優化的Fc變體及其產生方法

專利名稱：優化的Fc變體及其產生方法
技術領域：
本發明涉及新的優化的Fc變體，產生它們的工程改造(engineering)方法，以及 它們的應用，具體而言用于治療目的。
背景技術：
抗體是結合特異性抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠的大多數哺乳動物中，抗體 由配對的多肽重鏈和多肽輕鏈構成。每條鏈由分離的免疫球蛋白(Ig)結構域組成，因此上 述蛋白通稱免疫球蛋白。每條鏈由兩個不同的區組成，稱為可變區及恒定區。在抗體間輕 鏈和重鏈可變區顯示了明顯的序列多樣性，并負責結合靶抗原。恒定區顯示了較少的序列 多樣性，并負責結合許多天然蛋白以引發重要的生化反應。在人類中有五種不同類型的抗 體，包括IgA (其包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG (其包括亞類IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4)以及IgM。盡管在V區可能存在微小的差異，但是在這些類型的抗體間區別特征是它 們的恒定區。

圖1顯示了 IgGl抗體，在此用于舉例說明免疫球蛋白的大致結構特征，IgG抗 體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體蛋白。IgG重鏈由四個相連的免疫球蛋白結構域 組成，從N-末端到C-末端依次為Vh-C y I-C Y2-CY3,分別稱為重鏈可變區結構域、恒定區 Yl結構域、恒定區Y 2結構域和恒定區Y 3結構域。IgG輕鏈由兩個相連的免疫球蛋白結 構域組成，從N-末端到C-末端依次為VfCy分別稱為輕鏈可變區結構域和輕鏈恒定區結 構域。抗體的可變區含有該分子的抗原結合決定基，并因此決定了抗體對其靶抗原的特 異性。因為其與同一類型中其它抗體序列差別最明顯，所以命名為可變區。大多數序列可變 性存在于互補決定區(⑶Rs)。總共有6個⑶Rs，每條重鏈和輕鏈各有3個，命名為Vh⑶R1、 Vh CDR2、Vh CDR3、Vl CDRUVl CDR2 及 V1^ CDR3。在 CDRs 外的可變區稱為骨架(FR)區。盡 管不像CDRs —樣變化眾多，但是在不同抗體間FR區存在序列可變性。總的來說，抗體的結 構特征提供了穩定的支架(FR區)，在其上真正的抗原結合多樣性(CDRs)能得到暴露，通過 免疫系統以獲得對廣泛抗原的特異性。可獲得來自多種不同生物體可變區片段的許多高分 辨率結構，一些可變區是非結合狀態的，一些與抗原形成復合物。抗體可變區的序列和結構 特征得到充分鑒定(Morea 等·，1997，Biophys Chem 68 :9_16 ；Morea 等·，2000，Methods 20 :267-279)，抗體的保守特征已用于發展許多抗體工程技術(Maynard等.，2000，Annu Rev Biomed Eng 2:339-376)。例如，可將來自一種抗體，如鼠抗體的CDRs移植入另一種 抗體的骨架區，如人抗體。在本領域稱為“人源化”的該過程能從非人抗體中能產生具更低 免疫原性的抗體治療劑。存在著包含可變區的片段，其缺少抗體其它區域，包括諸如包含Vh-C γ 1和Vh-Q的抗原結合片段(Fab)、包含Vh和\的可變區片段(Fv)、包含在同一鏈中 連接在一起的Vh和\的單鏈可變區片段(scFv)以及多種其它可變區片段(Little等.， 2000，Immunol Today 21 :364_370)。抗體的Fc區與許多Fc受體及配體相互作用，行使一系列重要的功能，稱為效 應器功能。如圖1所示，IgG Fc區包含Ig結構域C γ2、C 和進入C 的N-末端鉸 鏈。對于IgG類而言，一類重要的Fc受體家族是Fc γ受體(Fe YRs)。這些受體介導抗 體與免疫系統的細胞臂之間的識別(Raghavan等.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220 ;Ravetch 等.，2001，Annu Rev Immunol 19 :275_290)。在人類中，該蛋白質家族包 含 Fc γ RI (CD64)，包括同種型(isoform) Fc y RIa、Fc y RIb 和 Fc y RIc ；Fc y RII (CD32)，包 括同種型 Fc y RIIa(包含同種異型(allotype) H131 和 R131)、Fc y RIIb (包含 Fc y RIIb-I 和 Fc y RIIb-2)以及 Fc γ RIIc ；禾口 Fc y RIII (CD16)，包括同種型 Fc γ RIIIa(包含同種 異型 V158 禾口 F158)禾口 Fc γ RIIIb (包括同種異型 Fc γ RIIIb-NAl 和 Fc y RIIIb_NA2) (Jefferis等，2002，Immunol Lett 82:57-65)。這些受體通常具有介導與Fc結合的胞 外結構域、跨膜區和可介導某些細胞內信號事件的胞內結構域。這些受體在不同的免疫 細胞中表達，包括單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞、 血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、朗罕氏細胞，自然殺傷(NK)細胞以及Y YT細胞。Fe/ Fc Y R復合物的形成招募這些效應細胞至結合抗原的位點，通常導致細胞內信號事件以及 隨后重要的免疫應答發生，諸如釋放炎癥介質、B細胞活化、細胞內吞作用、吞噬作用及細 胞毒性攻擊。介導細胞毒性和吞噬細胞效應器功能的能力是抗體破壞靶細胞的一種可能 機制。在細胞介導反應中表達Fc γ Rs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結合的抗 體并隨后導致靶細胞溶胞作用，稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC) (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) (Raghavan等·，1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181-220 ;Ghetie 等.，2000，Annu Rev Immunol 18 :739_766 ;Ravetch 等.，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。在細胞介導反應中表達Fc γ Rs的非特異性細胞毒性細胞 識別靶細胞上的結合的抗體并隨后導致對靶細胞的吞噬作用，稱為抗體依賴性細胞介導 的細胞吞噬作用(ADCP) (antibody dependent cell-mediated phagocytosis)。已解出 Λ Fc y Rs的胞外結構域的許多結構，包括Fc γ RIIa(pdb登記號1H9V) (Sondermann等·， 2001，J Mol Biol 309 :737_749) (pdb 登記號 1FCG) (Maxwell 等.，1999，Nat Struct Biol 6 437-442) ,Fc y RIIb(pdb 登記號 2FCB) (Sondermann 等·，1999, Embo J 18 :1095_1103)； 以及 Fc yRIIIb (pdb 登記號 1E4J) (Sondermann 等·，2000，Nature 406 267-273.)。所有 Fc y Rs結合Fc上相同區域，位于C γ 2結構域的N-末端和前述鉸鏈區，如圖2所示。該相 互作用可很容易地通過結構來鑒定(Sondermann等.，2001，J Mol Biol 309 :737_749)，并 已解出與人Fc γ RIIIb胞外結構域結合的人Fc的數種結構(pdb登記號1E4K) (Sondermann 等·，2000，Nature 406 :267_273·) (pdb 登記號 IIIS 和 IIIX) (Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 16469-16477)，也解出人 IgE Fc/Fc ε RI α 復合物結構(pdb 登記號 1F6A) (Garman 等.，2000，Nature 406 259-266)。不同IgG亞類對Fc y Rs具有不同親和力，IgGl和IgG3 —般較IgG2和IgG4能更 充分地與受體結合(Jefferis 等·，2002，Immunol Lett 82 :57_65)。所有 Fc y Rs 結合 IgG Fc上相同的區域，亦具有不同的親和力高親和力受體Fc γ RI對IgG具有ΙΟΛΓ1的Kd，反之低親和力受體Fc YRII和Fc γ RIII通常分別以10_6和lO—V的Kd結合。FcyRIIIa 與Fc γ RIIIb胞外結構域具有96%同一性，但是Fc Y RIIIb沒有胞內信號域。此外，盡管 FcyRI, Fcy RIIa/c和Fc Y RIIIa是免疫復合物觸發激活作用的正調節物，通過具有含有 免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)的胞內結構域而得到鑒定，但是FcYRIIb含有免疫受體 酪氨酸抑制基序列(ITIM)并因此而具有抑制性。因此，前者稱為激活性受體而Fc γ RIIb 稱為抑制性受體。在不同的免疫細胞中受體也具有不同的表達譜和表達水平。然而，在人 蛋白質組中另一種復雜性水平是存在著許多Fc γ R多態性。與臨床意義特別相關的多態 性是V158/F158Fc y RIIIa0人IgGl與V158同種異型的結合較與F158同種異型的結合具 更高親和力。不同親和力以及推測其對ADCC和/或ADCP的影響已顯示了是抗-CD20抗 體利妥昔單抗(Rituxan , IDEC Pharmaceuticals Corporation的注冊商標)功效的重 要決定因素。具有V158同種異型的患者對利妥昔單抗治療響應良好；然而，具有低親和力 F158同種異型的患者響應不良(Cartron等，2002，Blood 99 :754_758)。大約10-20%的 人是V158/V158純合子，45%是V158/F158雜合子，以及35-45%的人是F158/F158純合子 (Lehrnbecher 等.，1999，Blood 94 :4220_4232 ；Cartron 等.，2002，Blood 99 :754_758)。 因此80-90%的人是不良應答者，它們具有至少一個F158 Fc γ RIIIa等位基因。圖1顯示了 Fc上重疊但分離的位點，其作為與補體蛋白Clq作用的界面。同樣 地，FC/FcyR結合介導了 ADCC，Fc/Clq結合介導了補體依賴性細胞毒作用(⑶C)。Clq與 絲氨酸蛋白酶Clr形成復合物，再與Cls形成Cl復合物。雖然Clq與兩種IgGs的結合就 足以激活補體級聯，但是其能結合6種抗體。類似于Fc與Fc γ Rs的相互作用，不同IgG亞 類對Clq具有不同親和力，IgGl和IgG3—般較IgG2和IgG4能更充分地與Fc γ Rs結合 (Jefferis 等.，2002，Immunol Lett 82 :57_65)。當前沒有獲得 Fc/Clq 復合物結構；但是， 誘變研究已將人IgG上與Clq的結合位點定位于包含殘基D270、K322、K326、P329和P331， 以及 E333 的區域(Idusogie 等·，2000，J Immunol 164 :4178_4184 ；Idusogie 等，2001，J Immunol 166 :2571_2575)。圖1顯示了 Fc上C Y2和C Y3結構域之間的位點，其介導與新生受體FcRn的 相互作用，它們的結合使胞吞的抗體從內涵體再循環回血液中(Raghavan等.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181_220 ;Ghetie 等·，2000，Annu Rev Immunol 18:739-766)。該 過程結合基于較大尺寸的全長分子不被腎濾過，產生了有利的抗體血清半衰期，該半衰期 變化范圍從一周到三周。在抗體轉運中Fc與FcRn的結合也扮演著關鍵角色。Fc上結合 FcRn的結合位點也是細菌蛋白A和G的結合位點。通過在蛋白純化過程中使用蛋白A或 蛋白G親和層析，這些蛋白質的牢固結合通常用作為純化抗體的手段。因此，對于抗體的 臨床性能及其純化而言，Fc上該區域的保真度具有重要作用。已獲得的大鼠Fc/FcRn復 合物結構(Martin等.，2001，Mol Cell 7 :867_877)，以及Fc與蛋白A和G的復合物結構 (Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20 :2361_2370 ；Sauer-Eriksson 等· , 1995, Structure 3 265-278 ；Tashiro 等.，1995，Curr Opin Struct Biol 5 :471_481)提供了對 Fc 與這些 蛋白相互作用的了解。在Fc區起關鍵作用的是存在于N297的保守的N-糖基化，如圖1所示。對于抗體 而言，該糖，或有時稱為寡糖的，扮演著關鍵的結構和功能角色，并且是使用哺乳動物表達 系統產生抗體的主要原因之一。雖然不應限制于一種理論，但據信該糖結構上的用途可穩定或增溶Fe，決定C γ 3與C γ 2結構域間特定角度或柔性程度，阻止兩個C γ 2結構域橫越 中心軸的相互聚集，或這些的組合。Fc與Fc γ R以及Clq的有效結合需要這種修飾，N297 糖組成的改變或消除影響這些蛋白的結合(Umana等.，1999，Nat Biotechnoll7 :176_180 ； Davies 等.，2001，Biotechnol Bioeng 74 :288_294 ;Mimura 等，2001，J Biol Chem 276 45539-45547. ；Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 :16478_16483 ;Shields 等.，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604 ；Shields 等·，2002，J Biol Chem 277 :26733_26740 ；Simmons 等.，2002，J Immunol Methods 263 133-147)。然而，即使與Fc γ Rs有任何特異性接觸，該 糖的參與也少(Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 16469-16477)，表明在介導 Fc/Fc γ R 結合中Ν297糖的功能角色可能是通過在決定Fc構象中其所扮演的結構角色來實現的。該 結論通過所收集到的四個不同Fc糖型的晶體結構而得到支持，這些結構顯示了寡糖影響 7 Cy 2 構象并因此影響 Fc/Fc y R 界面(Krapp 等·，2003，J Mol Biol 325 :979_989)。上述所討論的抗體特征一特異于靶，能介導免疫效應機制及在血清中的長半衰 期一使得抗體可有效地用于治療。單克隆抗體可用于治療多種疾病，包括癌癥、炎癥和心血 管病。目前已有超過10種抗體產品上市，并有數百種產品正在開發中。除抗體外，在研究 和治療中發現Fc融合體這類抗體樣蛋白用途廣泛(Chamow等.，1996，Trends Biotechnol 14:52-60 ；Ashkenazi 等，1997，Curr Opin Immunol 9 :195_200)。Fc 融合體是一種蛋白質， 其中一個或多個多肽可操作地連接Fe。Fc融合體使抗體的Fc區與受體的靶結合區、配體 或一些其它蛋白或蛋白結構域結合，并因此有利于其效應器功能和藥物代謝動力學。后者 的角色是用于介導靶識別，并因而在功能上與抗體可變區相似。因為Fc融合體與抗體在結 構和功能上重疊，所以在本發明中對于抗體的討論可直接擴展至Fc融合體。盡管具有這樣廣泛的用途，對于臨床使用而言，抗體并不是優化的。抗體的兩個主 要缺點是它們并不理想的抗癌效力和它們過分苛求的生產必備條件。本發明解決了這些缺 陷。存在許多可能的抗體破壞腫瘤細胞機制，包括通過阻斷必需的生長途徑以抗增 殖、導致細胞凋亡的胞內信號、增強的下調作用和/或受體的轉換(turnover)、CDC、ADCC、 ADCP 以及啟動獲得性免疫應答(adaptive immune response) (Cragg 等·，1999，Curr Opin Immunol 11 :541_547 ;Glennie 等.，2000，Immunol Today 21:403-410)。抗腫瘤效力可 基于這些機制的組合，而且在臨床治療中它們各自的重要性依腫瘤的不同而不同。盡管是 抗腫瘤武器的兵工廠，但是抗體作為抗癌劑的效果卻并不令人滿意，具體而言是它們的高 成本。患者腫瘤響應數據顯示了相對于常規的單一試劑細胞毒素化學療法而言，在治療成 功率上單克隆抗體僅提供了很少的改善。舉例來說，在全部復發的低度非霍奇金淋巴瘤患 者中只有一半對抗-CD20抗體利妥昔單抗響應(McLaughlin等·，1998，J Clin Oncol 16 2825-2833)。在166個臨床患者中，6%顯示了完全響應，42%顯示了部分響應，中值響應持 續時間大約為12個月。曲妥單抗(Here印tin Genentech的注冊商標)，一種用于治療 乳腺癌轉移的抗_HER2/neU抗體，具有較低的療效。對222個受試患者使用曲妥單抗的總 響應率僅有15%，其中8個完全響應，26個部分響應，中值響應持續時間和存活時間為9-13 個月(Cobleigh等.，1999，J Clin Oncol 17:2639-2648)。目前對于抗癌治療而言，在死 亡率上任何小的改善都意味著成功。因此，特別需要增強抗體破壞靶癌細胞的能力。一種用于增強抗體抗腫瘤效力的有希望的方法是通過增加它們介導諸如ADCC、ADCP和CDC的細胞毒性效應器功能的能力。對于抗體抗癌活性而言，FcyR-介導的效應 器功能的重要性已在小鼠中得到證實(Clynes等.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95: 652-656 ；Clynes等.,2000,Nat Med 6 :443_446)，并在基于細胞的測定中證實了與靶細胞 毒性相關的Fc與特定FcyRs之間相互作用的親和力(Shields等.，2001，J Biol Chem 276 :6591-6604 ;Presta 等.，2002，Biochem Soc Trans 30 :487_490 ;Shields 等.，2002，J Biol Chem277 =26733-26740) 此外，已觀察到人臨床療效與它們的同種異型一Fc γ RIIIa 的高親和力多態型(V158)或低親和力多態型(F158)之間的相互關系(Cartron等.，2002， Blood 99 :754-758)。綜合起來，這些數據暗示了對于與特定Fc γ Rs結合而言，在患者體內 具有Fc區優化的抗體能更好地介導效應器功能并因此能更有效地破壞癌細胞。在激活與 抑制受體之間的平衡要得到重點考慮，并應由Fc產生最佳的效應器功能，對諸如FcyRI、 Fc y RIIa/c以及Fc y RIIIa的激活受體而言應具有增強的親和力，還應減少對抑制性受體 FcyRIIb的親和力。此外，因為Fc YRs能介導抗原攝入和通過抗原呈遞細胞的加工過程， 所以增強Fc/Fc y R親和力也能改善抗體治療能力以引發獲得性免疫應答。具有不同目的的誘變研究已用于Fe，通常對丙氨酸進行取代(稱為丙氨酸掃描) 或通過序列同源性取代指導操作(Duncan等·，1988，Nature 332 :563_564 ；Lund等·， 1991，J Immunol 147 :2657_2662 ；Lund 等.，1992，Mol Immunol 29 :53_59 Jefferis 等， 1995，Immunol Lett 44 111-117 ;Lund 等.，1995，Faseb J 9 :115_119 Jefferis 等.， 1996，Immunol Lett 54 101-104 ;Lund 等，1996，J Immunol 157 :4963_4969 ;Armour 等， 1999，Eur J Immunol 29 :2613_2624 ;Shields 等.，2001，J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis 等.,2002, Immunol Lett 82 :57_65)(us 5, 624, 821 ；us 5, 885, 573 ；pct wo 00/42072 ；PCT WO 99/58572)。大多數取代減少或消除了與Fc γ Rs的結合。另一方面，在 獲得具有更高Fc γ R親和力的Fc變體方面已取得了一些成功(參見例如US 5，624，821 和PCT WO 00/42072)。例如，Winter及其同事在小鼠IgG2b抗體的235位上用人氨基酸 進行取代(谷氨酸到亮氨酸突變)，該小鼠抗體與人Fc γ RI的結合增加了 100倍(Duncan 等·，1988，Nature 332 :563_564) (US 5，624，821)。Shields 等使用丙氨酸掃描誘變來定 位對Fc γ R結合起重要作用的Fc殘基，然后通過用非丙氨酸突變對所選定的殘基進行取代 (Shields 等.，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604 ;Presta 等.，2002，Biochem Soc Trans 30 487-490) (PCT WO 00/42072)。該研究公開了一些突變，包括 S298A、E333A 和 K334A，顯 示了與激活受體Fc γ RIIIa增強的結合以及減少了與抑制性受體Fc γ RIIb的結合。組合 這些突變以獲得雙重和三重突變的變體，在結合方面其顯示了累加的改善。在該研究中所 公開的最好的變體是S298A/E333A/K334A三重突變體，其與F158 Fc γ RIIIa的結合大約增 加了 1.7倍，與Fc γ RIIb的結合減少了 5倍，且ADCC增加了 2. 1倍。使用工程改造后的糖型(engineered glycoform)也已實現了 Fc對Fc γ R增 強的親和力，該糖型產生自工程改造的或變異的細胞系中抗體的表達(Umana等.，1999， Nat Biotechnol 17 :176_180 ;Davies 等，2001，Biotechnol Bioeng 74 288-294 ；Shields 等.，2002，J Biol Chem 277 :26733_26740 ；Shinkawa 等.，2003，J Biol Chem 278 3466-3473)。該方法產生了實質上增加的抗體與Fc γ RIIIa結合并介導ADCC的能力。盡 管在實踐中存在諸如在大規模生產條件下表達菌株生長效率的局限性，用于增強Fc/Fc γ R 親和力以及效應器功能的該方法仍然是有前途的。實際上，對于優化效應器功能來說，將這些可選的糖型技術與本發明的Fc變體結合可提供累加效應或協同效應。盡管需要更強的效應器功能，對于某些抗體治療劑而言，減少或消除效應器功能也許是其所需的。通常認為治療性抗體其作用機理包括阻斷或拮抗但不殺死具有靶抗原的 細胞。這樣的話耗盡靶細胞并不是所需的并認為存在著副作用。例如，抗CD4抗體阻斷T 細胞上CD4受體的能力使其能有效地抗炎，甚至它們招募Fc γ R受體的能力也可指導免疫 系統攻擊靶細胞，導致T細胞損耗(Reddy等.，2000，J Immunol 164:1925-1933)。對于 稱為放射綴合物的放射標記的抗體以及稱為免疫毒素的綴合毒素的抗體而言，效應器功能 也許是一道難題。這些藥物可用于破壞癌細胞，但是通過Fc與Fc γ R相互作用所招募的免 疫細胞使得健康的免疫細胞接近致死性的負載物(放射物或毒素)，導致正常淋巴組織連 同靴癌細胞一起損耗(Hutchins 等·，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92:11980-11984; White等.，2001，Annu Rev Med 52:125-145)。通過使用IgG同種型有可能解決該問題， 該IgG同種型無法充分地招募補體或效應細胞，例如IgG2及IgG4。可選的解決方案是開 發能減少或消除結合能力的Fc變體(Alegre等·，1994，Transplantation 57 1537-1543 ； Hutchins 等·，1995,Proc Natl Acad Sci USA 92 11980-11984 ；Armour 等·，1999,Eur J Immunol 29 :2613_2624 ;Reddy 等.，2000，J Immunol 164 :1925_1933 ;Xu 等.，2000，Cell Immunol 200 16-26 ；Shields等·，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604) (US 6，194，551 ；US 5, 885, 573 ；PCT WO 99/58572)。對于減少或消除效應器功能而言，主要的考慮是其它重要 的抗體特性不被干擾。應改造Fc變體，以不僅消除與Fc γ Rs和/或Clq的結合，而且還能 保持抗體的穩定性、可溶性和結構的整體性(integrity)，以及能保持與諸如FcRn和蛋白A 及G的其它重要Fc配體相互作用的能力。本發明解決了抗體的另一個主要缺點，即它們過分苛求的生產必備條件(Garber， 2001，Nat Biotechnol 19 184-185 ；Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777-779)。抗體應 當在哺乳動物細胞中表達，且目前市售抗體與其它高度需求的生物治療藥物基本上耗盡了 所有可用的制造能力。有數百種生物制劑正在開發中，其中大多數是抗體，迫切需要更有效 及更便宜的生產方法。不足的抗體制造能力具有三方面的下游效應。首先，對于生產者而 言顯著增加了產品成本，即傳遞給患者的成本。其次，其阻礙了批準的抗體產品的工業化生 產，限制了患者高度需求的治療劑的可用性。最后，因為臨床試驗需要大量還無利可圖的蛋 白質，所以不足的供給阻止了抗體市場化的成長過程。已研究用于嘗試解決該問題的可選的生產方法。正尋求將轉基因植物和動物作為 可能的更便宜及更高產的系統(Chadd等.，2001，Curr Opin Biotechnol 12 :188_194)。然 而，該表達系統可產生明顯不同于人糖蛋白的糖基化型(glycosylation patterns)。其可 導致效應器功能減少或甚至缺失，因為如上所討論，該糖結構能顯著地影響Fc γ R和補體 的結合。非人糖型潛在的巨大問題可能是免疫原性；對于免疫系統來說，糖是抗原性的關鍵 來源，并且非人糖型的存在具有相當大的引發抗體中和治療的機率，或更嚴重地引起有害 的免疫反應。因此，通過轉基因植物和動物生產的抗體的療效和安全性仍無法確定。細菌 表達是另一種引人注目的解決抗體生產難題的方案。在諸如大腸桿菌的細菌中表達提供了 一種用于生產蛋白質的節省成本和高效的方法。對于諸如抗體等復合物蛋白質而言，在細 菌表達中存在許多障礙，包括這些復合物分子的折疊和組裝、正確形成二硫鍵以及缺乏糖 基化時的溶解性、穩定性和功能性，因為在細菌中表達的蛋白質不被糖基化。已成功地在大腸桿菌中表達出能結合抗原的全長非糖基化抗體(Simmons等.，2002，J Immunol Methods 263:133-147)，因此在缺乏真核侶伴蛋白手段下，細菌性表達抗體的折疊、組裝和正確形成 二硫鍵可能發生。然而，用于治療的細菌性表達抗體的最終功效仍為缺乏糖基化而困擾，其 導致缺乏效應器功能并可導致不良的穩定性和溶解性。對于在高濃度下需要長期臨床使用 的劑型而言，很可能存在更多問題。對于上述可選的生產方法而言，具有有利溶解特性(solution property)以及介 導效應器功能的能力的非糖基化(aglycosylatecOFc將有效地使之成為可能。通過克服非 糖基化Fc結構和功能上的缺點，抗體可在細菌中以及轉基因植物和動物中生產，具有減少 的免疫原性危險，以及在諸如癌癥的臨床應用中具有所需細胞毒性的效應器功能。本發明 描述了利用蛋白質工程方法來開發具有效應器功能的穩定、可溶的Fc變體。當前，在本領 域中并不存在這樣的Fc變體。總之，需要具有增強的治療特性的抗體。設計優化或增強的Fc變體是符合該需求 的有前途的方法。雖然，設計具有所需特性的Fc變體的真正障礙在于預測無數可能性中的 哪些氨基酸修飾可實現所需目的，和對于抗體而言效率低的生產和篩選方法。實際上，對于 不完全成功的現有技術而言，其基本前提之一是使用類似于Fc設計的方法，因此更多地涉 及諸如丙氨酸掃描的嘗試(hit-or-miss)方法或使用不同的表達菌株來產生糖型。在這些 研究中，可進行完全或部分隨機的Fc修飾希望能獲得具有有利特性的變體。本發明提供了 多種工程方法，其中許多基于更完善和更有效的技術，可用于克服這些障礙以便開發對于 所需特性優化的Fc變體。所述的工程方法提供了指導Fc修飾的設計策略、用于設計有利 Fc變體的計算篩選方法、用于確定對試驗研究有用的抗體的文庫產生方法以及用于確定具 有有利特性Fc變體的一系實驗生產和篩選方法。發明概述本發明提供了 Fc變體，其許多與治療相關的特性得到優化。本發明的一個目的是提供新的Fc位置，在該位置上氨基酸修飾可用于產生優化 的 Fc 變體。所述 Fc 位置包括 240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328 和 332，其 中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發明描述在任一所述新的Fc位置上 的任何氨基酸修飾，以便產生優化的Fc變體。本發明的另一個目的是提供計算篩選的Fc變體。計算篩選的Fc變體是一種通過 在本文中所描述的計算篩選計算所預測的變體，對于優化所需特性而言，計算篩選較隨機 方法具有更有效的潛力。可見，計算篩選可作為試驗篩選的前奏或替代品，因此所述的計算 篩選的Fc變體被認為是新的。本發明的另一個目的是提供使用一種或多種本文所述的實驗方法鑒定的Fc變 體。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、 299、313、325、327、328、329、330或332，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方 式。在一個優選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種取代，選自L234D、L234E、L234N， L234Q、L234T、L234H、L234Y、L2341、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、 L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239T、S239H、 S239Y、V240I、V240A、V240T、V240M、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264Y、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266I、V266A、V266T、V266M、S267Q,S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A、P329F、A330L、A330Y、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、I332D、I332E、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區中殘基編號方式
