專利名稱：一種頂頭孢霉蛋白質組的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種頂頭孢霉蛋白質組的制備方法。
背景技術：
頂頭孢霉是工業上用于發酵生產頭孢菌素C的主要生產菌，而頭孢菌素C是頭孢類抗生素關鍵中間體7-氨基烷酸的前體。比較蛋白質組學是蛋白質組學研究的重要領域， 用于分析不同條件下蛋白質組的變化和差異，發現并鑒定在不同生理狀態下的差異蛋白。 鑒于頭孢菌素C在生產頭孢類抗生素中的重要地位，開展對頂頭孢霉的比較蛋白質組學研究，對發現高產菌與低產菌在蛋白質水平上的差異，從而可以為通過基因工程優化頭孢菌素產生菌的代謝途徑，獲得可用于工業生產的高產菌打下基礎，具有重要的意義。但是目前還沒有頂頭孢霉的蛋白質組學研究報道。蛋白質組制備是比較蛋白質組學技術的關鍵，目前尚沒有統一的蛋白提取標準。 但原則上是盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失，減少對蛋白質的人為修飾及破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于完全變性狀態。探索一種合適的蛋白處理方法是實驗成敗的關鍵。
發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的頂頭孢霉缺乏蛋白質組學研究的不足，提供一種頂頭孢霉蛋白質組的制備方法及頂頭孢霉總蛋白的提取方法，該方法提取的頂頭孢霉總蛋白適合用于頂頭孢霉蛋白質組的雙向凝膠電泳分析。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一是一種頂頭孢霉蛋白質組的制備方法，包括以下步驟將頂頭孢霉菌體用液氮研磨成粉末狀后，用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白樣品；將所得的總蛋白樣品與水化溶液混合后，水化上樣，采用IPG固相膠條，然后進行等電聚焦，等電聚焦完成后將膠條平衡，然后轉移至SDS-PAGE凝膠上進行電泳，當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳，得凝膠；將所得的凝膠經染色后，用凝膠掃描儀透射掃描，將得到的圖像用軟件進行分析。本發明中，所述的“TCA-丙酮沉淀法”是指本領域常用的蛋白樣品制備方法，一般的包括用含20mmol/L DTT或者0. 07% β -巰基乙醇的10% TCA (三氯醋酸)溶液20°C沉淀45分鐘以上，離心收集，再用20mmol/L DTT或者0.07% β-巰基乙醇清洗，空氣(冷凍) 干燥。TCA-丙酮沉淀法是適合于雙向電泳的常用蛋白樣品制備方法，具有雜質少，離子濃度小的特點。具體的，本發明的頂頭孢霉蛋白質組的制備方法包括以下步驟(1)制備頂頭孢霉雙向電泳的蛋白質樣品a.將頂頭孢霉菌體用液氮研磨成粉末狀；b.加入預冷的含有20mmol/L DTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中過夜；c.在4°C下，12000rpm離心25分鐘，棄上清，取沉淀，此步驟可重復多次，較佳的重復2 5次，最佳的重復3次；d.沉淀放于 室溫風干；e.在沉淀中加入雙向電泳樣品裂解液，室溫條件下浸提2小時，此步驟中可以用無菌槍頭吹吸裂解液中的沉淀多次，較佳的吹吸5 10次，最佳的吹吸8次，使溶液與沉淀充分接觸，提高浸提效果；f.在4°C 12000rpm下離心20min，取上清，即得頂頭孢霉胞內蛋白質樣品，測總蛋白濃度，分裝，貯存于-80°C ；雙向電泳樣品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG緩沖液，40mM DTT ；(2)雙向凝膠電泳取步驟(1)所得的總量為Img的蛋白樣品與水化溶液混合成總量為450 μ 1的上樣液，水化上樣，均勻泡漲24cm的IPG固相膠條，將泡漲后膠條轉移至膠條槽中，進行等電聚焦；等電聚焦完成后，將膠條在平衡液I中平衡15分鐘，再在平衡液II平衡15分鐘。 