專利名稱：利用集光多發色團的多核苷酸的檢測和分析的方法以及組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及在樣品中檢測和分析多核苷酸的方法、商品和組合物。
發明背景
允許實時和高靈敏度地檢測DNA序列的方法具有很大的科學和經濟利益ι 2’ 3。 它們的應用包括醫學診斷、遺傳突變的鑒定、基因送遞監控和特定的基因組技術4。陽離 子有機染料如溴化乙錠和噻唑橙，當插入雙鏈DNAOisDNA)的溝槽中時發射，并作為直 接的DNA雜交探針而起作用，但是缺乏序列特異性5’ 6。進行鏈特異性分析的能量/電 子傳遞發色團對存在，但需要兩種核酸的化學標記，或相同變化鏈的雙重修飾(例如分 子信標)7’8。在標記兩種DNA位點中的困難導致了低得率、高成本和單一標記的雜質， 這降低了檢測敏感性9。
本領域需要檢測和分析樣品中特定多核苷酸的方法，以及在這種方法中有用的 組合物和生產商品。
發明概述
提供檢測和分析樣品中目標多核苷酸的方法、組合物和生產的商品。
將一種懷疑含有目標多核苷酸的樣品與聚陽離子多發色團和一種同該目標多核 苷酸互補的傳感器多核苷酸相接觸。傳感器多核苷酸包含一個陰離子主鏈，如一般的磷 酸糖類主鏈，并與一種信號發色團綴合。在樣品中目標多核苷酸存在的情況下，信號發 色團能夠從激發的聚陽離子多發色團中更有效地獲得能量并發出增加的能夠檢測的光或 信號。目標多核苷酸能夠當其在樣品中出現時得到分析，或能夠在分析之前或結合分析 進行擴增。
盡管陰離子傳感器能夠與陽離子多發色團在缺少目標的情況下結合，相對于由 非互補序列混合物所產生的信號，在結合目標多核苷酸以形成雙鏈復合物之后已發現令 人驚訝的信號增強。這種信號的增強能夠用來在測試樣品中目標多核苷酸的檢測方法中 進行應用。
提供了含有對于實施本發明方法有用的試劑的溶液，以及含有這種試劑的試劑 盒。還提供了由多發色團和傳感器多核苷酸形成的傳感或檢測復合物。這些方法能夠用 于多重配置中，其中多個不同的傳感器多核苷酸用于測試多個不同的目標多核苷酸。這 些方法能夠任選在一種表面上進行，例如利用一種表面結合的聚陽離子多發色團；該表面可以是一種傳感器。這些方法還能夠以均一的形式提供。本文所述的這些方法和商品 能夠用作其它檢測多核苷酸技術的替代物。
附圖簡述
圖1描述了聚合物1和一種熒光素綴合傳感器多核苷酸的吸收(a(點狀線)和 c(短劃線))和發射(b(正方形)和d(圓圈))光譜。分別對聚合物1和傳感器多核苷酸 于380nm和480nm進行激發。于380nm激發的聚合物1和傳感器多核苷酸的能量傳遞 復合物也以黑色(e，實線)顯示。
圖2給出了傳感器系統的發射光譜，所述傳感器系統于pH = 8的lOmmol檸檬 酸鈉和IOOmm0I氯化鈉緩沖液中包含雜交的(實線)和未雜交的(點狀線)傳感器多核 苷酸。光譜相對于聚合物1的發射進行標準化。
圖3描述了由多發色團(聚合物1)的激發以及向傳感器多核苷酸的能量傳遞以 及隨后向多核苷酸特異性染料(溴化乙錠)的能量傳遞所產生的傳感器系統的發射光譜， 所述傳感器系統包含雜交的(實線)和未雜交的(點狀線)傳感器多核苷酸。測量是在 磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH = 7.40)中。見實施例4。
圖4描述了在傳感器系統中一種多核苷酸特異性染料(溴化乙錠，EB)的放大的 發射光譜，所述傳感器系統包含雜交的(實線)傳感器多核苷酸。放大的發射信號是多 發色團(聚合物1)的激發以及向傳感器多核苷酸的能量傳遞以及隨后向EB的能量傳遞的 結果。在雙鏈DNA(點狀線)中的直接的EB發射以及由傳感器多核苷酸激發以及隨后 向EB的能量傳遞所產生的發射(短劃線)證明了由聚陽離子多發色團所提供的增強的信 號。測量是在磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH = 7.40)中。見實施例5。