是Kabat的EU標引方式。在一個最優選的實施方案中，所述Fc變體選自V264L、V264I、 F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W, F241W/F243W/ V262A/V264A、F241L/V262I、F243L/V264I、F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/ V264T、F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/ V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、I332E、L328M/I332E、P244H、 P245A、P247V、W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、V264I/I332E、F241E/F243R/V262E/ V264R/I332E、F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241 E/F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E、S239Q/I332E, S239E、D265G、 D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、A327N、S267Q/ A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、A330Y、I332D、N297S、N297D、N297S/I332E、 N297D/I332E、N297E/I332E、D265Y/N297D/I332E、D265Y/N297D/T299L/I332E、D265F/ N297E/I332E、L328I/I332E、L328Q/I332E、I332N、I332Q、V264T、V264F、V240I、V263I、 V266I、T299A、T299S、T299V、N325Q, N325L、N325I、S239D、S239N、S239F、S239D/I332D、 S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、 S239N/I332D、 S239N/I332E、 S239N/I332N、 S239N/I332Q、 S239Q/I332D、 S239Q/I332N、 S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、A330Y/I332E、 V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234D、L234E、L234N、L234Q、 L234T、L234H、L234Y、L234I、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、 L235Y、L235I、L235V、L235F、S239T、S239H、S239Y、V240A、V240T、V240M、V263A、V263T、 V263M、V264M、V264Y、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296S、Y296T、 Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、N325A、 N325T、N325V、N325H、L328D/I332E、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328V/ I332E、 L328T/I332E、 L328H/I332E、 L3281/I332E、 L328A、 I332T、 I332H、 I332Y、 I332A、 S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239E/V264I/ S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265V/N297D/ I332E、 S239D/D265I/N297D/I332E、 S239D/D265L/N297D/I332E、 S239D/D265F/N297D/ I332E、 S239D/D265Y/N297D/I332E、 S239D/D265H/N297D/I332E、 S239D/D265T/N297D/ I332E、V264E/N297D/I332E、Y296D/N297D/I332E、Y296E/N297D/I332E、Y296N/N297D/ I332E、Y296Q/N297D/I332E、Y296H/N297D/I332E、Y296T/N297D/I332E、N297D/T299V/ I332E、N297D/T299I/I332E, N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E、N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/A330Y/I332E, S239D/ A330Y/I332E、 S239N/A330Y/I332E、 S239D/A330L/I332E、 S239N/A330L/I332E、 V264I/ S298A/I332E、 S239D/S298A/I332E、 S239N/S298A/I332E、 S239D/V264I/I332E、 S239D/ V264I/S298A/I332E 和 S239D/V264I/A330L/I332E，其中 Fc 區中殘基編號方式是 Kabat 的 EU標引方式。本發明的另一個目的是提供與一種或多種Fc γ Rs的結合具有更強親和力的Fc變 體。在一個實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對Fc γ R的親和力增加超過1倍。在 一個可選的實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對Fc γ R的親和力增加超過5倍。在 一個優選的實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對Fc γ R的親和力增加在5倍至300 倍之間。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位 置選自:234、235、239、240、243、264、266、328、330、332 和 325，其中 Fc 區中殘基編號方式 是Kabat的EU標引方式。在一個優選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取 代，選自L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、 S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、L328M、L328I、L328Q、L328D、 L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q 和 N325T，其中 Fc 區中殘基 編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優選的實施方案中，所述Fc變體選自V264I、 F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、 S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、 S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/ I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/ A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、 L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/ I332E、 L328I/I332E、 S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E、 S239E/V264I/A330Y/ I332E、 S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/ I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/ I332E、S239D/V264I/S298A/I332E 和 S239D/V264I/A330L/I332E，其中 Fc 區中殘基編號方 式是Kabat的EU標引方式。本發明的另一個目的是提供具有FcYRIIIa-倍數Fc γ RIIb-倍數比率大于 1 1的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體具有Fc γ RIIIa-倍數Fc γ RIIb-倍 數比率大于11 1。在一個優選的實施方案中，所述Fc變體具有在11 1至86 1之 間的FcYRIIIa-倍數FcYRIIb-倍數比率。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少 一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自234、235、239、240、264、296、330和1332，其中 Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優選的實施方案中，所述Fc變體包 含至少一種氨基酸取代，選自L234Y、L234I、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、 V240M、V264I、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A330I、I332D 和 I332E，其中 Fc 區中殘基編號方 式是Kabat的EU標引方式。在一個最優選的實施方案中，所述Fc變體選自I332E、V264I/ I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E, Y296Q, A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、 A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L234I、 L235I、V240A、V240M、V264Y、A330I、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E 和 S239D/V264I/A330L/ I332E，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發明的另一個目的是提供在存在效應細胞條件下能更有效地介導效應器功能 的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽更能介導ADCC。在一個優選的 實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽介導ADCC增加超過5倍。在一個最優選的實施方 案中，所述Fc變體較親本Fc多肽介導ADCC增加5-50倍。在一個實施方案中，所述Fc變 體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自234、235、239、240、243、264、266、328、 330、332和325，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優選的實施 方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，選自L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、 L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、 V264Y、V266I、L328M、L328I、L328Q, L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、 I332E、I332N、I332Q和N325T，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個 最優選的實施方案中，所述 Fc 變體選自V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、 V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/ I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/ I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/ I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/ I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、 N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、 S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E、 S239D/A330Y/I332E、 S239N/A330Y/ I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/ I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V2641/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E 和 S239D/ V264I/A330L/I332E，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發明的另一個目的是提供與一種或多種Fc γ Rs的結合具有較弱親和力的Fc 變體。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、 299、313、325、327、328、329、330和332，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方 式。在一個優選的實施方案中，所述Fc變體包含一種氨基酸取代，所在位點選自L234D、
L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239E、S239N、S239Q,S239F、S239H、S239Y、V240A、V240T、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266A、V266T、V266M、S267Q,S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、
N325A、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、328E、L328N、L328Q、L328F、L328H、L328A、P329F、 A330L、A330V、A330F、A330R、A330H、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y 和 I332A，其中 Fc 區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優選的實施方案中，所述Fc變體選自V264L、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W、F241W/ F243W/V262A/V264A, F241L/V262I、F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T、 F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、 F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、P244H、P245A、P247V、W313F、P244H/ P245A/P247V、P247G、F241 E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Y/V262T/V264R/ I332E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、 A327N、S267Q/A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、N297S、N297D、N297S/I332E、 I332N、I332Q, V264F、V263I、T299A、T299S、T299V、N325Q, N325L、N325I、S239N、S239F、 S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、L234D、L234N、 L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239H、 S239Y、V240A、V263T、V263M、V264M、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、 Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、 N325A、N325V、N325H、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328H/I332E、L328A、 I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。
本發明的另一個目的是提供在存在效應細胞條件下能更低效地介導ADCC的Fc 變體。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、 299、313、325、327、328、329、330和332，其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方 式。在一個優選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選 自:L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、 L235F、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239H、S239Y、V240A、V240T、F241W、F241L、F241Y、 F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、 V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、 V264F、V264M、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、 D265T、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、 Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、 T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、 N325E、N325A、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、328E、L328N、L328Q、L328F、L328H、L328A、 P329F、A330L、A330V、A330F、A330R、A330H、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y 和 I332A, 其中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優選的實施方案中，所述Fc 變體選自V264L、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I 、F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/ V264T、F241E/F243R/V262E/V264R 、F241E/F243Q/V262T/V264E 、F241R/F243Q/ V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、P244H、P245A、P247V、 W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、F241E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Y/ V262T/V264R/I332E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、 Y296Q, T299I、A327N、S267Q/A327S, S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、N297S、N297D、 N297S/I332E、I332N、I332Q、V264F、V263I、T299A、T299S、T299V、N325Q、N325L、N325I、 S239N、S239F、S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、 L235F、S239H、S239Y、V240A、V263T、V263M、V264M、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、 E269F、E269R、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330F、A330R、A330H、 N325D、N325E、N325A、N325V、N325H、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328H/ I332E、L328A、I332T、I332H、I332Y 和 I332A，其中 Fc 區中殘基編號方式是 Kabat 的 EU 標 引方式本發明的另一個目的是提供相對于親本Fc多肽的非糖型具有改良的功能和/或 溶解特性的Fc變體。本文中改良的功能性包括但不限于與Fc配體的結合親和力。本文中 改良的溶解特性包括但不限于穩定性和溶解性。在一個實施方案中，所述非糖基化Fc變體 較糖基化親本Fc多肽與Fc γ R的結合所具有的親和力是可比的或更大。在一個可選的實施 方案中，所述Fc變體與Fc γ R的結合所具有的親和力是在親本Fc多肽糖基化型的0. 4-倍 范圍內。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自 239、241、243、262、264、265、296、297、330 和 332，其中 Fc 區中殘基編號方式是 Kabat 的 EU標引方式。在一個優選的實施方案中，所述Fc變體包含一種氨基酸取代，選自S239D、 S239E、F241Y、F243Y、V262T、V264T、V264E、D265Y、D265H、Y296N、N297D、A330Y 和 I332E，其 中Fc區中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優選的實施方案中，所述Fc變體 選自N297D/I332E、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、S239D/N297D/I332E、S239E/ N297D/I332E、S239D/D265Y/N297D/I332E、S239D/D265H/N297D/I332E、V264E/N297D/ I332E、Y296N/N297D/I332E 和 N297D/A330Y/I332E，其中 Fc 區中殘基編號方式是 Kabat 的 EU標引方式。本發明也提供了用于設計優化的Fc變體的方法。本發明的一個目的是提供可用 于指導Fc優化的設計策略。本發明的另一個目的是提供可用于設計Fc變體的計算篩選方 法。本發明的另一個目的是提供產生用于實驗測試文庫的方法。本發明的另一個目的是提 供用于獲得優化的Fc變體的實驗生產和篩選方法。本發明提供了編碼本文所述Fc變體的分離的核酸。本發明提供了包含所述核酸 的載體，任選地，可操作地連接調控序列。本發明提供了包含該載體的宿主細胞，以及用于 生產和任選地回收該Fc變體的方法。本發明提供了包含本文所公開的Fc變體的新抗體及Fc融合體。所述新抗體及Fc 融合體可在治療產品中使用。本發明提供了包含抗體及Fc融合體以及生理學上或藥學上可接受的載體或稀釋 劑的組合物，所述抗體及Fc融合體包含本文所述的Fc變體。本發明提供了包含本文所公開的Fc變體的抗體及Fc融合體的治療與診斷用途。本發明還涉及1. 一種包含Fc變體部分的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區中包含至少一種氨 基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調節與Fc γ R的結合。2.根據項1所述的抗體，其中所述調節是所述抗體對所述FcyR親和力的增加。3.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置的位置包含至 少一種取代，所述人序列位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、 265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333 和 334 組成的組。4.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體在相應于人序列位置的位置包含至少一 種取代，所述人序列位置選自由 240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328 和 332