將平衡后膠條轉移至SDS-PAGE凝膠上，進行電泳，當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳，得凝膠；水化溶液8M尿素，2% CHAPS，0. 5% IPG 緩沖液，18mM DTT，0. 002%溴酚藍；SDS 平衡母液6M 尿素，75mM Tris-Cl ρΗ 8. 8，29. 3%甘油，2% SDS，0. 002%溴酚藍·
JUL，平衡液I :SDS平衡母液中加入DTT 0. Img/膠條；平衡液II =SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0. 25mg/膠條；(3)圖像采集分析將步驟(2)所得的凝膠經染色后，用凝膠掃描儀透射掃描，將得到的圖像用軟件進行分析。本發明中，可采用蛋白質組研究中常用的線性或者非線性的各種ρΗ范圍的固相干膠條，如線性的固相干膠條PH3-10，較佳的采用非線性的固相干膠條pH3-10，更佳的是線性的固相干膠條PH4-7。本發明中，所述的總蛋白樣品進行水化上樣時上樣液中DTT的濃度為常規，較佳的是1 2mM，最佳的是1. 8mM，IPG緩沖液的濃度為常規，較佳的是0. 5% 2%，最佳的是
2 % ο本發明中，所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般范圍在10 28°C， 通常是25°C。本發明中，所述的等電聚焦可以是蛋白質組雙向電泳中常規的等電聚焦程序。 較佳的，等電聚焦的電泳程序為50V 4h, 100V 3h, 1000V 2h, 3000V2h, 5000V 2h, 10000V 10h，上限電流為50 μ A/膠條，溫度20°C。本發明中，第二向的電泳程序可以是蛋白質組雙向電泳中常規的第二向電泳程序。較佳的，第二向的電泳程序為起始條件，IW/膠條，2h，然后2W/膠條，直至當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳。本發明中，所述的凝膠的染色方法是本領域常規的方法，可以是考馬斯亮藍染色法或者銀染染色法。
本發明中，圖像用軟件進行分析的方法是本領域常規的方法，一般用軟件 ImageMaster 2D Platinum 7. 0進行分析，分析所得圖像的一致性和差異性。本發明的上述方法中未特別提到的都是采用本領域常規的技術。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之二是，一種頂頭孢霉總蛋白的提取方法，包括以下步驟a.將頂頭孢霉菌體用液氮研磨成精細的粉末狀；b.加入預冷的含有20mmol/L DTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中過夜；c.在4°C下，12000rpm離心25min，棄上清，取沉淀，此步驟可重復多次；d.沉淀放于室溫風干；e.在沉淀中加入雙向電泳樣品裂解液，室溫條件下浸提2h，此步驟中可以用無菌槍頭吹吸多次，使溶液與沉淀充分接觸，提高浸提效果；f.在4°C 12000rpm下離心20min，取上清，即得頂頭孢霉總蛋白質樣品溶液；雙向電泳樣品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG緩沖液，40mM DTT。本發明中，上述優選條件在符合本領域常識的基礎上可任意組合，即得本發明各較佳實例。 本發明除特別說明之外，所用的百分比都是質量百分比。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現有技術，本發明的有益效果如下本發明通過建立一種適合于絲狀真菌頂頭孢霉的蛋白質組制備方法，獲得可用于比較蛋白質組學研究的樣品，利用雙向電泳檢測總蛋白提取的質量。頭孢菌素C在生產頭孢類抗生素中具有重要地位，可由此開展對頂頭孢霉的蛋白質組學研究，為優化頭孢菌素產生菌的分子育種及代謝工程打下基礎，具有重要的意義。
