專利名稱：抗α-胞襯蛋白多肽IgA抗體測定在干燥綜合征診斷中的應用的制作方法
抗α-胞襯蛋白多肽IgA抗體測定在干燥綜合征診斷中的
應用本發明涉及α-胞襯蛋白多肽作為抗原在檢測干燥綜合征及其它免疫疾病中的 應用。
背景技術：
干燥綜合征(Sjogren's Syndrome, SS)是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺為 特征的全身性自身免疫疾病。該病最常見的臨床表現為眼干、口干，并可累及肺、腎臟、淋巴 系統、血管及肝臟等器官。此病無明顯的地區分布差異，可發生于任何年齡，以40-60歲， 特別是絕經后的女性居多，男女之比為1 9。在我國的患病率為0.77%，在老年人群中 的患病率高達4%，全國有近1000萬患者。干燥綜合征可分為原發性干燥綜合征(Primary Sjogren，s syndrome)禾口繼發性干燥綜合征(Secondary Sjogren，s syndrome)兩類。該 病單獨發生時，稱為原發性干燥綜合征；與其它診斷明確的自身免疫性疾病如類風濕關節 炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統性紅斑狼疫(systemic lupus erythematosus, SLE) 等合并存在時，稱為繼發性干燥綜合征。近年來，人們對干燥綜合征的病因及發病機理進行了大量研究，但至今無突破性 進展。目前在臨床上尚未發現理想的血清學診斷方法，除臨床癥狀外，主要靠唇腺活檢及 腮腺造影等有創檢查明確診斷，由于患者的醫從性差，常常延誤診斷，并喪失最佳的治療時 機。因此，尋找一種敏感性強、特異性高而又簡便易行的檢測方法，對干燥綜合征的早期診 斷及治療具有重要意義。為此，本發明人經過多年研究發現了可以用于干燥綜合征早期診 斷的血清學特異性抗原多肽——α-胞襯蛋白多肽(為α-胞襯蛋白的抗原表位)，該多肽 可以特異性的識別干燥綜合征患者血清中IgA型的特異性抗體——抗IgA型α-胞襯蛋白 多肽抗體，該抗體可通過一些較為簡便的免疫學檢測方法(如酶聯免疫吸附法)檢測出 來。并且具有很高的敏感性和特異性。發明_既述本發明的目的之一是提供能夠有效檢測干燥綜合征的特異性抗原——α -胞襯蛋 白多肽。本發明的另一目的是提供所述的α-胞襯蛋白多肽在診斷干燥綜合征中的用途。最后，本發明提供了一種改良的ELISA方法利用所述的α _胞襯蛋白多肽作為抗 原用于檢測干燥綜合征。本發明所用術語“ α -胞襯蛋白多肽”指具有共同序列RQKLEDSYRFXFFRDEEL(即A rg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-X-Phe-Phe-Arg-Asp-Glu-Glu-Leu)的氨基酸 或多肽。X可以為Gly (甘氨酸)、Ala (丙氨酸)、Val (纈氨酸)、Leu (亮氨酸)、IIe (異亮 氨酸)、Phe (苯丙氨酸)、Trp (色氨酸)、Tyr (酪氨酸)、Asp (天冬氨酸)、His (組氨酸)、 Asn (天冬酰胺)、Glu (谷氨酸)、Lys (賴氨酸)、Gln (谷氨酰胺)、Met (甲硫氨酸)、Arg (精 氨酸)、Ser (絲氨酸)、Thr (蘇氨酸)、Cys (半胱氨酸)、Pro (脯氨酸)。F0drin(又稱胞襯蛋白)最早在神經細胞的胞漿內被發現，主要聚集在神經細胞
3和淋巴細胞的漿膜下，與漿膜平行呈板狀分布。它是真核細胞膜骨架的主要組成部分，類似 圓柱體結構，含有α和β兩個亞單位。前者的分子量為240KD，后者為235KD。α、β亞 單位以邊對邊的形式形成異二聚體，其間以二硫鍵相連。這種異二聚體進一步以尾對尾的 形式形成四聯體，并與肌鈣蛋白相連，成為膜骨架的基本結構，參與細胞的運動及維持細胞 的連接和形態，可能與周圍神經，腦，腎臟，肝臟及全身性自身免疫病的發生有關⑴。1997年日本德島大學醫學院的Haneji等人從干燥綜合征模型NFS/sld小鼠的腮 腺組織中分離出一種分子量為120kD的抗原，并發現該抗原在干燥綜合征患者的唇腺組織 中有大量表達，而在正常人中并未檢出；同時還發現該抗原能夠刺激干燥綜合征患者外周 血中的T淋巴細胞增殖；為了鑒定該抗原，Haneji等人將其氨基端的序列進行測定，結果發 現該抗原即為非紅細胞膜譜蛋白(nonerythroid α-spectrin) α -胞襯蛋白。該小組人員 繼而用基因工程的方法，用GST融合蛋白表達系統構建了帶有編碼α-胞襯蛋白氨基端序 列cDNA的融合蛋白表達系統——pGEX-2T/JS-l，(JS-1為編碼α -胞襯蛋白氨基端序列的 堿基序列，該段序列共1784個堿基)，該表達系統表達出的α-胞襯蛋白融合蛋白分子量 約為97.4kD。將純化出的α-胞襯蛋白融合蛋白做為抗原，用免疫印跡(Western blot) 的方法檢測了 43例原發性干燥綜合征(pSS)、8例繼發干燥綜合征、21例系統性紅斑狼瘡 (SLE)、14例類風濕關節炎(RA)患者和15例正常獻血者，結果顯示該蛋白在原發性干燥綜 合征中的陽性率為95.3%，繼發干燥綜合征中為50%，而在SLE、RA和正常人中未檢測到該 抗體⑵。