組成的組。5.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體包含在位置332的取代。6.根據項1所述的抗體，其中至少一種取代位于選自由239、264、297和330的 位置，附帶條件是如果所述序列基本上是人的，所述取代不是S239A、V264A、N297A、N297Q、 A330D、A330Q、A330K,或 A330S。7.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、234E、 234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、 235I、235V、235F、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、 241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、262I、 262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、 264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、 267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、 297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、 325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327N、327L、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、 328I、328V、328T、328H、328A、329F、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332E、 332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。8.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、264I、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、 243L/264I、243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、 241E/243Q/262T/264E、241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、 328F、332E、328M/332E、244H、245A、247V、313F、244H/245A/247V、247G、264I/332E、 241E/243R/262E/264R/332E、241E/243Q/262T/264E/332E、241R/243Q/262T/264R/332E、 241E/243Y/262T/264R/332E、298A/332E、239EI332E、239Q/332E、239E、265G、265N、 239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、327L、 329F、330L、330Y、332D、297S、297D、297S/332E、297D/332E、297E/332E、265Y/297D/332E、 265Y/297D/299L/332E、265F/297E/332E、328I/332E、328Q/332E、332N、332Q、264T、264F、 240I、263I、266I、299A、299S、299V、325Q、325L、325I、239D、239N、239F、239D/332D、 239D/332E、239D/332N、239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、 239N/332E、239N/332N、239NI332Q、239Q/332D、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、 241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、 264I/330L/332E、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、 235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、239T、239H、239Y、240A、240T、240M、263A、 263T、263M、264M、264Y、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、 298H、299H、330V、330I、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325T、325V、325H、328D/332E、 328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328V/332E、328T/332E、328H/332E、328I/332E、328A、 332T、332H、332Y、332A、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239E/264I/298A/330Y/332E、239D/297D/332E、239E/297D/332E、239D/265V/297D/332E、 239D/265I/297D/332E、239D/265L/297D/332E、239D/265F/297D/332E、 239D/265Y/297D/332E,239D/265H/297D/332E,239D/265T/297D/332E,264E/297D/332E, 296D/297D/332E,296E/297D/332E,296N/297D/332E,296Q/297D/332E,296H/297D/332E, 296T/297D/332E,297D/299V/332E,297D/299I/332E,297D/299L/332E,297D/299F/332E, 297D/299H/332E、297D/299E/332E、297D/330Y/332E、297D/298A/330YI332E、 239D/330Y/332E、239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、 239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 禾口 239D/264I/330L/332E 組成的組。9.根據項7所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置組成的組的 位置，進一步包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、 329、331、333、334 和 339 組成的組。10.根據項1所述的抗體，其中所述Fc YR是Fc YRIIIa。11.根據項10所述的抗體，其中所述Fc γ RIIIa是V158或F158Fc γ RIIIa的同種異型。12.根據項2所述的Fc變體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的，以及所述親和 力較所述的親本Fc多肽高約5倍。13.根據項12所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的，以及所述親和力 較所述親本Fc多肽高約5-約300倍。14.根據項12所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置的位置包 含至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和 325組成的組。15.根據項14所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234E、 234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239D、239E、239N、239Q、239T、240I、240M、243L、264I、 264T、264Y、266I、328M、328I、328Q、328D、328V、328T、330Y、330L、330I、332D、332E、332N、 332Q和325T組成的組。16.根據項15所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264I、243L/264I、328M、 332E、328M/332E、264I/332E、298A/332E、239E/332E、239Q/332E、239E、330Y、332D、 328I/332E、328Q/332E、264T、2401、2661、239D、239D/332D、239D/332E、239D/332N、 239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、239N/332E、239Q/332D、 330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234E、234Y、234I、235D、 235S、235Y、235I、239T、240M、264Y、330I、325T、328D/332E、328V/332E、328T/332E、 328I/332E、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239D/330Y/332E、 239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、239D/298A/332E、 239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 和 239D/264I/330L/332E 組成的 組。17.根據項15所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、 322、326、329、331、333、334和339組成的組組成的組的位置，進一步包含至少一種取代。18.根據項1或2所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的、小鼠的、大鼠的或猴子的。19.根據項1或2所述的抗體，其中與一種或多種Fc配體的結合是未改變的。20.根據項19所述的抗體，其中所述Fc配體選自由Clq、FcRn、蛋白A和蛋白G組 成的組。21.根據項1或2所述的抗體，其中⑶C不受影響。22.根據項1或2所述的抗體，其中與一種或多種Fc配體的結合是改變的。23.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體具有的Fc γ RIIIa倍數Fc γ RIIb倍 數比率大于1。24.根據項23所述的抗體，其中所述Fc變體具有的Fc y RIIIa倍數Fc y RIIb 倍數比率大于約11 1。25.根據項24所述的抗體，其中所述Fc變體具有的Fc y RIIIa倍數Fc y RIIb 倍數比率在約11 1-約86 1。26.根據項23所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置的位置包含 至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、264、296、330和1332組成的組。27.根據項26所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234Υ、 234I、235I、239D、239E、239N、239Q、240A、240M、264I、264Y、296Q、330L、330Y、330I、332D 和 332E組成的組。28.根據項27所述的抗體，其中所述Fc變體選自由332E、264I/332E、239E/332E、 239Q/332E、296Q、330L、330Y、332D、239D、239D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、 330L/332E、264I/330L/332E、234Y、234I、235I、240A、240M、264Y、330I、239D/330L/332E、 239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 禾口 239D/264I/330L/332E 組成的組。29.根據項26所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、 322、326、329、331、333、334和339組成的組的位置，進一步包含一種或多種取代。30.根據項1所述的抗體，其中相對于親本Fc多肽所述Fc變體與至少一種Fc γ R 的結合具有減少的親和力。31.根據項1所述的抗體，其中所述Fc YR是Fc YRIIIa。32.根據項31所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239E、239N、239Q、 239F、239H、239Y、240A、240T、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、 244H、245A、247V、247G、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、 264T、264R、264F、264M、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、 266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、 296L、296I、296H、297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、 313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325V、325H、327N、327L、328M、328E、328N、328Q、 328F、328H、328A、329F、330L、330V、330F、330R、330H、332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。33.根據項31所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、243L/262I/264ff,241Y/243Y/262T/264T,241E/243R/262E/264R,241E/243Q/262T/264E, 241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、328F、244H、245A、247V、313F、 244H/245A/247V,247G,241E/243R/262E/264R/332E,241E/243Y/262T/264R/332E,265G, 265N、239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、 327L、329F、330L、297S、297D、297S/332E、332N、332Q、264F、263I、299A、299S、299V、325Q、 325L、325I、239N、239F、239N/332N、239N/332Q、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239H、239Y、240A、 263T、263M、264M、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、298H、 299H、330V、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325V、325H、328E/332E、328N/332E、 328Q/332E、328H/332E、328A、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。34. 一種包含親本Fc多肽變體的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區中包含至少 一種氨基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調節效應器功能。35.根據項34所述的抗體，其中所述效應器功能是ADCC。36.根據項35所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽改善。37.根據項36所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽提高約5 倍。38.根據項37所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽提高約 5_約50倍。39.根據項37所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置的位置包 含至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和 325組成的組。40.根據項39所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234E、 234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239D、239E、239N、239Q、239T、240I、240M、243L、264I、 264T、264Y、266I、328M、328I、328Q、328D、328V、328T、330Y、330L、330I、332D、332E、332N、 332Q和325T組成的組。41.根據項39所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264I、243L/264I、328M、 332E、328M/332E、264I/332E、298A/332E、239E/332E、239Q/332E、239E、330Y、332D、 328I/332E、328Q/332E、264T、2401、2661、239D、239D/332D、239D/332E、239D/332N、 239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、239N/332E、239Q/332D、 330Y/332E、2641/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234E、234Y、2341、235D、 235S、235Y、2351、239T、240M、264Y、3301、325T、328D/332E、328V/332E、328T/332E、 328I/332E、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239D/330Y/332E、 239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、239D/298A/332E、 239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 和 239D/264I/330L/332E 組成的 組。42.根據項39所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、 322、326、329、331、333、334和339組成的組的位置，進一步包含至少一種取代。43.根據項39所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的、小鼠的、大鼠的或 猴子的。
44.根據項35所述的抗體，與所述親本Fc多肽比較其中所述Fc變體減弱了 ADCC。45.根據項44所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239E、239N、239Q、 239F、239H、239Y、240A、240T、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、 244H、245A、247V、247G、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、 264T、264R、264F、264M、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、 266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、 296L、296I、296H、297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、 313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325V、325H、327N、327L、328M、328E、328N、328Q、 328F、328H、328A、329F、330L、330V、330F、330R、330H、332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。46.根據項44所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、 243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、241E/243Q/262T/264E、 241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、328F、244H、245A、247V、313F、 244H/245A/247V、247G、241E/243R/262E/264R/332E、241E/243Y/262T/264R/332E、265G、 265N、239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、 327L、329F、330L、297S、297D、297S/332E、332N、332Q、264F、263I、299A、299S、299V、325Q、 325L、325I、239N、239F、239N/332N、239N/332Q、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、234D、 234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239H、239Y、240A、 263T、263M、264M、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、298H、 299H、330V、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325V、325H、328E/332E、328N/332E、 328Q/332E、328H/332E、328A、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。47. 一種包含親本Fc多肽的非糖基化Fc變體的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc 區中包含至少一種氨基酸修飾，相對于所述親本Fc多肽的非糖基化型，所述非糖基化Fc變 體具有改善的穩定性、溶解性或對Fc配體的結合親和力。48.根據項47所述的抗體，與親本Fc多肽的非糖基化型比較，所述非糖基化Fc變 體具有改善的對Fc配體的結合親和力。49.根據項48所述的抗體，其中所述Fc配體是Fc y R050.根據項49所述的抗體，其中所述Fc γ R是Fc γ RIIIa051.根據項48所述的抗體，其中所述改善的結合親和力在親本Fc多肽的糖基化型 的0.4倍范圍內。52.根據項47所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置的位置包含 至少一種取代，所述人序列位置選自由239、241、243、262、264、265、296、297、330和332組 成的組。53.根據項52所述的抗體，其中所述Fc變體包含一種或多種取代，選自由239D、 239E、241Y、243Y、262T、264T、264E、265Y、265H、296N、297D、330Y 和 332E 組成的組。54.根據項52所述的抗體，其中所述Fc變體選自由297D/332E、 241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、239D/297D/332E、239E/297D/332E、239D/265Y/297D/332E、239D/265H/297D/332E、264E/297D/332E、296N/297D/332E 禾口 297D/330Y/332E 組成的組。55.根據項53所述的抗體，其中所述非糖基化Fc變體部分在相應于人序列位置 的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、329、 331、333、334 和 339。56.根據項1所述的抗體，包含含有所述Fc變體的Fc融合體。57.根據項1或56所述的抗體，其中所述抗體進一步包含工程改造的糖型。58.根據項57所述的抗體，其中所述工程改造的糖型改善了效應器功能。59. 一種藥物組合物，包含根據項1所述的抗體和藥學上可接受的載體。60. 一種治療需要所述治療的哺乳動物的方法，包含施用項1的抗體。61. 一種包含Fc變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由332D、332E、 332N或332Q組成的組，其中所述位置相應于人序列位置，其中所述抗體對靶抗原具有特異 性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。62. 一種包含Fc變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由264Ι、264Τ 或264Υ組成的組，其中所述位置相應于人序列位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具 有特異性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR, EpCAM、MUCl、GD3、 CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。63. 一種包含Fc變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由239D、239E、 239N、239Q或239T組成的組，其中所述位置相應于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合 體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、 MUC1、GD3、CEA、CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。