圖5給出了在磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH = 7.40)中EB以及雜交 的(實線)和未雜交的(點狀線)傳感器多核苷酸都存在的情況下，在聚合物1激發后EB 的發射光譜。見實施例6。發射是僅僅在雜交的雙鏈DNA的情況下由聚陽離子多發色 團向插入的EB的能量傳遞的結果。
發明詳述
目前的DNA和RNA傳感器的技術(包括“基因芯片”和“DNA芯片”)依賴于熒光標記(生光團)與DNA單鏈的共價附著，從而依賴于樣品或樣品組分的標記，具 有由樣品間標記反應效率的不同所產生的不可避免的問題，因而需要復雜的相互校準。 其它的系統依賴于多重標記的探針(例如，分子信標，Taqmaii 、Scorpion 探針、 Eclipse 探針)，從而需要生光團和猝滅劑與精確設計的序列之間的多重附著。
發明方法包括將樣品與包含至少兩種組分的水溶液相接觸；(a)—種集光的、聚 陽離子的、發光的多發色團系統如，例如一種綴合的聚合物、半導體量子點狀或樹狀結 構，它是水溶性的，和(b) —種與發光信號發色團(稱作“寡-C*” )綴合的傳感器多 核苷酸。具有信號發色團波長特性的光的發射表明具有與傳感器多核苷酸序列互補的堿 基序列的目標多核苷酸溶液的存在。通過利用具有不同堿基序列和不同信號發色團的多 個傳感器多核苷酸(寡i-C/、寡2_(/等)，能夠獨立地檢測多個各自具有特異性堿基序 列的多核苷酸。可以引入第三種組分如多核苷酸特異性染料以通過進一步將能量從傳感 器多核苷酸傳遞給多核苷酸特異性染料來提高選擇性。
選擇集光發色團和信號發色團(C*)以便兩個物種的吸收波段具有最小的重疊，從而兩個物種的發光發射光譜具有不同的波長。當在水溶液中進行制備時，集光和 發光多發色團系統帶正電(例如帶正電的綴合聚合電解質)。通過靜電引力確保帶負電 傳感器多核苷酸和帶正電集光和發光多發色團系統之間的接近。當暴露于具有集光發 色團吸收波段中波長的入射輻射時，有來自信號發色團的發射，例如通過FSrster能量 傳遞機制。在加入目標多核苷酸如具有與傳感器多核苷酸序列相互補的堿基序列的單鏈 DNA(ssDNA)之后，SSDNA與傳感器多核苷酸雜交，導致沿著DNA鏈負電荷密度的升 高“1’11。在這些環境下，并考慮到嚴格的靜電力，傳感器多核苷酸和帶正電的集光多發 色團系統之間的相互作用將是有利的，導致有效的能量傳遞和來自信號發色團的強烈發 射。當加入具有與傳感器多核苷酸序列不相互補的堿基序列的ssDNA時，不發生堿基對 雜交。通過與非互補ssDNA的競爭來篩選集光多發色團系統與傳感器多核苷酸之間的 靜電絡合。因而，集光多發色團系統和寡-C *之間的平均距離在非互補序列存在的情況 下較大，導致較低效率的向信號發色團的能量傳遞。當在其互補目標存在的情況下信號 寡-C*的發射比在其非互補鏈存在的情況下要強烈。整個方案提供了一種傳感器以在試 驗溶液中檢測具有特異性堿基序列的目標多核苷酸的存在。通過使用具有不同堿基序列 和不同信號發色團的多個傳感器多核苷酸，能夠單獨檢測多個目標。
除了所述的方法，發明還提供含有至少兩種組分的主要含水的溶液；(a) —種陽 離子多發色團，和(b) —種包含與信號發色團綴合的陰離子多核苷酸的“傳感器多核苷 酸”(寡-C*)。
如在實施例中所表明的，由水溶性多發色團如綴合的聚合物所提供的光學放大 能夠用來檢測多核苷酸與傳感器多核苷酸的雜交。這種放大能夠通過利用較高分子量的 水溶性綴合聚合物或其它結構如本文所述的聚陽離子多發色團增強。發明能夠以利用熒 光檢測法的簡易性的均一形式提供。發明能夠用于檢測擴增的目標多核苷酸或，由于大 的信號放大，用作一種單獨鏈的分析，而不需要多核苷酸的擴增。
不像基因芯片技術，本發明不必需要在分析之前通過將生光團或發色團共價結 合到包含于或源于樣品的多核苷酸而對每個待分析樣品進行標記。那些偶聯方法在偶聯 效率的重復性上具有固有的困難并且產生對樣品間相互校準的需要。
