專利名稱：利用堿性蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白制備抗凍多肽的制作方法
技術領域：
本發明提供了一種抗凍多肽及其制備方法，更具體地涉及了一種利用堿性蛋白酶 酶解牛皮膠原蛋白制備的抗凍多肽，屬于生物技術領域。
背景技術：
食品和醫藥產品在低溫儲存和運輸過程中由于環境溫度的波動變化而反復地遭 受冰晶生長和重結晶的問題越來越受到人們的關注。溫度的反復升降使冰晶不斷生長、凍 融和重結晶，嚴重破壞細胞和組織結構而失去產品應有的品質。世界范圍內的科學家正面 臨嚴肅的挑戰如何控制冰晶生長及重結晶，實現低溫冷鏈上的冰晶生長控制，是制約眾多 食品和醫藥產品品質的關鍵所在。抗凍蛋白(antifreeze proteins, AFPs)或者稱“冰結構蛋白”(ice structuring proteins)，是一類附著在冰晶體(ice crystals)表面而抑制冰晶的生長和重結晶的活性 蛋白質。抗凍蛋白由于其具有控制冰晶生長、減少細胞損傷及保持產品原有組織結構、質 地和品質的特點和突出意義而成為熱點研究主題，近年來國內外對抗凍蛋白的研究十分活 躍，《Nature》和《Science》密切跟蹤報道抗凍蛋白方面的最新研究進展。目前的研究主 要集中在從極地魚類、陸地昆蟲、植物和細菌等生物體中分離到多種抗凍蛋白，并尋求它們 在食品、醫學和其它工業上的應用。伴隨著多種抗凍蛋白的發現和研究的深入，其制約生物 體抗凍蛋白的研究和應用的二大關鍵問題也日益凸現1.天然分離純化所得到的數量微 少，非常有限的數量限制了它在食品和醫學上的大規律應用前景；2.當科學家致力于轉 基因技術以擴大生物體來源的抗凍蛋白產量時，轉基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧 慮又成為廣大消費者、歐盟組織和國際FDA組織所共同擔憂的焦點問題。同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結構域 (domain)而并不是整體蛋白質在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍 然需要探究其活性域domain來進一步提高抗凍效率。所以，如何獲得食品源的結構緊湊 的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種抗凍多肽及其制備方法，使抗凍活性得以 高效地實現。本發明的一種抗凍多肽，氨基酸序列為Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Arg。所述抗凍多Jj太的分子量為 2107 Da。本發明的一種抗凍多肽的制備方法，以牛皮膠原蛋白為原料，采用堿性蛋白酶對 其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽；所述酶解條件為酶解PH為PH7-10、溫度 30-55°C、酶解時間為20 - 60分鐘、酶-底物配比為1:15 — 1 :20 (w/w);所述酶為堿性蛋 白酶。優選的酶解條件為酶解PH為9.0、溫度45°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為 1:15 (w/w)。所述分離純化的手段包括S印hadex G-50分子篩、S^harose SP C-25離子
3交換色譜和RP-HPLC反相高效液相色譜。所述分離純化的具體步驟為酶解產物首先利用S印hadex G_50凝膠色譜進行分 離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活 性的峰，再用Sulfopropyl-S印adex C-25陽離子交換色譜進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯 度為0-0. 5M的0. 01mol/L pH7. 0的磷酸緩沖液，流速為0. 5mL/min ；收集具有最佳抗凍活 性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用 10-90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽；所述高純 度的特異性抗凍多肽的分子量為2107 Da0為了實現上述方案，本發明采取的具體步驟如下 (1) 明膠酶解條件的優化
本技術所采用的酶和牛皮膠原蛋白購自Sigma生物試劑公司(中國·上海)。采用單因素實驗，分別對三個酶解因素進行考察，分別為酶解溫度(37°C，45°C和 50°C)、酶解時間(10，20，30，40和60分鐘)以及酶-底物配比(1 100，1 50，1 20，1 15和 1:10 w/w)0稱取1.65克牛皮膠原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH將其 PH調節至9.0。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應 量的酶，按照預定的反應時間開始反應。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再IOOOrpm 離心10分鐘。上清液收集后，分別對其抗凍活性進行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有 最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是酶解PH為pH7-10、溫度30-55°C、酶解時間為20 — 60分鐘、酶-底物配比為1:15 — 1 :20 (w/w)0(2) 酶解酶解產物的分離、純化
先在最佳酶解條件下進行酶解，得到的酶解產物先經過S印hadex G-50凝膠色譜(長 100cm,直徑2. 6cm)進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進 行測量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-S印adex C-25陽離子交換色譜 (長55cm，直徑2. 0cm)進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5M的0. 01mol/L pH7. 0 的磷酸緩沖液，流速為0. 5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液 相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為洗脫液，流 速為lmL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽。利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALDI-T0F)測定該純化的特異性抗凍多肽的分子量為2107 Da0(3) 抗凍活性的測試
