專利名稱：兩頭尖中兩種單體化合物的分離純化方法
技術領域：
本發明屬于天然植物提取技術領域，設計一種從兩頭尖中用高速逆流色譜法同時 分離純化竹節香附素A和兩頭尖皂苷D。
背景技術：
兩頭尖系毛茛科(Ranunculaceae)多被銀蓮花Anemone raddeana Regel的根莖。 產于東北地區及山東等地，以吉林省產量最大。該藥首載于明朝劉文泰所著《本草品匯精 要》中，臨床上有“祛風除濕，消癰腫”的作用，用于“風寒濕痹、四肢拘攣、骨節疼痛、瘡癰潰
爛”等癥。竹節香附素A(Anemodeanin A)和兩頭尖皂苷D (raddeanosede D)是兩頭尖的主 要有效成分，均為三萜苷類化合物。具有較強的生理活性。林小欽等將不同質量濃度的竹 節香附素A與H印G2細胞共同培養，采用MTT比色法及細胞集落形成法檢測竹節香附素A 對H印G2細胞生長、增殖的影響。結果竹節香附素A各劑量的作用與未處理組相比，在各時 間點均有顯著差異，從而得到結論竹節香附素A對IfepG2細胞增殖有明顯抑制作用，在一 定范圍內隨著試藥質量濃度的升高和作用時間的延長而增強。兩頭尖皂苷D具有較強的抗 癌活性。總皂苷能抑制癌的形成。皂苷D、F、H對人體致病的乙型鏈球菌、綠膿桿菌、傷寒桿 菌、痢疾桿菌、金黃色葡球菌等均呈現不同程度的抑菌作用，對醋酸所致小鼠痛覺反應，熱 刺激引起的疼痛均有鎮痛作用。皂苷D對角叉菜膠所致腫脹有明顯抑制作用，抑制強度高 于總皂苷。兩頭尖總皂苷、皂苷D對正常小鼠自發活動有抑制作用，以皂苷D為最強。王明 奎等用水解和溶劑萃取的方法從中藥兩頭尖中提取制備了待測總皂苷(銀蓮花素A占總苷 的20% )，并研究了總皂苷的體外和體內的抑瘤活性，發現制備的兩頭尖總苷具有較好的 抑制腫瘤生長的活性，是一個有潛力的抗癌藥物。劉大有等已對兩頭尖進行了分離及結構鑒定，采用的為常壓硅膠柱法，但其采 用正丁醇萃取再上大孔樹脂，正丁醇萃取率較低，保留成分損失較大。中國專利申請號 200610124327. 5采用水煎煮后，以乙醇為洗液用樹脂柱吸附，制得的兩頭尖皂苷純度僅為 85%，但該方法引入堿液，易引起化合物化學性質的變化，使化合物不穩定并增加損失。高速逆、流色i普(high—speed counter-current chromatography, HSCCC)是國際上 世紀80年代以來在液-液分配色譜基礎上發展起來的新型分離技術，其分離原理是利用螺 旋柱在高速行星運動時產生的巨大離心力，使螺旋柱中互不相溶的兩相不斷混合，達到穩 定的流體動力學平衡態。HSCCC的流動相、固定相為互不相溶的液體。利用螺旋管柱方向性 及特定的高速流星式旋轉所產生的離心場作用，使無載體支持的固定相穩定地保留在聚四 氟乙烯管中，利用恒流泵連續輸入流動相，隨流動相進入螺旋柱的溶質再兩相間持續分配， 按分配系數大小依次洗脫。HSCCC具有以下優點無不可逆吸附，聚四氟乙烯管中的固定相 不需要載體，可以消除氣-液和固-液色譜中因使用載體而帶來的吸附現象，避免樣品再分 離過程可能存在的變性，適用于分離極性物質和生物活性物質；回收率高，由于液體作為流 動相和固定相，滯留在柱中的樣品可以通過多種洗脫方式予以完全回收，能夠同時完成分離純化與制備，適于制備性分離；操作簡單快捷，因固定相為液體，體系更換與平衡方便、快 捷；與HPLC相比，HSCCC進樣量較大，最多可達數克，是HPLC的數百倍。與常壓、低壓色譜 相比，HSCCC的分離能力強，有些樣品經一次分離即得到1個甚至多個化合物，并且分離時 間短，數小時即可完成。
發明內容