本文所述的發明對于任何測試都是有用的，在所述測試中能夠關于目標多核苷 酸對樣品進行分析。一般的測試包括測定樣品中目標多核苷酸的存在或其相對量，或者 測試可以是定量的或半定量的。
發明的方法都能夠以多種形式實施。通過與各個傳感器多核苷酸綴合的不同 信號發色團的應用，可以使用多種不同的傳感器多核苷酸來檢測樣品中相應不同的目標 多核苷酸。利用2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200、400或更多不同傳感器 多核苷酸提供多種方法，所述傳感器多核苷酸能夠同時用來測試相應不同的目標多核苷酸。
這些方法能夠在基片上，以及溶液中實施，盡管由于擴散問題溶液形式預計更 快。因而測試能夠，例如，在基片上以陣列形式實施，所述基片可以是一種傳感器。這 能夠通過將一種測試組分錨定于或整合入基片，例如傳感器多核苷酸、聚陽離子多發色 團或二者之上。這些基片可以是玻璃、硅、紙、塑料的表面，或用作光電轉換器的光電 半導體(如，但不限于，摻銦的硝酸鎵或聚合的聚苯胺等)的表面。給定的傳感器多核苷酸的定位可以是已知的或在陣列形式中是可測定的，并且陣列形式可以是可微尋址的 (microaddressable)或可納尋址的(nanoaddressable)。在一種變異型中，能夠將一個或多個含有擴增產物的樣品附著于基片，并且基片能夠與一種或多種標記的傳感器多核苷酸 以及聚陽離子多發色團相接觸。
在進一步詳述本發明之前，應理解本發明并不限于所述的特定方法、設備、溶 液或裝置，因為這些方法、設備、溶液或裝置當然能夠變化。還應理解本文所用的術語 僅僅是為了描述特定的實施方案的目的，并不限制本發明的范圍。
單數形式的使用包括復數含義，除非上下文清楚地另外指定。因而，例如，“一種目標多核苷酸”的含義包括多種目標多核苷酸，“一種信號發色團”的含義包括 多種這類發色團，“一種傳感器多核苷酸”的含義包括多種傳感器多核苷酸等。此外， 特定復數寫法，如“二”、“三”等的使用理解為相同事物的較大數目，除非上下文清 楚地另外指定。
術語如“連接的”、“附著的”和“鍵合的”在本文中可交換使用并且包括直 接以及間接的連接、附著、鍵合或綴合，除非上下文清楚地另外指定。當敘述一個范圍 的值時，應理解在所敘述的該范圍的上限和下限之間的每一個中間整數值及其每個分數 值也與這些值之間的小范圍一起得到具體地公開。任何范圍的上限和下限都能夠獨立地 包括在該范圍之內或排除于該范圍之外，并且每個其中包括一個、零個或兩個界限的范 圍也包括在發明之內。在討論值具有固有的界限時，例如在一種組分能夠以0-100%的濃 度存在時，或在水溶液的PH值能夠由1到14時，對那些固有的界限進行具體地公開。在 明確敘述一個值時，應理解與所敘述的值相同量的值也在發明的范圍內，基于該值的范 圍也在發明的范圍內。當公開一種組合時，該組合的要素的每種亞組合也得到具體地公 開并且在發明的范圍之內。相反地，在公開了不同的要素或要素組時，其組合也得到公 開。在一個發明的任何要素公開為具有多個選擇時，該發明的實施例也由此得到公開， 所述發明中單一地將每一種選擇或與其它選擇組合排除在外；一個發明的一種以上的要 素能夠具有這類排除，并且由此也公開了具有這類排除的要素的所有組合。
除非另外定義或上下文清楚地另外指定，本文所用的所有技術和科學術語都具 有與本發明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同意義。盡管能夠將與本文所述的那 些相似或等同的任何方法和材料用于發明的實施或測試上，現在還是要描述優選的方法 和材料。
為了公開和描述參考文獻所引的特定的材料和方法，在此將所提及的所有出版 物引入作為參考。本文所討論的出版物僅是基于其公開內容在本申請的申請日之前而提 供。本文沒有內容可以解釋為承認本發明無權依靠優先權發明而早于這些公開內容。