64. 一種包含Fc變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由330Y、330L 或3301組成的組，其中所述位置相應于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原 具有特異性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、 CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。65. 一種包含Fc變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由2401或240Μ 組成的組，其中所述位置相應于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具有特 異性，所述靶抗原選自由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、CEA, CA 125、HLA-DR、TNF α 和 VEGF 組成的組。66. 一種包含Fc變體的抗體，所述Fc變體包含一種取代，選自297D，其中所述位 置相應于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自 由 CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUCl、GD3、CEA, CA 125、HLA-DR, TNF α 和VEGF組成的組。67. 一種根據項61、62、63、64、65或66所述的抗體，其中所述Fc變體還包含取代 298Α。附圖簡述圖1.抗體結構與功能。顯示的是全長人IgGl抗體的模型，模型使用了來自pdb 登記號 ICEl (James 等·，1999，J Mol Biol 289 293-301)的人源化 Fab 結構和來自 pdb 登記號 1DN2 (DeLano 等·，2000，Science 287 1279-1283)的人 IgGl Fc 結構。未顯示連接 Fab和Fc區的柔性鉸鏈。IgGl是異二聚體的同二聚體，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。標記 了抗體包含的Ig結構域，對于輕鏈而言包括八和Q，對于重鏈而言包括VH、CyI、CY2和 CY30標記了 Fc區。標記了相關蛋白的結合位點，包括可變區中的抗原結合位點，以及Fc 區中Fc γ Rs、FcRn, Clq和蛋白A和G的結合位點。圖2. Fc/Fc YRIIIb復合物結構1IIS。Fc顯示為灰色飄帶圖，Fc γ RIIIb顯示為 黑色飄帶圖。Ν297糖顯示為黑色棒狀。圖 3.阿侖單抗(alemtuzumab) (Campath , Ilex Pharmaceuticals LP 的注冊商 標)抗體的重鏈氨基酸序列，闡明了位置編號順序(在氨基酸序列上的2行)和依照Kabat 的EU標引方式的位置編號(在氨基酸序列下的2行)。Ig結構域VH1、Cy1、鉸鏈、CY2和 C Y 3大致的起點也標記于上述連續編號中。已觀察到許多Fc位點上的多態性，包括但不限 于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此此處顯示的序列與現有技術序列之間可能存 在著微小的差異。圖4.定位在Fc/Fc γ RIIIb復合物結構IllS上的實驗文庫殘基。Fc顯示為灰色 飄帶圖，Fc γ RIIIb顯示為黑色飄帶圖。實驗文庫殘基顯示為黑色球狀和棒狀。N297糖顯 示為黑色棒狀。圖5.人IgGl Fc序列，顯示了與Fc變體實驗文庫設計相關的位點。該序列包括 鉸鏈區、C Y2結構域和C Y3結構域。殘基編號依照Kabat的EU標引方式。與實驗文庫相 關的位點加下劃線。因為觀察到許多Fc位點上的多態性突變，所以此處顯示的序列與文獻 序列之間可能存在著微小的差異。圖6. 293T細胞中阿侖單抗的Fc變體和野生型(WT)蛋白的表達。含有阿侖單抗重 鏈基因(野生型或變體)的質粒與含有阿侖單抗輕鏈基因的質粒共轉染。轉染5天后收獲 培養液。對于每個轉染的樣品而言，在SDS-PAGE凝膠上加載IOul培養液進行蛋白質印跡分 析(Western analysis) 0用于蛋白質印跡的探針是過氧化物酶偶聯的羊抗人IgGCJackson Immuno-Research，產品目錄#109-035-088)。WT 生型阿侖單抗；1-10 阿侖單抗變體。H 和L分別表示抗體重鏈和輕鏈。圖7.使用蛋白A層析純化阿侖單抗。在293T細胞中表達野生型阿侖單抗蛋白，轉 染5天后收獲培養液。將培養液用PBS稀釋到1 1，并用蛋白A(PierCe，產品目錄#20334) 純化。0 純化前原始樣品；FT 流出液；E 洗脫液；C 濃縮的最終樣品。左圖顯示了 Simple 藍染色的SDS-PAGE凝膠，右圖顯示了使用過氧化物酶偶聯的羊抗人IgG標記的蛋白質印 跡。圖8.去糖基化抗體的產生。在293T細胞中表達阿侖單抗的野生型和變體，并用 蛋白A層析純化。抗體與肽-N-糖苷酶(PNGase F)在37°C溫育24小時。對于每個抗體來 說，平行進行模擬處理樣品(-PNGase F)的試驗。WT 野生型阿侖單抗；#15、#16、#17、#18、 #22 分別為阿侖單抗變體 F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/ F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R 和 I332E。相對于模擬處理的樣品，PNGase F處理的樣品遷移更快，代表了去糖基化重鏈。圖9.表達自293T細胞的阿侖單抗與其抗原的結合。融合有GST的⑶52肽抗原 在IPTG誘導下表達自大腸桿菌BL21 (DE3)。未誘導和誘導的樣品都繼續跑SDS-PAGE凝膠，并轉移到PVDF膜上。對于蛋白質印跡來說，來自Sotec (α-⑶52，Sotec)的阿侖單抗(終 濃度為2. 5ng/ul)或經轉染的293T細胞(Campath，Xencor)的培養液(阿侖單抗終濃度約 為0. 1-0. 2ng/ul)作為一抗，過氧化物酶偶聯的羊抗人IgG作為二抗。M 預染色的標記物； U 未誘導GST-CD52的樣品；I 誘導GST-CD52的樣品。圖10.人V158Fc γ RIIIa胞外區的表達和純化。標記的Fc γ RIIIa轉染入293T細胞中，3天后收獲含有分泌的Fc YRIIIa的培養液并用親和層析純化。1 培養液；2 流出 液；3 洗滌液；4-8 連續的洗脫液。simple藍染色的SDS-PAGE凝膠和蛋白質印跡的結果都 得到顯示。對于蛋白質印跡而言，膜用抗-GST抗體探針探測。圖11.使用實施例2所述的AlphaScreen 分析法確定實驗文庫選擇的阿侖單抗 Fc變體與人V158Fc YRIIIa的結合。在存在競爭性抗體(Fe變體或野生型阿侖單抗)情 況下，當發光信號減少時觀察到特征性抑制曲線。磷酸鹽緩沖液(PBS)單獨作為陰性對照。 這些數據對最大和最小發光信號歸一化，所述最大和最小發光信號分別提供自低和高濃度 競爭性抗體的基線。曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬合，所述擬合使用了非線性 回歸。這些擬合提供了每個抗體的IC50s，野生型和S239D用點線說明。圖12. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人Fc γ RIIb的結 合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖13. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人Vall58Fc y RIIIa 的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖14. AlphaScreen 分析法測量了在背景利妥昔單抗(rituximab)中選擇的Fc 變體與人V158FC YRIIIa的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬 合。PBS作為陰性對照。圖15. AlphaScreen 分析法測量了在背景曲妥單抗(trastuzumab)中選擇的Fc 變體與人V158 Fc γ RIIIa的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬 合。PBS作為陰性對照。圖16a_16b. AlphaScreen 分析法比較了選擇的阿侖單抗Fc變體與人V158 Fc γ RIIIa (圖16a)及人Fc γ RIIb (圖16b)的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位 點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖17. AlphaScreen 分析法測量了在背景曲妥單抗中選擇的Fc變體與人V158 Fc YRIIIa的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬合。圖18. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人R131 Fc y RIIa 的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬合。圖19a和19b. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人 V158 FcYRIIIa的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型(one site competition model)的擬合。PBS作為陰性對照。圖20. AlphaScreen 分析法顯示了非糖基化阿侖單抗Fc變體與人V158 Fc γ RIIIa的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰 性對照。圖21. AlphaScreen 分析法比較了選擇的阿侖單抗Fc變體糖基化型(實心符號， 實線)及非糖基化型(空心符號，打點的線)與人V158 FcYRIIIa的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位點競爭性模型的擬合。圖22a_22b. AlphaScreen 分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人Fc y RIIIa 的V158(圖22a)及F158(圖22b)同種異型的結合。歸一化數據，曲線代表了數據對單位 點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖23a_23d.圖23a和23b顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與V158 Fc γ RIIIa (圖 23a)及 F158 Fc γ RIIIa(圖 23b)結合的 SPR Kd' s 與 AlphaScreen IC50' s 之間的相 關性。圖23c和23d顯示了對于選擇的阿侖單抗Fc變體與V158 Fc γ RIIIa(圖23c)及 F158 Fc YRIIIa(圖23d)結合而言，SI3R與AlphaScreen 測定的較野生型改良的倍數的結 果之間的相關性。結合數據列于表62中。通過數據的線代表了數據的線性擬合，r2值表示 這些擬合的顯著性。圖24a_24b.在背景阿侖單抗中選擇的Fc變體基于細胞的ADCC測定。使用基 于DELFIA EuTDA的細胞毒性測定法(Perkin Elmer, ΜΑ)測量ADCC，描述于實施例7，使用 DoHH-2淋巴靶細胞和50倍過量的人PBMCs。圖24a是顯示了用于指示lOng/ml阿侖單抗抗體的原始熒光數據的條形圖。PBMC 條顯示了在缺乏抗體條件下細胞毒性的基礎水平。對于指明的阿侖單抗抗體而言，圖24b 顯示了 ADCC對抗體濃度的劑量依賴性，對最小和最大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒 光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數據對S形劑量-響應模型的擬合， 所述擬合使用了非線性回歸。圖25a_25b.在背景利妥昔單抗中選擇的Fc變體基于細胞的ADCC測定。使用 DELFIA EuTDA的細胞毒性測定法(Perkin Elmer, ΜΑ)測量ADCC，描述于實施例7，使用 WIL2-S淋巴靶細胞和50倍過量的人PBMCs。圖25a是顯示了用于指示lng/ml利妥昔單抗 抗體的原始熒光數據的條形圖。PBMC條顯示了在缺乏抗體條件下細胞毒性的基礎水平。對 于指明的利妥昔單抗抗體而言，圖25b顯示了 ADCC對抗體濃度的劑量依賴性，對最小和最 大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代 表了數據對S形劑量-響應模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖26a_26c.在背景曲妥單抗中選擇的Fc變體基于細胞的ADCC測定。使用 DELFIA EuTDA的細胞毒性測定法(Perkin Elmer, ΜΑ)測量ADCC，描述于實施例7，使用 BT474和Sk-Br-3乳腺癌靶細胞和50倍過量的人PBMCs。圖26a是顯示了用于指示lng/ml 曲妥單抗抗體的原始熒光數據的條形圖。PBMC條顯示了在缺乏抗體的條件下細胞毒性的基 礎水平。對于指明的曲妥單抗抗體而言，圖26b和26c顯示了 ADCC對抗體濃度的劑量依賴， 對最小和最大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒光信號分別提供自低和高濃度抗體的基 線。曲線代表了數據對S形劑量-響應模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖27a_27b.選擇的Fc變體介導結合和激活補體的能力。圖27a顯示 AlphaScreen 分析法測量的選擇的阿侖單抗Fc變體與Clq的結合。數據對最大和最小發 光信號歸一化，所述最大和最小發光信號分別提供自低和高濃度競爭性抗體的基線。曲線 代表了數據對單位點競爭性模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖27b顯示了基于 細胞測定法測量的選擇的利妥昔單抗Fc變體介導CDC的能力。使用Amar藍(Amar Blue) 來監測人血清補體(Quidel，San Diego, CA)對Fc變體和野生型利妥昔單抗調理的WIL2-S 淋巴細胞的溶胞作用而實現CDC測定。對于指明的利妥昔單抗抗體而言，顯示了補體介導的溶胞作用對抗體濃度的劑量依賴性，對最小和最大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒 光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數據對S形劑量-響應模型的擬合， 所述擬合使用了非線性回歸。圖28. AlphaScreen 分析法測量的選擇的阿侖單抗Fc變體與細菌蛋白A的結合， 描述于實施例9。歸一化數據，曲線代表數據對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對 照。圖29. AlphaScreen 分析法測量的選擇的阿侖單抗Fc變體與小鼠Fc y RIII的結 合，描述于實施例10。歸一化數據，曲線代表數據對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰 性對照。圖30. AlphaScreen 分析法測量的選擇的曲妥單抗Fc變體與人V158Fc y RIIIa 的結合，所述曲妥單抗Fc變體在293Τ和CHO細胞中表達，描述于實施例11。歸一化數據， 曲線代表數據對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖31a_31c.顯示了改良的抗-⑶20抗體的序列。利妥昔單抗的輕鏈和重鏈序列分 別呈現于圖31a和圖31b中，獲得自US 5，736，137的翻譯的序列3。圖31b中相關位置用 粗體表示，包括 S239、V240、V2641、N297、S298、A330 和 1332。圖 31c 顯示了改良的抗-CD20 抗體重鏈序列，具有粗體X” X2> X3、X4、X5、X6和Z1所指定的可變區位置。序列下的表格提 供了對于那些位置而言可能的取代。改良的抗-⑶20抗體序列包含至少一種非野生型氨基 酸，可能的取代選自對&、^3、&、&和&的取代。這些改良的抗-⑶20抗體序列也可包 含Z1的取代。這些位置依照Kabat的EU標記方式編號，因此并不相應于序列中連續的順 序。發明詳述為了能更徹底地理解發明，以下列出一些定義。上述定義意在包含語法等同成分。本文中使用的“ADCC”或“抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用”意指細胞介導的反 應，其中表達Fc y Rs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結合抗體并隨后引起對靶 細胞的溶胞作用。本文中使用的“ADCP”或“抗體依賴性細胞介導的細胞吞噬作用”意指細胞介導的 反應，其中表達Fc y Rs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結合抗體并隨后引起對 靶細胞的吞噬作用。本文中的“氨基酸修飾”意指多肽序列中氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中優 選的氨基酸修飾是取代。"TT本文中“抗體”意指由基本上為公認的免疫球蛋白基因的全部或部分所編碼的一 種或多種多肽組成的蛋白質。所述公認的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括kappa( κ) κ、Iambda(A) λ和重鏈基因座，其中包含了無數的可變區基因，以及分別編碼IgM、IgD、 IgG、IgE 和 IgA 同種型的恒定區基因 mu( μ) μ ,delta( δ ) δ >gamma(y) γ ,sigma(o ) σ、 alpha(a) α。本文中的抗體意指包括全長抗體和抗體片段，和來自任意生物體可稱為天 然抗體的，工程抗體，或為試驗、治療目的或其它如下所進一步規定的目的而重組產生的抗 體。因此，“抗體”包括多克隆和單克隆抗體(mAb)。制備和純化單克隆及多克隆抗體的方 法為本領域所公知，描述于如 Harlow 禾口 Lane，Antibodies :A Laboratory Manual 中(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)。如本文所概述，“抗體”明確地包括本文中所描述的Fc變體，“全長”抗體包括本文中描述的Fc變體片段，以及本文中描述的與 其它蛋白質融合的Fc變體。在一些實施方案中，抗體可以是中和性的、或抑制性的、或刺激性的抗體，在優選 的實施方案中，如本文所描述，與親本抗體(如，當非天然存在變體用作為本文中的計算分 析的出發點時)相比時，或與原始的野生型抗體相比時，通過變體抗體與受體親和力的增 加來測定刺激活性。因此，本文中“中和(neutralization)”、“中和(neutralize) ”、“中和 (neutralizing)，，以及語法等同成分意指抑制或減少抗體的生物效應，在一些情況下通過 與抗原結合(如競爭性地)消除或減弱結合的生物效應，或通過結合以導致結合的生物效 應減弱。術語“抗體”包括抗體片段，為本領域所公知，諸如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fc或 抗體的抗原結合的其它亞序列，例如，單鏈抗體(例如Fv)、嵌合抗體等，或通過修飾完整抗 體或使用重組DNA技術重新合成的那些抗體而產生的抗體片段。具體優選的是如本文所 述的Fc變體。術語“抗體”還包含能做為激動劑或拮抗劑抗體的多克隆抗體和單克隆抗體 (mAbs) ο如本文所概述，本發明的抗體特異性結合Fc受體。本文中“特異性結合”意指 具有結合常數至少為KT4-KT6M-1,優選為Ι Τ-Ι ΤΜ—1的LC抗體。在一個優選的實施方案 中，本發明的抗體是人源化的。使用通用的單克隆抗體技術，人們可制備事實上抗已得到 鑒定的任意靶抗原的人源化抗體[Stein, Trends Biotechnol. 15 :88_90 (1997)]。非人 (如，鼠)抗體的人源化型是免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如as Fv, Fe, Fab, Fab' , F(ab' ) 2或其它抗體的抗原結合序列)的嵌合分子，所述片段含有衍生自非人免 疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受者的抗體)，其中接受者的互 補決定區(CDR)的殘基為來自諸如具有所需特異性、親和力以及能力的小鼠、大鼠或兔的 非人物種(供體的抗體)CDR的殘基所取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架區殘 基為相應的非人殘基所取代。人源化抗體也可包含既不在接受者抗體中也不在被引入的 CDR或骨架區序列中發現的殘基。一般而言，人源化的抗體可包含至少一個、以及通常為 兩個可變區的基本上全部的結構，其中全部或基本上全部的CDR區相應于非人免疫球蛋白 的那些CDR區，全部或基本上全部的FR區是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體最好 也包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(Fe)，通常為人免疫球蛋白的恒定區[Jones等.， Nature 321 :522_525(1986) ；Riechmann 等·，Nature 332 :323_329(1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. BIOL. 2 :593_596 (1992)]。人源化非人抗體的方法為本領域眾所周知。 一般而言，人源化抗體引入了一個或多個非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基 通常稱為引入殘基(import residues)，其一般來自引入的可變區。采用Winter與其同 事的方法[Jones 等.，同上；Riechmann 等.，同上；以及 Verhoeyen 等.，Science，239 1534-1536 (1988)]，通過用嚙齒動物⑶Rs或⑶R序列取代人抗體的相應序列，人源化可基 本上得到完成。人源化小鼠單克隆抗體的其它實例也為本領域所公知，例如，結合人蛋白 C
，白介素 2 受體[Queen 等· ,Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α. 86 10029-33 (1989])，以及人表皮生長因子受體2的抗體[Carter等·， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 :4285_9 (1992)]。因此，上述人源化抗體為嵌合抗體(美國 專利第4，816，567號)，其中基本上小于完整的人可變區已為來自非人物種的相應序列所取代。實際中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些⑶R殘基和可能有一些FR殘基為來自 嚙齒動物抗體中的相似位點所取代。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體是基于人序列的，因此人序列被用作為 “堿基”序列，抗諸如大鼠、小鼠和猴子的序列。為確定與原序列或結構的同源性，前體或親 本Fc的氨基酸序列與本文所列的人Fc序列直接比較。在序列比對后，使用一種或多種本 文所述的同源性比對程序(例如在物種之間使用保守殘基)來確定與人Fc原序列中特定 氨基酸等價的殘基，為維持比對的進行應考慮到必需的插入和缺失(即，避免通過任意的 缺失或插入而排除保守殘基)。保守殘基的排列優選上述殘基應100%保守。然而，大于 75%或少至50%的保守殘基的比對也足夠用于確定等價殘基(在本文中有時稱為“相應的 殘基”)。對于已通過X-射線結晶學測定三維結構的Fc片段而言，等價殘基也可通過確定 三維結構水平上的同源性而得到確定。等價殘基確定為親本或前體特定氨基酸殘基的兩個 或更多個主鏈原子的原子坐標(N對N，CA對CA，C對C以及0對0)在比對后處于0. 13nm 范圍內以及優選在0. Inm內的那些。在最佳模型已定向并定位以給出Fc變體片段非氫蛋 白質原子的原子坐標的最大重疊后，比對得到實現。明確地包括于“抗體”定義范圍內的是非糖基化抗體。本文使用的“非糖某化杭 體”意指在Fc區297位缺少糖附著的抗體，其中編號方式依照Kabat的EU系統。非糖基 化的抗體可以是去糖基化的抗體，其是一種Fc糖已去除的抗體，例如以化學或酶的方法去 除。可選地，所述非糖基化抗體可以是非糖基化或未糖基化的抗體，其是一種無Fc糖表達 的抗體，例如通過突變一種或多種編碼糖基化型的殘基或通過在諸如細菌的不將糖附著到 蛋白質上的生物體中表達。明確地包括于“抗體”定義范圍內的是含有Fc變體部分的全長抗體。本文中“全 意指構成抗體的天然生物學類型的結構，包括可變區和恒定區。舉例來說，在包括