然而，Watanabc等人的用重組的98kD的α -胞襯蛋白做為抗原，用Western blot 的方法在不同疾病中檢測的陽性率為原發性干燥綜合征78% (7/9)，LE繼發SS:60% (9/15)，LE 7% (3/44)⑶。Witte等人用ELISA的方法，將重組的93kD的α -胞襯蛋白做為 抗原檢測出的原發干燥綜合征患者陽性率為55% (47/85)，SLE繼發SS的為40% (6/15)， RA 繼發 SS 的為 43% (3/7)，RA 為 41. 6% (5/12)，SLE 為 20% (1/50)，正常人組為 1. 9% (3/160)⑷。基于以上研究，本發明人經過序列分析及對抗原多肽的篩選，發現α-胞襯蛋白 中有一段氨基酸，序列與鼠非紅細胞膜譜蛋白序列同源，同時該序列中具有四個保守或較 保守的氨基酸，可能與該蛋白的抗原特性有關，并在干燥綜合征的發病中發揮重要作用，該 序列為 RQKLEDSYRFXFFRDEEL (即 Arg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-X-Phe-Phe -Arg-Asp-Glu-Glu-Leu)，稱為α-胞襯蛋白多肽⑸。本發明人利用戊二醛偶聯法將α-胞 襯蛋白多肽連接于牛血清白蛋白BSA形成BSA-G- α -胞襯蛋白多肽復合物，將該復合物作 為抗原，用ELISA的方法檢測干燥綜合征、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡及正常人血清中 的IgA型的α-胞襯蛋白多肽抗體，結果發現該多肽對干燥綜合征的診斷具有較高的敏感 性和特異性，可以用于干燥綜合征的診斷，從而達到通過血清學的方法診斷干燥綜合征的 目的，為干燥綜合征的臨床診斷提供客觀的實驗室依據。本發明的抗IgA型的α-胞襯蛋白多肽的檢測可通過多種方法(例如酶聯免疫 吸附法、免疫印跡法、金標記法等)對干燥綜合征患者進行檢測，其檢測方法為本領域技術 人員所熟知的。本發明所述的α-胞襯蛋白多肽可以通過多種方法得到，例如固相合成法、基因 工程表達純化法等。
圖1.首先利用戊二醛偶聯法將α-胞襯蛋白多肽連接于牛血清白蛋白BSA，形成 BSA-G- α -胞襯蛋白多肽復合物，將該復合物作為抗原包被于酶聯免疫吸附微孔板上，與待 測血清一起孵育，如果血清中存在的抗α-胞襯蛋白多肽抗體，該抗體就會與包被的固相 抗原結合，形成抗原_抗體復合物。將未結合的抗體及其它成分沖洗干凈后，加入辣根過氧 化物酶(HRP)標記的羊抗人IgA抗體(IgA-HRP) —起孵育，此時IgA-HRP就會與抗原-抗 體復合物結合，形成抗原_抗體_酶標抗體復合物，洗去未結合的成分，洗板5次后加入TMB 顯色液，37°C反應15分鐘后加入IM H2SO4終止，若血清中含有抗α-胞襯蛋白多肽IgA抗 體，則會顯出特定的顏色，且抗體滴度越高顏色越深。加終止液后，酶標儀在450nm波長處 測定標本的OD值。圖2.由圖可見α _胞襯蛋白多肽-IgA抗體在原發性和繼發性干燥綜合征中的陽 性率均明顯高于SLE、RA及正常對照(P均< 0. 05或< 0. 01)。
實施例 實施例1 α -胞襯蛋白多肽IgA抗體陽性率在干燥綜合征、類風濕關節炎、系統性 紅斑狼瘡及正常人的比較本研究用ELISA方法檢測了 α -胞襯蛋白多肽抗體在干燥綜合征(SS)、類風濕關 節炎(RA)、系統性紅斑狼瘡(SLE)及正常人的陽性率(表1，圖2)。應用u檢驗比較各組數 據，結果顯示，α -胞襯蛋白多肽抗體在原發和繼發性干燥綜合征的陽性率顯著高于類風濕 關節炎、系統性紅斑狼瘡和正常人，P值均<0.05。原發和繼發性干燥綜合征的α-胞襯蛋 白多肽抗體的陽性率相近，無統計學差異。而α-胞襯蛋白多肽抗體在系統性紅斑狼瘡和 類風濕關節炎的陽性率顯著高于正常人(P < 0. 05)。表1抗α F-IgA抗體在不同疾病的陽性率
病例數
權利要求
α 胞襯蛋白(α Fodrin)多肽，其序列為RQKLEDSYRFQFFQRDAEEL(即Arg Gln Lys Leu Glu Asp Ser Tyr Arg Phe Gln Phe Phe Gln Arg Asp Ala Glu Glu Leu)的多肽。
2.權利要求1中的α-胞襯蛋白多肽在制備干燥綜合征診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明提供了一條α-胞襯蛋白多肽及其類似物用于干燥綜合征的診斷。這種多肽抗原的IgA型抗體，在干燥綜合征得診斷中具有很高的敏感性和特異性。
文檔編號C07K7/08GK101974074SQ20101050369
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者何菁, 李英妮, 栗占國 申請人:北京大學人民醫院