利用冰淇淋基體(Ice Cream Base Mix)為抗凍多肽研究載體。取5uL的冰淇淋，利用 cold-heat-stage系統，使其以40°C /min的速度快速降溫至_40°C，在該溫度下保持5min 并拍照。然后以1°C /min的速度再升溫至_14°C，并且接著以每3min —次的頻率在_14°C 和_12°C之間往復循環7次，以模擬冰淇淋在兩個月儲藏運輸過程中的溫度的變化，并拍照 以觀察冰晶變化。(4) 抗凍多肽分子量的測定
利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)測定特異性抗凍多肽的分子量。(5)氨基酸序列測定
利用蛋白質測序儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ,U.S.A)測定特異性抗凍多肽的氨基酸全序列。本發明透過目前生物體純化抗凍蛋白研究的數量局限性和轉基因抗凍蛋白的食 用安全性顧慮，立足于抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于特異的肽鏈結構域(domain)而不 是整體蛋白質在起作用的理論基礎，以來自于牛皮的膠原蛋白為出發點，著眼于通過堿性 蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結構域組成的活性多肽，而使抗凍 活性得以高效地實現。本發明突破了國內外現存的抗凍蛋白(多肽)的研究思路和方法，克服從天然生物 體中純化抗凍蛋白數量的局限性以及國際FDA組織對轉基因抗凍蛋白在食品應用中的安 全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發基于食品源的抗凍多肽以及探索其在 食品、醫學上的廣泛應用奠定理論基礎。
圖1為膠原蛋白酶解物S印hadex G-50洗脫圖2為S印hadex G-50洗脫峰三個部分對冰淇淋中冰晶生長及其冰晶抑制效果圖； 圖 3 為 Fraction2 的 Sulfopropyl-S印adex C-25 洗脫圖4為添加1% (w/w) SPUSP2洗脫峰對冰淇淋中冰晶生長及抑制冰晶生長的效果圖； 圖5為純化的抗凍多肽MALDI-T0F圖6為純化的特異性抗凍多肽對冰淇淋中冰晶生長及抑制冰晶生長的效果；其中，A、B 分別表示空白冰淇淋、添加0. 5% (w/w)特異性抗凍多肽樣品的冰晶生長情況圖。
具體實施例方式本發明的抗凍多肽的氨基酸序列為Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly -Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Argο制備方法如下
以牛皮膠原蛋白為原料，使用堿性蛋白酶對其進行酶解，并按照國際抗凍蛋白活性檢 測的標準，建立抗凍活性檢測系統，優化其酶解條件，得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶 解條件是酶解PH為9. O、溫度是45 °C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1 15 ；在最 佳酶解條件下進行酶解，得到的酶解產物先經過S印hadex G-50凝膠色譜(長100cm，直徑 2. 6cm)進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量。收集 具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-S印adex C-25陽離子交換色譜(長55cm，直徑 2. Ocm)進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5M的0. Olmol/L pH7. O的磷酸緩沖液，流 速為0. 5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一 步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為lmL/min，得到 高純度的特異性抗凍多肽。利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)測定該 純化的特異性抗凍多肽的分子量。冷凍干燥得到本發明的抗凍多肽，進行分子量測定表明，用堿性蛋白酶酶解得到 的特異性抗凍多肽的分子量為2107 Da0本發明采用的儀器、檢測手段如下
本發明的制備抗凍多肽的抗凍活性檢測系統，采用結合冷熱循環(cold — heat -
5stage)系統，多倍顯微鏡和自動照相系統，組構抗凍活性的抑制冰晶生長檢測系統平臺。以 液氮維持操作過程的低溫環境。模擬產品在低溫儲存過程中的溫度波動。通過系統程序設 置，設置樣品的溫度波動變化并連續反復7 25個循環，連接多倍顯微鏡和實時照相記錄 系統，記錄樣品在冷一熱反復循環過程中的實時冰晶生長情況。應用S印hadex G-50分子篩、Sepharose SP C-25離子交換色譜、RP-HPLC反相高 效液相色譜、透析等多種分離純化手段，實現最顯著活性的特異抗凍多肽的高效分離純化。利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)測定特異性抗凍多肽的分子量。利用蛋白質測序儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ, U. S. Α)測定特異性抗凍多肽的氨基酸全序列。為了進一步了解本發明內容、特點及功效，茲例舉以下實施例 實施例1