定義
在描述本發明中，將會用到以下術語，并且如下所示進行定義。
術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可以 交換使用指一種任何長度的核苷酸的聚合形式，并且可以包括核糖核苷酸、脫氧核糖核 苷酸及其類似物，或其混合物。這些術語僅指分子的一級結構。因而，這些術語包括 三鏈、雙鏈和單鏈脫氧核糖核苷酸(“DNA”)，以及三鏈、雙鏈和單鏈核糖核苷酸 (“RNA”)。它還包括多核苷酸的例如通過烷基化和/或通過加帽反應修飾的和未修飾的形式。
不論是修飾的還是未修飾的，傳感器多核苷酸都是陰離子化的并且能夠在不存 在目標多核苷酸的情況下與陽離子多發色團相互作用。目標多核苷酸在理論上能夠加上 電荷或去除電荷，盡管它一般預期是陰離子化的，例如RNA或DNA。
更具體地，術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括 多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(包含D-核糖)，包括剪接 的或未剪接的tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，和其它類型的嘌呤或嘧啶堿基的N_或 C-糖苷多核苷酸，和其它包含磷酸或其它聚陰離子主鏈的聚合物，和其它合成的序列 特異性核酸聚合物，前提是該聚合物包含構型允許如在DNA或RNA中所發現的堿基配 對和堿基堆積的核堿基。在術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分 子”，之間沒有長度上的區別，且這些術語在本文可互換使用。這些術語僅僅指分子的 一級結構。因而，這些術語包括，例如3’ -脫氧-2’，5’ -DNA、寡脫氧核糖核苷 酸N3’ P5’氨基磷酸酯、2，-O-烷基取代RNA、雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈 RNA,及其雜交物包括例如DNA和RNA之間的雜交物，并且還包括已知類型的修飾， 例如標記、烷基化、“帽”、一個或多個用類似物進行的核苷酸的替代，核苷酸間修飾 如，例如那些以帶負電的鍵合(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)進行的修飾、那些 包含側基部分例如蛋白質(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸 等)的修飾、那些包含插入物(例如，吖啶、補骨脂素等)的修飾、那些包含螯合物(例 如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、那些包含烷基化物的修飾、那些 具有改進的鍵合(例如，α異頭核酸等)的修飾、以及多核苷酸或寡核苷酸的未修飾形 式。
應當理解如本文所用的術語“核苷”和“核苷酸”將包括那些不但包含已知 的嘌呤和嘧啶堿基，還包含其它已進行修飾的雜環堿基的部分。這類修飾包括甲基化的 嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶，或其它雜環。經修飾的核苷或核苷酸還能夠包括在糖 部分上的修飾，例如，其中一個或多個羥基為鹵素、脂肪族所取代，或功能化為醚、胺 等。術語“核苷單位(nudeotidicunit)”包括核苷和核苷酸。
另外，對核苷單位的修飾包括重排、添加、替代或在嘌呤或嘧啶堿基上改變功 能基，所述功能基與各自互補的嘧啶或嘌呤形成氫鍵。得到的經修飾的核苷單位可以任 選地與其它這種經修飾的核苷單位但不與A、T、C、G或U形成堿基對。可以整合不 會阻止多核苷酸功能的脫堿基位點；優選多核苷酸不包含脫堿基位點。在多核苷酸中的 一些或全部殘基能夠任選以一種或多種方式進行修飾。
