專利名稱：一種魚皮膠原蛋白的制備方法
技術領域：
本發明屬于魚皮膠原蛋白加工領域，具體涉及一種可以作為魚類細胞培養載體的 魚皮膠原蛋白制備方法。
背景技術：
膠原蛋白是一種重要的功能性蛋白質，膠原蛋白含有一種獨特的氨基酸-羥脯氨 酸(Hyp)，膠原蛋白與細胞增生、分化、運動、免疫、關節潤滑、傷口愈合等密切相關。由于膠 原蛋白的特殊功能，已被廣泛應用于醫藥、食品、日用化工、生物合成等工業領域，如醫用膠 囊、外科手術材料、食用明膠、照相明膠、化妝品等。目前生產的膠原蛋白的原料主要是豬、牛等陸生哺乳動物的皮、骨和肌腱，因近年 來隨著導致瘋牛病、口蹄疫等流行病的發生，使得從陸生動物皮、骨中提取膠原蛋白的危險 性增大。歐、美、日本等國家相繼出臺了不少法規，限制從牛等哺乳動物皮、骨中提取物用于 食品、醫藥等對人體直接影響的產品中。因而，從水生動物魚皮中提取安全、衛生、無害的膠 原蛋白已成為當前國內外研發的一個熱門課題。我國養殖魚類產量多年來一直位居世界第 一，同時，隨著羅非魚、斑點叉尾鮰魚片加工業的發展，具有大量的魚皮資源，從這些廢棄物 中提取膠原蛋白并加以多用途利用，具有較大的開發前景。動物細胞培養需要膠原蛋白作為支持載體，常規的膠原蛋白主要為牛皮膠原和鼠 尾膠原I型膠原蛋白，主要是為了可改善培養瓶、或培養板表面性狀，有利于細胞貼壁生 長。在我們的實驗中發現，使用牛皮膠原蛋白或鼠尾膠原蛋白作為支持載體，用于草魚腸道 原代上皮細胞、肝臟原代細胞培養時細胞貼壁速度慢，細胞生長不是很理想。現有技術中，利用魚皮提取膠原蛋白的方法有以下幾種1、專利號為02111683. 0的中國發明專利公開了一種以深海魚皮為原料的生物相 容性好的膠原蛋白及其制備方法通過堿溶液處理魚皮，再利用限制性酶解方法處理上述 魚皮，凈化酶解上清液即得可降解生物相容性的魚皮膠原蛋白；該技術方案中，堿性條件容 易造成肽鍵水解，不易獲得完整的大分子膠原蛋白，而且酶的使用使得成本提高，并且，該 技術方案中膠原蛋白的得率也不高，為5% 8%質量百分數，得率不高。2、專利號為200710024384.0的中國發明專利公開了一種淡水魚皮膠原蛋白的 制備方法，屬于水產加工技術領域將魚皮洗凈、浙干、剪碎后；首先用含有0. 005% -2% (V/V)雙氧水的0. 001-0. 2M的堿液浸泡3-48H ；高速攪拌后，再用有機試劑清洗、浸泡； 然后用含有0.01%-2% (M/V)胃蛋白酶的PH在1.0-5.0的酸液提取12-64H，所得體 系用30-10CMM的膜過濾后，再用1-3CMM的膜過濾；最后向濾液中加入5M NaCl溶液至 0. 8-2. 0M，離心所得沉淀用0. 001-0. IM乙酸溶解，蒸餾水透析，冷凍干燥，即可得到潔白無 腥味的膠原蛋白固體；該技術方案中，酶的使用使得成本提高。3、專利號為200510047408. 5的中國發明專利公開了一種酸溶性魚皮膠原蛋白， 包括原料處理、提取、鹽析、純化透析干燥步驟，具體包括(1)原料處理海魚皮為原料，切碎；
(2)提取=NaCl溶液浸泡去雜質、乙醇丙酮脫脂的處理，進而用檸檬酸和醋酸的混 合液浸泡提取后離心分離得酸溶性魚皮膠原溶液；(3)鹽析再經NaCl固體鹽析得酸溶性魚皮膠原蛋白沉淀；(4)純化透析干燥最后將酸溶性魚皮膠原蛋白沉淀溶解于醋酸溶液中，而后在 Na2HPO4 (pH8. 6)中透析，或經分子量大于6萬的醋酸纖維中空纖維膜進行超濾處理，透析或 超濾得到的固體真空冷凍干燥即可得到產品。產品潔白，無腥味，冷凍干燥后呈海綿狀。膠 原蛋白制品純度達>97%。膠原蛋白中含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸，其水解產物 中還有生理活性肽，膠原蛋白分子量大于60000，含有3條異種α鏈，S卩α (Ι)、α2(Ι)和 α 3(1)，該方案中膠原蛋白的得率為12% 14%質量百分數，得率不高。