稱取1.65克牛皮膠原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調節 至9. O。先將該溶液水浴加熱到45°C，接著再按照酶-底物配比為1 15的比例加入相應量 的酶，酶解時間為30分鐘。接著在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再HOOOrpm離心10分鐘， 收集上清液備用。將上清液用S印hadex G-50凝膠色譜(長100cm，直徑2. 6cm)進行分離，洗脫 液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量，見圖1。收集各峰并測定抗凍 活性(如圖2所示)。從圖1可以看出，Fraction具有最好的抗凍活性，統計學分析表明， 冰晶平均直徑為5. 02um,明顯小于Fractionl (17. 96um)和Fraction3 (8. 39um),具有顯 著性差異(P <0.05)。分離出來Fraction2再進行下一步的分離，用Sulfopropyl-S印adex C-25陽離子 交換色譜(長55cm，直徑2. Ocm)進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5M的0. Olmol/ L PH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min，見圖3。收集各峰并測定抗凍活性(如圖4所 示)。很明顯，SP2的冰晶直徑明顯小于SP1，統計學分析表明，其冰晶大小分別為3. 35um和 9. 16um，具有顯著性差異(P < 0.05)。對分離出來SP2部分的樣品利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分 離，得到高純度的特異性抗凍多肽。利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F) 測定該純化的特異性抗凍多肽的分子量。從圖5可以看出，本發明的特異性抗凍多肽的分 子量為2107 Da。純化的特異性抗凍多肽具有很強的抑制冰晶生長的能力，由圖6可以看出，與空 白對照(圖6A)相比，添加了 0.5%(w/w)的特異性抗凍多肽，冰晶幾乎不生長(圖6B)。對純化的特異性抗凍多肽利用蛋白質測序儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ, U. S. Α)測定特異性抗凍多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列 為:Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gl y-Pro-Argo
權利要求
一種抗凍多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列為Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Pro Arg。
2.根據權利要求1所述的抗凍多肽1，其特征在于所述抗凍多肽的分子量為2107Da0
3.一種抗凍多肽的制備方法，其特征在于以牛皮膠原蛋白為原料，采用堿性蛋白酶 對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽；所述酶解條件為酶解PH為pH7-10、溫 度30-55°C、酶解時間為20 - 60分鐘、酶-底物配比為1:15 — 1 :20 (w/w);所述酶為堿性 蛋白酶。
4.根據權利要求2所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于以牛皮膠原蛋白為原料， 采用堿性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽；所述酶解條件為酶解 PH為9.0、溫度45°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:15 (w/w)0
5.根據權利要求3所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于所述分離純化的手段包 括S印hadex G-50分子篩、Sepharose SP C-25離子交換色譜和RP-HPLC反相高效液相色■；並
6.根據權利要求4所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于所述分離純化的 具體步驟為酶解產物首先利用S印hadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子 水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用 Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0. 5M 的0. Olmol/L pH7. O的磷酸緩沖液，流速為0. 5mL/min ；收集具有最佳抗凍活性的峰，利用 RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈 溶液作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽。
7.根據權利要求6所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于所述高純度的特異性抗 凍多肽的分子量為2107 Da0
全文摘要
本發明提供了一種抗凍多肽及其制備方法，該方法以牛皮膠原蛋白為原料，通過對堿性蛋白酶的酶解條件篩選與優化，分離純化，得到特異性抗凍多肽，其分子量為2107Da，其氨基酸全序列為Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Arg。本發明突破了國內外現存的抗凍蛋白的研究思路和方法，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數量的局限性以及國際FDA組織對轉基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫學上的廣泛應用奠定理論基礎。
文檔編號C07K1/16GK101921328SQ201010277569
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者汪少蕓, 鄭邦曉, 饒平凡 申請人:福州大學