人和小鼠的大多數哺乳動物中，IgG類的全長抗體是一種四聚體并由相同的兩對兩條免疫 球蛋白鏈組成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈，每條輕鏈包含免疫球蛋白結構域\和Q， 每條重鏈包含免疫球蛋白結構域VH、CyI、CY2和CY3。在一些哺乳動物中，例如在駱駝 (camel)和美洲駝(llamas)中，IgG抗體可僅由兩條重鏈組成，每條重鏈包含一個附著在Fc 區上的可變區。本文中使用的‘ εΤ’意指屬于抗體類的多肽，其基本上為公認的免疫球蛋白 Y基因所編碼。在人中，該類包含IgGl、IgG 2、IgG3和IgG4。在小鼠中，該類包含IgGl、 IgG2a、IgG2b、IgG 3。本文中使用的“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20種天然存在的氨基酸之一或 任一非天然類似物，它們可位于特別規定的位置。本文中“蛋白質”意指至少兩個共價連接 的氨基酸，其包括蛋白質、多肽、寡肽和肽。蛋白質可由天然存在的氨基酸和肽鍵構成，或由 合成的肽模擬物結構構成，該肽模擬物即“類似物”，特別是當將LC肽施用于患者時，如類 肽(peptoid)(參見，Simon 等·，PNAS USA 89(20) :9367 (1992))。因此本文中使用的“氨 基酸”或“肽殘基”意指天然存在和合成的氨基酸。舉例來說，對于本發明目的而言，高苯基 丙氨酸、瓜氨酸和降亮氨酸被認為是用于本發明目的的氨基酸。“氨基酸”也包括諸如脯氨 酸和羥脯氨酸的亞氨基酸殘基。側鏈可以是(R)或(S)構型。在優選的實施方案中，氨基 酸以(S)或L-構型存在。如果使用非天然存在的側鏈，可使用非氨基酸取代，例如以阻止或延遲體內降解。本文中“計算篩詵方法(computational screening method) ”意指用于設計蛋白 質中一種或多種突變的任何方法，其中所述方法使用了計算機來評估可能的氨基酸側鏈取 代相互之間和/或與蛋白質的其它部分相互作用的能量。本領域技術人員可以理解，能量 評估涉及能量計算，能量計算涉及一些對一種或多種氨基酸修飾的打分方法。所述方法可 涉及物理或化學能項(energy term)，或可涉及基于已有知識-、統計學-、序列的能項等。 所述計算由在本文中稱為“計算篩詵計算(computational screening calculations) ”的 計算篩選方法組成。本文中使用的“效應器功能”意指由抗體Fc區與Fc受體或配體相互作用產生的 生化反應。效應器功能包括但不限于ADCC、ADCP和⑶C。本文中使用的“效應細胞”意指表 達一種或多種Fc受體并介導一種或多種效應器功能的免疫系統細胞。效應細胞包括但不 限于單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、 大顆粒淋巴細胞、朗罕氏細胞，自然殺傷(NK)細胞以及灃T細胞，以及可來自任何生物體包 括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。本文中“^1”意指任意形式的一組Fc變體，包括 但不限于一列核酸或氨基酸序列，一列在可變位置的核酸或氨基酸取代，包含編碼庫序列 的核酸的物理文庫，或包含Fc變體蛋白質的物理文庫，所述Fc變體蛋白質以純化或未純化 的形式存在。本文中使用的“Fc”、“Fc區”、“Fe多肽”等意指于本文定義的抗體,其包括包含除 免疫球蛋白結構域第一恒定區外的抗體恒定區的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG免疫球 蛋白結構域的最后兩個恒定區，IgE和IgM免疫球蛋白的最后三個恒定區，和這些結構域的 N-末端連接的柔性鉸鏈。對于IgA和IgM而言，可包括J鏈。對于IgG來說，如圖1所示， Fc包含免疫球蛋白結構域C γ 2和C γ 3以及C γ 1和C γ 2之間的鉸鏈。盡管Fc區的邊界 可改變，人IgG重鏈Fc區通常規定為在其羧基末端包含殘基C226或P230，其中編號方式依 照Kabat的EU標引方式。Fc可指分離的該區域，或在上下文的抗體、抗體片段或Fc融合體 中的該區域。Fc可以是抗體、Fc融合體，或包含Fc的蛋白質或蛋白質結構域。特別優選的 是Fc變體，其是非天然存在的Fc變體。本文中使用的“Fe融合體”意指其中一個或更多個多肽可操作地連接Fc的蛋白 質。在本文中Fc融合體與現有技術中所使用的術語“免疫粘合素”、“Ig融合體”、“Ig嵌合 體，，以及“受體球蛋白”(有時加破折號)(Chamow等· , 1996,Trends Biotechnol 14 :52_60 ； Ashkenazi 等.，1997，Curr Opin Immunol 9 195-200)的含義是相同的。Fc 融合體將免疫 球蛋白Fc區與融合伴侶(fusion partner)結合，一般而言，所述融合伴侶可以是任何蛋白 質，包括但不限于，受體的靶結合區、粘合素分子、配體、酶或某些其它蛋白質或蛋白質結構 域。Fc融合體非Fc-部分的作用是介導靶結合，因此其功能類似于抗體的可變區。本文中使用的“Fe γ受體”或“Fe y R”意指結合IgG抗體Fc區并且基本上為Fc γ R 基因所編碼的蛋白質家族的任何成員。在人類中，該家族包括但不限于Fc YRI (CD64)，包 含亞類 Fc y RIa、Fc y RIb 和 Fc y RIc ；Fc y RII (CD32)，包含 Fc γ RIIa(包括同種異型 Η131 和 R131)、Fc y RIIb (包括 Fc y RIIb-I 禾口 Fc y RIIb-2)禾口 Fc y RIIc ；以及 Fc y RIII (CD16)， 包含但不限于發Fc y RIIIa(包括同種異型V158和F158)和Fc y RIIIb (包括同種異型 Fc γ RIIIb-NAl 和 Fc YRIIIb-NA2) (Jefferis 等·，2002，Immunol Lett 82 :57_65)，也包括任何未被發現的人Fc Y Rs或Fc Y R亞類或同種異型。Fc y R可來自任何生物體，包括但不限 于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠Fc y Rs包括但不限于Fc y RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)、 FcyRIII (CD16)以及Fc γ RIII-2 (CD16-2)，也包括任何未被發現的小鼠Fc γ Rs或Fc γ R 亞類或同種異型。本文中使用的“Fe配體”意指來自仵何牛物體的一種分子,優詵一種多肽,其與抗體的Fc區結合以形成Fc-配體復合物。Fc配體包括但不限于Fc y Rs、Fc y Rs、Fc y Rs、 FcRn、Clq、C3、甘露聚糖結合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G以及病 毒Fc γ R。Fc配體可包括未被發現的能結合Fc的分子。本文中使用的“Μ”意指一種屬于抗體類的多肽，其基本上為公認的免疫球蛋白 Y基因所編碼。在人類中，該類包含IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，該類包含IgGl、 IgG2a、IgG2b、IgG3。本文中“免疫球蛋白(Ig) ”意指由基本上為免疫球蛋白基因所編碼的 一個或多個多肽組成的蛋白質。免疫球蛋白包括但不限于抗體。免疫球蛋白可具有許多 結構型，包括但不限于全長抗體、抗體片段和單個免疫球蛋白結構域。本f中“免瘡球蛋白 iM^HM”意指為蛋白質結構領域技術人員所確定的作為分離的結構實體而存在的免疫 球蛋白的區域。Ig結構域通常具有特征性的多層(sandwich)折疊拓撲結構。抗體IgG 類中已知的Ig結構域VH、CY 1、C γ 2、C γ 3、Vl以及Cl。本文中使用的“親本多肽”或“前體多肽”(包括Fc親本或前體)意指一種隨后被 修飾以產生變體的多肽。所述親本多肽可以是天然存在多肽，或天然存在多肽的變體或工 程型。親本多肽可指該多肽自身、包含該親本多肽的組合物或編碼其的氨基酸序列。因此， 本文中使用的“親本Fc多肽”意指未修飾的Fc多肽，其可修飾以產生變體，在本文中使用 的“親本抗體”意指未修飾的抗體，其可修飾以產生抗體變體。如上所概述，Fc分子的某些位置可得到改變。本文中使用的“位置”意指在蛋白質 序列中的位置。位置可按順序編號，或依據已確定的方式編號，例如Kabat的EU標引方式。 舉例來說，位置297是人抗體IgGl中的一個位置。如上所述，一般通過與其它親本序列比 對確定相應的位置。本文中使用的“_”意指在蛋白質中的位置以及與之相關的氨基酸同一性。例 如，Daragine 297 (也稱為N297)是在人抗體IgGl中的一種殘基。本文中使用的“I^M”意指與給定抗體可變區特異性結合的分子。靶抗原可以 是蛋白質、糖類、脂質或其它化合物。本文中使用的“靶細胞”意指表達靶抗原的細胞。本文中使用的“可變區”意指包含一個或多個基本上為任一 Vk、νλ和/或Vh基 因所編碼的Ig結構域的免疫球蛋白區域，所述的VK、νλ和/或Vh基因分別構成了免疫 球蛋白κ、λ和重鏈的基因座。本文中使用的“變體多肽”意指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親本多肽序列 的多肽序列。變體多肽可指多肽自身、包含該多肽的組合物或編碼其的氨基序列。優選地， 與親本多肽相比該變體多肽具有至少一個氨基酸修飾，如與親本多肽相比約1到約10個氨 基酸修飾，以及優選約1到約5個氨基酸修飾。本文中該變體多肽序列與親本多肽序列優 選具有至少約80%的同源性，最優選至少約90%的同源性，更優選至少約95%的同源性。 因此，本文中使用的“Fe變體”意指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親本Fc序列的Fc序列。Fc變體可以僅包含Fc區，或可存在于上下文的抗體、Fc融合體或其它基本上由Fc編 碼的多肽中。Fc變體可指Fc多肽自身、包含該Fc變體多肽的組合物或編碼其的氨基酸序 列。對于本發明中討論的所有位置而言，免疫球蛋白重鏈的編號方式依照EU標引方 式(Kabat 等·，1991，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 5 片反·，United States Public Health Svice， National Institutes of Health， Bethesda)。 "Kabat 的 EU標引方式”指人IgGlEU抗體的殘基編號方式。本發明的Fc變體可對不同的特性進行優化。可優化的特性包括但不限于對Fc YR 增強或減少的親和力。在一個優選的實施方案中，優化本發明的Fc變體對人激活的Fc y R、 優選 Fc y RI,Fc y RIIa,Fc y RIIc,Fc y RIIIa 和 Fc y Rlllb，最優選 Fc y RIIIa 具有增強的 親和力。在一個可選地優選的實施方案中，優化Fc變體對人抑制性受體Fc y RIIb具有減 少的親和力。這些優選的實施方案預期能提供在人中具有增強治療特性的抗體和Fc融合 體，例如增強的效應器功能以及更強的抗癌效力。在一個可選的實施方案中，優化本發明的 Fc 變體以對人 Fc y R，包括但不限于 Fc γ RI、Fc γ RIIa,Fc γ RIIb、Fc γ RIIc、Fc γ RIIIa 和 Fc YRIIIb具有減少或消除的親和力。這些實施方案預期能提供在人中具有增強治療特性 的抗體和Fc融合體，例如減少的效應器功能以及減少的毒性。優選的實施方案包含優化結 合人Fc γ R的Fe，另一方面，在可選的實施方案中本發明的Fc變體對于來自非人生物體的 Fc γ Rs具有增強或減少的親和力，非人生物體包括但不限于小鼠、大鼠、兔子和猴子。對與 非人Fc γ R的結合進行優化的Fc變體可用于試驗目的。舉例來說，對于不同疾病而言，所 獲得的小鼠模型能夠測試諸如有效性、毒性和藥物代謝動力學的特定候選藥物特性。在本 領域中公知一種稱為異種移植術的方法可將癌細胞移植或注射如小鼠中以模擬人癌癥。對 包含對一種或多種小鼠Fc y Rs優化的Fc變體的抗體或Fc融合體進行測試可提供與該抗 體或Fc融合體有效性、其作用機理等相關的有價值的信息。本發明的Fc變體也可優化以 增強非糖基化型的功能性和/或溶解性。在一個優選的實施方案中，本發明的非糖基化Fc 變體較親本Fc多肽的非糖基化型對Fc配體的結合具有更大的親和力。所述Fc配體包括 但不限于Fc YRs、Clq、FcRn以及蛋白A和G，且可來自任何來源包括但不限于人、小鼠、大 鼠、兔子或猴子，優選人。在一個可選地優選的實施方案中，該優化的Fc變體較親本Fc多 肽的非糖基化型可更穩定和/或更易溶解。得到改造或預測顯示任一上述優化特性的Fc 變體在本文中稱為“優化的Fc變體”。本發明的Fc變體可來自不同來源的親本Fc多肽。該親本Fc多肽可基本上為一種 或多種Fc基因所編碼，所述Fc基因來自任意生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、駱 駝、美洲駝、單峰駱駝、猴子，優選哺乳動物，最優選人和小鼠。在一個優選的實施方案中，該 親本Fc多肽包含抗體，稱為親本抗體。所述親本抗體可以是完全人抗體，例如獲得自使用 轉基因小鼠(Bruggemann 等.,1997, Curr Opin Biotechnol 8 :455_458)或人抗體文庫夕卜 加選擇方法所產生的抗體(Griffiths 等.，1998，Curr Opin Biotechnol 9:102-108)。所 述親本抗體勿需天然存在。舉例來說，該親本抗體可以是工程抗體，包括但不限于嵌合抗體 和人源化抗體(Clark，2000，Immunol Today 21 :397_402)。所述親本抗體可以是基本上為 一種或多種天然抗體基因所編碼的抗體的工程變體。在一個實施方案中，該親本抗體已得 到親和力成熟，所述技術為本領域所公知。可選地，該抗體可以用某些其它方法進行修飾，例如于2003年3月3日提交的USSN 10/339788中所描述的方法。本發明的Fc變體可基本上為屬于任一抗體類型的免疫球蛋白基因所編碼。在一 個優選的實施方案中，在抗體或Fc融合體中使用的本發明的Fc變體包含屬于抗體IgG類 型的序列，該IgG類型包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一個可選的實施方案中，在抗體或 Fc融合體中使用的本發明的Fc變體包含屬于抗體IgA (包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、 IgG或IgM類型的序列。本發明的Fc變體可包含超過一條的蛋白鏈。換句話說，在抗體或 Fc融合體中使用的本發明的Fc變體是單體或寡聚體，包括同_或異-寡聚體。本發明的Fc變體可以與其它Fc變體結合，包括但不限于改變了效應器功能的變 體。在抗體或Fc融合體中上述結合可提供附加的、協同的或新的特性。在一個實施方案中， 本發明的Fc變體可以與其它已知的Fc變體結合(Duncan等，1988，Nature 332 563-564 ； Lund等，1991，J Immunol 147 :2657_2662 ;Lund等·，1992，Mol Immunol 29 53-59 ；Alegre φ . ，1994, Transplantation 57 :1537—1543 ；Hutchins 等.，1995, Proc Natl Acad Sci USA 92 :11980-11984 Jefferis 等.，1995，Immunol Lett 44 :111_117 ;Lund 等·，1995， Faseb J 9 :115_119 Jefferis 等·，1996，Immunol Lett 54 :101_104 ；Lund 等·，1996，J Immunol 157 :4963-4969 ;Armour 等·，1999，Eur J Immunol 29 :2613_2624 ;Idusogie 等·， 2000，J Immunol 164 :4178_4184 ；Reddy 等.，J Immunol 2000，164 1925-1933 ；Xu 等·， 2000,Cell Immunol 20016-26 ;Idusogie等·，2001，J Immunol 166 2571-2575 ；Shields 等，2001，J Biol Chem 276 :6591_6604 Jefferis 等.，2002，Immunol Lett 82:57-65; Presta 等·，2002，Biochem Soc Trans 30 487-490)(US 5,624, 821 ；US 5，885，573 ；US 6, 194, 551 ；PCT WO 00/42072 ；PCT WO 99/58572)。在一個可選的實施方案中，本發明的 Fc變體摻入到包含一種或多種工程糖型的抗體或Fc融合體中。本文中使用的“工程糖型 (enRineerd Rlycoform)，，意指與Fc多肽其價連接的糖組合物，其中所述糖組合物在化學 特性上與親本Fc多肽不同。工程糖型可用于不同用途，包括但不限于增強或減少效應器 功能。可通過任何方法產生工程糖型，例如通過使用工程的或變體表達菌株，通過與一種 或多種酶共表達，例如β 1-4-Ν-乙酰葡糖氨基轉移酶III (GnTIII)，通過在不同生物體或 來自不同生物體的細胞系中表達Fc多肽，或通過在Fc多肽得到表達后修飾糖類。用于產 生工程糖型的方法為本領域所公知，包括但不限于(Umafia等.，1999，Nat Biotechnol 17 176-180 ；Davies 等，2001，Biotechnol Bioeng 74 288-294 ；Shields 等.,2002, J Biol Chem 277 26733-26740 ；Shinkawa 等.,2003, J Biol Chem 278:3466-3473) US 6,602, 684 ；USSN 10/277, 370 ；USSN 10/113, 929 ；PCT WO 00/61739A1 ；PCT WO 01/29246A1 ；PCT WO 02/31140A1 ；PCT WO 02/30954A1 ；Potelligent 技術(Biowa，INC.， Princeton, N. J.) ；GlycoMAb 糖基化工程技術(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)) 0工程糖型通常指不同的糖或寡糖；因此Fc多肽，例如抗體或Fc融合體可 包含工程糖型。可選地，工程糖型可指包含不同糖或寡糖的Fc多肽。因而，本發明的Fc變 體與其它Fc修飾的組合，以及與未被發現的Fc修飾的組合預期可達到產生新的具有優化 特性的抗體或Fc融合體的目的。本發明的Fc變體可供抗體使用。本文中使用的“本發明的抗體”意指包含本發明 Fc變體的抗體。實際上，本發明可供包含Fc的任何蛋白質使用，因此本發明的Fc變體的應 用不限于抗體。本發明Fc變體可供Fc融合體使用。本文中使用的“本發明的Fc融合體”指的是包含本發明Fc變體的Fc融合體。Fc融合體可包含可操作地與細胞因子、可溶性受體結 構域、粘附分子、配體、酶、肽或其它蛋白質或蛋白質結構域連接的本發明Fc變體，對Fc融 合體的描述包括但不限于 US 5，843，725 ；US 6，018，026 ；US 6，291，212 ；US 6，291，646 ；US 6，300，099 ；US 6，323，323 ；PCT WO 00/24782 ；以及(Chamow等·，1996，Trends Biotechnol 14 52-60 ；Ashkenazi 等.，1997, Curr Opin Immunol 9 195-200)。事實上本發明的抗體和融合體可靶向于任何抗原，包括但不限于如下所列的蛋 白質、屬于下列蛋白質的亞基、結構域、基序和表位:CD2 ；CD3, CD3E, CD4, CDl 1, CD11A， CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (p67 蛋白)， CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4， IL-5，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-18，IL-23，α-干擾素、β-干擾素、γ-干 擾素；TNF-α , TNF^ 2, TNFc, TNFa β , TNF-RI, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF，LIGHT, VEGI, 0X40L, TRAIL 受體-1，Al 腺苷受體，淋巴 毒素 β 受體，TACI，BAFF-R, EPO ；LFA-3, ICAM—l，ICAM—3，EPCAM, β 1_ 整聯蛋白、β 2_ 整 聯蛋白、α4/β7_整聯蛋白、α2_整聯蛋白、α3_整聯蛋白、α4_整聯蛋白、α 5_整聯 蛋白、α 6-整聯蛋白、α ν-整聯蛋白、0￥03-整聯蛋白、？6 1 -3，角質化細胞生長因子、 VLA-I, VLA-4, L-選擇蛋白，抗獨特型抗體(anti-id)，E-選擇蛋白，HLA, HLA-DR，CTLA-4， T 細胞受體，B7-1，B7-2，VNR 整聯蛋白(VNR integrin)，TGF-β 1，TGF-β 2，嗜酸細胞活 化趨化因子1，BLyS(B-淋巴細胞刺激物)，補體C5，IGE，因子VII，CD64，CBL, NCA 90， EGFR(ErbB-I)，Her2/neu (ErbB-2)，Her3 (ErbB-3)，Her4 (ErbB-4)，組織因子，VEGF, VEGFR, 內皮素受體，VLA-4，半抗原NP-加帽或NIP-加帽蛋白，T細胞受體α/β，E-選擇蛋白， 地高辛，胎盤堿性磷酸酶(PLAP)和睪丸類PLAP堿性磷酸酶，鐵傳遞蛋白受體，癌胚抗原 (CEA)，CEACAM5, HMFG ΡΕΜ，粘蛋白 MUC1，MUC18，類肝素酶(h印aranase) I，人心臟肌球蛋 白，腫瘤相關糖蛋白-72 (TAG-72)，腫瘤相關抗原CA 125，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，高 分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)，癌相關抗原，Gcoprotein Ilb/IIIa(GPIIb/IIIa)， 表達 Lewis Y 相關糖的月中瘤相關抗原(tumor-associated antigen expressing Lewis Y relatedcarbohydrate)，人巨細胞病毒(HCMV) gH包膜糖蛋白，HIV GP120, HCMV，呼吸合胞 病毒RSV F，RSVF Fgp, VNR整聯蛋白，IL-8，細胞角蛋白腫瘤相關抗原，Hep B GP120, CMV， gpllbllla，HIV IIIB GP120 V3環，呼吸合胞病毒(RSV) Fgp，單純皰疹病毒(HSV)gD糖蛋 白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白和產氣莢膜梭菌毒素。本領域技術人員應當理解上述列出的靶不僅指特定的蛋白質及生物分子，而且還 指包含它們的生化途徑或各種途徑。例如，當提及的CTLA-4作為靶抗原時，意味著配體和 受體組成了 T細胞共刺激途徑，包括CTLA-4、B7-l、B7-2、CD28，并且任何其它未被發現的配 體或受體也是靶對象。因此本文中使用的靶不僅指特定的生物分子，也指與所述靶以及所 述靶所屬的生化途徑的成員相互作用的一組蛋白。本領域技術人員應當進一步理解任一上 述的靶抗原、配體或它們相應的生化途徑能可操作地與本發明的Fc變體連接以便產生Fc 融合體。因此，舉例來說，靶向EGFR的Fc融合體能通過可操作地將Fc變體與EGF、TGF α 或任何其它已發現或未被發現的能結合EGFR的配體連接而得到構建。因此，本發明的Fc 變體能可操作地與EGFR連接以便產生能結合EGF、TGFa或任何其它已發現或未被發現的 可結合EGFR的配體的Fc融合體。因而，事實上任何多肽，無論是配體、受體或一些其它蛋白質或蛋白質結構域，包括但不限于上述靶和組成它們相應的生化途徑的蛋白質，能可操 作地與本發明的Fc變體連接以便開發Fc融合體。 在臨床試驗或在開發研制中批準使用的許多抗體和Fc融合體都可受益于本發明 的Fc變體。所沭抗體和Fc融合體在本文中稱為“臨床產物和候詵物”。因此在一個優選 的實施方案中，本發明的Fc變體可供一系列臨床產物和候選物使用。例如，靶向CD20的 許多抗體可受益于本發明Fc變體。例如本發明的Fc變體可供抗體使用，所述抗體基本 上類似于利妥昔單抗(Rituxan IDEC/Genentech/Roche)(參見，例如 US 5，736，137)， 一種批準用于治療非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗⑶20抗體；HuMax-⑶20，一種目前正由 Genmab 開發的抗 CD20 抗體，一種描述于 US 5，500，362 的抗 CD20 抗體，AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc.), 以 及 HumaLYM(Intracel)0 許 多抗體，其靶向表皮生長因子受體家族成員，包括EGFR (ErbB-I)、Her2/neu (ErbB-2)、 Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)，可受益于本發明的Fc變體。例如本發明的Fc變體可供 抗體使用，所述抗體基本上類似于曲妥單抗(Here印tin Genentech)(參見，例如US 5，677，171)，一種批準用于治療乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗體；目前正由Genentech 開發的 pertuzumab (rhuMab_2C4，Omnitagr )；一種描述于 US 4，753，894 的抗 Her2 抗 體；西妥昔單抗(Erbitux Imclone) (US 4, 943, 533 ；PCT WO 96/40210)，一種在臨床 試驗中用于治療多種癌癥的嵌合抗EGFR抗體；目前正由Abgenix/Immunex/Amgen開發 的 ABX-EGF (US 6，235，883)；目前正由 Genmab 開發的 HuMax-EGFr (USSN 10/172，317)； 425、EMD55900、EMD62000 和 EMD72000 (Merck KgaA) (US 5558864 ；Murthy 等.1987，Arch Biochem Biophys. 252(2) :549_60 ;Rodeck 等.，1987，J Cell BiochemI. 35(4) :315_20 ； Kettleborough 等.,1991, Protein Eng. 4 (7) 773-83) ；ICR62 (institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045 ；Modjtahedi 等.，1993，J. Cell Biophys. 1993，22(1-3) 129-46 ；Modjtahedi 等.，1993，Br J Cancer. 1993，67 (2) :247_53 ；Modjtahedi 等，1996， Br J Cancer,73(2) 228-35 ；Modjtahedi 等，2003，Int J Cancer,105(2) :273_80)； TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba) (US 5, 891, 996 ；US 6, 506, 883 ；Mateo 等，1997，Immunotechnology, 3 (1) :71_81)； mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (JungbIuth 等· 2003，Proc Natl Acad Sci USA. 100(2) :639_44) ；KSB_102(KS Biomedix)； MRl-I (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2)；以及 SClOO (Scancell) (PCT WO 01/88138)。在另一個優選的實施方案中，本發明的Fc變體可供阿侖單抗 (Campath Millenium)使用，阿侖單抗是一種目前已批準用于治療B細胞慢性淋巴細 胞性白血病的人源化單克隆抗體。