專利名稱：一種抗口蹄疫病毒的單克隆抗體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗0型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備方法及制備的抗體的用途，屬于口蹄疫防控領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種嚴重危害偶蹄動物的烈性傳染病。由于該病可引起幼畜死亡、動物生產(chǎn)性能下降、畜產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量降低，加之傳播迅速，一經(jīng)發(fā)生即給發(fā)病國家和地區(qū)造成巨大的經(jīng)濟損失，沉重打擊對外貿(mào)易，因而該病曾一度被稱為“政治經(jīng)濟性疾病”。作為一種世界范圍內(nèi)的重大動物疫病，口蹄疫一直是世界各國口岸檢疫、防控監(jiān)測的重要目標(biāo)。目前，對于口蹄疫的檢測診斷方法主要包括經(jīng)典的病毒分離、PCR擴增病毒核酸和血清學(xué)檢測，但是因為前兩種方法需要動用病毒，因而需要配備相應(yīng)級別的實驗室， 同時還存在檢測周期長的缺點。血清學(xué)方法因為回避了上述問題而獲得了極大的發(fā)展。在各類血清學(xué)檢測方法中，抗體作為其中的核心試劑，直接決定著檢測方法的特異性和靈敏度。目前，雖然包括噬菌體展示、單鏈抗體等技術(shù)提供的抗體類型比以往更加豐富多樣，但是口蹄疫檢測中所采用的抗體仍以多克隆抗體和單克隆抗體為主，二者常被單獨或結(jié)合使用。鑒于實驗動物的個體差異，難于保證不同批次多克隆抗體水平的完全均一，單克隆抗體正憑借其特異、均勻和可無限供應(yīng)的優(yōu)勢，被越來越多的研究者選用。自口蹄疫出現(xiàn)至今， 有關(guān)單克隆抗體的研究亦時有報道，但多屬零散且缺乏系統(tǒng)性。這主要是因為單克隆抗體盡管具有上述諸多優(yōu)點，但同時它也存在制備周期長、結(jié)果難以預(yù)知的缺點。此外，口蹄疫病毒的抗原結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，不同血清型、基因型和分離株的抗原結(jié)構(gòu)存在很大差異。這些都限制了口蹄疫單克隆抗體的研制?；谏鲜銮闆r，積極開展口蹄疫完整的單克隆抗體庫建設(shè)，不管對于口蹄疫的理論研究還是口蹄疫的現(xiàn)實防控都具有積極而重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株可特異性分泌抗0型口蹄疫病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞系；本發(fā)明的目的之二是提供一種由上述雜交瘤細胞系分泌的抗口疫病毒的單克隆抗體；本發(fā)明的目的之三是將上述單克隆抗體用于診斷、預(yù)防和研究口蹄疫。本發(fā)明的一株能分泌抗0型口蹄疫病毒的血清型依賴性單克隆抗體的雜交瘤細胞系6B8，其雜交瘤細胞株已于2010年5月11日保藏于中國武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其微生物保藏號是CCTCC NO. C201049。本發(fā)明的一種抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體由保藏號為CCTCC NO :C201049的雜交瘤細胞株雜交瘤細胞株6B8產(chǎn)生，該抗體亞型為IgGl。本發(fā)明的雜交瘤細胞系可在制備診斷0型口蹄疫的試劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明的單克隆抗體在制備診斷0型口蹄疫的試劑方面的應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中口蹄疫單克隆抗體的制備多采用完整病毒或人工表達的病毒某一片段為免疫抗原，再采用病毒篩選的方法來制備，由此帶來的后果就是獲得的單克隆抗體難于直接確定其識別的抗原表位，必須經(jīng)過一系列的后期鑒定方可確知，這無疑增加了單克隆抗體的工作量和制備周期。近些年，隨著口蹄疫病毒抗原位點的一一揭示，人們對于口蹄疫病毒中誘發(fā)免疫保護的關(guān)鍵位點越來越明確。