4、專利號為200610036860. 6的中國發明公開了一種提取膠原的方法及用膠原制 備膠原蛋白的方法，以羅非魚皮為原料，將魚皮剪碎后加入正己烷，脫脂后用0. 05 0. 2Μ 的NaOH溶液除雜蛋白，然后用醋酸溶液提取膠原蛋白，經濃縮、冷凍干燥得到膠原。并且，上述4種方案并沒有指出所得魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養載體具有意 想不到的效果。
發明內容
本發明的目的是提供一種魚皮膠原蛋白的制備方法，在保持所得魚皮膠原蛋白的 生物特性、純度的基礎上，提高得率，并且應用所得魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養載體。為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為一種魚皮膠原蛋白的制備方法，包 括原料處理、提取、鹽析、純化透析干燥步驟，其中，所述原料處理、提取步驟具體包括(1)原料處理清除魚鱗，將魚皮剪成碎粒，按照固液比為1 15 25，將氫氧化 鈉(NaOH)水溶液加入魚皮碎粒，1 5°C下浸泡3 5h，用20目篩卷網過濾得魚皮濾渣，風 干；以魚皮濾渣的體積份為1份，用3 5份的無水乙醚于35 40°C回流3 4h，除去魚 皮的脂肪，然后風干，得到除脂后的魚皮渣；其中，所述魚皮碎粒的尺寸約為2mmX2mmX2mm ；所述氫氧化鈉水溶液的濃度為 0. 04M 0. 05M ；(2)提取按照固液比為1 50 70，將0.5 0.6M乙酸加入除脂后的魚皮渣 中，浸提60 80h，40目篩卷網過濾得到含魚皮膠原蛋白的濾液；重復進行一次。上述技術方案中，所述原料選自草魚、斑點叉尾鮰或羅非魚的魚皮，魚皮可以是 干燥的也可以是新鮮的。上述技術方案中，所述鹽析步驟為經終濃度為2. 5M氯化鈉(NaCl)鹽析得到膠原 蛋白沉淀。上述技術方案中，所述純化透析干燥步驟為將步驟(3)所得膠原蛋白沉淀溶解 于0. 5M乙酸，然后先以0. 5M乙酸為透析外液進行透析3 5次、再以雙蒸水作為透析外液 進行透析，直至透析外液檢測不到氯離子，以保留分子量IOOkDa以上的膠原蛋白；收集透 析后的膠原蛋白液體，采用冷凍干燥方法進行干燥，得到魚皮膠原蛋白。本發明同時要求保護采用上述技術方案得到的魚皮膠原蛋白，所述魚皮膠原蛋白 的羥脯氨酸含量為8. 2 8. 5%質量百分數，膠原蛋白純度平均值為89. 92 94. 62% ；所 述魚皮膠原蛋白含有3種I型膠原蛋白，S卩116KDa的α UlOOKDa的α 2肽鏈以及200KDa的β鏈。采用上述魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養的支持載體時，細胞親和性好、貼壁速 度快、細胞生長良好、生長密度高，相對于牛皮膠原蛋白或鼠尾膠原蛋白而言取得了顯著的 進步，因此，本發明同時要求保護上述魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養的支持載體的應用， 以及應用上述魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養的方法，具體包括以下步驟將上述魚皮膠 原蛋白粉以質量含量0. 13 0. 15%的量溶解于0. IM乙酸中，并均勻鋪滿細胞培養瓶、或細 胞培養板內表面，作為魚類細胞培養的支持載體。上述技術方案中，所述魚類細胞優選自草魚腸道原代上皮細胞、草魚肝臟原代細 胞。