專利名稱：從鷹嘴豆豆瓣中提取天然抗腫瘤活性蛋白質和多肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種從鷹嘴豆豆瓣中提取天然抗腫瘤活性蛋白質和多肽的方法。
背景技術：
目前腫瘤已成為僅次于心腦血管疾病的第二大殺手，盡管目前腫瘤治療模式取得 了很大進展，但是腫瘤仍是全球范圍內發病率和死亡率都很高的一種的疾病。在美國，腫瘤 是導致85歲以下人群死亡的主要原因。并且許多腫瘤，諸如皮膚癌，前列腺癌，乳腺癌，腎 癌等的發病率仍在持續上升。腫瘤嚴重威脅著人類健康，已經成為世界各國面臨的重要社 會問題之一。尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物是目前世界范圍內的研究熱點之一。然而，目前尚無一種抗腫瘤活性物質進行較大規模的商品化生產，其原因可能是 藥源問題難以解決，或者在具有明確的抗腫瘤活性同時也存在一定的毒副作用，難以在臨 床上直接使用。生物活性肽(bioactive peptides)是一類天然存在于動、植物和微生物等生物 體內，或動、植物蛋白質經過蛋白酶解以及人工化學合成、生物工程等方法也可以獲得。生 物體內已發現幾百種肽，是機體完成各種復雜生理活性必不可少的參與者。所有生物細胞 都能合成多肽物質，其功能活動也受多肽的調節。近年來，國內外研究者試圖從天然物質中 獲取具有單一活性抗腫瘤多肽，以克服現有藥物不良反應及腫瘤耐藥性。與傳統的化療和 放療相比，天然抗腫瘤活性多肽最大的優點在于相對分子質量小、活性高、不良反應小、易 于多途徑吸收、不易產生耐藥性。而且它們多存在內源性靶點、極易穿透腫瘤細胞、提高免 疫應答、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤生長和轉移等特點，已成為腫瘤治療研究的一個新熱 點ο幾十年來，人們一直在抗腫瘤藥物領域不停的探索，已經取得了一定的成果。從天 然資源中尋找特異性高、活性強、毒副反應小且使用面廣的抗腫瘤新藥研究已廣泛開展，目 前已發現很多天然來源的抗腫瘤藥物具有很好的療效，明確其作用機制，有利于開發利用 其有效結構并加以改進，使之更好的發揮分子靶向作用。隨著生物技術的不斷發展，抗腫瘤 藥物研發已經迎來新的時代，這也為抗腫瘤生物活性肽的研發提供了樂觀的前景。鷹嘴豆(Cicer arietinumol/L L.)屬于豆科，豌豆族，鷹嘴豆屬，在新疆有2500 年的生長歷史，是維吾爾醫常用藥材，維吾爾語名為諾胡提，已被收載在中華人民共和國衛 生部《藥品標準》維吾爾藥分冊和《維吾爾藥志》中，“它具有清除異常體液，開通體液閉阻， 調節機體等作用。用于身體瘦弱，性欲低下，食欲不振，皮膚瘙癢及糖尿病等疾病”。雖然鷹 嘴豆用藥歷史悠久，但其功能因子不清楚，特別是具有生物活性多肽類化合物的研究空白。本發明的目的在于提供一種從鷹嘴豆豆瓣中提取天然抗腫瘤活性蛋白質和多肽 的方法，該方法通過磷酸緩沖溶液提取、硫酸氨沉淀、以及脫鹽后離心等步驟純化得到具有 抗腫瘤活性的蛋白質和多肽，為維吾爾藥食兩用植物鷹嘴豆的生物活性物質基礎研究，并 開發相應的產品提供了依據。該方法制備過程簡單，又不易使蛋白質和多肽失活，制備的蛋 白質和多肽抗腫瘤活性高，無毒性、熱穩定性好，易于擴大規模生產，降低純化過程成本，是制備生物活性蛋白質和多肽的理想方法之一。通過該方法獲得的蛋白質和多肽作為制備食 品、藥品添加劑的用途
發明內容
本發明目的在于，提供一種從鷹嘴豆豆瓣中提取天然抗腫瘤活性蛋白質和多肽的 方法，該方法通過磷酸緩沖溶液提取、硫酸銨沉淀得到具有生物活性(如抗腫瘤活性)的蛋 白質和多肽，為維吾爾藥食兩用植物鷹嘴豆的生物活性物質基礎研究，并開發相應的產品 提供了依據。該方法提取過程簡單，又不易使蛋白質和多肽失活，制備的蛋白質和多肽抗腫 瘤活性高，無毒性、熱穩定性好，易于擴大規模生產，降低生產成本，是制備生物活性蛋白質 和多肽的理想方法之一。通過該方法獲得的蛋白質和多肽作為制備食品、藥品添加劑的用 途。