以下結合
本發明的特征和有益效果。圖1是采用寬范圍線性Immobiline DryStrip膠條，pH值3_10，24cm長，采用 0. 5%濃度IPG緩沖液3-10，電泳條件為120kVh的雙向電泳凝膠的膠體考染圖。圖2是采用寬范圍非線性(NL)的Immobiline DryStrip膠條，pH值3-10，24cm 長，采用2%濃度IPG緩沖液3-10NL，電泳條件為120kVh的雙向電泳凝膠的膠體考染圖。圖3是采用中等范圍線性Immobiline DryStrip膠條，pH值4_7，24cm長，采用2% 濃度IPG緩沖液4-7，電泳條件為120kVh的雙向電泳凝膠的膠體考染圖。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發明人通過對頂頭孢霉CPC產生菌Acremonium chrysogenum 46117進行發酵培養七天后，發酵液離心后取菌體沉淀進行蛋白質組樣品的制備，經過雙向電泳技術對制備的樣本質量進行檢測。證明所制備的樣本在完整性和重復性方面都比較好。實施例1頂頭孢霉蛋白質組樣本的提取
1、頂頭孢霉Acremonium chrysogenum 46117斜面培養與菌種保藏將頂頭孢霉CPC產生菌Acremonium chrysogenum ATCC46117接種于表面濕潤的基礎培養基斜面(麥芽汁20%，麥芽糖4.0，聚胨1%，ρΗ 7. O，加純化瓊脂粉2%)，于28°C 恒溫培養10 14d(天)，直至長出豐滿的孢子。長好的斜面置于4°C冰箱可保存1個月左右。較長期的保存采取向節孢子懸浮液中加入等體積40%的無 菌甘油，混勻后用液氮速凍并迅速置于-70°C保存。長期保存需將節孢子與脫脂牛奶混勻，分裝冷凍玻璃管，然后用冷凍干燥機凍干，最后抽真空封口，置4°C保存。2、頂頭孢霉 Acremonium chrysogenum ATCC 46117 的發酵培養從培養約IOd的斜面上刮下適量孢子，接種于裝量為20ml的種子培養基(玉米漿，6%，蔗糖，3.5%，葡萄糖，0.5%，甲硫氨酸，0.05%，(NH4)2SO4,0.8，CaCO3,0. 5，豆油，
0.2ml/20ml, pH 6. 5) (w/v)中，于旋轉式搖床培養3d，轉速為230r/min，溫度28 °C。然后再以10% (ν/ν)接種量轉接至裝量為20ml發酵培養基[玉米漿，10%，淀粉，3%，糊精6% 葡萄糖，0. 5 %，甲硫氨酸，0.6%,尿素，0. 3 %，KH2PO4,0.9%, MgSO4 · 7H20，0. 3%, (NH4) 2S04，
1.3%, CaCO3,1 微量元素溶液(FeSO4 · 7Η20，0· 8%, MnSO4 · H20,0. 2%, ZnSO4 · 7Η20, 0. 2%,CuSO4 ·5Η20，0· 2% ) 1ml，豆油，0. 4ml/20ml，pH，6. 2]的 250ml 搖瓶中，25°C，230rpm， 培養7d。3、頂頭孢霉發酵產物的HPLC檢測上述發酵液經普通定性濾紙過濾，收集濾液直接進行HPLC分析。采用大連依利特公司Hypersil 20DS，C18 (5 μ m，4. 6 X 150讓)柱，流動相為甲醇0. 2% (w/v)磷酸二氫鈉 (5 95)，檢測波長為254nm，流速lml/min，柱溫為40°C，進樣量為10 μ 1。4、頂頭孢霉蛋白質組的制備頂頭孢霉屬于絲狀真菌范疇，其細胞壁是由胞壁蛋白質與葡聚糖、甘露聚糖及幾丁質錯綜交織而成的厚而堅韌的壁狀結構，這使得絲狀真菌來源的蛋白質組制備較困難。 選擇合適的破壁方式使得胞內蛋白質釋放完全是胞內蛋白質組制備的關鍵。采用液氮多次研磨并加入一定濃度的DTT破壞所有含有二硫鍵的蛋白質的結構，輔助破壁。在裂解蛋白質時采用硫脲，輔助尿素對蛋白質進行變性，同時增加膜蛋白的溶解度。