由于上述技術方案的采用，與現有技術相比，本發明具有如下優點1、本發明中使用無水乙醚去除脂肪，既便于干燥，又可以提高魚皮膠原蛋白收 率；2、本發明中使用0. 5 0. 6Μ乙酸作為膠原蛋白提取溶劑，可以提高魚皮膠原蛋白 收率；整個工藝中均使用乙酸作為溶劑，適合于魚類細胞培養支持載體的需要；3、本發明整個制備過程中均為低溫操作(低于40°C )，保持了魚皮膠原蛋白的生 物學特性，更適合魚類細胞培養的需要；4、本發明所述魚皮膠原蛋白經過透析出去小分析物質、采用冷凍干燥得到魚皮膠 原蛋白粉，可以滿足作為魚類細胞培養支持載體的需要。
圖1為實施例一所得魚皮膠原蛋白的電泳圖；圖2a為實施例七中使用魚皮膠原蛋白作為支持載體培養的草魚肝臟原代細胞的 效果圖；圖2b為實施例七中使用魚皮膠原蛋白作為支持載體培養的草魚腸道原代上皮細 胞的效果圖；圖3a為實施例八中以魚皮膠原蛋白為支持載體培養90min后的草魚腸道原帶細 胞效果圖；圖3b為實施例八中以鼠尾膠原蛋白為支持載體培養的草魚腸道原帶細胞效果 圖；圖4a為實施例八中以魚皮膠原蛋白為支持載體培養12h后的草魚肝臟原帶細胞 效果圖；圖4b為實施例八中以牛皮膠原蛋白為支持載體培養的草魚肝臟原帶細胞效果 圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。實施例一，魚皮膠原蛋白制備方法以風干的羅非魚為原料，經攪碎成2mmX2mmX 2mm左右大小碎粒后，進行以下操 作
(1)按照固液比為1 20加入0. 05M NaOH、4°C下浸泡魚皮碎粒4h，用20目篩卷 網過濾得魚皮濾渣，風干；風干的魚皮濾渣用3 5倍體積的無水乙醚、40°C水浴回流3 4h，除去脂肪，風干得到除脂后的魚皮渣；(2)按照固液比1 60加入0. 5M乙酸于除脂后的魚皮渣中，4°C下浸提72h，40 目篩卷網過濾得濾液；重復進行一次；(3)在濾液中加入NaCl粉末，至終濃度為2. 5M，使膠原蛋白鹽析；于4°C、6500rpm 離心30min，收集沉淀物；(4)按照沉淀物3倍體積量加入0. 5M乙酸溶解，得膠原蛋白溶解液；將膠原蛋白 溶解液裝入直徑22mm透析袋中，以保留分子量IOOkDa以上的膠原蛋白，先用10倍體積的 0. 5M乙酸作為透析外液，4°C、1 2轉/min (搖床)下透析5次，每次2 3小時；再用雙 蒸水為透析外液，4°C、1 2轉/min (搖床)下透析48h，以0. IM AgNO3檢測透析外液無沉 淀為止；收集透析后的膠原蛋白液體于冷凍干燥機種冷凍干燥，得到可以用作魚類細胞培 養載體的魚皮膠原蛋白粉，得到魚皮膠原蛋白粉8. 56g。以魚皮為原料，計算魚皮膠原蛋白的收率；采用氨基酸分析儀測定魚皮膠原蛋白 的羥脯氨酸含量；采用8%膠濃度的SDS-PAGE電泳分析所得膠原蛋白成分以及純度，電泳 圖參見圖1，由圖可知最終得到I型膠原蛋白的116KDa、IOOKDa的α 1和α 2肽鏈，以及 200KDa的β鏈，共3條蛋白條帶，膠原蛋白純度已達SDS-PAGE純度。實施例二，參照實施例一，區別在于，步驟(2)中，固液比為1比50，乙酸的濃度為 0. 6Μ，浸提時間為60h。實施例三，參照實施例一，區別在于，步驟(2)中，固液比為1比70，乙酸的濃度為 0. 5M，浸提時間為80h。結果見表1 實施例一至三所得魚皮膠原蛋白收率分別為40. 18士0.052 %、 39. 76 士 0. 012%,39. 76 士 0. 013 % ；反映魚皮膠原蛋白純度的羥脯氨酸含量分別為 8. 47 士 0. 06%,8. 33 士 0. 16%,8. 3 士 0. 2 %，其魚皮膠原蛋白含量分別為 93. 98 士 0. 64%, 92. 50士 1. 28%,92. 13士2. 22% ；表1 無水乙醚脫脂、0. 5 0. 6M乙酸工藝提取魚皮膠原蛋白的收率及純度