本發明針對高含量竹節香附素A和兩頭尖皂苷D缺乏的問題，在已有研究基礎上， 采用高速逆流色譜技術從兩頭尖中分離制備出這兩種活性成分。本發明的目的在于提供一種兩頭尖中兩種單體化合物的分離純化方法，利用該方 法得到的竹節香附素A和兩頭尖皂苷D的純度高達98%。本發明提供的一種兩頭尖中兩種單體化合物的分離純化方法包括以下步驟1)取兩頭尖根莖，粉碎后用甲醇水溶液回流或冷浸提取，合并提取液，濃縮至總體 積的1/10-6/10，低溫放置，高速離心；2)將離心所得沉淀物采用高速逆流色譜儀，色譜儀分離系統由二氯甲烷、甲醇、正 丙醇和水組成，其體積比為7-10 12-15 0. 5-2 4-8 ；3)將溶劑系統置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，取上相作為固定相，下相作 為流動相，將步驟1)所得沉淀物溶于上下相的混合溶劑中，再使色譜柱中充滿固定相，使 主機轉動，泵入流動相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收目標成分。4)將兩個目標成分分別合并，濃縮、用乙酸乙酯-乙醇(2 1)混合溶液重結晶， 干燥即得。步驟1)中所述甲醇水溶液甲醇的體積百分比為70-100%，用量為藥材質量的 3-12倍，提取1-2次，每次提取時間為2-12小時。步驟3)中所述的高速逆流色譜儀中的分離柱轉速為600-1000r/min，所述流動相 的流速為2-5ml/min。本發明具有的積極效果是本發明采用高速逆流色譜進行竹節香附素A和兩頭尖 皂苷D的分離純化，分離條件溫和，分離時間短，不引入酸堿，減少了化合物的損失，保持了 化合物的穩定性。
具體實施例方式實施例1 兩頭尖200g用800mL甲醇冷浸提取，提取2次，每次浸泡時間為10小時，合并提 取液，減壓回收甲醇，濃縮至原體積的1/10，低溫放置2小時，然后在3000rpm轉速下離心 10分鐘，得離心沉淀物67. 7g。精確稱取離心沉淀物lg，用二氯甲烷-甲醇-正丙醇-水(9 14 1 6)混合 溶劑系統溶解樣品，開啟恒溫循環器，以該溶劑系統的上相為流動相，下相為固定相，泵入 流動相和固定相，當溶劑從管路出口流出時，停止泵入固定相，設定流動相流速為3ml/min， 同時啟動主機，調節轉速為850rpm，待管柱內溶劑達成動態平衡，管柱出口只有流動相流 出。設定波長為207nm，根據譜峰分別收集保留成分。濃縮后分別用乙酸乙酯-乙醇(2 1) 重結晶，干燥得到得到竹節香附素A 5. 3mg(含量98. 8 % )和兩頭尖皂苷D4. 7mg(含量98. 6% )。實施例2:兩頭尖200g用600mL甲醇回流提取，提取1次，每次提取時間為2小時，合并提取 液，減壓回收甲醇，濃縮至原體積的4/10，低溫放置5小時，然后在4000rpm轉速下離心15 分鐘，得離心沉淀物70. 4g。精確稱取離心沉淀物1.4g，用二氯甲烷-甲醇-正丙醇-水(8 13 2 7) 混合溶劑系統溶解樣品，開啟恒溫循環器，以該溶劑系統的上相為流動相，下相為固定相， 泵入流動相和固定相，當溶劑從管路出口流出時，停止泵入固定相，設定流動相流速為5ml/ min,同時啟動主機，調節轉速為600rpm，待管柱內溶劑達成動態平衡，管柱出口只有流動 相流出。設定波長為207nm，根據譜峰分別收集保留成分。濃縮后分別用乙酸乙酯-乙醇 (2 1)重結晶，干燥得到得到竹節香附素A7. Omg(含量98. 3%)和兩頭尖皂苷D5.6mg(含 M 99. 0% )。實施例3 兩頭尖2kg用24L甲醇冷浸提取，提取1次，每次浸泡時間為12小時，合并提取 液，減壓回收甲醇，濃縮至原體積的1/10，低溫放置4小時，然后在5000rpm轉速下離心10 分鐘，得離心沉淀物716g。精確稱取離心沉淀物1.5g，用二氯甲烷-甲醇-正丙醇-水(7 15 1 8) 混合溶劑系統溶解樣品，開啟恒溫循環器，以該溶劑系統的上相為流動相，下相為固定相， 泵入流動相和固定相，當溶劑從管路出口流出時，停止泵入固定相，設定流動相流速為4ml/ min,同時啟動主機，調節轉速為900rpm，待管柱內溶劑達成動態平衡，管柱出口只有流動 相流出。設定波長為207nm，根據譜峰分別收集保留成分。濃縮后分別用乙酸乙酯-乙醇 (2 1)重結晶，干燥得到得到竹節香附素A7.6mg(含量98. 6%)和兩頭尖皂苷D7. Img(含 M 98. 9% )。