同時，伴隨著肽合成技術(shù)的發(fā)展，研究者已經(jīng)可以按照自己的意愿合成目標(biāo)蛋白肽段。綜合上述種種情況，本發(fā)明設(shè)計了以蛋白短肽為免疫原，合成肽、載體和病毒三者同時篩選的單克隆抗體制備程序。該設(shè)計的優(yōu)勢在于 ①以蛋白短肽為免疫抗原，不需要進行病毒培養(yǎng)、純化、標(biāo)定、蛋白表達等以病毒和表達產(chǎn)物做抗原時帶來的一系列實驗操作，從而大大節(jié)省前期抗原準(zhǔn)備時間；②合成肽、載體和病毒三者同步篩選，只有同時與合成肽和病毒結(jié)合而又不與載體結(jié)合的雜交瘤細胞才被篩選出來，既排除了誤篩與載體結(jié)合的雜交瘤細胞，又保證了與病毒具有結(jié)合力的雜交瘤細胞的獲得；③以蛋白短肽為免疫抗原，蛋白序列可以預(yù)先設(shè)定，間接限定了制備抗體的識別位點，進而省略了抗原表位的鑒定。本發(fā)明的口蹄疫單克隆抗體的制備周期縮短、制備流程簡化，從而大大便利了口蹄疫單克隆抗體的研制。本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)首先，對口蹄疫病毒VPl序列分析，選定用作免疫抗原的片段，通過肽合成技術(shù)人工合成目標(biāo)片段，為增加其免疫原性，在其末端連接載體蛋白KLH ；為充分展示抗原位點，在遠離抗原區(qū)域的一側(cè)進行載體連接；為獲得良好連接效果，在合成肽載體連接一端引入一個半胱氨酸。其次，在制定免疫程序時，本發(fā)明采用小劑量OOug/次/小鼠)免疫策略，以提高特異性強、效價高的雜交瘤的獲得率；再次，采用合成肽、載體蛋白、病毒同步篩選方案，有力確保篩選的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體與病毒的結(jié)合力。最后，在抗0型口蹄疫病毒單克隆抗體制備中，本發(fā)明主要采用體內(nèi)誘生法的活體采集法，即待小鼠腹水產(chǎn)生后在保證其存活狀態(tài)下采集，然后繼續(xù)培養(yǎng)至腹水產(chǎn)生后再次收集如此反復(fù)直至不再有腹水產(chǎn)生或者小鼠死亡。該方案既保證了最大限度的腹水收率，又獲得了更高的腹水效價。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的目的和內(nèi)容，實施例分成三部分完成。實施例一分泌抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體的雜交瘤細胞系6B8的建立；實施例二 抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體(以下命名為mab-6B8)的制備及其特性分析；實施例三抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體mab-6B8的用途。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例一分泌抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體的雜交瘤細胞系6B8的建立(一)抗原制備通過文獻報道和生物學(xué)軟件對不同血清型口蹄疫病毒基因組VPl序列分析，選擇該片段上0型口蹄疫特異、線性、中和性抗原位點的關(guān)鍵區(qū)段，合成一條包含觀個氨基酸的短肽 SSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPC-KLH (SEQ ID NO 1),為提高短肽的免疫原性，在其末端連接載體血藍蛋白(KLH，購自Sigma公司)。為保證短肽的良好結(jié)構(gòu)，充分暴露其攜帶的抗原位點，在載體與短肽連接時在二者之間引入一個半胱氨酸。經(jīng)質(zhì)譜和液相色譜檢測， 上述所得的肽合成物獲得93%以上的純度，適于用作免疫抗原。1)動物免疫取6-8周齡SPF級BALB/c小鼠4只，免疫前一天眼底采血，分離血清用作陰性對照。首次免疫將口蹄疫合成肽的KLH連接物用滅菌PBS溶解，與福氏完全佐劑(購自Sigma 公司)等體積混合皮下多點注射小鼠，每只小鼠20ug，即300ul/只。