本發明的Fc變體可供多種抗體或Fc融合體使用， 所述抗體或Fc融合體基本上類似于其它臨床產物和候選物，包括但不限于莫羅單抗 (muromonab) -CD3 (Orthoclone 0KT3 )，一種由 Ortho Biotech/Johnson&Johnson 開發的 抗 CD3 抗體，替伊莫單抗(ibritumomab tiaxetan) (Zevalin )，一種由 IDEC/Schering AG開發的抗CD20抗體，吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg ) — 種由 Celltech/Wyeth 開發的抗 CD33 (p67 蛋白)抗體，alefacept (Amevive )，一種 由Biogen開發的抗LFA-3 Fc融合體，由Centocor/Lilly開發的阿昔單抗(abciximab) (ReoPro ),由 Novartis 開發的巴利昔單抗(basiIiximab) (Simulect ),由 Medlmmune開發的帕利珠單抗(palivizumab) (Synagi )，英夫利昔單抗(infliximab) (Remicade )，一種由Centocor開發的抗TNF α抗體，阿達木單抗(adalimumab) (Humira )，一種由 Abbott開發的抗TNFa抗體，他111化3(16"1，一種由061丨6吐開發的抗1順0抗體，依那西 普(etanerc印t) (Enbrel )，一種由 Immunex/Amgen 開發的抗 TNF α Fc 融合體，ABX-CBL， 一種正由Abgenix開發的抗CD147抗體，ABX-IL8，一種正由Abgenix開發的抗IL8抗 體，ΑΒΧ-ΜΑ1，一種正由 Abgenix 開發的抗 MUC18 抗體，Pemtumomab (R1549，9CIY-muHMFGl)， 一種正由Antisoma開發的抗MUCl抗體，Therex(R1550)，一種正由Antisoma開發的抗 MUCl 抗體，正由 Antisoma 開發的 AngioMab (AS1405)，正由 Antisoma 開發的 HuBC-Ι，正由 Antisoma 開發的 Thioplatin (AS1407)，Antegren (那他珠單抗)，一種正由 Biogen 開 發的抗a-4-i3-l(VLA-4)和a-4-β _7抗體，VLA-1單抗，一種正由Biogen開發中的抗 VLA-I整聯蛋白抗體，LTBR單抗，一種正由Biogen開發的抗淋巴毒素β受體(LTBR)抗 體，CAT-152, 一種正由 Cambridge Antibody Technology 開發的抗 TGFβ 2 抗體，J695, 一種正由 Cambridge Antibody Technology 和 Abbott 開發的抗 IL-2 抗體，CAT-192，一 種正由 Cambridge Antibody Technology 和 Genzyme 開發的抗 TGF β 1 抗體，CAT-213， 一種正由Cambridge Antibody Technology開發的抗嗜酸細胞活化趨化因子1抗體， LymphoStat-B , 一禾中正由 Cambridge Antibody Technology 禾口 Human Genome Sciences INC 開發的抗Blys 抗體，TRAIL-RlmAb, 一種正由 Cambridge Antibody Technology 禾口 Human Genome Sciences, INC 開發的抗 TRAIL-Rl 抗體，Avastin (貝伐單抗，rhuMAb-VEGF)，一 種正由Genentech開發的抗VEGF抗體，一種正由Genentech開發的抗HER受體家族抗體， 抗組織因子(ATF)，一種正由Genentech開發的抗組織因子抗體，Xolair (Omalizumab)， 一種正由 Genentech 開發的抗 IgE 抗體，Raptiva (Efalizumab), 一種正由 Genentech 禾口 Xoma 開發的抗 CDlla 抗體，正由 Genentech 禾口 Millenium Pharmaceuticals 開發 的MLN-02抗體(以前稱為LDP-02)，HuMax CD4，一種正由Genmab開發的抗CD4抗體， HuMax-ILl5, 一種正由 Genmab 禾口 Amgen 開發的抗 IL15 抗體，正由 Genmab 禾口 Medarex 開 發的 HuMax-布洛芬(Inflam)，HuMax-Cancer, 一種正由 Genmab 和 Medarex 以及 Oxford GcoSciences開發的抗類肝素酶I抗體，正由Genmab和Amgen開發的HuMax-Lymphoma， 正由 Genmab 開發的 HuMax-TAC，IDEC-131，一種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發的抗 CD40L抗體，IDEC-151(克立昔單抗)，一種正由IDEC Pharmaceuticals開發的抗CD4抗 體，IDEC-114，一種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發的抗 CD80 抗體，IDEC-152，一種正由 IDEC Pharmaceuticals開發的抗CD23抗體，正由IDEC Pharmaceuticals開發的抗巨噬細 胞移動因子(MIF)抗體，BEC2，一種正由Imclone開發的抗獨特型抗體，IMC-1C11，一種正由 Imclone開發的抗KDR抗體，DClOl，一種正由Imclone開發的抗f Ik-I抗體，正由Imclone 開發的抗VE鈣粘蛋白抗體，CEA-Cide (labetuzumab)，一種正由Immunomedics開發的 抗癌胚抗原(CEA)抗體，LymphoCide (依帕珠單抗)，一種正由Immunomedics開發的抗 CD22 抗體，正由 Immunomedics 開發的 AFP-Cide,正由 Immunomedics 開發的 MyelomaCide, 正由 Immunomedics 開發的 LkoCide,正由 Immunomedics 開發的 ProstaCide, MDX-010, 一 種正由Medarex開發的抗CTLA4抗體，MDX-060，一種正由Medarex開發的抗CD30抗體， 正由 Medarex 開發的 MDX-070，正由 Medarex 開發的 MDX-018，Osidem (IDM-I)，一種正 由 Medarex 和 Immuno-Designed Molecules 開發的抗 Her2 抗體，HuMaX _CD4，一種正由Medarex和Genmab開發的抗CD4抗體，HuMax_IL15，一種正由Medarex和Genmab開發的 抗 IL-15 抗體，CNTO 148，一種正由 Medarex 和 Centocor/J&J 開發的抗 TNF α 抗體，CNTO 1275，一種正由Centocor/J&J開發的抗細胞因子抗體，MORlOl和M0R102，正由MorphoSys 開發的抗細胞間粘附因子-I(ICAM-I)(⑶54)抗體，M0R201，一種正由MorphoSys開發的 抗成纖維細胞生長因子受體3(FGFR-3)抗體，Nuvion(visilizumab)，一種正由Protein Design Labs開發的抗CD3抗體，HuZAF ，一種正由Protein Design Labs開發的抗γ干擾 素抗體，正由Protein Design Labs開發的抗α 5 β 1整聯蛋白抗體，正由Protein Design Labs開發的抗IL-12，ING-1，一種正由Xoma開發的抗Ep-CAM抗體，以及MLN01，一種正由 Xoma開發的抗β 2整聯蛋白抗體。應用Fc變體于上述抗體及Fc融合體的臨床產物和候選物中不應受它們明確組成 所約束。本發明的Fc變體可摻入到上述臨床候選物和產物中，或摻入到基本上與它們類似 的抗體和Fc融合體中。本發明的Fc變體可摻入到上述臨床候選物和產物的人源化的、親 和力成熟的、工程的或以一些其它方法修飾的型式中。此外，無需使用上述臨床產物和候選 物的完整多肽來構建摻入本發明的Fc變體的新的抗體或Fc融合體；例如僅使用臨床產物 或候選物抗體的可變區，基本上相似的可變區，或可變區的人源化的、親和力成熟的、工程 的或修飾的型式。在另一個實施方案中，本發明的Fc變體可供抗體或Fc融合體使用，所述 抗體或Fc融合體能結合上述臨床產物和候選物之一的相同表位、抗原、配體或受體。本發明的Fc變體可供不同抗體和Fc融合體使用。在一個實施方案中，本發明的 抗體或Fc融合體是一種治療、診斷或研究試劑，優選是一種治療試劑。可選地，本發明的 抗體和Fc融合體可用于農業或工業用途。在一個可選的實施方案中，本發明的Fc變體組 成可用實驗方法篩選的文庫。該文庫可以是一列核苷酸或氨基酸序列，或可以是編碼文庫 序列的核酸或多肽的物理組合物。Fc變體可供單克隆或多克隆抗體組合物使用。在一個 優選的實施方案中，本發明的抗體和Fc融合體可用于殺死具有靶抗原的靶細胞，例如癌細 胞。在一個可選的實施方案中，本發明的抗體和Fc融合體用于阻斷、拮抗(antagonize)或 激動(agonize)靶抗原，例如用于拮抗細胞因子或細胞因子受體。在一個可選地優選的實 施方案中，本發明的抗體和Fc融合體用于阻斷、拮抗或對抗靶抗原并殺死具有該靶抗原的 靶細胞。本發明的Fc變體可用于不同的治療目的。在一個優選的實施方案中，施用Fc變體 蛋白質于患者以治療與抗體相關的病癥。對于本發明的目的而言，“患盍”包括人和其它動 物，優選哺乳動物，最優選人。因此本發明的抗體和Fc融合體可用于治療人和牲畜。在優選 的實施方案中，患者是哺乳動物，在最優選的實施方案中，患者是人。本發明中術語“治療” 意指對于疾病或病癥包括治療性處理，也包括預防性或抑制性方法。因此，舉例來說，在疾 病發作前成功施用抗體或Fc融合體以產生疾病治療作用。如其它實例，在疾病臨床表現后 成功施用優化的抗體或Fc融合體以抗疾病癥狀，包含了疾病的治療。“治療”也包含在疾病 發作后施用優化的抗體或Fc融合體蛋白質以便根除疾病。在發作以及臨床癥狀發生后成 功地施用試劑，有可能消除臨床癥狀并改善疾病，包含了治療該疾病。那些“需要治療的”包 括已經患有疾病或病癥的哺乳動物，也包括那些易患疾病或病癥的那些，包括疾病或病癥 要得到預防的那些。本文中“抗體相關的病癥”或“抗體應答的病癥”或“病癥”或“疾病”意 指通過施用包含本發明的抗體或Fc融合體的藥物組合物可得到改善的病癥。抗體相關的病癥包括但不限于自身免疫性疾病、免疫性疾病、傳染病、炎性疾病、神經系統疾病、和包括 癌癥的腫瘤件以及瘤形成疾病。本文中“癌癥”和“癌件的”指的是或描沭為哺乳動物中的牛 理狀態，其一般通過未調節的細胞生長得到鑒定。癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚 細胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神經內分泌腫瘤、間皮瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、腺瘤、黑素瘤以 及非白血性白血病或淋巴惡性腫瘤。上述癌癥更具體的實例包括鱗狀細胞癌(如，鱗狀上 皮細胞癌)、肺癌包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌以及肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細 胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺 癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲 狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤，也包括頭癌和頸癌。此外，本發明 的Fc變體可用于治療的病癥包括但不限于充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤 瘡、濕疹、心肌炎和其它心肌病癥、系統性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細胞增生 以及骨髓基質瘤；骨質丟失；變形性骨炎(Paget’ sdisease)、破骨細胞瘤；多發性骨髓瘤、 乳腺癌、失用型骨質減少；營養不良、牙周病、家族性脾性貧血、朗罕氏細胞組織細胞增多 病、脊髓損傷、急性膿毒性關節炎、骨軟化癥、皮質醇增多癥、單骨纖維性骨發育不良、多發 性骨纖維性發育不良、牙周再建以及骨折；肉樣瘤病；多發性骨髓瘤；溶骨癌(osteolytic bone cancers)、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉移、骨痛治療和體液惡性高鈣血癥、強直 性脊椎炎和其它脊椎關節病；移植排斥、病毒感染、血液瘤以及類瘤形成病癥例如何杰金氏 淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(Burkitt' s淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞性白血 病、蕈樣肉芽腫病、外套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、彌漫性巨大B細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴 瘤、毛細胞性白血病以及淋巴漿細胞性白血病)、淋巴細胞前體細胞腫瘤、包括B細胞急性 成淋巴細胞性非白血性白血病/淋巴瘤、也T細胞急性成淋巴細胞性非白血性白血病/淋 巴瘤，胸腺瘤、成熟T和NK細胞腫瘤，包括外周T細胞非白血性白血病、成熟T細胞非白血 性白血病/T細胞淋巴瘤以及大顆粒狀淋巴細胞性白血病、朗罕氏細胞組織細胞增多癥、諸 如急性骨髓性粒細胞性白血病的骨髓瘤形成，包括成熟的急性骨髓性白血病(AML)、分化 的急性骨髓性白血病、急性前髓細胞性白血病、急性骨髓單核細胞性白血病、和急性單核細 胞性白血病、脊髓發育不良綜合征、慢性骨髓增生病，包括慢性髓細胞性白血病、中樞神經 系統腫瘤，如腦腫瘤(神經膠質瘤、成神經細胞瘤、星細胞瘤、成神經管細胞瘤、室管膜細胞 瘤和視網膜成神經細胞瘤)、實體瘤(鼻咽癌、基底細胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波氏肉瘤、睪 丸癌、子宮、陰道或宮頸癌、卵巢癌、原發性肝癌或子宮內膜癌、以及血管系統腫瘤(血管肉 瘤和hemagiopericytoma)、骨質疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、脊椎關節炎、類風濕性關節炎、炎 性腸疾病(IBD)、敗血癥和敗血癥性休克、節段性回腸炎、牛皮癬、硬皮病、移植物抗宿主病 (GVHD)、異源胰島移植排斥(allogenic islet graft rejection)、血液惡性腫瘤諸如多發 性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、腫瘤相關的炎癥、 周圍神經損傷或脫髓鞘性病。 在一個實施方案中，將本發明的抗體或Fc變體施用于患病的患者，所述疾病涉及 蛋白質的不適當表達。在本發明范圍內，其意指包括以異常蛋白質為特征的疾病和病癥，例 如基于改變蛋白質存在的數量、存在突變蛋白質，或兩者的疾病或病癥。蛋白質過量可基于 任何原因，包括但不限于在分子水平上過表達、在作用部位出現持續很久或蓄積、或相對于 正常增加了蛋白質活性。以蛋白質減少為特征的疾病和病癥也包括在該定義內。所述減少可基于任何原因，包括但不限于在分子水平上減少的表達、在作用部位出現減小或減少、蛋 白質的突變體形式、或相對于正常減少了蛋白質活性。上述相對于蛋白質正常表達、出現或 活性的蛋白質過多或減少可得到測定，所述的測定在開發和/或臨床試驗本發明的抗體和 Fc變體中可扮演一個重要角色。在一個實施方案中，本發明的抗體或Fc融合體僅作為治療活性劑施用于患者。可 選地，本發明的抗體或Fc融合體與一種或多種其它治療劑聯合施用，包括但不限于細胞毒 素劑、化學治療劑、細胞活素類、生長抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、抗血管生成劑、保心藥 或其它治療劑。上述分子以合適的化合物形式和量存在，以有效地用于預期目的。有經驗 的醫師可憑經驗確定其它用于本文治療劑的合適劑量。本發明的抗體和Fc融合體可伴隨 一種或多種其它治療方案施用。舉例來說，本發明的抗體或Fc融合體隨同化學療法、放射 療法或兩者一起施用于患者。在一個實施方案中，本發明的抗體或Fc融合體可聯合一種或 多種可能包含或可能不包含本發明Fc變體的抗體或Fc融合體施用。在一個實施方案中，本發明的抗體和Fc融合體與化學治療劑一起施用。本 文中使用的“4ii^iiiiM”意指在癌癥治療中使用的化合物。化學治療劑的實例包括 但不限于諸如硫替派和環磷酰胺(cyclosphosphamide) (CYTOXAN )的烷基化劑；諸如 白消安、英丙舒凡和嗪消安的烷基磺酸鹽類；諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美 妥多巴(meturedopa)和烏瑞多巴(uredopa)的氮丙啶類；乙烯亞胺類和甲基蜜胺類 (methylamelamines)包括六甲密胺、三亞胺嗪、trietylenephosphoramide、三亞乙基硫化 磷酰胺和trimethylolomelamine ；氮芥類諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、磷 雌氮芥、異磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氧氮芥鹽酸化物、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥膽甾醇、 潑尼莫司汀、氯乙環磷酰胺、尿嘧啶氮芥；諸如卡氮芥、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫 司汀、雷莫司汀的硝脲類；諸如aclacinomysins、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、博 來霉素、放線菌素C、刺孢霉素、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔 紅霉素、地托比星、6-重氮基-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達比星、 麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、派來霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、 三鐵阿霉素、羅比多星、鏈黑霉素、鏈唑霉素，殺結核菌素、烏苯美司、新制癌菌素、佐柔比星 的抗生素；諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代謝物；諸如二甲葉酸、氨甲葉酸、蝶 酰三谷氨酸、曲美沙特的葉酸類似物；諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤的 嘌呤類似物；諸如鹽酸環胞苷、氮雜胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧 氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU的嘧啶類似物；諸如卡普睪酮、丙酸屈他雄酮、環硫雄醇、 美雄烷、睪內酯的雄激素；諸如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦的抗腎上腺素；諸如frolinic acid的葉酸補充劑；乙酰葡醛酸內酯；醛磷酰胺糖苷；氨基戊酮酸；安吖啶；bestrabucil ； 比山群；依達曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine ；依利醋銨；依托格魯；硝 酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；二胺硝吖啶；噴司他 丁 ；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰胼(2-ethyl hydrazide)；丙卡巴胼；PSK ; 雷佐生；施佐非蘭；鍺螺胺；細格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；烏拉坦； 長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；gacytosine ；阿糖 胞苷(”Ara-C")；環磷酰胺；塞替派；紫杉烷類，例如紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N. J.)禾口紫杉蔽(TAXOTERE ,Rhne-Pou 1 enc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；諸如順鉬和卡鉬的鉬類似物；長春堿；鉬；依托泊苷(VP-16)；異環磷酰胺；絲裂霉素；米托蒽醌；長春新堿；長 春瑞濱；諾維本；諾消靈；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；CPT-Il ；拓 樸異構酶抑制劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins ；卡培他濱；胸 腺嘧啶核苷酸合酶抑制劑(諸如拓優得)；諸如celicoxib (CELBREX, MK-0966 (VIOXX ) 的cox-2抑制劑；以及任一上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。在腫瘤上產生調節或抑 制激素結果的抗激素劑也包括于該定義中，諸如抗雌激素類包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、 抑制4 (5)-咪唑的芳香酶、4-羥泰米芬、曲沃昔芬、ke0Xifene、LY 117018，奧那司酮和托瑞 米芬(法樂通)；以及抗雄激素類諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞 林；以及任一上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。化學治療劑或其它細胞毒素劑可作為前藥施用。本文中使用的“·”意指藥學上 活性物質的前體或衍生物形式，與母體藥物相比其對腫瘤細胞具有較小的細胞毒性，并且 可被酶活化或轉化為更具活性的母體形式。參見，例如Wilman，1986，Biochemical Society Transactions,615th Meeting Belfast,14 :375_382 ；禾口 Stella 等.，“Prodrugs :A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery,Borchardt 等.，(ed.) =247-267,Humana Press，1985。可供本發明使用的前藥包括但不限于含有磷酸 鹽前藥、含有硫代硫酸鹽前藥、含有硫酸鹽前藥、含肽前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化前 藥、含有內酰胺前藥、含有任選地取代的苯氧基乙酰胺前藥或含有任選地取代的苯乙 酰胺前藥、5-氟胞嘧啶和其它的5-氟脲嘧啶前藥，上述前藥能轉化為更具活性的細胞毒性 游離藥物。用于與本發明的抗體和Fc融合體一起使用并衍生自前藥形式的細胞毒性藥物 的實例包括但不限于任一上述化學治療劑。本發明的抗體和Fc融合體可結合其它治療方案。例如，在一個實施方案中，要用 抗體或Fc融合體治療的患者也可接受放射治療。放射治療可依據本領域所采用的和本領 域技術員所公知的常規實驗設計進行。上述治療包括但不限于銫、銥、碘或鈷輻射。該放射 治療可全身照射，或可對體內或體表上特定部位或組織局部定向照射，該特定部位或組織 例如肺、膀胱或前列腺。一般而言，放射治療每隔約1-2周時間以脈沖形式進行。然而，放射 治療可間隔更長時間進行。例如，對患有頭癌和頸癌的患者進行放射治療可間隔約6-7周。 任選地，放射治療可以單劑量或多劑量、連續劑量的形式進行。有經驗的醫師可憑經驗確定 用于本文的放射治療的合適劑量。依照本發明的另一個實施方案，本發明的抗體或Fc融合 體以及一種或多種其它抗癌療法用于治療離體癌細胞。應當預計到上述離體治療可應用于 骨髓移植，以及具體地應用于自體骨髓移植。舉例來說，如上所述在受體患者中可用抗體或 Fc融合體與一種或多種其它抗癌療法治療含有癌細胞的細胞或組織，以在移植前排除或基 本上排除癌細胞。當然，應當預計到本發明的抗體和Fc融合體還可與諸如外科手術的其它 治療技術聯合使用。在一個可選的實施方案中，本發明的抗體和Fc融合體與細胞因子一起施用。本文 中使用的“細胞因子”意指一種細胞群所釋放的對其它細胞起細胞間介質作用的蛋白質的 通稱。上述細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子以及傳統的多肽激素。細胞因子包括諸如 人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素的生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素； 胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)的糖蛋白激素；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤 壞死因子-α和β ；苗勒氏抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮 生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；諸如NGF-β的神經生長因子；血小板生長因 子；諸如RGF-α和TGF-β的轉化生長因子(TGFs)；胰島素樣生長因子_1和II ；促紅細胞 生成素(EPO)；骨誘導因子；諸如α、β、Υ-干擾素的干擾素；諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)、 粒細胞巨噬細胞-CSF (CM-CSF)和粒細胞-CSF (G-CSF)的集落刺激因子(CSFs)；諸如IL-1、 IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-15 的白 介素(ILs)；諸如TNF-α或THF-β的腫瘤壞死因子；以及其它多肽因子，包括LIF和試劑 盒配體(kit ligand)(KL)。當在本文中使用時，術語細胞因子包括天然來源或重組細胞培 養基來源的蛋白質，以及天然序列細胞因子生物學上的活性等價物。其它許多治療劑可供與本發明的抗體和Fc融合體一起施用。在一個實施方 案中，抗體或Fc融合體與抗血管生成劑一起施用。本文中使用的“抗血管生成劑”意 指一種可阻斷或以某種程度干擾血管發育的化合物。例如，抗血管生成因子可以是一 種小分子或蛋白質，例如是一種抗體、Fc融合體或細胞因子，其能結合與血管發生有關 的生長因子或生長因子受體。本文中優選的抗血管生成因子是能結合血管內皮生長因 子(VEGF)的一種抗體。在一個可選的實施方案中，抗體或Fc融合體與能誘導或增強獲 得性免疫應答的治療劑一起施用，例如一種能靶向CTLA-4的抗體。在一個可選的實施 方案中，抗體或Fc融合體與酪氨酸激酶抑制劑一起施用。本文中使用的“酪氨酸激酶 抑制劑”意指一種在某種程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。上述抑制 劑的實例包括但不限于喹唑啉(quinazoline)，諸如PD153035，4_ (3_氯苯胺基)喹唑 啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，諸如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706 ； 吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并(2，3-d)嘧啶；姜黃素(curcumin)(姜黃素，4， 5_雙(4-氟代苯胺基)鄰苯二甲酰二胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制劑； PD-0183805 (Warner-Lambert)；反義分子(如，與ErbB編碼核酸結合的那些)；喹啉(US 5,804,396) ；tryphostins(US 5,804, 396) ；ZD6474(Astra Zeneca) ；PTK-787(Novartis/ Schering A G)；諸如 Cl-1033 (Pfizer)的全 ErbB 抑制劑；Affinitac (ISIS 3521 ； Isis/Lilly)；甲磺酸伊馬替尼(STI571，Gleevec Novartis) ；PKI166 (Novartis)； GW2016(GLAXO SmithKline) ；Cl-1033(Pfizer) ；EKB-569(Wyeth) ；Semaxinib(Sugen)； ZD6474 (AstraZeneca) ；PTK-787(Novartis/Schering AG) ；INC-I Cll(Imclone) ； 或如在下列任一專利申請中所述的抑制劑:US 5，804，396 ；PCT WO 99/09016 (American Cyanimid) ；PCT WO 98/43960 (American Cyanamid) ；PCT WO 97/38983(Warner-Lambert)； PCT WO 99/06378(Warner-Lambert) ；PCT WO 99/06396(Warner-Lambert) ；PCT WO 96/30347 (Pfizer,Inc) ；PCT WO 96/33978 (AstraZeneca) ；PCT W096/3397(AstraZeneca)； PCT WO 96/33980 (AstraZeneca), gefitinib(IRESSA , ZD1839, AstraZeneca),禾口 0SI-774(Tarceva , OSI Pharmaceuticals/Genentech)。在一個可選的實施方案中，本發明的抗體或Fc融合體與另外的治療化合物偶聯 或可操作地連接。所述治療化合物可以是一種細胞毒素劑、化學治療劑、毒素、放射性同位 素、細胞因子或其它治療活性劑。可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑制備抗體或Fc融合體 與細胞毒素劑的偶聯物，所述偶聯劑諸如N-琥珀酰-3-(2-聯硫基吡啶)_丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰-4-(N-maleimid0methyl)環己烷-1-羧酸鹽、巰醇亞胺(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍 生物(諸如二甲基己二亞酰胺化氯化氫)、活化酯類(諸如二琥珀酰辛二酸鹽)、醛類(諸 如戊二醛)、二疊氮基化合物(諸如二(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺)、二重氮基衍生物 (諸如二 _ (對-重氮基苯甲酰基)“乙二胺)、二異氰酸鹽類(諸如tolyene 2,6- 二異氰酸 鹽)以及雙活化氟化合物(諸如1，5_ 二氟-2，4_ 二硝基苯)。例如，可根據Vitetta等.， 1971, Science 238 1098中所述方法制備蓖麻毒素免疫毒素。碳14標記的1_異硫代氰氧 基芐基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種用于將放射性核苷酸與抗體偶聯的典 型的螯合劑(cheating agent) 0參見PCT WO 94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細 胞毒類藥物的可裂解接頭。舉例來說，可使用對酸敏感的接頭、對肽酶敏感的接頭、二甲基 接頭或含有二硫化物的接頭(Chari等·，1992，Cancer Research 52:127-131)。