專利名稱：一種人工合成的新型抗血栓多肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及多肽，尤其涉及經人工修飾并合成的具有抗血栓活性的多肽。本發明 還涉及該多肽的制備方法以及作為抗血栓劑的應用，屬于生物醫藥領域。
背景技術：
隨著人口的老齡化、心血管疾病發病率的增加，現行抗血栓標準藥物已經不能適 應和滿足現有需求，該類藥物的市場容量仍在不斷增大。目前的抗血栓藥物未能滿足活性 好、藥效可預測、可口服、起效快、副作用小等要求。因而，鑒于市場機會較大和現有藥物各有缺陷，尋找安全，方便的新型抗栓藥物已 成為國內外醫藥界的研究熱點，與此同時，對于此類藥物的創新性研究，特別是對多肽及可 口服的小分子類肽或化合物的研究也就具有更加重要的意義和市場前景。動脈粥樣硬化是血管系統疾病的主要病理基礎，動脈粥樣硬化斑塊破裂和繼發的 血栓形成是大多數急性血管事件發生的主要原因。近年研究表明，動脈粥樣硬化的形成和 斑塊的破裂與細胞外基質的破壞和重構有密切關系，而基質金屬蛋白酶(MMPs)是一族Zn2+ 依賴型蛋白水解酶，主要負責降解細胞外基質，其表達水平的增高和活性的增強都能夠加 速不穩定斑塊及血栓的形成。因此，基質金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)成為了藥物化學領域研 究的一個熱點，越來越多的研究試圖通過抑制MMI3S活性以延緩動脈粥樣硬化的發生和防 止斑塊破裂、血栓形成。其中，基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)屬于半胱氨酸蛋白酶超 家族，為MMPI中一組多功能因子家族，能特異的抑制MMPs的活性，其N端功能區半胱氨酸 殘基與MMPs的鋅離子活性中心結合，C端功能區與MMPs的其他部位結合，以1 1的比例 非共價鍵結合形成MMP-TIMP復合體，阻斷MMPs與底物的結合，抑制MMI3S蛋白水解活性。因 此，調節MMPs的活性可能是心血管疾病治療，特別是血栓治療的一個新方向，對其拮抗劑 的進一步研究將促進臨床的早日應用。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種人工合成的具有良好抗血栓活性的新型多肽BNC， 其氨基酸序列為Pyr-Asn-Cys。根據基質金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)的設計思路，基于底物的MMPI的設計理論，利 用固相多肽合成技術，設計完成了新型抗血栓多肽BNC，其氨基酸序列為Pyr-Asn-Cys，分 子量為346。本發明的目的之二是提供一種具有良好抗血栓活性的新型多肽BNC的制備方法。根據所設計的BNC氨基酸序列，利用!^mc固相多肽合成技術進行合成。先將所要 合成肽鏈的C末端半胱氨酸的羧基以酯鍵形式與2-氯三苯甲基氯樹脂相連，然后以此結合 在固相載體上的半胱氨酸作為氨基組份，經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分進 行縮合并脫保護。重復(縮合一洗滌一去保護一洗滌一下一輪縮合)操作，達到所要合成 的肽鏈長度，最后利用切割液將肽鏈從樹脂上裂解下來，即得粗品。經HPLC反相柱進行純化后通過質譜分析確證。以上所述的!^mc固相多肽合成方法是本領域的常規并公知的技術。電刺激大鼠頸總動脈血栓形成、ADP誘發的小鼠急性肺血栓形成以及小鼠的凝血 時間測定等動物實驗證明，本發明的多肽BNC具有較強的抗血栓活性。本發明的目的之三是將新型多肽BNC應用于抗血栓藥物的制備中。本發明的有益效果在于根據基質金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)的設計思路，基于底物的MMPI的設計理論，利 用固相多肽合成技術，設計完成的新型抗血栓多肽BNC具有結構簡單、人工合成方便和良 好的抗血栓活性等有益特點，有望成為一種極具應用潛力且安全有效的抗血栓多肽藥物。