本發明所述的一種從鷹嘴豆豆瓣中提取天然抗腫瘤活性蛋白質和多肽的方法，按 下列步驟進行a、將鷹嘴豆清洗除去雜物，浸泡Ih-Sh ；b、將步驟a清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，溫度為15_30°C，水溫 15-30°C，淋水時間3-10秒，淋水間隔2-6小時，發芽時間3-7天；C、將步驟b發芽的鷹嘴豆豆芽上的芽和豆瓣分開，并分別晾干；d、將步驟c晾干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過10-60目篩后，用正己烷進行冷浸脫脂， 所得脫脂粉備用；e、將步驟d脫脂粉用液氮研磨，再用磷酸緩沖液攪拌提取，時間為1-5小時，過濾， 將濾液用低溫離心機除去沉淀，得到上清液備用；f、將步驟e上清液加入無水硫酸氨，充分攪拌溶解后放置冰箱靜置24小時，低溫 離心，時間20min，將沉淀用水溶解透析脫鹽后，再進行低溫離心，時間20min，沉淀干燥即 可得到抗腫瘤活性蛋白質和多肽；g、再利用常規方法十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定提取的蛋白質和 多肽的成分及其分子量，對提取的蛋白質和多肽進行抑制結腸癌細胞的活性來確定提取的 蛋白質和多肽的抗腫瘤活性。步驟e、f和g中的提取、分離、純化過程所用水均為三蒸水。步驟e、f中的低溫離心速度為12000轉/分。步驟e中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0. 01-0. lmol/L,ρΗ = 4. 0-10.0。 步驟f中無水硫酸銨飽和度為30 % -80 %。通過本發明所述的方法獲得的鷹嘴豆天然抗腫瘤活性蛋白質和多肽作為制備食 品或藥品的添加劑的用途。
圖1為本發明鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽的15% SDS-PAGE考馬斯染色圖， 其中0 標準蛋白標記，甲狀旁腺激素(1-34) (4. lkDa)，抑肽酶(6. 5kDa)，甲狀旁腺激 素(1-84) (9.5kDa)，溶菌酶(14. 4kDa)，胰蛋白酶抑制劑(20. OkDa)，磷酸丙糖異構酶(27. OkDa)，豬胃蛋白酶(35. OkDa)，卵清蛋白(45. OkDa)，牛血清白蛋白(66. OkDa)；圖中1 號為實施例1 ；2號為實施例2 ；3號為實施例3 ；4號為實施例4 ；5號為實施例5 ；6號為實 施例6。
具體實施例方式實施例1 鷹嘴豆豆瓣的制備將Ikg鷹嘴豆清洗除去外雜物，浸泡Ih ；將清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，豆芽箱的溫度為15°C，水溫20°C，淋水 時間3秒，淋水間隔2小時，發芽時間4天；將發芽4天的鷹嘴豆的芽和豆瓣分開，并分別晾干；將干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過10目篩后，用正己烷進行冷浸脫脂，所得脫脂粉備 用；蛋白質和多肽的提取取100克脫脂的鷹嘴豆豆瓣粉用液氮研磨，再用濃度為0. lmol/L, pH = 6. 0的磷 酸緩沖液在溫度4°C攪拌提取2小時，將提取液先用紗布過濾，再用低溫離心機除去沉淀， 得到上清液備用；蛋白質和多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為30 %，充分攪拌溶解后放入冰箱 中靜置24小時，低溫離心，時間20min，將沉淀透析脫鹽，將脫鹽后的蛋白質和多肽溶液再 次低溫離心，時間20min，得到水溶性蛋白質和多肽以及水不溶的蛋白質和多肽，并分別低 溫干燥，水不溶的蛋白質和多肽部位即為抗腫瘤活性蛋白質和多肽。所述的方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽作為制備食品或藥品的添加劑 的用途。實施例2鷹嘴豆豆瓣的制備將Ikg鷹嘴豆清洗除去外雜物，浸泡4h ；將清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，豆芽箱的溫度為20°C，水溫15°C，淋水 時間5秒，淋水間隔6小時，發芽時間3天；將發芽3天的鷹嘴豆的芽和豆瓣分開，并分別晾干；將干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過40目篩后，用正己烷進行冷浸脫脂，所得脫脂粉備 用；蛋白質和多肽的提取取100克脫脂的鷹嘴豆豆瓣粉用液氮研磨，再用濃度為0. 05mol/L,pH = 7. 0的磷 酸緩沖液在溫度4°C攪拌提取1小時，將提取液先用紗布過濾，再用低溫離心機除去沉淀， 得到上清液備用；蛋白質和多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為50 %，充分攪拌溶解后放入冰箱 中靜置24小時，低溫離心，時間20min，沉淀，將沉淀物采用透析脫鹽，將脫鹽后的蛋白質和多肽溶液再次低溫離心，時間20min，得到水溶性的蛋白質和多肽以及水不溶的蛋白質和多 肽，并分別低溫干燥，水不溶的蛋白質和多肽部位即為抗腫瘤活性蛋白質和多肽。