(1)將實施例2的發酵液離心，棄掉上清，分離出菌體沉淀，保存于_70°C。將保存于-70°C的菌體沉淀500mg用液氮研磨成精細的粉末狀，絲狀真菌細胞壁厚而堅韌，較難破壁，故研磨盡量徹底，以保證菌體完全破壁。(2)研磨后的細粉末置于1. 5ml的Eppendorf離心管中，加入約Iml預冷的含有 20mmol/L DTT的10% TCA丙酮溶液，顛倒數次混勻后置于_20°C中過夜沉淀蛋白。(3)過夜后的混合液在4°C下，12000rpm離心25min。棄掉上清，沉淀再加入約Iml 含有20mmol/L DTT的預冷丙酮溶液洗滌后，相同的條件下離心20min。(4)棄上清，沉淀放于室溫風干，待殘留的丙酮溶液揮發盡，直至沉淀干燥成細粉狀。(5)在沉淀中加入約400 μ 1含有尿素和硫脲的雙向電泳樣品裂解液(7Μ尿素，2Μ 硫脲，4% CHAPS，2% IPG緩沖液，40mM DTT)，室溫條件下浸提2h。在這之間要用無菌槍頭吹吸多次，使溶液與沉淀充分接觸，提高浸提效果。(6)樣品混合液在4°C 12000rpm下離心20min，取上清保存于_70°C，即為胞內蛋白質溶液。經分光光度法測定后蛋白濃度約在8mg/ml 12mg/ml之間，可用于雙向電泳技術檢測。實施例2雙向電泳對蛋白組樣本進行分離取總量為Img的蛋白樣品與尿素水化溶液(8M尿素，2% CHAPS, 0. 5% IPG緩沖液， 18mM DTT, 0. 002%溴酚藍)混合成總量為450 μ 1的上樣液，室溫放置Ih (25°C )，期間輕柔搖動。將水化好的蛋白質溶液放入DryStrip泡漲盤中，拖動24cm的Immobiline DryStrip 干膠條使蛋白質溶液均勻浸泡膠條，泡漲12 16h(25°C )。將泡漲后膠條轉移至Manifold 膠條槽中，采用用Ettan IPGphor III系統進行等電聚焦，聚焦程序為(24cm膠條)50V 4h， IOOV 3h, 1000V 2h, 3000V 2h, 5000V 2h, 10000V 10h，上限電流為 50 μ A/膠條，聚焦溫度 20°C。聚焦完成后，配制SDS平衡母液(6M尿素，75mMTris-Cl pH 8. 8，29. 3%甘油，2% SDS， 0. 002 %溴酚藍)，將IOml/膠條的平衡液I (SDS平衡母液中加入DTT 0. Img,平衡15min，取出膠條用去離子水進行清洗后加入IOml/膠條的平衡液II (SDS平衡母液中加入碘乙酰胺 0. 25mg/膠條)平衡。將平衡后膠條轉移至Ettan DAL Tsix系統制備的SDS-PAGE凝膠上 (配制方法按常規SDS電泳配制)，用瓊脂糖封膠。加入緩沖液(1. 5M Tris-HCl, pH8. 6和 0. 4% (w/v) SDS))，接通冷凝水，接通電源進行電泳，起始條件，Iff/膠條，2h，然后2W/膠條， 直至當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳采用雙向電泳膠體考染方法(由Neuhoff等修正)對制備的SDS-PAGE凝膠進行染色。首先將跑完的凝膠放于固定液(10%冰乙酸，40%無水乙醇)中固定過夜。然后輕輕倒出固定液，并將凝膠置于膠體考馬斯藍G-250染料工作液(8%硫酸銨，0. 8%磷酸， 0. 08%考馬斯藍光-250，20%甲醇；每塊凝膠約500ml)中進行膠體染色，染色時間在8h左右。染色完畢后的凝膠用去離子水清洗兩次，除去殘留的染料，再加入約400ml去離子水置于脫色搖床上進行背景脫色，時間約在24h，其間換水2-3次。背景干凈后的凝膠可置于凝膠掃描儀掃描儀上進行透射掃描，保存圖像，用LabScan軟件進行掃描，ImageMaster 2D Platinum 7. 0進行分析或直接用凝膠比較分析。實施例3雙向電泳不同條件下檢測蛋白質組雙向電泳的第一向是等電聚焦，依據各種蛋白質的等電點不同，且有向其等電點會聚的特性，蛋白質可以沿梯度分離至各自的等電點。