軟骨的厚度隨著時間過去而增厚 (圖3)。注射細胞分泌的TGF-β 1，可通過用TGF-β 1抗體免疫組織化學染色觀察到(圖 3)。用未經TGF-β 1轉染的正常成纖維細胞注射的對側關節未觀察到透明軟骨覆蓋。在部 分損傷的區域，在Safrain-O染色中再生透明軟骨呈紅色(圖4)。(新形成的軟骨深度幾 乎與缺損的深度相同)。該發現提示注射的細胞通過旁分泌作用模式激活周圍正常軟骨細 胞。完全損傷的軟骨中再生組織不是透明軟骨而是纖維狀膠原。它們的顏色在 Safrain-O染色中呈白色，而不是透明軟骨獲得的紅色(圖5)。軟骨被纖維狀組織覆蓋，意 味著僅通過自分泌模式激活這些細胞。可被TGF-β激活的周圍骨細胞看來由于存在厚的鈣化骨基質而阻擋了 TGF-β對其的刺激。注射的細胞可能由于該屏障不能刺激骨細胞。將TGF-β 1轉染的細胞注射到家兔跟腱中。這樣操作的腱顯示比對照腱總體更厚 的形態學(圖7)。對該跟腱的切片作Η&Ε染色，在顯微鏡下檢查，注入的NIH3T3-TGF-i3 1 細胞存活并在家兔的跟腱中產生纖維狀膠原(圖8)。顯微鏡檢查用TGF-β 1抗體作免疫組 織化學染色的再生的腱組織，顯示TGF-β 1在腱中的表達(圖9)。為了說明雖然已描述了本發明的具體實施例，對于本領域技術人員來說本發明的 細節顯然可作許多變化，然而這些變化不違背本發明權利要求所確定的范圍。本文引用的所有參考文獻在此弓I入以供參考。參考文獻Andrew JG, Hoyland J, Andrew SM, Freemont AJ 禾口 Marsh D 在正常骨折愈合中 通過原位雜交顯示 TGF-β 1 mRNAo Calcif Tissue Int，52 :74_78，1993。Bourque WT,Gross M和Hall BK 在骨折修復過程中四種生長因子的表達。Int J Dev Biol,37 :573_579，1993。Brand T和Schneider MD 無活性II型和I型受體TGF-β是TGF-β依賴轉錄 的優勢抑制劑。J Biol Chem，270 :8274-8284，1995。Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O 禾口 PetersonL 用自 身軟骨細胞移植治療膝關節中的深度軟骨缺損。New Engl J Med 331 :889_895，1994。Carringtong JL, Roberts AB, Flankers KC, Roche NS 禾口 Reddi AH:在軟骨內骨 發育中 TGF-β 的積聚、定位和區室化 J Cell Biology，107 :1969-1975，1988。Centrella Μ, Massague J和Canalis E 人血小板衍生的轉化生長因子-β刺激 胎鼠顱骨中的骨生長。Endocrinology, 119 :2306_2312，1986。Cheifetz S, Weatherbee JA, Tsang MLS, Anderson JK, Lucas R, MassagueJ 轉化 生長因子β系統，交叉反應配體和受體的復雜模式。Cell，48 :409-415，1987。Chenu C, Pfeilschifter J, Mundy GR 禾口 Roodman GD =TGF-β 抑制長期人骨髓培 養物中的成骨樣細胞形成。Proc. Natl. Acad. Sci，85 :5683_5687，1988。Critchlow MA, Bland YS和Ashhurst DE 外源轉化生長因子- β 2對家兔骨折愈 合上的效果。Bone，521-527，1995。Dallas SL, Miyazono K, Skerry TM, Mundy GR 和 Bonewald LF 潛在的轉化生長 因子β結合蛋白(LTBP)在潛在的TGF-β儲藏于胞外基質中和作為結構基質蛋白質的雙 重作用。J Cell Biol, 131 :539_549，1995。Dumont N，O’ Connor M和Philip A 人子宮內膜細胞上的轉化生長因子受體I 型和II型受體以及糖基化-磷酯酰肌醇錨定的TGF-β結合蛋白質的鑒定。M CellEndo, 111 -.57-66,1995。Frenkel SR, Toolan B, Menche D, Pitman MI 禾口 Pachence JM 用于軟骨修復的膠 原雙層基質軟骨細胞移植。J Bone J Surg[Br]79-B :831-836，1997。Heine UI, Munoz EF, Flanders KC, Ellingsworth LR, Peter Lam H-Y, Thomp sonNL, Roberts AB和Sporn MB:轉化生長因子-β在小鼠胚胎發育中的作用J CellBiology,105 :2861_2876，1987。Jenks S 基因治療掌握基礎，限定細節[新聞]J Natl Cancer Inst, 89 (16)1182-1184，1997。Joyce Me, Roberts AB, Sporn MB 和 Bolander ME 轉化生長因子- β 和大鼠股骨 中軟骨生成和骨生成的引發。J Cell Biology, 110 :2195-2207，1990。Lind Μ, Schumacker B, Soballe K, Keller J, Melsen F 和 Bunger 轉化生長因子 β 增強家兔脛骨的骨折愈合。A Orthop Scand,64(5) :553_556，1993。