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容。應當指出，這些實施例僅用來 對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。本發明中所出現的縮略語的說明HBTUDIEAFomcTFATISEDTDMFDCMMeOH實施例1新型抗血栓多肽BNC的制備及分離純化按下述序列制備BNC。BNC的氨基酸序列為焦谷氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸。本實施例采用固相多肽合成技術進行手工合成，合成的多肽經高濃度的TFA切割 后，得到粗品。經HPLC反相柱進行純化后，通過質譜分析確證。具體實驗步驟如下DBNC的制備(以制備1. 323mmol量的BNC為例說明固相合成多肽的方法)以下制備抗血栓多肽BNC的樹脂、Fmoc保護氨基酸及縮合試劑、切割試劑均購買 于上海吉爾生化有限公司。制備從C端到N端逐個進行。稱取1.01g(1.323mmOl)2-氯三苯甲基氯樹脂放 入小燒杯中，加入DMF(沒過樹脂)溶脹30min，后倒出一半體積的DMF加入等體積的DCM 再溶脹30min，之后倒入砂芯漏斗抽濾干。連接好裝置，并通入氮氣，調節使氣流平穩。 稱取Fmoc-Cys(Trt)-OH 1. 93g (3. 31mmol)用DMF溶解，之后加入裝置中，并加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，接著補加DMF使反應液的總體積為柱床體積的2 3倍，室溫反應lh。 利用茚三酮顯色法檢測反應完全后，加入部分20 %的哌啶/DMF先反應5min，之后加入剩 余部分再反應15min (共30ml)，脫去Fmoc保護基。用茚三酮顯色法檢測，結果表明脫保護 反應已進行完全。濾去反應液，將樹脂用DMF洗滌4次，至濾液加水無渾濁，濾干。稱取第
苯并三唑-N，N, N’，N’四甲基脲六氟磷酸酯
二異丙基乙胺
9-芴甲氧羰基
三氟乙酸
三異丙基硅烷
1,2-乙二硫醇
二甲基甲酰胺
二氯甲烷
無水甲醇2 個氨基酸 Fmoc-Asn (Trt)-OHl. 97g(3. 31mmol)，另稱取縮合劑 HBTU 1. 57g(3. 80mmol)，混 合后用DMF溶解，之后將完全溶解的混合液加入到含多肽樹脂的砂心漏斗中，調節氮氣的 流速使之處于穩速狀態，之后再加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，后加入DMF使反應液的總量 為柱床體積2 3倍，室溫反應lh。用茚三酮顯色法檢測，結果表明縮合反應已進行完全。 將反應后的樹脂濾干，用DMF洗4次，抽濾干，加入20%的哌啶/DMF重復脫保護操作。濾 去反應液，將樹脂用DMF洗滌6次，至濾液加水無渾濁，濾干。接著稱取第三個氨基酸Pyr 0. 55g(4. ^mmol)，縮合劑HBTU1. 57g，混合后于DMF中溶解完全，之后加入反應裝置中，調 節氮氣使流速平穩，之后再加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，后加入DMF使反應液的總量為柱 床體積2 3倍，室溫反應lh。用茚三酮顯色法檢測，結果表明縮合反應已進行完全。將反 應后的樹脂濾干，用DMF洗4次，無水MeOH洗1次，DCM洗2次，無水MeOH洗2次，每次洗 滌不少于lmin，之后抽濾干。將樹脂轉移后，加入切割液TFA TIS EDT H2O (9. 4 0. 1 0. 25 0. 25) 攪拌30min。抽濾，在濾液中加入10倍體積的冰乙醚，充分震蕩后靜置30min。抽干，真空 干燥，即得BNC粗肽。