間隔兩周后，等量抗原與福氏不完全佐劑(購自Sigma公司)等體積混合腹腔注射進行第二次免疫。兩周后同法進行第三次免疫，一周后小鼠尾靜脈采血測抗體效價。選取抗體效價最高者于融合前三天， 以20ug抗原劑量不加佐劑腹腔注射加強免疫。2)細胞融合(1)骨髓瘤細胞的準(zhǔn)備B細胞融合技術(shù)中的骨髓瘤細胞均來自于本動物。鼠源骨髓瘤細胞主要有X-63、NS-I和SP2/0三種，又以SP2/0最為常用，本發(fā)明即選用該細胞作為單克隆抗體制備的骨髓瘤細胞。以含10%進口優(yōu)級胎牛血清(PAA，購自西班牙Nalgene 公司)的1640培養(yǎng)基(Nissui，購自日本日水制藥株式會社)于融合前兩周復(fù)蘇SP2/0細胞，并調(diào)整狀態(tài)使其處于對數(shù)生長期，于融合前36-48小時，將骨髓瘤細胞擴大培養(yǎng)，并提高其培養(yǎng)基的血清濃度至15%。融合當(dāng)天，先用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基將骨髓瘤細胞洗滌兩次， 然后用彎頭滴管將細胞從瓶壁上輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。lOOOr/min離心10分鐘，棄上清。細胞沉淀重懸于30ml 1640不完全培養(yǎng)基，混勻，取少量骨髓瘤細胞懸液加入0. 4%臺盼蘭染色計數(shù)后備用。計算公式如下每毫升細胞數(shù)=4個大方格細胞數(shù)X 105/4 ；或每毫升細胞數(shù)=5個中方格細胞數(shù)X 106/2。(2)脾淋巴細胞的準(zhǔn)備將免疫好的BALB/c小鼠，摘眼球采血后(用于制備陽性血清)脫白處死，置75%酒精中浸泡消毒10分鐘，于超凈臺內(nèi)無菌依次打開腹部皮膚、腹膜， 分離脾臟，去除粘連的組織和脂肪后，經(jīng)1640不完全培養(yǎng)基洗滌后，將脾臟移入200目銅網(wǎng)中。用滅菌注射器內(nèi)芯輕輕擠壓脾臟釋放脾細胞，加入不完全培養(yǎng)基洗滌收集細胞懸液。 1000r/min離心5_10分鐘，棄上清，將細胞重懸于IOml不完全培養(yǎng)基并混勻。取少量上述脾細胞懸液，加臺盼蘭染色計數(shù)后備用。(3)飼養(yǎng)細胞的制備在細胞融合早期，為滿足新生雜交瘤細胞對養(yǎng)分及細胞密度的要求，同時清除培養(yǎng)過程中大量死亡的骨髓瘤細胞和脾細胞，常常需要在融合細胞板中加入飼養(yǎng)細胞。常用的飼養(yǎng)細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞，小鼠腹腔巨噬細胞因來源方便且制備簡單而使用最為廣泛。本發(fā)明選用小鼠腹腔巨噬細胞作為實驗的飼養(yǎng)細胞，其制備方法如下于細胞融合前一天，按上述脾細胞制備方法采血、處死、消毒小鼠后，無菌剝離小鼠腹部皮膚，暴露腹膜，經(jīng)酒精棉球消毒后，用注射器將IOml不完全培養(yǎng)基沿腹膜內(nèi)壁注入腹腔(進針時避免穿入腸管，同時避免脂肪阻塞針頭)。一手維持注射器針頭留置腹腔內(nèi)，另一手輕輕按摩小鼠腹部，隨后將注入的培養(yǎng)基從小鼠腹腔回吸入注射器。 1000r/min離心10分鐘，棄上清。細胞沉淀重懸于5ml HAT (購自Sigma公司)培養(yǎng)基，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2 X 105/ml，按96孔培養(yǎng)板每孔2 X IO4個細胞的數(shù)量加入飼養(yǎng)細胞，置 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。(4)細胞融合將上述方法準(zhǔn)備的脾細胞和骨髓瘤細胞懸液，按5 1的比例混合于融合管內(nèi)，lOOOr/min離心10分鐘，盡量吸凈上清。輕擊融合管底，使細胞沉淀松散并混合均勻。吸取37°C預(yù)熱的50% PEG1500(PH 8. 0，購自Sigma公司)Iml于1分鐘內(nèi)緩慢加入融合管內(nèi)，邊加邊輕輕攪拌，靜置1分鐘后，按由慢到快、由少到多的原則向融合管內(nèi)加入 20-30ml 37°C預(yù)熱的不完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，37°C靜置10分鐘。