Lopez-Casillas F,Chifetz S,Doody J,Andres JL,Lane WS MAssague J =TGF-β 受體系統膜蛋白多糖成分的結構和表達。Cell，67 :785-795，1991。Madri JA，Pratt BM和Tucker AM 轉化生長因子β對子宮內膜細胞的表型調節 依賴于胞外基質的組成和結構。J Cell Biology，106 :1375-1384，1988。Mankin HJ 關節軟骨對機械損傷的反應。J Bone Joint Surg，52A :460_466， 1982。Massague, Ann. Rev. Biochem. 67 :753_791，1998。Matsumoto K, Matsunaga S, Imamura Τ, Ishidou Y, Yosida H Sakou T 骨折愈合 過程中轉化生長因子β的表達和分布，In vivo,8 =215-220,19940Miettinen PJ, Ebner R, Lopez AR 禾口 Derynck R TGF-β 誘導哺乳動物表皮細胞 轉分化成間充質細胞涉及I型受體。J Cell Biology，127-6 :2021-2036，1994。O，Driscoll, J.Bone Joint Surg.，80A :1795_1812，1998。OzkaynakΕ, Rueger DC, Drier EA, Corbett C禾口 Ridge RJ :OP-IcDNA編碼 TGF-β 家族的成骨蛋白。EMBO J,9 =2085-2093,1990oRosenburg L 關節軟骨研究中Safranin-O組織學用途的化學基礎。J BoneJoint Surg,53A :69-82，1971。Sampath TK, Rueger DC 骨生成蛋白-I (0P-1)的結構、功能和矯形手術應用。 Complications in Ortho,101—107,1994。Snyder SH 細胞之間通訊的分子基礎。Sci Am, 253 (4) 132-140，1985。Sporn MB 和 Roberts AB 肽生長因子是多功能的。Nature (London)，332 217-219. 1988。Wakefield LM, Smith DM, Flanders KC 和 Sporn MB 來自人血小板的潛在轉化生 長因子-β。J Biol chem，263，7646-7654，1988。Wolff JA 和 Lederberg J 基因轉移和治療的歷史。John A. Wolff 編。 GeneTherapeutics,3-25—1994. Birkhauser, Boston。Wrana JL, Attisano L, Wieser R, Ventura F 禾口 Massague J TGF-β 受體激活的 機制。Nature，370 :341-347，1994。
權利要求
一種軟骨細胞系的用途，所述細胞系在體外被與啟動子可操縱性連接的，編碼轉化生長因子β1的DNA序列轉染，其特征在于，所述細胞系用于制備治療關節炎或再生透明軟骨的藥物，所述細胞通過關節內注射實現直接引入哺乳動物宿主。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA序列在病毒載體中。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是逆轉錄病毒載體。
4.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是腺關聯病毒載體。
5.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是腺病毒載體。
6.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是單純皰疹病毒載體。
7.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述重組載體是質粒載體。
8.如權利要求1所述的用途，其特征在于，在移植前先儲藏所述軟骨細胞系。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述軟骨細胞系在液氮下儲藏在10%DMSO中。
10.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述轉染是通過脂質體包裹、磷酸鈣共沉 淀、電穿孔和DEAE-葡聚糖介導完成的。
11.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述啟動子是金屬硫蛋白I啟動子。
全文摘要
本發明涉及使用屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員的細胞介導的基因治療，治療矯形外科疾病。證實了TGF-β基因治療可作為變性關節炎的新療法。在將TGF-βcDNA表達載體轉染入成纖維細胞(NIH 3T3-TGF-β1)后，將該細胞注射入家兔跟腱和具有人為造成的軟骨缺損的膝關節中。進行腱內注射來確定其體內表達的最佳濃度。制造了部分缺損軟骨模型來模仿膝關節的變性關節炎。新形成的透明軟骨覆蓋了用細胞-介導的基因治療方法治療的部分軟骨缺損，表明細胞存活并在該區域內刺激基質形成。完全除去軟骨的區域被纖維狀膠原覆蓋。
文檔編號C07K14/495GK101972275SQ20101052807
公開日2011年2月16日 申請日期2000年5月3日 優先權日1999年5月3日
發明者盧文鐘, 康庚愛, 李寬熙 申請人:組織基因股份有限公司