第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照蛋白質和多肽的分子量大小將其分離。現在常用的分離蛋白質的膠條有線性和非線性之分，其pH值范圍有寬窄之別。線性和非線性膠條的區別在于線性膠條的等電點是等距分布的，而非線性膠條在4-7之間的距離被延長。寬范圍的膠條可以用于大略獲得蛋白分布的總體情況，而窄范圍膠條可以用于近距離研究所感興趣的蛋白質區域。本實驗分別嘗試了不同PH梯度的線性和非線性的膠條。既有寬范圍的PH3-10線性和pH3-10非線性膠條，也有窄范圍的pH4-7線性，比較詳細的獲得了蛋白質組中各種蛋白質在PH值和分子量方面的信息。最初采用pH值3-10的固相干膠條，其雙向電泳的凝膠染色圖見圖1。可見，得到的蛋白質分離效果不明顯。分析原因一方面是由于最初制備的蛋白樣本中含有干擾一向聚焦的物質，另一方面是頂頭孢霉偏酸性的生長環境導致胞內大部分蛋白也是偏酸性的。針對以上兩點，樣本進行水化時降低了 DTT的濃度，提高了 IPG的濃度；并且采用了寬范圍非線性的固相干膠條PH3-10NL，并且提高IPG緩沖液的濃度為2%，所得的雙向電泳的凝膠染色圖見圖2。從圖2中可以看出，蛋白分離效果有顯著改善。由于非線性的固相干膠條 PH3-10NL在4-7之間的距離被延長，以致等電點在4_7左右的蛋白質會分得比較開。因此又采用中等范圍的PH4-7的固相干膠條對制備的蛋白質樣本進行分離，雙向電泳的凝膠染色圖見圖3。圖3說明pH4-7線性的固相干膠條比較適合頂頭孢霉胞內蛋白質組的分離。
同時本實驗還對多批次的頂頭孢霉發酵菌進行實驗，證明采用以上制備方法得到的蛋白質溶液重復性比較高。同一菌株不同批次的樣品制備溶液所得到的雙向電泳圖譜比較一致，沒有明顯蛋白點的丟失。說明頂頭孢霉胞內蛋白質組的制備方法具有可行性和可重復性。
權利要求
1.一種頂頭孢霉蛋白質組的制備方法，其特征在于，包括以下步驟將頂頭孢霉菌體用液氮研磨成粉末狀后，用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白樣品；將所得的總蛋白樣品與水化溶液混合后，水化上樣，采用IPG固相膠條，然后進行等電聚焦，等電聚焦完成后將膠條平衡，然后轉移至SDS-PAGE凝膠上進行電泳，當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳，得凝膠；將所得的凝膠經染色后，用凝膠掃描儀透射掃描，將得到的圖像用軟件進行分析。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)制備頂頭孢霉雙向電泳的蛋白質樣品a.將頂頭孢霉菌體用液氮研磨成粉末狀，b.加入預冷的含有20mmol/LDTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中過夜；c.在4°C下，12000rpm離心25分鐘，棄上清，取沉淀；d.沉淀放于室溫風干；e.在沉淀中加入雙向電泳樣品裂解液，室溫條件下浸提2小時；f.在4°C12000rpm下離心20min，取上清，即得頂頭孢霉胞內蛋白質樣品，測總蛋白濃度，分裝，貯存于-80°C ；其中，所述雙向電泳樣品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG緩沖液，40mMDTT ；(2)雙向凝膠電泳取步驟(1)所得的總量為Img的蛋白樣品與水化溶液混合成總量為450 μ 1的上樣液， 水化上樣，均勻泡漲24cm的IPG固相膠條，將泡漲后膠條轉移至膠條槽中，進行等電聚焦；等電聚焦完成后，將膠條在平衡液I中平衡15分鐘，再在平衡液II平衡15分鐘。將平衡后膠條轉移至SDS-PAGE凝膠上，進行電泳，當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳， 得凝膠；其中，所述水化溶液8M尿素，2% CHAPS, 0. 5% IPG緩沖液，18mMDTT，0. 002%溴酚藍；SDS 平衡母液6M 尿素，75mM Tris-Cl pH 8. 8，29. 3%甘油，2% SDS，0. 002%溴酚藍;平衡液I :SDS平衡母液中加入DTT 0. Img/膠條；平衡液II =SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0. 25mg/膠條；(3)圖像采集分析將步驟(2)所得的凝膠經染色后，用凝膠掃描儀透射掃描，將得到的圖像用軟件進行分析。