800r/min離心5分鐘，棄上清，加入15%血清的HAT培養(yǎng)基，輕輕重懸細胞，按每孔0. Iml量接種于事先鋪好飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。融合第5天用HAT培養(yǎng)基進行半換液， 7-10天用HT (購自Sigma公司)培養(yǎng)基進行全換液，14天后用普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞克隆長至孔底面積的1/4-1/3時取細胞上清檢測。( 二)雜交瘤細胞的篩選對于雜交瘤細胞株的篩選有免疫熒光試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、血凝試驗等等，據(jù)實驗設(shè)計本發(fā)明選用酶聯(lián)免疫吸附試驗對雜交瘤細胞進行篩選。實驗中采用口蹄疫病毒、合成肽連接物、載體蛋白三者同時篩查，即一孔雜交瘤培養(yǎng)上清分成三份分別加入上述三種物質(zhì)包被的ELISA板孔中進行檢測。具體方法為首先通過方陣滴定的方法確定口蹄疫病毒、合成肽連接物的最佳包被濃度，即用包被液(碳酸鈉緩沖液，PH9. 5)分別將口蹄疫病毒和合成肽連接物進行系列稀釋后，按50ul/孔加入ELISA板，輕輕震蕩使其充分覆蓋孔底，4°C過夜包被，棄掉孔內(nèi)液體，PBST洗滌三次，每次:3min ；每孔加入200ul5%脫脂乳和3% BSA配成的封閉液，4°C過夜封閉。棄掉封閉液，同上法洗滌三次后，加入系列稀釋的陽性血清，50ul/孔，37°C濕盒孵育lh。同法洗滌，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG (購自Rockland 公司)，37°C濕盒中反應(yīng)lh，洗滌，加入OPD-H2O2底物溶液，37°C避光孵育15min，用2M H2SO4 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀OD49tlIim讀值。本研究最終確定口蹄疫病毒的最佳包被濃度是1 500倍， 合成肽連接物的最佳包被濃度為2. 5ug/ml。為保證試驗的嚴謹性載體KLH也采用2. 5ug/ ml的劑量包被ELISA板。只有當(dāng)檢測細胞上清僅與病毒和肽結(jié)合物反應(yīng)而不與載體反應(yīng)且檢測孔上清的OD值為陰性對照(SP2/0上清和免疫前采小鼠血清)的2. 1倍時檢測孔才被判定為陽性孔。通過連續(xù)4次亞克隆和ELISA篩選，最終獲得了一株雜交瘤細胞系，被命名為 6B8，并于2010年5月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏。實施例二抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體mab-6B8的制備及其特性分析(一)抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體mab-6B8的制備目前單克隆抗體的制備方法主要有體內(nèi)誘產(chǎn)法和體外培養(yǎng)法。由于前法操作簡便、產(chǎn)量高，故本發(fā)明采用體內(nèi)誘生法來生產(chǎn)單克隆抗體。具體操作如下選用SPF級8-10 周齡BALB/c小鼠，腹腔接種滅菌降植烷或液體石蠟，每只小鼠0. 3ml。7-10天后向小鼠腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基懸浮的處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞6B8，每只小鼠5X IO5個 /0. 3mL· 一周后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待其腹部明顯膨大時，用滅菌12號針頭進行活體采集腹水，1-2天后待其腹部再次產(chǎn)生腹水時如上法收集直至不再有腹水產(chǎn)生。用此法制備單克隆抗體，平均每只小鼠可收腹水6-7ml，最多者可收15ml。將采集的腹水合并后， 2000r/min離心5分鐘，除去細胞和油脂成分，收集中間無色或淡黃色澄清層，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和凝膠過濾純化，測定效價，分裝，-70°C凍存?zhèn)溆?。