可選地， 所述抗體或Fc融合體可操作地與治療劑連接，如通過重組技術或肽合成。如上已描述了用于偶聯到本發明抗體和Fc融合體上的化學治療劑。在一個可選 的實施方案中，所述抗體或Fc融合體偶聯到或可操作地連接到毒素上，包括但不限于小 分子毒素和細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。小分子 毒素包括但不限于刺孢毒素(calicheamicin)、美登素(US 5，208，020)、trichothene和 CC1065。在本發明的一個實施方案中，所述抗體或Fc融合體偶聯到一種或多種美登素分 子上(如，每抗體分子約1-10個美登素分子)。例如，美登素也可轉化為May-SS-Me，其 可還原為May_SH3并與修飾的抗體或Fc融合體反應(Chari等.，1992，Cancer Research 52:127-131)以產生美登素_抗體或美登素-Fc融合體偶聯物。另一種感興趣的偶聯反 應包含將抗體或Fc融合體偶聯到一種或多種刺孢毒素分子上。所述刺孢毒素抗生素家 族在亞皮摩爾濃度下能產生雙鏈DNA斷裂物。可使用的刺孢毒素的結構類似物包括但不 限于 Y/、α 2\ α 3、N-乙酰基-γ/、PSAG 禾口 G11, (Hinman 等.，1993，Cancer Research 53 3336-3342 ；Lode 等·，1998，Cancer Research 58 2925-2928)(US 5，714，586 ；US 5，712，374 ；US 5，264，586 ；US 5，773，001)。多拉司他汀(Dolastatin) 10 類似物，——如 可供本發明 Fc 變體偶聯使用的 auristatin E (AE)和 monomethylauristatin E(MMAE) (Doronina 等.,2003, Nat Biotechnol 21(7) 778-84 ；Francisco 等.,2003 Blood 102(4) :1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限于白喉毒素A鏈、白喉毒素非結合活性片 段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒 素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美國商陸蛋白(ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ 和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制物、白樹毒 素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素以及單端孢霉烯族毒素。參見，例如，PCT WO 93/21232。本發明也涉及一種本發明的抗體或Fc融合體與具有溶核活性的化合物形成的 偶聯物或融合體，所述化合物例如核糖核酸酶或諸如脫氧核糖核酸酶(Dnase)的DNA核酸 內切酶。在一個可選的實施方案中，本發明的抗體或Fc融合體可偶聯或可操作地連接放 射性同位素以形成放射性偶聯物。許多放射性同位素可用于產生抗體和Fc融合體的放射 性偶聯物。實例包括但不限于，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和 Lu 的放射 性同位素。在另一個實施方案中，本發明的抗體或Fc融合體可偶聯“受體”(諸如鏈霉抗生物素蛋白)用作為腫瘤前靶(pretargeting)，其中所述抗體-受體或Fc融合體-受體偶聯物 施用于患者，接著使用清除劑從循環系統中除去未結合的偶聯物，然后施用偶聯細胞毒素 劑(如，放射性核苷酸)的“配體”(如，抗生物素蛋白)。在一個可選的實施方案中，所述 抗體或Fc融合體偶聯或可操作地連接于酶以便進行抗體依賴性酶介導前藥療法(ADEPT)。 ADEPT可通過將所述抗體或Fc融合體與前藥激活酶偶聯或可操作地連接而進行，該前藥激 活酶可轉化前藥(如，肽酰化學治療劑，參見PCT WO 81/01145)為活化的抗癌藥物。參見， 例如PCT WO 88/07378和US 4，975，278。用于ADEPT的免疫偶聯物的酶組分包括任何能以 使得前藥轉化為更具活性、細胞毒性形式的這樣一種方式激活前藥的酶。用于本發明方法 中的酶包括但不限于用于將含有磷酸鹽的前藥轉化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含有 硫酸鹽的前藥轉化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；用于將無毒5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥 物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫氨酶；諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、 羧肽酶以及組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)的蛋白酶，其可用于將含肽前藥轉化為游離 藥物(free drug) ；D-丙氨酰基羧肽酶，用于轉化含D-氨基酸取代物的前藥；諸如β -半乳 糖苷酶和神經氨酸酶的糖裂解酶，用于將糖基化前藥轉化為游離藥物；β "內酰胺酶，用于 將α "內酰胺衍生的藥物轉化為游離藥物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素 G酰胺酶，用于將在其胺的氮原子處分別用苯氧基乙酰基或苯乙酰基取代衍生的藥物轉化 為游離藥物。可選地，在本領域中也已知為“抗體酶(abzymes)”的具有酶活性的抗體可用 于將本發明的前藥轉化為活性的游離藥(參見，例如Massey，1987，Nature 328 =457-458) 0 可制備抗體-抗體酶和Fc融合體_抗體酶偶聯物用于遞送抗體酶至腫瘤細胞群中。應當 預料到在本文中還有本發明抗體和Fc融合體的其它修飾。例如，所述抗體或Fc融合體可 連接有多種非蛋白質聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇 的共聚物。 應當預料到用本發明抗體或Fc融合體與一種或多種治療活性劑配制的藥物 組合物。通過將所述具有所需純度的抗體或Fc融合體與任選的藥學上可接受載體、賦 形劑或穩定劑混合制備用于存儲的本發明的抗體和Fc融合體的劑型(Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A. Ed.，1980)，為凍干劑型或水溶液形 式。可接受載體、賦形劑或穩定劑所使用的劑量或濃度對于接受者是無毒的，包括緩沖液 諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐 劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯己雙銨、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、苯酚、丁基 orbenzyl醇、諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯的烷基對羥基苯甲酸酯類、兒茶酚、雷瑣酚、環 己醇、3-戊醇以及間甲酚)；低分子量(低于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白；諸如聚乙烯吡咯酮的親水聚合物、諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 組氨酸、精氨酸或賴氨酸的氨基酸、單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精、諸如 EDTA的螯合劑、諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇的糖類、甜味劑和其它調味劑、諸如微晶 纖維素、乳糖、玉米及其它淀粉的充填劑、粘合劑、添加劑、著色劑、諸如鈉的成鹽反離子金 屬復合物(如鋅_蛋白質復合物)和/或諸如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)的非 離子表面活性劑。在一個優選的實施方案中，所述包含本發明的抗體或Fc融合體的藥物組 合物以水溶形式存在，諸如以藥學上可接受的鹽存在，其意指包括酸和堿加成鹽。“藥學上 可接受的酸加成鹽”指的是那些保持游離堿生物有效性且是非生物學或在其它方面不需要的鹽類，與諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的無機酸以及諸如乙酸、丙酸、羥乙酸、丙 酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、枸櫞酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲 磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等的有機酸所加成的。“藥學上可接受的堿加成鹽”包括 那些衍生自諸如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽等的無機堿類的那些。特別優選的 是銨、鉀、鈉、鈣和鎂鹽。衍生自藥學可接受的有機無毒堿類包括伯、仲和叔胺、取代的胺包 括天然存在的取代的胺、環胺以及陽離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、 三丙胺和乙醇胺。用于體內給藥的劑型優選無菌的。通過無菌過濾膜或其它方法可容易地 達到無菌目的。本文所公開的抗體和Fc融合體也可配制為免疫脂質體。脂質體是一種小的囊狀 體，包含不同類型脂質、磷脂和/或表面活性劑，用于遞送治療劑予哺乳動物。通過諸如描 述于 Epstein 等.，1985，Proc Natl Acad Sci USA, 82 3688 ；Hwang 等.，1980，Proc Natl Acad Sci USA, 77 4030 ；US 4，485，045 ；US 4，544，545 ；和 PCT WO 97/38731 中的本領域公 知方法可制備含有所述抗體或Fc融合體的脂質體。具有增強的循環時間的脂質體公開于 US5, 013，556。脂質體的組分通常以雙分子層的形式排列，類似于生物膜的脂質排列方式。 可將包含卵磷脂、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物通過反相蒸發 法制備得到特別有用的脂質體。通過具有確定孔徑的過濾器將脂質體擠出以產生具有所 需直徑的脂質體。化學治療劑或其它治療活性劑可任選地包含于脂質體中(Gabizon等.， 1989，J National Cancer Inst 81 :1484)。抗體、Fc融合體和其它治療活性劑也可包被于微膠囊中，通過包括但不限于凝聚 技術、界面聚合法(例如使用羥甲基豆素或明膠微膠囊或聚(甲基丙烯酸酯)微膠囊)、 膠體給藥系統(例如，脂質體、白蛋白微膠囊、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)以及粗乳狀 液(macroemulsion)的方法制備得至Li。上述技術公開于Remington‘ s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A. Ed.，1980。可制備持續釋放制劑。持續釋放制劑合適的 實例包括固相疏水聚合物的半透性基質，所述基質以成型制品的形式存在，如薄膜或微膠 囊。持續釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙 烯醇))、聚交酯(US 3，773，919)、L-谷氨酸和鬩一 γ乙基-谷氨酸酯的共聚物、非降解乙 烯-醋酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注 射微球體)的可降解乳酸_乙醇酸共聚物、聚-D-(-)_3-羥基丁酸以及ProLease ,(可從 Alkermes購得)，其是一種由所需生物活性分子摻入聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基 質組成的基于微球體的遞藥系統。在制劑中本發明的治療活性抗體或Fc融合體的濃度可從約0. 1變化為100重 量％。在一個優選的實施方案中，所述抗體或Fc融合體的濃度在0. 003-1. 0摩爾的范圍 內。為了治療患者，可給予本發明的抗體或Fc融合體的治療有效劑量。本文中“治療有效 劑量”意指對于其所施用的能產生效果的劑量。精確的劑量將依賴于治療的目的，并可為 本領域技術人員通過使用公知技術所確定。劑量范圍可為0.01-100mg/kg體重或更大，例 如0. 1、1、10或50mg/kg體重，優選l-10mg/kg。如本領域所公知，對于抗體或Fc融合體降 解、全身性或局部性遞藥和新蛋白酶合成速率，以及年齡、體重、大致健康狀況、性別、飲食、 給藥時間、藥物相互作用以及病癥的嚴重程度而言，調整可以是必須的，并可由本領域那些 技術人員通過常規的實驗方法來確定。
包含本發明抗體或Fc融合體的藥物組合物優選以無菌水溶液形式施用，可以 多種方法進行，包括但不限于經口、皮下、靜脈內、鼻內、耳內(intraotically)、經皮、局 部(如凝膠劑、油膏劑、洗劑、霜劑等)、腹膜內、肌內、肺內(如，AERx 吸入技術，購自 Aradigm，或Inhance 肺遞藥系統，購自Inhale Therapeutics)、經陰道、腸胃外、經直腸或 眼內施用。在一些實例中，例如對于治療創傷、炎癥等而言，所述抗體或Fc融合體可直接以 溶液或噴霧劑的形式應用。如本領域所公知，可依據導入方式相應地配制所述藥物組合物。工程方法本發明提供了可用于產生Fc變體的工程方法。阻礙先前Fc工程嘗試的主要障礙 在于僅有隨機修飾已成為可能，部分是由于無效的工程策略及方法，以及由于抗體生產和 篩選的低通量特性。本發明描述了能克服這些缺陷的工程方法。涉及多種設計策略、計算 篩選方法、文庫產生方法和實驗生產和篩選方法。這些策略、途徑、技術和方法可單獨應用 或以不同的組合方式應用以設計優化的Fc變體。設計策略產生對所需特性優化的Fc變體的最有效方法是針對目的指導工程研究計劃。因 此，本發明教導了可用于設計優化的Fc變體的設計策略。設計策略的使用意在指導Fc工 程改造，但基于用于設計Fc變體的設計策略，并不意在將其限制為特定的優化特性。初一 想，其可能看來像是違反直覺，然而其有效性是得自可確定蛋白質以及蛋白質-蛋白質復 合物的結構、穩定性、溶解性和功能的微妙相互作用的龐大的復雜性。盡管可盡力預測對 于設計目的而言重要的蛋白質位置、殘基、相互作用等，但是時常地關鍵的某些因素卻無法 預測。通常無法預測對蛋白質結構、穩定性、溶解性以及功能的影響是否是有利的或不利 的。然而卻有無數的對蛋白質有損或有害的氨基酸修飾存在。因此通常地，最好的工程方 法來自產生可通常聚焦于設計目的而不導致有害效應的蛋白質變體。因此，設計策略主要 的目標在于產生特性多樣性(quality diversity)。在一個過分簡單化的水平(simplistic level)上，其可被認為是人們所偏愛的可能性的疊加。例如，對如下所述的Fc糖或特定的 結構域_結構域夾角的微擾，對于產生優化的Fc變體而言是有效的設計策略，盡管事實上 無法充分理解糖和結構域_結構域夾角如何決定Fc的特性。減少有害氨基酸數量的修飾 即為篩選，即通過特性多樣性篩選，這些設計策略可具有實用性。因此本發明中所教導的設 計策略的真實價值在于它們能直接將工程研究計劃應用于產生有價值的Fc變體。在實驗 后可確定任一所產生變體的特定價值。提供了一種用于設計Fc變體的設計策略，其中在Fc與所述的Fc配體的界面上通 過設計氨基酸修飾改變了 Fc與一些Fc配體的相互作用。本文中Fc配體可包括但不限于 Fc y Rs、Clq、FcRn、蛋白A或G等。通過在能量方面探查位于對結合界面產生影響的Fc位 置的有利取代，可設計變體，對新的界面構象采樣，其中一些與Fc配體的結合可得到改善， 一些與Fc配體的結合減少了，以及一些可具有其它有利特性。上述新的界面構象起因可能 在于，例如，形成該界面的殘基與Fc配體的直接作用，或由于諸如側鏈或主鏈構象微擾的 氨基酸修飾所引起的間接作用。可選擇據信在確定界面的構象中扮演重要角色的位置為可 變位置。例如，可選擇這樣一組殘基作為可變位置，該殘基與Fc配體直接接觸的任意殘基 在一定距離范圍內，例如5埃(A)，優選I-IOA0提供了一種用于產生Fc變體的額外設計策略，其中在N297的Fc糖構象得到優化。在上下文中使用的優化意在包括N297糖構象和組成的改變，其產生了所需特性， 例如增加或減少了對Fc γ R的親和力。通過所觀察到的糖結構和構象顯著地影響了 Fe/ Fc YR 以及 Fc/Clq 結合，支持了上述策略(Umana 等.，1999，Nat Biotechnol 17:176-180; Davies 等.，2001，Biotechnol Bioeng 74 :288_294 ;Mimura 等.，2001，J Biol Chem 276 45539-45547. ；Radaev 等，2001，J Biol Chem 276 16478-16483 ；Shields 等.,2002, J Biol Chem 277 :26733_26740 ；Shinkawa 等·，2003，J Biol Chem 278 :3466_3473)。但是， 該糖并不具體接觸Fc γ Rs。通過在能量方面探查對糖有影響的位置上的有利取代，可設計 變體的特性多樣性，對新的糖類構象采樣，其中一些改善了與一種或多種Fc配體的結合， 但另一些減少了。雖然大多數接近Fe/糖界面的突變似乎改變了糖構象，但是已顯示了一 些突變改變了糖基化組合物(Lund 等.，1996，J Immunol 157 :4963_4969 Jefferis 等.， 2002，Immunol Lett 82 :57_65)。提供了另一種用于產生Fc變體的設計策略，其中C γ 2和C γ 3結構域之間的夾 角得到優化。在上下文中使用的優化意在描述C γ 2-C γ 3結構域夾角的構象改變，其產生 了所需特性，例如增加或減少了對Fc γ R的親和力。所述夾角是Fc/Fc y R親和力的重要 決定因素(Radaev 等.，2001，J Biol Chem 276 16478-16483)，且許多 Fc/Fc γ R 界面遠 端的突變通過調節該夾角而影響了結合的可能性(Shields等.，2001，J Biol Chem 276 6591-6604)。通過在能量方面探查在確定C γ 2-C γ 3夾角以及相對于彼此之間的結構域柔 性中似乎扮演著一種關鍵角色的有利取代位置，可設計變體的特性多樣性，對新的夾角和 柔性水平采樣，對于所需Fc特性而言其中一些得到了優化。提供了另一種用于產生Fc變體的設計策略，其中再改造Fc以消除對糖基化的結 構與功能依賴性。該設計策略包括在缺乏Ν297糖的條件下優化Fc結構、穩定性、溶解性和 /或Fc功能(例如Fc對一種或多種Fc配體的親和力)。在一種方法中，暴露于溶劑的位 置在缺乏糖基化的條件下得到改造，使它們穩定、在結構上與Fc結構相容、且不具有聚集 的傾向。在抗體中C Υ2僅是未配對的Ig結構域(參見圖1)。因此Ν297糖覆蓋了通常作 為蛋白質_蛋白質與其它Ig結構域相互作用界面的暴露的疏水區，維持了 Fc穩定性以及 結構整體性，并阻止了 C Υ2結構域越過中心軸的聚集。用于優化非糖基化Fc的方法可包 括但不限于設計通過摻入在內部面向C γ 2-C γ 2 二聚體軸的極性和/或荷電的殘基以增強 非糖基化Fc穩定性和/或溶解性的氨基酸修飾，以及通過設計直接增加非糖基化Fc/Fc y R 界面或非糖基化Fc與其它一些Fc配體的界面的氨基酸修飾。提供了另一種用于設計Fc變體的設計策略，其中C Y2結構域的構象得到優化。 在上下文中使用的優化意在描述C γ 2結構域夾角的構象改變，其產生了所需特性，例如增 加或減少了對Fc γ R的親和力。通過在能量方面探查對C γ 2構象發生影響的C γ 2位置上 的有利取代，可設計變體的特性多樣性，對新的C y 2構象采樣，其中一些可達到設計目的。 上述新的C Y2構象起因可能在于，例如，通過對變體采樣所得的可選的主鏈構象。可選擇 如任意位置的可變位置，據信在確定C Y2結構、穩定性、溶解性、柔性、功能等的過程中其 扮演著一種重要角色。例如，C γ 2疏水核心殘基，其是部分或全部地與溶劑隔絕的C γ 2殘 基，可得到再改造。可選地，可考慮非核心(noncore)殘基，或認為對決定主鏈結構、穩定性 或柔性重要的殘基。提供了另一種用于Fc優化的設計策略，其中通過調節Fc與所述Fc配體之間的靜電作用的修飾改變了與Fc γ R、補體或其它一些Fc配體的結合。上述修飾可認為是對Fc的 整體靜電特性的優化，并包括了用荷電氨基酸取代中性氨基酸、用中性氨基酸取代荷電氨 基酸或用帶相反電荷(即反向電荷)的氨基酸取代荷電氨基酸。上述修飾可用于影響Fc 和一種或多種Fc配體之間的結合親和力的改變，所述Fc配體例如Fc y Rs。在一個優選的 實施方案中，使用用于計算靜電勢的多種眾所周知的方法之一來選擇可影響結合的靜電取 代位置。在最簡單的實施方案中，庫侖定律用于產生作為在蛋白質中該位置功能的靜電勢。 另外的實施方案包括了使用德拜-休克爾標度(Debye-Huckel scaling)來計算離子強度 的影響，以及在更復雜的實施方案中使用諸如泊松-玻耳茲曼(Poisson-Boltzmarm)計算。 上述靜電計算可使位置突出并暗示了可達到設計目的的特定氨基酸修飾。在某些情況下， 可預計這些取代對結合不同的Fc配體具有不同的影響，例如可增強與激活性的Fc y Rs的 結合，或減少對抑制性Fc y Rs的結合親和力。計算篩選在數量龐大的可能發生的修飾中預測何種氨基酸修飾能達到所需目的的過程 中，主要障礙是很難獲得有價值的Fc變體。實際上，對先前已失敗的產生具有重要臨 床價值Fc變體的Fc工程嘗試而言，一個主要的原因是迄今為止Fc工程方法都與嘗試 (hit-or-miss)方法相關。本發明提供了使Fc變體定量和系統工程改造成為可能的計算篩 選(computational screening)方法。這些方法通常使用原子水平打分函數、側鏈旋轉異 構體采樣(side chain rotamer sampling)以及先進的優化方法以精確獲取蛋白質序列、 結構和功能之間的相互關系。計算篩選通過對產生的龐大多樣性過濾使探查靶位置完整序 列區的可能性能夠實現。對于允許激活性Fc優化以達到所需目的的穩定的、合適的折疊以 及功能性序列而言，計算篩選變體文庫可有效地使之富集。因為重疊序列約束了蛋白質結 構、穩定性、溶解性和功能，而在文庫中大量候選物卻占據著“無用的”序列區。舉例來說， 大部分序列區編碼未折疊、錯誤折疊、無完全折疊、部分折疊或聚集的蛋白質。其對于Fc工 程特別相關，因為Ig結構域是小β片層結構，已證實其的工程是非常必需的(Quirm等.， 1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 :8747_8751 ；Richardson 等.，2002，Proc Natl Acad Sci USA 99 =2754-2759)。甚至看上去在β片層表面上無害的取代都能導致嚴重的堆積沖 突，明顯地破壞了折疊平衡(Smith等·，1995，Science 270 :980_982)；順便提及，丙氨酸是 一種最不利的β片層構成者Minor等.，1994，Nature 371 =264-267) 0 β片屋穩定性和 特異性的決定因素是處于極大數量的微妙相互作用之間的一種微妙平衡。計算篩選能夠產 生主要由有效序列區組成的文庫，并因此增加了鑒定對設計目的優化的蛋白質的機率。事 實上計算篩選產生了增加的命中率，從而減少了應用實驗方法篩選的變體數量。Fc工程的 另外障礙是需要有效設計具相互關系或聯系的突變。例如，迄今為止所觀察到的具有最大 Fc/Fc y R親和力增加的是S298A/E333A/K334A，可通過將三種分別在丙氨酸掃描中得到的 較好突變結合而獲得之(Shields等.，2001，J Biol Chem 276:6591-6604)。計算篩選在 一次試驗中就能產生上述三重變體而無須進行三次單獨的試驗，此外還能測試在那些位置 所有20種氨基酸而不僅是丙氨酸的功能性。計算篩選可通過將組合問題減少到實驗上所 能處理的數量以處理上述復雜性。從廣義上看，計算篩選具有四個步驟1)選擇并制備蛋白質模板結構，2)選擇 可變位置、在那些位置應當考慮的氨基酸和/或選擇旋轉異構體以模擬所考慮的氨基酸，3)計算能量，以及4)優化組合。該計算篩選更詳細過程描述如下。將蛋白質三維結構 作為起點(starting point)。鑒定要被優化的位置，其可以是完整蛋白序列或其子集 (subset (s))0在每個位置上選擇所考慮的氨基酸。在一個優選的實施方案中，每個被考慮 的氨基酸可為具有稱為旋轉異構體的容許(allowed)構象的離散集合所代表。計算所考慮 的每個氨基酸與其它所考慮的每個氨基酸之間、以及其與蛋白質的其余部分，包括與該蛋 白質主鏈和不變殘基之間相互作用能量。在一個優選的實施方案中，計算所考慮的每個氨 基酸側鏈旋轉異構體與其它所考慮的每個氨基酸側鏈旋轉異構體(amino acid side chain rotamer)之間、以及其與蛋白質的其余部分，包括與該蛋白質主鏈和不變殘基之間相互作 用能量。接著用一或更多組合搜索算法來鑒定具有最低能量的序列和/或具有低能量的序 列。在一個優選的實施方案中，所用的計算篩選方法基本上類似于Protein Design Automation (PDA )技術，該技術描述于 US 6，188，965 ；US 6，269，312 ；US 6，403，312 ； USSN 09/782, 004；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ；PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588中。在另一個優選的實施方案中，所用的計算篩選方法基本 上類似于 Sequence Prediction Algorithm (SPA )技術，該技術描述于(Raha 等.，2000， Protein Sci 9 1106-1119)、USSN 09/877，695 和 USSN 10/071，859 中。在另一個優選的 實施方案中，所用的計算篩選方法描述于2003年3月3日提交的，標題為“抗體優化”的 USSN 10/339788中。在一些實施方案中，可使用不同計算篩選方法的組合，包括PDA. 技術 與SPA 技術的組合，也包括這些計算方法與其它設計工具的組合。同樣地，這些計算方法 可同時使用或以任一次序順序使用。模板結構作為計算篩選計算的輸入量。本文中“樽板結構”意指要被優化的蛋白 質的部分或全部結構坐標。所述模板結構可以是任何三維結構(即，一組蛋白質原子的三 維坐標)已公知或可計算、估計、模擬、創造或測定的蛋白質。使用包括但不限于X-射線晶 體學技術、核磁共振(NMR)技術、從頭建模法以及同源建模法可測定蛋白質的三維結構。如 果對于沒有用實驗方法解出結構的蛋白質而言優化是所需的，那么可產生一種合適的結構 模型以作為計算篩選計算的模板。用于產生蛋白質同源模型的方法為本領域所公知，這些 方法可供本發明使用。參見例如，Luo，等· 2002，Protein Sci 11 :1218_1226，Lehmann和 Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12(4) :371_5· ；Lehmann 等·，2000，Biochim Biophys Acta 1543(2) :408_415 ;Rath 禾口 Davidson，2000，Protein Sci，9(12) 2457-69 ；Lehmann φ . ,2000, Protein Eng 13(1) :49_57 ;Desjarlais 禾口 Berg，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90(6) 2256-60 ；Desjarlais 和 Berg,1992, Proteins 12(2) 101-4 ；Henikoff 和 Henikoff，2000，Adv Protein Chem 54 :73_97 ;Henikoff 和 Henikoff，1994，J Mol Biol 243(4) :574-8 ;Morea 等，2000，Methods 20:267-269。使用對接(docking)方法也可獲得 蛋白質/蛋白質復合物。可作為模板結構的合適的蛋白質結構包括但不限于，所有那些在 Protein Data Base 中所發現的，該Protein Data Base 數據庫為 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB，原來稱為 Brookhaven National Lab)所編輯禾口維 護。