在允許形成分別在胸腺嘧啶核苷的N3-H和C4-氧與腺嘌呤核苷的Nl和 C6-NH2之間和分別在胞嘧啶核苷的C2-氧、N3和C4-NH2與鳥嘌呤核苷的C2-NH2、 N' -H和C6-氧之間的氫鍵的條件下，標準的A-T和G-C堿基對形成。因而，可 以修飾鳥嘌呤核苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)以形成異鳥嘌呤核苷 (2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。這種修飾產生了一種核苷堿基，它不再有 效地與胞嘧啶形成標準的堿基對。但是，修飾胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧-4-氨 基-嘧啶)以形成異胞嘧啶(1- β -D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧-嘧啶)產生一種修飾 的核苷酸，它將不會有效地與鳥嘌呤核苷形成堿基對但將與異鳥嘌呤核苷形成堿基對。異胞嘧啶由Sigma Chemical Cc^St丄ouis，MO)可購得；異胞嘧啶核苷可以通過Switzer 等(199;3):Biochemistry 32 10489-10496和其中引用的參考文獻中所述的方法制備； 2'-脫氧-5-甲基-異胞嘧啶核苷可以通過Tor等(1993) J.Am.Chem.Soc. 115 4461-4467 和其中引用的參考文獻的方法制備；而異鳥嘌呤核苷酸可以利用Switzer等(1993)，同 上，和Mantsch等(1993)Biochem.14 5593-5601所述的方法，或通過在授予Collins等 的美國專利號5,780,610中所述的方法制備。其它非天然的堿基對可以通過在Piccirilli等 (1990)Nature 343 33-37中所述的合成2，6-二氨基嘧啶及其互補體(1-甲基吡唑-[4， 3]嘧啶-5，7-(4H, 6H)_ 二酮)的方法進行合成。其他這種形成獨特堿基對的修飾的核 苷單位是已知的，如在 Leach 等(1992) J.Am.Chem.Soc. 114 3675-3683 和 Switzer 等，同 上中所描述的。
“優選結合”或“優先雜交”指與樣品中非互補性聚合物相比，一種多核苷酸 或PNA結合到樣品中它的互補體上的增強的傾向。
雜交條件將一般包括小于大約IM的鹽濃度，更通常小于大約500mM并且優選 小于大約200mM。在肽核酸和多核苷酸之間雜交的情況下，雜交能夠在含有小量或不含 鹽的溶液中進行。雜交溫度能夠低至5°C，但一般大于22°C，更通常大于大約30°C，并 且優選超過大約37°C。較長的片段可以需要較高的雜交溫度以進行特異性雜交。其它 因素可以影響雜交的嚴格性，包括堿基組成和互補鏈的長度，有機溶劑的存在以及堿基 錯配的程度，并且所用參數的組合比任何單一參數的絕對測量更加重要。對于一種給定 測試形式的適當的雜交條件能夠由本領域技術人員進行測定；可以進行調節的非限制性 參數包括測試組分的濃度、所用的鹽及其濃度、離子強度、溫度、緩沖液類型和濃度、 溶液pH、降低背景結合封閉劑如重復序列或封閉蛋白質溶液的存在和濃度、去污劑的類 型和濃度、提高多核苷酸相對濃度的分子如聚合物、金屬離子及其濃度、螯合劑及其濃 度，以其其它本領域公知的條件。
“多重性的”在此指一種測試或其它分析性方法，其中能夠同時測試多個被分 析物。
“任選的”或“任選地”意為隨后所述的事件或環境可以發生或可以不發生， 以及說明書包括發生了事件或環境的情況和其未發生的情況。
樣品