權利要求
一種魚皮膠原蛋白的制備方法，包括原料處理、提取、鹽析、純化透析干燥步驟，其特征在于，所述原料處理、提取步驟具體包括(1)原料處理清除魚鱗，將魚皮剪成碎粒，按照固液比為1∶15～25，將氫氧化鈉水溶液加入魚皮碎粒，1～5℃下浸泡3～5h，用20目篩卷網過濾得魚皮濾渣，風干；以魚皮濾渣的體積份為1份，用3～5份的無水乙醚于35～40℃回流3～4h，除去魚皮的脂肪，然后風干，得到除脂后的魚皮渣；所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0.04M～0.05M；(2)提取按照固液比為1∶50～70，將0.5～0.6M乙酸加入除脂后的魚皮渣中，浸提60～80h，40目篩卷網過濾得到含魚皮膠原蛋白的濾液；重復進行一次。
2.根據權利要求1所述魚皮膠原蛋白的制備方法，其特征在于，所述原料選自草魚、 斑點叉尾鮰或羅非魚的魚皮。
3.根據權利要求1所述魚皮膠原蛋白的制備方法，其特征在于，所述鹽析步驟為經終 濃度為2. 5M氯化鈉鹽析得到膠原蛋白沉淀。
4.根據權利要求1所述魚皮膠原蛋白的制備方法，其特征在于，所述純化透析干燥步 驟為將步驟(3)所得膠原蛋白沉淀溶解于0. 5M乙酸，然后先以0. 5M乙酸為透析外液進 行透析3 5次、再以雙蒸水作為透析外液進行透析，直至透析外液檢測不到氯離子，以保 留分子量IOOkDa以上的膠原蛋白；收集透析后的膠原蛋白液體，采用冷凍干燥方法進行干 燥，得到魚皮膠原蛋白。
5.采權利要求1所述技術方案得到的魚皮膠原蛋白，其特征在于，所述魚皮膠原蛋白 的羥脯氨酸含量為8. 2 8. 5%質量百分數，膠原蛋白純度平均值為89. 92 94. 62% ；所 述魚皮膠原蛋白含有3種I型膠原蛋白，S卩116KDa的α UlOOKDa的α 2肽鏈以及200KDa 的β鏈。
6.權利要求5所述魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養的支持載體的應用。
7.應用權利要求5所述魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養的方法，其特征在于，具體包 括以下步驟將權利要求5所述魚皮膠原蛋白粉以質量含量0. 13 0. 15%的量溶解于 0. IM乙酸中，并均勻鋪滿細胞培養瓶、或細胞培養板內表面，作為魚類細胞培養的支持載 體。
8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所述魚類細胞優選自草魚腸道原代上皮細 胞、草魚肝臟原代細胞。
全文摘要
本發明屬于魚皮膠原蛋白加工領域，具體涉及一種可以作為魚類細胞培養載體的魚皮膠原蛋白制備方法，包括原料處理、提取、鹽析、純化透析干燥步驟，其中，所述原料處理中采用無水乙醚于35～40℃回流3～4h，除去魚皮的脂肪，然后風干，得到除脂后的魚皮渣；所述提取步驟為按照固液比為1∶50～70，將0.5～0.6M乙酸加入除脂后的魚皮渣中，浸提60～80h，40目篩卷網過濾得到含魚皮膠原蛋白的濾液；重復進行一次。本發明在保持所得魚皮膠原蛋白的生物特性、純度的基礎上，提高得率，并且應用所得魚皮膠原蛋白作為魚類細胞培養載體時，細胞親和性好、貼壁速度快、細胞生長良好、生長密度高，相對于牛皮膠原蛋白或鼠尾膠原蛋白而言取得了顯著的進步。
文檔編號C07K14/78GK101948533SQ20101028830
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者葉元土, 唐嶄, 姚仕彬, 宋亮, 戴如燕, 蔡春芳 申請人:蘇州大學