所述的方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽作為制備食品或藥品的添加劑 的用途。實施例3鷹嘴豆豆瓣的制備 將Ikg鷹嘴豆清洗除去外雜物，浸泡5h ；將清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，豆芽箱的溫度為25°C，水溫25°C，淋水 時間7秒，淋水間隔4小時，發芽5天；將發芽5天的鷹嘴豆的芽和豆瓣分開，并分別晾干；將干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過60目篩后，用正己烷進行冷浸脫脂，所得脫脂粉備 用；蛋白質和多肽的提取取100克脫脂的鷹嘴豆豆瓣粉用液氮研磨，再用濃度為0. 07mol/L,pH = 5. 0的磷 酸緩沖液在溫度4°C攪拌提取3小時，將提取液先用紗布過濾，再用低溫離心機除去沉淀， 得到上清液備用；蛋白質和多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為70 %，充分攪拌溶解后放入冰箱 中靜置24小時，低溫離心，時間20min，沉淀，將沉淀物采用透析脫鹽，將脫鹽后的蛋白質和 多肽溶液再次低溫離心，時間20min，得到水溶性蛋白質和多肽以及水不溶的蛋白質和多 肽，并分別低溫干燥，水不溶的蛋白質和多肽部位即為抗腫瘤活性蛋白質和多肽。所述的方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽作為制備食品或藥品的添加劑 的用途。實施例4鷹嘴豆豆瓣的制備將Ikg鷹嘴豆清洗除去外雜物，浸泡8h ；將清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，豆芽箱的溫度為30°C，水溫30°C，淋水 時間8秒，淋水間隔5小時，發芽6天；將發芽6天的鷹嘴豆的芽和豆瓣分開，并分別晾干；將干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過50目篩后，用正己烷進行冷浸脫脂，所得脫脂粉備 用；蛋白質和多肽的提取取100克脫脂的鷹嘴豆豆瓣粉用液氮研磨，再用濃度為0. 01mol/L,pH = 9. 0的磷 酸緩沖液在溫度4°C攪拌提取5小時，將提取液先用紗布過濾，再用低溫離心機除去沉淀， 得到上清液備用；蛋白質和多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為40 %，充分攪拌溶解后放入冰箱 中靜置24小時，低溫離心，時間20min，沉淀，將沉淀物采用透析脫鹽，將脫鹽后的蛋白質和 多肽溶液再次低溫離心，時間20min，得到水溶性蛋白質和多肽以及水不溶的蛋白質和多肽，并分別低溫干燥，水不溶的蛋白質和多肽部位即為抗腫瘤活性蛋白質和多肽。所述的方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽作為制備食品或藥品的添加劑 的用途。實施例5鷹嘴豆豆瓣的制備將Ikg鷹嘴豆清洗除去外雜物，浸泡2h ；將清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，豆芽箱的溫度為22°C，水溫25°C，淋水 時間10秒，淋水間隔6小時，發芽7天；將發芽7天的鷹嘴豆的芽和豆瓣分開，并分別晾干；將干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過30目篩后，用正己烷進行冷浸脫脂，所得脫脂粉備 用；蛋白質和多肽的提取取100克脫脂的鷹嘴豆豆瓣用液氮研磨，再用濃度為0. 03mol/L,pH = 4. 0的磷酸 緩沖液在溫度4°C攪拌提取4小時，將提取液先用紗布過濾，再用低溫離心機除去沉淀，得 到上清液備用；蛋白質和多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為60%，充分攪拌溶解后放入冰箱 中靜置24小時，低溫離心，時間20min，沉淀，將沉淀物采用透析脫鹽，將脫鹽后的蛋白質和 多肽溶液再次低溫離心，時間20min，得到水溶性蛋白質和多肽以及水不溶的蛋白質和多 肽，并分別低溫干燥，水不溶的蛋白質和多肽部位即為抗腫瘤活性蛋白質和多肽。所述的方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽作為制備食品或藥品的添加劑 的用途。