實施例4 兩頭尖5kg用30L甲醇回流提取，提取2次，每次提取時間為3小時，合并提取液， 減壓回收甲醇，濃縮至原體積的3/10，低溫放置3小時，然后在4500rpm轉速下離心15分 鐘，得離心沉淀物1780g。精確稱取離心沉淀物1.2g，用二氯甲烷-甲醇-正丙醇-水(10 12 0. 5 9) 混合溶劑系統溶解樣品，開啟恒溫循環器，以該溶劑系統的上相為流動相，下相為固定相， 泵入流動相和固定相，當溶劑從管路出口流出時，停止泵入固定相，設定流動相流速為3ml/ min，同時啟動主機，調節轉速為750rpm，待管柱內溶劑達成動態平衡，管柱出口只有流動 相流出。設定波長為207nm，根據譜峰分別收集保留成分。濃縮后分別用乙酸乙酯-乙醇 (2 1)重結晶，干燥得到得到竹節香附素A6. Img(含量98. 8%)和兩頭尖皂苷D5.7mg(含 量 98. 5% )。實施例5 兩頭尖IOkg用70L甲醇冷浸提取，提取2次，每次浸泡時間為8小時，合并提取 液，減壓回收甲醇，濃縮至原體積的2/10，低溫放置5小時，然后在3500rpm轉速下離心10 分鐘，得離心沉淀物3518g。精確稱取離心沉淀物1.3g，用二氯甲烷-甲醇-正丙醇-水(9 11 2 8)
5混合溶劑系統溶解樣品，開啟恒溫循環器，以該溶劑系統的上相為流動相，下相為固定相， 泵入流動相和固定相，當溶劑從管路出口流出時，停止泵入固定相，設定流動相流速為5ml/ min,同時啟動主機，調節轉速為950rpm，待管柱內溶劑達成動態平衡，管柱出口只有流動 相流出。設定波長為207nm，根據譜峰分別收集保留成分。濃縮后分別用乙酸乙酯-乙醇 (2 1)重結晶，干燥得到竹節香附素A 6.6mg(含量99.2%)和兩頭尖皂苷D6.1mg(含量 98. 7% )。
權利要求
1.兩頭尖中兩種單體化合物的分離純化方法，其特征在于包括以下步驟1)取兩頭尖根莖，粉碎后用甲醇水溶液回流或冷浸提取，合并提取液，濃縮至總體積的 1/10-6/10，低溫放置，高速離心；2)將離心所得沉淀物采用高速逆流色譜儀，色譜儀分離系統由二氯甲烷、甲醇、正丙醇 和水組成，其體積比為7-10 12-15 0.5-2 4-8 ；3)將溶劑系統置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流 動相，將步驟1)所得沉淀物溶于上下相的混合溶劑中，再使色譜柱中充滿固定相，使主機 轉動，泵入流動相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收目標成分。4)將兩個目標成分分別合并，濃縮、用乙酸乙酯-乙醇(2 1)混合溶液重結晶，干燥 即得。
2.如權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于步驟1)中所述甲醇水溶液甲醇的 體積百分比為70-100%，用量為藥材質量的3-12倍，提取1-2次，每次 提取時間為2-12小 時。
3.如權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于步驟3)中所述的高速逆流色譜儀中 的分離柱轉速為600-1000r/min，所述流動相的流速為2-5ml/min。
全文摘要
本發明涉及天然藥物化學技術領域，具體設計一種從兩頭尖中分離純化高純度的單體化合物竹節香附素A和兩頭尖皂苷D的方法。國內外多采用硅膠柱層析等傳統方法來分離純化，但分離效果均不理想。本發明先用甲醇水溶液回流或冷浸法得到兩頭尖粗提液，濃縮至總體積的1/10-6/10，低溫放置，高速離心，將離心所得沉淀物用高速逆流色譜分配溶劑溶解，收集分離物，將不同成分分別收集、濃縮，乙酸乙酯-乙醇重結晶，干燥得到98％以上的竹節香附素A和兩頭尖皂苷D。
文檔編號C07J63/00GK102002088SQ20101052021
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月26日 優先權日2010年10月26日
發明者蘇劉花 申請人:南京澤朗農業發展有限公司