2) BNC 的純化將200mg上述粗肽溶解于50ml純水中，用制備型反相HPLC純化。色譜柱為 Delta-I^akClSZSX200mm ；流動相為A液5%甲醇+水相中0. 05%三氟乙酸，B液95%甲 醇+水相中0. 05%三氟乙酸，以70%的B液為流動相等度洗脫，流速為5ml/min，檢測波長 為^Onm和214nm，主峰保留時間為17min左右，比較合適，分離效果較好，適合樣品的大量 制備。收集主峰峰尖部分后，用分析型反相HPLC對收集成分進行檢測，色譜柱為蘇州環球 柱，流動相同上，洗脫程序為49% B液20min，流速為lml/min，檢測波長214nm，收集 的成分達到純度要求。收集液經旋轉蒸發濃縮，然后冷凍干燥得到BNC純肽。純肽的質譜 表明，其分子量為346，與計算值相符。實施例2BNC對電刺激大鼠頸總動脈內膜后血栓形成的影響1)樣品溶液的配制陽性對照組臨用前將氯吡格雷以生理鹽水稀釋成所需濃度的藥液Omg/ml) ；BNC 組臨用前以0. 2% L-精氨酸溶解，并以生理鹽水稀釋成所需濃度的藥液Omg/ml)。各組均 尾靜脈給藥，容積為10ml/kg。2)動物模型的制備大鼠腹腔注射10mg/L戊巴比妥鈉溶液(30mg/kg)，麻醉后仰臥位固定。頸部正 中線切口，游離右側頸總動脈，近心端放置BT87-3型實驗性體內血栓形成測定儀的刺激電 極，遠心端放置溫度探頭。當刺激電極接通電流后，以2mA直流電刺激動脈7min，使刺激部 位的血管內皮受損，激活血小板和凝血系統，管腔混合血栓逐漸形成，血流逐漸阻斷，當血 流完全阻斷時，遠端溫度突降，儀器報警，顯示堵塞時間(tt^)，即血栓形成時間。3)實驗步驟 取Wistar大鼠32只，體重200 250g，雌雄各半，按體重隨機分為4組，每組8只， 即空白對照組，模型對照組，陽性對照組(劑量為20mg/kg)，BNC組(劑量為20mg/kg)。采 用尾靜脈注射給藥，給藥體積為10ml/kg，給藥后15min開始刺激。空白對照組給予0. 2% L-精氨酸，模型對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予氯吡格雷。
4)統計學處理采用Excel軟件處理數據。所有數據均表示為均數士標準差6土S)表示，兩組 間比較用t檢驗，結果見表1。表1各組對電刺激大鼠頸總動脈內膜后血栓形成的影響6士S)
權利要求
1.一種具有抗血栓活性的多肽BNC，其氨基酸序列為Pyr-Asn-CyS，分子量為346。
2.一種制備權利要求1多肽的方法，其特征在于，所述的制備方法為i^omc固相合成法。 包括(1)稱取2-氯三苯甲基氯樹脂放入小燒杯中，加入DMF溶脹30min，后倒出一半體積的 DMF加入等體積的DCM再溶脹30min，之后倒入砂芯漏斗抽濾干；(2)經保護的氨基酸在樹脂上按預先設計的順序從C端到N端逐個進行偶合并脫保護， 反應過程中利用氮氣攪拌；(3)合成的多肽經切割液TFA TIS EDT H2O(9. 4 0. 1 0. 25 0.25)剪切 30min后，得到多肽粗品。
3.權利要求1的多肽在制備抗血栓藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥領域，公開了一種人工合成的具有抗血栓活性的多肽BNC，并公開了其制備方法以及作為抗血栓劑的應用。BNC利用Fomc固相化學法合成，含有3個氨基酸殘基，序列為Pyr-Asn-Cys，分子量為346，結構式如下。動物試驗表明該多肽對電刺激大鼠頸總動脈內膜后血栓的形成及對ADP誘發的小鼠急性肺血栓的形成均有抑制作用，并且可以延長小鼠的凝血時間。BNC結構式
文檔編號C07K1/06GK102060908SQ201010284849
公開日2011年5月18日 申請日期2010年9月17日 優先權日2010年9月17日
發明者孔毅, 楊天雨, 賴伊麗, 邵妤 申請人:中國藥科大學