實施例6鷹嘴豆豆瓣的制備將Ikg鷹嘴豆清洗出去外雜物，浸泡6h ；將清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，豆芽箱的溫度為20°C，水溫20°C，淋水 時間4秒，淋水間隔3小時，發芽4天；將發芽4天的鷹嘴豆的芽和豆瓣分開，并分別晾干；將干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過20目篩子后，用正己烷進行冷浸脫脂，所得脫脂粉蛋白質和多肽的提取取100克脫脂的鷹嘴豆豆瓣粉用液氮研磨，再用濃度為0. 08mol/L, pH = 10. 0的 磷酸緩沖液在溫度4°C攪拌提取3小時，將提取液先用紗布過濾，再用低溫離心機除去沉 淀，得到上清液備用；蛋白質和多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為80 %，充分攪拌溶解后放入冰箱 中靜置24小時，低溫離心，時間20min，沉淀，將沉淀物采用透析脫鹽，將脫鹽后的蛋白質和 多肽溶液再次低溫離心，時間20min，得到水溶性蛋白質和多肽以及水不溶的蛋白質和多 肽，并分別低溫干燥，水不溶的蛋白質和多肽部位即為抗腫瘤活性蛋白質和多肽。
7
所述的方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽作為制備食品或藥品的添加劑 的用途。實施例7通過本發明所述方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽進行分子量范圍的確 定試劑配制及樣品處理樣品緩沖液0. 5mL的0. 5mol/L的三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(pH 6. 8)、2mL的 10%十二烷基磺酸鈉、ImL甘油、0. 5mL的β -巰基乙醇、ImL的水、微量的溴酚藍；樣品的處理樣品溶液和樣品緩沖液等體積混合，隔水煮沸lOmin，離心IOmin ；電極緩沖液將15. 1克三羥甲基氨基甲烷、94克甘氨酸、50mL的10%十二烷基磺 酸鈉溶解并定容至4L。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儲存液30% (W/V)丙烯酰 胺、0. 8% (ff/V)N, N，-甲叉雙丙烯酰胺；15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠配制1. lmL&H20、2. 5mL的 30% (V/V)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儲存液、1. 3mL的1. 5mol/L的三羥甲基 氨基甲烷-氯化氫(pH 8. 8)、0. 05mL的10% (W/V)十二烷基磺酸鈉、0. 05mL的10% (W/V) 過硫酸銨、0. 002mL的N，N，N，，N，-四甲基乙二胺；5%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠配制0. 68mL的H20、0. 17mL 的30% (V/V)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儲存液、0. 13mL的0. 5mol/L的三羥 甲基氨基甲烷_氯化氫(pH 6. 8)、0. OlmL的10% (W/V)十二烷基磺酸鈉、0. OlmL的10% (W/V)過硫酸銨、0. OOlmL的N, N，N，，N，-四甲基乙二胺；電泳條件恒壓100伏，電泳時間約2小時。考馬斯亮藍脫色液25%無水乙醇、8%的冰乙酸。考馬斯亮藍染色液將0. 6克的考馬斯亮藍G-250溶解在300mL的脫色液中，過 濾，棕色瓶儲存；電泳結束后將凝膠片置于考馬斯亮藍染色液中4h，再用脫色液浸泡至背景色褪色 完全為止。實施例8通過本發明所述方法獲得的鷹嘴豆豆瓣活性蛋白質和多肽抗腫瘤活性的確定取培養4-5天，處于指數生長期的細胞培養一瓶，加入適量胰蛋白酶-乙二胺四乙 酸溶液，使貼壁細胞脫落，用IOmL含5%胎牛血清的美國Sigma 1640培養液配成懸液；用臺盼藍染色后在血球計數板上做細胞計數，一般不著色的活細胞應在97%以 上；用完全培養基稀釋細胞懸液，配成每IOOmL含5000-40000個細胞；取96孔平板，每孔加細胞懸液100 μ L，加細胞的過程應控制在4小時內，將平板置 于37°C CO2 (5% )溫箱24小時；受試化合物作5個稀釋度，最大濃度為10-4mol/L，依次作1 10稀釋(10_4， 10-5，10-6，10-7，10-8mol/L)。天然產物的粗提物最大濃度用250 μ g/mL,也作1 10稀釋。 樣品一般不需要加熱消毒或過濾，為了避免污染，在稀釋樣品用的完全培養基中加50yg/ mL慶大霉素；