含有或懷疑含有目標多核苷酸的樣品的部分能夠是任何來源的生物學材料，它 含有能夠直接或間接獲自一種活體生物的多核苷酸，所述生物包括細胞、組織或流體， 以及由該生物所遺留的沉積物，包括病毒、支原體和化石。樣品可以包含通過合成方法 制備的完整的或部分的多核苷酸。一般地，樣品在一種主要含水的介質中獲得或分散在 該介質中。樣品的非限制性例子包括血液、尿液、精液、乳、痰、粘液、口腔棉拭、 陰道棉拭、直腸棉拭、吸出物、針刺活組織檢查、例如通過外科手術或尸體解剖所獲組 織的切片、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌 物、眼淚、口水、腫瘤、器官、體外細胞培養組分樣品(包括但不限于源自細胞培養基 中細胞生長的條件培養基、推定為病毒感染的細胞、重組細胞和細胞組分)以及包含多 核苷酸序列的重組文庫。樣品可以存在于本文所述基片上。基片可以是包含樣品的載玻 片，如用在熒光原位雜交(FISH)中的載玻片。8
樣品可以是一種陽性對照樣品，它已知包含目標多核苷酸或其替代品。也能夠 使用一種陰性對照樣品，盡管預期其不含目標多核苷酸，但懷疑包含它(通過一種或多 種試劑的污染)或能夠產生假陽性的其它組分，并通過用于給定分析中的試劑的目標多 核苷酸進行試驗從而確認沒有污染，以及測定一套給定的分析條件是否產生假陽性(即 使在樣品中沒有目標多核苷酸的情況下的陽性信號)。
樣品能夠進行稀釋、溶液、懸浮、提取或另外進行處理來溶解和/或純化任何 存在的目標多核苷酸或使它易為用于擴增方案中的試劑或檢測試劑所接近。在樣品包含 細胞的情況下，能夠將細胞裂解或透化以釋放細胞內的多核苷酸。能夠使用一步透化緩 沖液裂解細胞，它允許在裂解后直接進行進一步的步驟，例如聚合酶鏈反應。
目標多核苷酸和由其產生的擴增產物
目標多核苷酸可以是單鏈的、雙鏈的，或更高級的，并可以是線性的或環狀 的。例示性的單鏈目標多核苷酸包括mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA 病毒基因組，盡管這些多核苷酸可以包含內部互補序列和顯著的二級結構。例示性的雙 鏈目標多核苷酸包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因組、質粒、噬菌體和類病毒。目標多核苷酸能夠合成制備或由生物來源純化。可以 對目標多核苷酸進行純化以去除或減少一種或多種不希望的樣品組分或濃縮目標多核苷 酸。相反地，在目標多核苷酸太濃而不能進行特定分析的情況下，可以稀釋目標多核苷酸。
在樣品收集和任選的核酸提取之后，含有目標多核苷酸的樣品核酸部分能夠進 行一種或多種預備性反應。這些預備性反應能夠包括體外轉錄(IVT)、標記、片段化、 擴增和其它反應。能夠在檢測和/或擴增之前首先以反轉錄酶和引物處理mRNA以產 生cDNA ；這能夠在體外以純化的mRNA進行或原位進行，例如在附著于載玻片上的細 胞或組織中。核酸擴增提高了目的序列如目標多核苷酸的拷貝數。多種擴增方法適于應 用；適合的擴增反應的非限制性例子包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、 自動維持序列擴增(3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、Q Beta復制酶的使用、反轉 錄、切口平移等。
在目標多核苷酸為單鏈的情況下，擴增的第一個循環形成了與目標多核苷酸互 補的引物延伸產物。如果目標多核苷酸為單鏈RNA，在第一擴增中使用具有反轉錄酶活 性的聚合酶以將RNA反轉錄成DNA，另外的擴增循環就能夠進行以拷貝引物延伸產物。 PCR的引物當然必須設計為與在其相應模板中將產生可擴增片段的區域雜交；因而，每 個引物必須雜交以便其3’核苷酸與在其互補模板鏈中的一個核苷酸配對，所述核苷酸位 于用來在PCR中復制該互補模板的引物的3’核苷酸的3’。