這樣獲得了由雜交瘤細胞系6B8 分泌的抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體mab-6B8。(二)抗0型口蹄疫病毒的單克隆抗體mab-6B8的特性鑒定(1)亞類鑒定鑒定單克隆抗體類和亞類的方法主要有免疫擴散、ELISA和試紙條法三種，本發(fā)明采用Sigma公司ELISA型亞類鑒定試劑盒進行亞類鑒定，具體操作按說明書進行。經(jīng)鑒定， 本發(fā)明制備的單克隆抗體mab-6B8亞類為IgGl，結(jié)果見表1。(2)效價測定
本發(fā)明采用間接ELISA方法測定抗體效價。操作程序如下首先用預(yù)實驗確定的 0型病毒包被濃度1 500包被ELISA板，50ul/孔，4°C過夜包被。洗滌，用5%脫脂乳和 3% BSA構(gòu)成的封閉液4°C過夜封閉，200uV。洗滌，加入梯度稀釋的腹水和細胞培養(yǎng)上清， 50ul/孔，每個稀釋度作兩個重復(fù)，37°C溫浴Ih ；洗滌，加入1 1000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG, 50ul/孔，37°C作用Ih ；洗滌，加入OPD底物溶液，50ul/孔，避光作用15min,加入2M H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀OD49tlIim波長下讀取結(jié)果。當(dāng)檢測腹水時，以SP2/0腹水為陰性對照，當(dāng)檢測細胞培養(yǎng)上清時，以SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對照，當(dāng)檢測孔OD值大于陰性對照的2. 1倍判為陽性，結(jié)果顯示(見表1)本發(fā)明獲得的單克隆抗體mab-6B8效價高，適于進行口蹄疫診斷試劑開發(fā)和研究使用。表1單克隆抗體mab-6B8亞類鑒定和效價測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株能分泌抗O型口蹄疫病毒的血清型依賴性單克隆抗體的雜交瘤細胞系6B8，其特征是微生物保藏號是=CCTCC NO. C201049。
2.一種抗O型口蹄疫病毒的單克隆抗體，其特征在于該抗體由保藏號為CCTCC NO C201049的雜交瘤細胞株雜交瘤細胞株6B8產(chǎn)生，該抗體亞型為IgGl。
3.由權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞系在制備診斷O型口蹄疫的試劑方面的應(yīng)用。
4.由權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備診斷O型口蹄疫的試劑方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗O型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備方法及制備的抗體的用途，屬于口蹄疫防控領(lǐng)域。本發(fā)明的可特異性分泌抗O型口蹄疫病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞系6B8其微生物保藏號是CCTCC No:C201049。由該雜交瘤細胞株雜交瘤細胞株6B8產(chǎn)生單抗亞型為IgG1。本發(fā)明的雜交瘤細胞系可在制備診斷O型口蹄疫的試劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明的單克隆抗體可在制備診斷O型口蹄疫的試劑方面的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/10GK102277332SQ201010527859
公開日2011年12月14日 申請日期2010年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月30日
發(fā)明者劉永生, 周建華, 張 杰, 陳豪泰, 馬麗娜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所