將平板在，含5% CO2空氣及100%濕度的溫箱中孵育2-4天；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽用無血清美國Sigma 1640培養 液配成lmg/mL溶液，每孔加50，37°C溫育4小時，使MTT還原為甲臜；吸出上清液，加入150yL 二甲基亞砜使甲臜溶解，用平板搖床搖勻；用自動化分光光度平板讀數計(Model312，BiotechResearchLaboratories，Inc.， Rockville, Md)在550nm處測定每個小孔的光密度。結果分析細胞的存活率將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養基加3-(4，5- 二甲 基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，無細胞)或空白藥物孔OD值(完全培養基加受試藥 物的不同稀釋度加3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽，無細胞)，各重復孔的 OD值取均數士 SD。細胞的存活率以T/C%表示，T為加藥細胞的OD值，C為對照細胞的OD值。細胞存活率(加藥細胞OD/對照細胞0D) X 100求出T/C = 50時的藥物濃度(IC5tl)。所得蛋白質和多肽的IC5tl濃度
權利要求
一種從鷹嘴豆豆瓣中提取天然抗腫瘤蛋白質和多肽的方法，其特征在于按下列步驟進行a、將鷹嘴豆清洗除去雜物，浸泡1h 8h；b、將步驟a清洗、浸泡的鷹嘴豆放入豆芽箱內發芽，溫度為15 30℃，水溫15 30℃，淋水時間3 10秒，淋水間隔2 6小時，發芽時間3 7天；c、將步驟b發芽的鷹嘴豆豆芽上的芽和豆瓣分開，并分別晾干；d、將步驟c晾干燥的鷹嘴豆豆瓣粉碎，過10 60目篩后，用正己烷進行冷浸脫脂，所得脫脂粉備用；e、將步驟d脫脂粉用液氮研磨，再用磷酸緩沖液攪拌提取，時間為1 5小時，過濾，將濾液用低溫離心機除去沉淀，得到上清液備用；f、將步驟e上清液加入無水硫酸氨，充分攪拌溶解后放置冰箱靜置24小時，低溫離心，時間20min，將沉淀用水溶解透析脫鹽后，再進行低溫離心，時間20min，沉淀干燥即可得到抗腫瘤活性蛋白質和多肽；g、再利用常規方法十二烷基磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳確定提取的蛋白質和多肽的成分及其分子量，對提取的蛋白質和多肽進行抑制結腸癌細胞的活性來確定提取的蛋白質和多肽的抗腫瘤活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟e、f和g中的提取、分離、純化過程所 用水均為三蒸水。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟e、f中的低溫離心速度為12000轉/分。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟e中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為 0. 01-0. lmol/L, pH = 4. 0-10. 0。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟f中無水硫酸銨飽和度為30%-80%。
全文摘要
本發明涉及一種從鷹嘴豆豆瓣中提取天然抗腫瘤活性蛋白質和多肽的方法，該方法通過磷酸緩沖溶液提取、硫酸銨沉淀，除鹽和離心等步驟，即可得到能夠抑制結腸癌細胞活性的蛋白質和多肽。為維吾爾藥食兩用植物鷹嘴豆的生物活性物質基礎研究，并開發相應的產品提供了依據。該方法提取過程簡單，又不易使蛋白質和多肽失活，制備的多肽生物活性高，無毒性、熱穩定性好，易于擴大規模生產，降低提取過程的成本，是提取制備生物活性蛋白質和多肽的理想方法之一。通過該方法獲得的蛋白質和多肽作為制備功能食品或藥品添加劑的用途。
文檔編號C07K1/14GK101962399SQ201010502809
公開日2011年2月2日 申請日期2010年10月11日 優先權日2010年10月11日
發明者阿吉艾克拜爾·艾薩, 阿布力米提·伊力, 馬慶苓 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所