3.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的IPG固相膠條是線性的固相干膠條PH3-10、非線性的固相干膠條pH3-10或者線性的固相干膠條pH4_7。
4.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的總蛋白樣品進行水化上樣時上樣液中DTT的濃度是1 2mM，IPG緩沖液的濃度是0. 5% 2%。
5.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的總蛋白樣品進行水化上樣時上樣液中IPG緩沖液的濃度是0. 5% 2%。
6.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的等電聚焦的電泳程序為 50V 4h, 100V 3h, 1000V 2h, 3000V 2h, 5000V 2h，10000V10h，上限電流為 50 μ A/膠條，溫度 20°C。
7.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，第二向的電泳程序為起始條件，IW/膠條，2h，然后2W/膠條，直至當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳。
8.一種頂頭孢霉總蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步驟a.將頂頭孢霉菌體用液氮研磨成精細的粉末狀；b.加入預冷的含有20mmol/LDTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中過夜；c.在4°C下，12000rpm離心25min，棄上清，取沉淀；d.沉淀放于室溫風干；e.在沉淀中加入雙向電泳樣品裂解液，室溫條件下浸提2h；f.在4°C12000rpm下離心20min，取上清，即得頂頭孢霉總蛋白質樣品溶液；其中，所述雙向電泳樣品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG緩沖液，40mMDTT。
9.如權利要求8所述的提取方法，其特征在于，步驟c重復2 5次。
10.如權利要求8所述的提取方法，其特征在于，步驟e中用無菌槍頭吹吸裂解液中的沉淀5 10次。
全文摘要
本發明公開了一種頂頭孢霉蛋白質組的制備方法，包括以下步驟將頂頭孢霉菌體用液氮研磨成粉末狀后，用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白樣品；將所得的總蛋白樣品與水化溶液混合后，水化上樣，采用IPG固相膠條，然后進行等電聚焦，等電聚焦完成后，將膠條平衡后轉移至SDS-PAGE凝膠上，進行電泳，當溴酚藍指示劑到達底部邊緣時停止電泳，得凝膠；將所得的凝膠經染色后，用凝膠掃描儀透射掃描，將得到的圖像用軟件進行分析。頭孢菌素C在生產頭孢類抗生素中具有重要地位，可由此開展對頂頭孢霉的蛋白質組學研究，為優化頭孢菌素產生菌的分子育種及代謝工程打下基礎，具有重要的意義。
文檔編號C07K1/30GK102443047SQ201010503369
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者劉紅, 劉艷, 朱寶泉, 朱春寶, 胡又佳, 龔桂花 申請人:上海醫藥工業研究院