目標多核苷酸一般通過將一種或多種目標多核苷酸的鏈與引物和聚合酶相接觸 來擴增，所述聚合酶具有延伸引物并拷貝目標多核苷酸以生產全長互補的多核苷酸或其 較小部分的活性。可以使用任何具有能夠拷貝目標多核苷酸的聚合酶活性的酶，包括 DNA聚合酶、RNA聚合酶、反轉錄酶、具有一種以上類型聚合酶活性的酶，并且酶可以 是不耐熱的或熱穩定的。還能夠使用酶的混合物。例示性的酶包括DNA聚合酶如DNA 聚合酶l(〃 Poll" )、Poll 的克列諾片段、T4、T7、Sequenase T7、Sequenase Version 2.0T7、Tub、Taq、Tth、Pfx， Pftu Tsp、Tfl、Tli 和火球菌屬物種(Pyrococcussp) GB-D DNA聚合酶；RNA聚合酶如大腸桿菌(E.coli)、SP6、T3和T7RNA聚合 酶；和反轉錄酶如 AMV、M-MuLV> MMLV> RNAse> H-MMLV (SliperScript )、 SuperScript π、ThermoScript 、Hlv-l和RAV2反轉錄酶。所有這些酶都是商業上現有的。具有多重特異性的例示性聚合酶包括RAV2和Tlitex0-)聚合酶。例示性的 熱穩定聚合酶包括Tub、Taq> Tth、Pfx> Pfu、Tsp、TfU Tli和火球菌屬物種GB-DDNA聚合酶。
選擇適當的反應條件以允許進行目標多核苷酸的擴增，包括pH、緩沖液、離子 強度、一種或多種鹽的存在和濃度、反應物和輔因子如核苷酸和鎂和/或其它金屬離子 (例如，錳)的存在和濃度、任選的助溶劑、溫度、包含一個聚合酶鏈反應的擴增方案的 熱循環曲線，并且可以部分依賴所用的聚合酶以及樣品的性質。助溶劑包括甲酰胺(一 般于大約2%到大約10% )、甘油(一般于大約5%到大約10% )和DMSO (—般于大約 0.9%到大約10% )。可以在擴增方案中使用技術從而使假陽性產物或擴增過程中產生的 假象最小化。這些包括"降落(touchdown) “ PCR,熱啟動技術、使用嵌套引物或設計 PCR引物使它們在引物二聚體形成的結果中形成莖環結構并因而不被擴增。能夠利用加 速PCR的技術，例如離心PCR，它允許在樣品中更強的對流，并且包括紅外加熱步驟以 進行樣品的快速加熱和冷卻。能夠進行一個或多個擴增循環。能夠使用過量的一種引物 以在PCR過程中產生過量的一種引物延伸產物；優選地，過量產生的引物延伸產物是待 檢測的擴增產物。可以使用多種不同的引物以擴增不同的目標多核苷酸或樣品中特定目 標多核苷酸的不同區域。
擴增的目標多核苷酸可以進行擴增后處理。例如，在一些情況下，希望在雜交 之前將目標多核苷酸片段化從而提供更易接近的片段。核酸的片段化能夠通過任何產生 在實施的分析中有用大小的片段的方法進行；適當的物理、化學和酶學方法是本領域公 知的。
擴增反應能夠在允許傳感器多核苷酸在一個擴增循環的至少一部分過程中雜交 到擴增產物上的條件下進行。當分析以這種方式進行時，通過監控來自信號發色團的光 發射的變化能夠進行這種雜交事件的實時檢測，該光發射基于該擴增方案過程中的雜交 而發生。
聚陽離子多發色團
由于它們包含的多個發色團，集光多發色團系統已證實是有效的光吸收劑。例 子包括，但不限于綴合的聚合物、綴合分子的聚集體、附著于飽和聚合物上的發光染 料、半導體量子點狀和樹狀結構。例如，在綴合聚合物上的每個重復單位能夠認為是一 個起作用的發色團，量子點由許多原子組成，飽和的聚合物能夠為在側鏈上的許多發光 染料分子所功能化，包含許多共價連接的個體發色團的樹枝狀化合物(dendrimer)能夠得 到合成。發色團組件附著于固體支持物，如聚合物珠或表面上，也能夠用于集光。
集光多發色團系統能夠將能量有效地傳遞給附近的發光物(例如，“信號發色 團”)。能量傳遞的機制包括，例如，共振能量傳遞(Fiirster (或熒光)共振能量傳 遞，FRET)、量子電荷交換(Dexter能量傳遞)等。但是一般地，這些能量傳遞機制是相 對短范圍的；即，需要集光多發色團系統密切接近信號發色團以進行有效的能量傳遞。 在進行有效能量傳遞的條件下，當集光多發色團系統中的個體發色團數目很大時會發生來自信號發色團發射的擴大；即，當入射光(“泵光(pumplight)”)處于集光多發色團 系統吸收的波長時來自信號發色團的發射比當信號發色團被泵光直接激發時更加強烈。
綴合聚合物(CPs)的特征是非定域電子結構，它能夠用作化學和生物學目標的 高度易傳感的光學報道分子12’ 13。因為有效的綴合長度基本上比聚合物鏈的長度短，所 以骨架在靠近處包含大量的綴合片段。因而，綴合的聚合物對集光是有效的并使得通過 Ffirster能量傳遞進行光學放大成為可能14。
已經對陽離子聚電解質和DNA之間自發的共聚體絡合進行過描述，并且主要是 協同靜電力的結果15’ 16’ 17O近來還認定了在芳香族聚合物單元和DNA堿基之間的疏水 相互作用18’ 19O聚電解質/DNA相互作用的自由能受與溶液變量相關使用的參與物的結 構控制，所述變量如pH、離子強度和溫度2°。近來對這些相互作用的強度和特異性進行 了協調以識別質粒DNA的三級結構21。
用于本發明的多發色團是聚陽離子的并能夠與傳感器多核苷酸靜電相互作用。 可以在所述方法中使用任何能夠吸收光并將能量傳遞給傳感器多核苷酸上信號發色團的 聚陽離子多發色團。能夠使用的例示性的多發色團包括綴合的聚合物、飽和的聚合物或 以任何活的方式整合多個發色團的樹枝狀化合物，以及半導體納晶體6CNCs)。可以制 備綴合的聚合物、飽和的聚合物和樹枝狀化合物以整合多個陽離子物或使它們在合成后 衍生化為聚陽離子的；可以通過將陽離子物加至它們的表面上使半導體納晶體聚陽離子 化。
在一個優選的實施方案中，使用一種綴合的聚合物作為聚陽離子多發色團。一 個具體的例子示于結構1中，其中可溶于水的陽離子綴合聚合物是具有碘化物相反陰離 子的聚(9，9_雙(6' -N，N，N-三甲基銨)-己基)_亞苯基芴(fluorenephenylene))22。 這種聚合物的特定大小并不重要，只要它能夠吸收光并將能量傳遞給帶至近處的信號發 色團。一般的“η”值落入2到大約100,000的范圍內。這種具體的分子結構并不重要；能夠使用任何具有足夠發光量子效率的水溶性陽離子綴合聚合物。
權利要求
1.測試方法，包括提供懷疑含有目標多核苷酸的樣品；提供在激發后能夠將能量傳遞給信號發色團的聚陽離子多發色團； 提供單鏈的并且與目標多核苷酸互補的陰離子性傳感器多核苷酸，所述傳感器多核 苷酸綴合到信號發色團上，其中所述傳感器多核苷酸與多發色團相互作用并且發射光能 夠在目標多核苷酸缺失的情況下于多發色團激發之后由信號發色團產生，并且其中在目 標多核苷酸存在的情況下多發色團激發后由信號發色團產生更大量的發射光；在傳感器多核苷酸能夠與倘若存在的目標多核苷酸雜交的條件下，將樣品與傳感器 多核苷酸和多發色團在溶液中進行接觸；對該溶液應用能夠激發多發色團的光源；以及 檢測由信號發色團發射的光是否在樣品存在的情況下增強。
2.權利要求1的方法，其中多發色團包含選自飽和的聚合物、綴合的聚合物、綴合分 子的聚集體、樹枝狀化合物和半導體納晶體的結構。
3.權利要求2的方法，其中多發色團包含飽和的聚合物。
4.權利要求2的方法，其中多發色團包含樹枝狀化合物。
5.權利要求2的方法，其中多發色團包含半導體納晶體。
6.權利要求2的方法，其中多發色團包含綴合分子。
7.權利要求6的方法，其中綴合的聚合物具有結構
8.權利要求2的方法，其中多發色團是綴合分子的聚集體。
9.權利要求8的方法，其中聚集體包含具有結構
全文摘要
提供了測定樣品中目標多核苷酸的方法、組合物和生產的商品。將一種懷疑含有目標多核苷酸的樣品與聚陽離子多發色團和同目標多核苷酸互補的傳感器多核苷酸相接觸。傳感器多核苷酸包含一種信號發色團以接收來自受到激發的多發色團的能量并且在目標多核苷酸存在的情況下增強發射。該方法能夠以多種形式進行利用。還提供包含實施此方法的試劑的試劑盒。
文檔編號C07H21/00GK102021243SQ201010528009
公開日2011年4月20日 申請日期2003年8月26日 優先權日2002年8月26日
發明者B·S·蓋洛德, G·C·巴贊, S·王 申請人:加州大學評議會