所述模板結構可以是天然存在或工程蛋白質的。所述模板結構也可以是基本上為 來自任意生物體的蛋白質所編碼的蛋白質的，所述任意生物體優選人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。所述模板結構可包含許多蛋白質結構型的任意一種。在一個優選的實施方案中，所述 模板結構包含Fc區或Fc結構域或Fc片段。在一個可選地優選的實施方案中，所述模板結 構包含結合有一種或多種Fc配體的Fc或Fc結構域或Fc片段，優選為Fc/Fc y R復合體。 模板結構中的Fc可糖基化或不糖基化。所述模板結構可包含多于一條的蛋白鏈。所述模板 結構可額外含有非蛋白質組分，包括但不限于小分子、底物、輔因子、金屬、水分子、輔基、聚 合物以及糖。在一個優選的實施方案中，所述模板結構是多個或一組模板蛋白質，例如諸如 獲得自NMR的一組結構。可選地，所述一組模板結構可產生自一組相關的蛋白質或結構，或 人工創建的結構集合。所述組合物和模板結構的來源基于工程目的。舉例來說，對于增加 人Fc/Fc y R親和力而言，人Fc/Fc y R復合體結構或其衍生物可作為模板結構。可選地，非 組合的Fc結構可作為模板結構。如果所述目的是為了增加人Fc對小鼠Fc γ R的親和力， 則模板結構可以是與小鼠Fc γ R結合的人Fc結構或模型。在設計計算前可修飾或改變所述模板結構。用于制備模板結構的許多方法描述于 US 6，188，965 ；US 6，269，312 ；US 6，403，312 ；USSN 09/782，004 ；USSN 09/927，790 ；USSN 09/877, 695 ；USSN 10/071，859，USSN 10/218，102 ；PCT WO 98/07254 ；PCT WO 01/40091 以 及PCT WO 02/25588中。舉例來說，在一個優選的實施方案中，如果其不包括在所述結構 中，則可添加額外的氫原子。在一個可選的實施方案中，對結構進行能量最小化以釋放張力 (strain)，包括基于范德華沖突(clashes)、不利鍵角以及不利鍵長的張力。可選地，所述模 板結構可用其它方法改變，諸如手動地改變，包括受控或隨機微擾。也可在計算篩選后的步 驟中進行模板修飾，包括能量計算以及組合優化步驟。在一個可選的實施方案中，所述模板 結構在計算篩選計算前或過程中不被修飾。一旦獲得模板結構，可變位置就被選定。本文中“可變位置”意指在計算篩選計算 中氨基酸同一性允許得到改變的位置。如本領域所公知，僅在某些可變位置上允許考慮氨 基酸修飾，可減少計算的復雜性并使計算篩選能更直接適應設計目的。在計算篩選中一種 或多種殘基可位于可變位置。選定作為可變位置的位置可以是有助于或推測有助于要優化 的蛋白質特性的那些，所述蛋白質特性例如對Fc γ R的Fc親和力、Fc穩定性、Fc溶解性等 等。可變位置上的殘基對特定的蛋白質特性可有利亦可不利。例如，位于Fc/Fc γ R界面處 的殘基與介導結合相關，因此該位置在設計計算中可改變旨在提高Fc/Fc γ R親和力。如另 一實例，具有暴露疏水側鏈的殘基可能是導致不利聚集的原因，因此在設計計算中該位置 可改變旨在增加溶解性。可變位置可以是與作為特定蛋白質特性決定因素的相互作用直接 相關的那些位置。例如，Fc的Fc γ R結合位點可規定為包括能接觸特定Fc γ R的所有殘基。 本文中“_”意指在Fc殘基的至少一個原子與所結合的Fc γ R的至少一個原子之間的某 些化學相互作用，所具有的化學相互作用包括但不限于范德華相互作用、氫鍵相互作用、靜 電相互作用以及疏水相互作用。在一個可選的實施方案中，可變位置可包括與蛋白質性質 間接相關的那些位置，即上述位置可鄰近于已知或推測有助于Fc性質的殘基。例如，Fc的 Fc γ R結合位點可規定為包括所有位于特定距離內的Fc殘基，例如4-1(^ (^1 范德華接觸 內的任一 Fc殘基。因此在該情況下，不但可選擇直接與Fc γ R接觸的殘基作為可變位置， 也可選擇與接觸Fc γ R的殘基接觸并因此間接影響結合的那些作為可變位置。所述特定位 置的選定依賴于所要采用的設計策略。在模板結構中一個或多個不是可變的位置可以是漂浮的(floated)。本文中“湩浮位置“意指在計算篩選計算中于此允許改變氨基酸構象而非氨基酸同一性的位置。在一 個實施方案中，所述漂浮位置可具有親本氨基酸同一性。例如，漂浮位置可位于與可變位置 殘基具有極小距離內的位置，例如5A。在一個可選的實施方案中，漂浮位置可具有非親本氨 基酸同一性。舉例來說，當目的是為了評估特定突變的能量或結構結果時，上述實施方案可 供本發明。既不是可變的位置也不是漂浮的位置的那些位置稱為固定的(fixed)位置。本文 中“M^^”意指在計算篩選計算中于此氨基酸同一性和構象保持不變的位置。可以是 固定的位置包括與所要優化的性質不相關的已知或推測的殘基。在該情況下，推測通過改 變這些位置，幾乎不會或完全不會獲得所要優化的性質。固定位置也可包括已知或推測該 處殘基對維持固有的折疊、結構、穩定性、溶解性和/或生物學功能起重要作用的位置。例 如，對于與特定Fc配體相互作用的殘基或編碼糖基化位點的殘基而言，位置可以是固定的 以便確保與Fc配體的結合及適當的糖基化各自不受微擾。同樣地，如果穩定性得到優化， 其可有益于使直接或間接與諸如Fc γ R的Fc配體相互作用的位置固定，使得結合不受微 擾。固定位置也可包括結構上重要的殘基，諸如二硫鍵中的半胱氨酸，對于決定主鏈構象而 言起關鍵作用的殘基，如脯氨酸或甘氨酸，關鍵的氫鍵結合殘基以及形成有利堆積相互作 用的殘基。在計算篩選中下一個步驟是在每個特定可變位置選擇一組考慮認為可能的氨基 酸同一性。在可變位置的該組可能的氨基酸在本文中稱為“考虎的氨基酸”。本文中使用 的“a^M”指20種天然氨基酸和任何非天然或合成類似物的組。在一個實施方案中，考 慮到所有20種天然氨基酸。可選地，在給定的可變位置上也考慮氨基酸的子集或甚至僅考 慮一種氨基酸。本領域技術員應當理解，在可變位置上僅考慮特定氨基酸的同一性有利于 計算，因為其減少了搜尋的組合復雜性。此外，在可變位置上僅考慮特定氨基酸可適用于針 對特定設計策略的計算。例如，對于優化非糖基化Fc穩定性而言，在糖基化不存在情況下 暴露于溶劑的非極性Fc殘基處僅允許考慮極性氨基酸是有利于計算的。非天然氨基酸，包 括合成的氨基酸以及天然氨基酸的類似物，也可以是考慮的氨基酸。例如參見，Chiri等.， 2003, Science, 301 (5635) :964_7 ；和 Chin 等.，2003，Chem Biol. 10(6) :511_9。許多方法可單獨或組合地使用以選擇在每個位置上應當考慮的氨基酸。舉例來 說，可基于暴露于溶劑的程度來選擇在給定可變位置處考慮的氨基酸組。疏水或非極性氨 基酸通常位于蛋白質的內部或核內(core)，其難以接近或幾乎難以接近溶劑。因此在核 內可變位置，有利之處在于可僅考慮或主要考慮非極性氨基酸，諸如丙氨酸、纈氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸。親水或極性氨基酸通常位于蛋白 質的外部或表面，其具有顯著程度的溶劑可及性。因此在可變表面位置，有利之處在于可 僅考慮或主要考慮極性氨基酸，諸如丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸以及組氨酸。某些位置是部分暴露或部分埋藏的，無法明確是 蛋白質核內或表面位置，在某種意義上作為位于核內與表面殘基之間的邊界殘基。因此在 上述可變邊界位置，有利之處在于可同時考慮非極性和極性氨基酸，諸如丙氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸。可通過蛋白質結構生物學領域技術 人員主觀評價或圖像檢查(visual inspection)模板結構來確定可變位置處溶劑暴露的程度，或可通過使用本領域公知的多種算法進行之。通過計算方法，諸如計算溶劑可及表 面區域或使用評估相對于溶劑可及表面的Ca -C β向量方向的算法，可輔助或完全決定可 變位置所要考慮的氨基酸類型的選擇，上述計算方法概述于US 6，188，965 ；6, 269，312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ； PCT WO 01/40091和PCTWO 02/25588中。在一個實施方案，每個可變位置可明確地分類為 核內、表面或邊界位置，或是基本上類似于核內(core)、表面或邊界的分類。在一個可選的實施方案中，允許在可變位置通過假設驅動一組氨基酸的選擇。由 于蛋白質結構生物學領域的技術人員通過主觀評價或圖像檢查模板結構，所以應當考慮在 可變位置所假設的氨基酸類型。例如，如果推測在可變位置氫鍵相互作用有利，則可考慮具 有形成氫鍵能力的極性殘基，即使該位置位于核內。同樣地，如果猜測在可變位置疏水堆積 相互作用有利，則可考慮具有形成有利堆積相互作用的非極性殘基，即使該位置在表面上。 其它通過假設驅動方法的實例可涉及主鏈柔性或蛋白質折疊的結果。本領域公知某些殘 基，例如脯氨酸、甘氨酸以及半胱氨酸在蛋白質結構與穩定性中起重要作用。較所有其它氨 基酸而言，甘氨酸能加強主鏈柔性，脯氨酸對主鏈的約束超過了所有其它氨基酸，以及半胱 氨酸可形成二硫鍵。因此，包括一種或多種這些氨基酸類型可有利于實現所需的設計目的。 可選地，從所考慮的氨基酸列表中排除一種或多種這些氨基酸類型也是有利于實現所需的設計目的。在一個可選的實施方案中，氨基酸的子集可被選擇以使覆蓋范圍最大化。在該情 況下，在可變位置可考慮具有類似于模板結構中氨基酸性質的額外氨基酸。例如，如果模板 結構中可變位置的所述殘基是大疏水殘基。則在該位置可考慮額外的大疏水氨基酸。可選 地，氨基酸的子集可被選擇以使多樣性最大化。在該情況下，在可變位置可考慮具有不同于 模板結構中那些氨基酸性質的氨基酸。例如，如果模板結構中可變位置的所述殘基是大疏 水殘基，則可考慮小疏水性、極性等的氨基酸。本領域公知在設計計算過程中，一些計算篩選方法僅需要確定所考慮氨基酸的同 一性。即，不需要關于所述氨基酸側鏈的構象或可能構象的信息。其它優選的方法利用了 一組離散的側鏈構象，稱為旋轉異構體，其對于每個氨基酸而言是要考慮的。因此，在每個 可變和漂浮位置可考慮一組旋轉異構體。旋轉異構體可獲得自公開的旋轉異構體文庫(參 見例如，Lovel 等.，2000，Proteins Structure Function and Genetics 40 :389_408 ； Dunbrack 禾口 Cohen,1997, Protein Science 6 :1661_1681 ；Demaeyer 等.,1997, Folding and Design 2 53-66 ；Tuffery φ . ,1991, J Biomol Struct Dyn 8 1267—1289，Ponder 禾口 Richards, 1987, J Mol Biol 193:775-791)。本領域公知旋轉異構體文庫可以是不依賴 于主鏈的或依賴于主鏈的。旋轉異構體也可獲得自分子力學或從頭計算，以及使用其它方 法。在一個優選的實施方案中，使用了一種柔性旋轉異構體模型(參見Mendes等.，1999， Proteins Structure,Function,and Genetics 37:530—543)。同樣地，可使用人工產生的 旋轉異構體，或對于每個氨基酸和/或可變位置擴大所設置的選擇。在一個實施方案中，至 少一種不是能量低的構象包括于旋轉異構體列中。在一個可選的實施方案中，模板結構中 可變位置殘基的所述旋轉異構體包括于該可變位置許可的旋轉異構體列中。在一個可選的 實施方案中，僅提供了在可變位置所考慮的每個氨基酸的同一性，在設計計算過程中并不 使用每個氨基酸的特定構象態。即，對于計算篩選而言，旋轉異構體的使用不是必需的。
實驗信息可用于指導可變位置的選擇和/或在可變位置所考慮的氨基酸的選擇。 本領域公知誘變實驗通常用于確定在蛋白質結構和功能中某些殘基的作用，例如，哪幾個 蛋白質殘基在決定穩定性中起作用，或哪幾個殘基構成了蛋白質-蛋白質相互作用的界 面。獲得自上述實驗的數據在本發明中是有用的。例如，對于增加Fc/Fc γ R親和力而言， 可變位置可包括其上突變已顯示能影響結合的可變的所有位置。同樣地，上述實驗的結果 可用于指導在可變位置所容許的氨基酸類型的選擇。例如，如果發現某些類型的氨基酸取 代是有利的，可考慮相似類型的那些氨基酸。在一個實施方案中，在可變位置可考慮額外氨 基酸，其具有類似于那些實驗中發現是有利的氨基酸的性質。舉例來說，如果在Fc/Fc y R 界面可變位置的根據實驗突變為大疏水殘基被認為是有利的話，那么在計算篩選中，使用 者可選擇在該位置包括額外的大疏水氨基酸。本領域公知展示和其它選擇技術可結合隨機 誘變以產生一列或多列對所選定特性有利的氨基酸取代。獲得自上述實驗工作中的上述一 列或數列氨基酸取代可供本發明使用。例如，在上述實驗中所發現的不變位置在計算篩選 計算中可排除作為可變位置，反之發現能更容易接受突變或能順利響應突變的位置可選擇 作為可變位置。同樣地，來自上述實驗的結果可用于指導在可變位置所容許的氨基酸類型 的選擇。例如，如果某些類型的氨基酸在實驗淘選中出現更頻繁，可考慮那些氨基酸的相似 類型。在一個實施方案中，在可變位置可考慮額外的氨基酸，其具有類似于那些實驗中發現 是有利的氨基酸的性質。例如，如果在位于Fc/Fc y R界面的可變位置所選擇的突變被發現 是不荷電的極性氨基酸，使用者可選擇在該位置上包括額外的不荷電的極性氨基酸，或可 能包括荷電的極性氨基酸。序列信息也可用于指導可變位置的選擇和/或在可變位置所考慮的氨基酸的選 擇。本領域公知一些蛋白質具有共同的結構骨架(scaffold)以及在序列上是同源的。該 信息可用于獲得對蛋白質家族中特定位置的了解。本領域公知序列比對通常用于確定哪幾 個蛋白質殘基是保守的以及哪幾個是非保守的。換言之，通過蛋白質序列的比較和對比比 對，可觀察到位置上的可變性程度，亦可觀察到位置上天然出現的氨基酸類型。獲得自上述 分析的數據在本發明中是有用的。使用序列信息來選擇可變位置及在可變位置所考慮的氨 基酸的好處具有幾方面。對于可變位置的選擇而言，使用序列信息主要的優點在于可獲得 對哪幾個位置是更能容許突變以及哪幾個位置是較少容許突變的了解。因此序列信息可幫 助確保特性多樣性，即對蛋白質結構、穩定性等無害的突變在計算上被采樣。所述相同的優 點適用于在可變位置使用序列信息來選擇所考慮的氨基酸類型。即，出現在蛋白質序列比 對中的氨基酸組可視為根據進化預篩選的，對于與蛋白質的結構、穩定性、溶解性、功能等 的相容性而言，其較隨機篩選的具有更高機率。因此更高的特性多樣性在計算上被采樣。在 可變位置使用序列信息來選擇所考慮的氨基酸類型的第二種好處是某些比對可提供較隨 機序列可具有較小免疫原性的序列。舉例來說，如果在給定可變位置所考慮的氨基酸是在 人蛋白質序列比對中在該位置所出現的氨基酸組，則那些氨基酸可視為根據性質(nature) 預篩選的，如果所述優化的蛋白質用作為人治療劑，則那些氨基酸用于不產生或產生低的 免疫應答。序列的來源可廣泛多變，包括一種或多種已知的數據庫，包括但不限于Kabat數 據庫(Johnson 和 Wu，2001 ,Nucleic Acids Res 29:205-206 Johnson 和 Wu，2000，Nucleic Acids Res 28 :214_218)、IMGT 數據庫(IMGT，the international ImMunoGeneTicsinformation system ； Lefranc 等.,1999, Nucleic Acids Res 27 :209_212 ；Ruiz φ.,2000 Nucleic Acids Re. 28 219~221 ；Lefranc φ . ,2001, Nucleic Acids Res 29: 207-209 ；Lefranc 等·，2003，Nucleic Acids Res 31:307-310)和 VBASE、SwissProt、 GenBank和Entrez、以及EMBL核苷酸序列數據庫。蛋白質序列信息可獲得自、編譯自和/ 或產生自來自任意生物體的天然存在的蛋白質的序列比對，所述生物體包括但不限于哺乳 動物。蛋白質序列信息可獲得自私人編譯的數據庫。在本領域中公知眾多基于序列的比對 程序和方法，所有的這些程序和方法可供本發明使用以產生包含Fc和Fc配體的蛋白質的 序列比對。一旦進行了比對，序列信息可用于指導可變位置的選擇。上述序列信息可固有地 或以其它方式涉及所給定位置的可變性。本文中的可變性應區別于可變位置。可變性指在 序列比對中在所給定位置出現的氨基酸類型顯示出的變化程度。可變位置，再次重申，是使 用者所選擇的在計算篩選計算過程中以改變氨基酸同一性的位置。可變性可為生物信息 學領域的技術人員所定性確定。也有為本領域所公知的定量確定可變性的方法，其可供本 發明使用。最優選的實施方案測量了信息熵(Information Entropy)或香農熵(Shannon Entropy)。可變位置可基于獲得自密切相關的蛋白質序列或較不密切相關的序列的序列信 息以選擇。使用序列信息來選擇可變位置可廣泛地供本發明使用。例如，如果在模板結構 中Fc/Fc γ R界面位置是色氨酸，且在比對中觀察到在多于90%的序列中色氨酸位于該位 置，可能有益于該位置的固定。反之，如果發現另一個界面位置具有較高水平的可變性，例 如如果在該位置觀察到五種不同的氨基酸，每種具有大約20%的頻率，則該位置可被選擇 作為可變位置。在另一個實施方案中，對排列的蛋白質序列的圖像檢查可取代或有助于對 蛋白質結構的圖像檢查。序列信息也可用于在可變位置指導所考慮的氨基酸的選擇。上 述序列信息可涉及在給定的位置一個氨基酸、多個氨基酸或氨基酸類型(例如極性或非極 性、荷電或不荷電)固有地或以其它方式出現的頻率的多少。在一個實施方案中，在可變 位置所考慮的氨基酸組可包含在比對中在該位置所觀察到的氨基酸組。因此，在計算篩選 計算中所述位置特異性比對信息可直接用于產生在可變位置上所考慮的氨基酸列。上述 策略為本領域眾所周知；參見例如Lehmann和Wyss，2001，Curr Opin Biotechnol 12(4) 371-5 ；Lehmann φ . ,2000, Biochim Biophys Acta 1543(2) :408_415 ;Rath 禾口 Davidson， 2000，Protein Sci，9(12) :2457_69 ；Lehmann 等.，2000，Protein Eng 13(1) :49_57 ； Desjarlais禾口Berg，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90(6) :2256_60 ；Desjarlais禾口Berg， 1992, Proteins 12(2) : 101-4 ;Henikoff 和 Henikoff，2000，Adv Protein Chem 54:73-97; Henikoff 和 Henikoff，1994，J Mol Biol 243(4) :574_8。在一個可選的實施方案中，在一 個或多個可變位置所考慮的氨基酸組可包含于比對中最頻繁觀察到的氨基酸組。因此，特 定標準應用于在確定是否氨基酸或氨基酸類型的頻率能證明其包含于該氨基酸組中，所述 氨基酸組為可變位置上所考慮的。本領域公知在比對中使用統計學方法來計算在任一位置 序列多樣性以及在某一位置每個氨基酸出現的頻率或概率，可對序列比對分析。接著，上述 數據可用于確定哪幾種氨基酸類型要考慮。在最簡單的實施方案中，通過對一個比對位置 所觀察到的一種氨基酸次數的數量計數，然后除以該比對中的序列的總數而計算出這些出 現頻率。在其它的實施方案中，通過多種可能的機制對每個序列、位置或氨基酸對計數程序的貢獻進行權重(weighted)。在一個優選的實施方案中，根據在所述比對中相對于其它序 列的其多樣性權重進行每個比對序列對頻率統計的貢獻的權重。用于實現該目的的常用策 略是 Henikoff 和 Henikoff (Henikoff 和 Henikoff，2000，Adv Protein Chem 54:73-97; Henikoff和Henikoff，1994，J Mol Biol 243:574-8)所推薦的序列權重系統。在一個優 選的實施方案中，所述每個序列對所述統計表的貢獻依賴于其對靶序列的相似性程度，即 所使用的模板結構，使得對該靶序列具有更高相似性的序列得到更高的權重。相似性測量方法的實例包括，但不限于，序列同一性、BLOSUM相似性打分、PAM矩陣相似性打分和BLAST 打分。在一個可選的實施方案中，所述每個序列對統計表的貢獻依賴于其已知的物理或功 能特性。這些特性包括但不限于熱和化學穩定性、活性的貢獻以及溶解性。舉例來說，當優 化非糖基化Fc的溶解性時，在比對中的那些序列應當是已知最能溶解的(例如參見Ewert 等.，2003，] 01 Biol 325 :531-553)，可對所計算的頻率貢獻更多。在序列比對中無論什么標準在可變位置用于選擇所考慮的氨基酸組，使用序列信 息來選擇考慮的氨基酸可廣泛地應用于本發明中。例如，通過置換暴露的非極性表面殘基 以優化Fc溶解性，所考慮的氨基酸可被選擇作為氨基酸組，或那些符合某一標準的氨基酸 的子集，就是在蛋白質序列比對中在該位置所觀察到的。作為另一個實例，可主觀地對源自 序列比對的一列氨基酸添加或刪除一個或多個氨基酸以最大化覆蓋范圍。例如，在可變位 置可考慮具有類似于那些在序列比對中發現的氨基酸的性質的額外氨基酸。例如，如果在 序列比對中觀察到已知的或推測能結合Fc γ R的Fc位置具有不荷電的極性氨基酸，則在計 算篩選計算中使用者可選擇在該位置以包括額外不荷電的極性氨基酸，或荷電的極性氨基 酸。在一個實施方案中，將序列比對信息與能量計算組合，討論如下。例如，擬能量 (pseudo energies)可源自產生打分函數的序列信息。使用基于序列的打分函數可明顯有 助于減少計算的復雜性。然而，本領域技術人員應當理解單獨使用基于序列的打分函數可 能是不適當的，因為在突變之間序列信息通常顯示易誤解的相互關系，在實際上可導致結 構上的不一致。因此，在一個優選的實施方案中，單獨使用基于結構的能量計算方法或與基 于序列的打分函數組合使用。即，優選的實施方案并不單獨依賴于序列比對信息作為分析 步驟。能量計算涉及氨基酸修飾打分方法。通過一種或多種打分函數，相互作用的能量 得到測量。多種打分函數可供本發明用于計算能量。打分函數可包括許多勢(potentials)， 在本文中稱為打分函數的能項，包括但不限于范德華勢、氫鍵勢、原子溶劑化勢或其它溶劑 化勢、二級結構傾向勢、靜電勢、扭角勢和熵勢。至少一種能項被用于對每個可變或漂浮位 置打分，盡管取決于所述位置、所考慮的氨基酸以及其它需要考慮的事項，所述能項可能不 同。在一個實施方案中，利用了使用一種能項的打分函數。在最優選的實施方案中，使用含 有多于一種能項的打分函數計算能量，例如描述范德華、溶劑化、靜電和氫鍵相互作用的能 項，以及它們的組合。在額外的實施方案中，額外的能項包括但不限于熵項、扭角能以及基 于已知的能量。在US 6, 188, 965 ；US 6, 269, 312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790；USSN 09/877, 695 ；USSN 10/071，859，USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ； PCT WO 01/40091以及PCT WO 02/25588中描述了多種打分函數。本領域技術人員應當理解，打分函數無需受限于物理化學能項。例如，基于所知的勢可供本發明的計算篩選 方法學應用。上述基于所知的勢可源自蛋白質序列和/或結構統計，包括但不限于穿織 (threading)勢、參考能量、擬能量、基于同源性的能量以及源自序列比對的序列偏移。在 一個優選的實施方案中，一種打分函數得到改良以包括用于免疫原性的模型，諸如源自肽 與MHC (主要組織相容性復合體)結合數據的函數，其可用于鑒定潛在的免疫原性序列(參 見例如 USSN 09/903，378 ；USSN 10/039，170 ；USSN 60/222，697 ；USSN 10/339788 ；PCT WO 01/21823和PCT WO 02/00165)。在一個實施方案中，序列比對信息能用于對氨基酸取代物 打分。舉例來說，不管所述蛋白質的來源是否是人類、猴子、小鼠或其它，蛋白質序列的比較 結果在本發明的計算篩選方法學中可用于提示氨基酸突變或對氨基酸突變打分。在一個實 施方案中，本領域公知在計算分析過程中一種或多種打分函數可得到優化或“訓練”，接著 使用優化的系統再運行分析過程。上述改變的打分函數可獲得自例如，通過使用實驗數據 訓練的打分函數。本領域技術人員應當理解，許多力場，其由一種或多種能項組成，可作為 打分函數。力場包括但不限于從頭(ab inito)力場或量子力場、半經驗(semi-empirical) 力場以及分子力場。基于已知的或使用統計學方法的打分函數可供本發明使用。這些方法 可用于評估序列和三維蛋白質結構之間的匹配，并因此對于蛋白質結構的保真度而言，可 用于對氨基酸取代打分。在一個實施方案中，通過分別計算突變序列打分的分子動力學計 算可用于計算篩選序列。可用多種方式來表示氨基酸以便進行有效的能量計算。在一個優選的實施方案 中，所考慮的氨基酸表示為如前所述的旋轉異構體，在每個可變以及漂浮位置上計算每個 可能的旋轉異構體與其它可變以及漂浮異構體、固定位置殘基、以及主鏈結構和任何非蛋 白質原子的相互作用的能量(或分數)。在一個優選的實施方案中，對每個可變和漂浮位置 上每條側鏈旋轉異構體的兩組相互作用能量在旋轉異構體和固定原子之間的相互作用能 量(“單重”能量)，以及在可變和漂浮位置旋轉異構體與在每個其它可變和漂浮位置上的 所有其它可能的旋轉異構體之間的相互作用能量(“雙重”能量)進行計算。在一個可選 的實施方案中，對于固定位置以及可變和漂浮位置計算單重和雙重能量。在一個可選的實 施方案中，所考慮的氨基酸并不表示為旋轉異構體。計算篩選的一個重要組成部分是鑒定一種或多種具有有利分數的序列，即具有低 能量的序列。從極大數量的可能性中確定一組低能量序列是非同尋常的，組合優化算法可 用于解決該難題。對于組合優化算法而言，通過調查在典型的計算篩選計算中所考慮的 可能性的數量來闡明其所需要的。對于所給定的設計問題而言，旋轉構象集合(rotamer sets)的離散(discrete)特性容許對可能的旋轉異構體序列進行簡單計算。主鏈長度η 與m(每個位置可能的旋轉異構體數)組合可具有mn條可能的旋轉異構體序列，具有隨著 序列長度而指數式增長的數量。對于特別簡單計算而言，有可能去檢查每條可能的序列以 便鑒定最優序列和/或一種或多種有利序列。然而，對于典型的設計問題而言，可能序列 的數量(高達108°或更多)是足夠大的，以致很難對每條可能序列進行檢查。然后，多種 組合優化算法可用于鑒定優化序列和/或一種或多種有利序列。組合優化算法可分為兩 類(1)如果它們收斂(converge)的話，能保證返回全局極小值能量構型的那些，和(2)并 不能保證返回全局極小值能量構型，但總是能返回溶液構型的那些。第一類算法的實例包 括但不限于死端消除法(Dead-End Elimination) (DEE)和分支與邊界法(Branch&Bound)(B&B)(包括分支(Branch)和終止(Terminate)) (Gordon 和 Mayo，1999，Structure Fold Des 7:1089-98)。第二類算法的實例包括但不限于蒙特卡羅法(Monte Carlo) (MC)、自洽 平均法(self-consistent mean field) (SCMF)、玻耳茲曼采樣法(Boltzmann sampling) (Metropolis 等.，1953，JChem Phys 21 1087)、模擬退火法(Kirkpatrick 等.，1983， Science，220 :671-680)、遺傳算法(GA)以及快速和精確側鏈拓樸學及能量精化(FASTER) (Desmet，等.，2002，Proteins，48 :31_43)。一種組合優化算法可單獨使用或與其它組合優 化算法共同使用。在本發明的一個實施方案中，適用于組合優化算法的策略用于尋找全局極小值 能量構型(global minimum energy configuration)。在一個可選的實施方案中，所述 策略用于尋找一種或多種低能量或有利序列。在一個可選的實施方案中，所述策略用 于尋找全局極小值能量構型，接著用于尋找一種或多種低能量或有利序列。例如，概述 于USSN 6，269，312，優選的實施方案利用了死端消除(DEE)法和蒙特卡羅法。在其它實 施方案中，在其它搜索方法中使用禁忌搜索算法(tabu search algorithms)或將其與 死端消除法(DEE)和/或蒙特卡羅法組合(參見Modern Heuristic Search Methods, V. J. Rayward-Smith 等編輯，1996，John WILEY&Sons Ltd. ；USSN 10/218，102 ；和 PCT WO 02/25588)。在另一個優選的實施方案中，可使用遺傳算法；參見例如USSN 09/877，695和 USSN 10/071,859。作為另外的實例，其更充分地描述于US 6, 188,965 ；US 6, 269, 312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 98/07254 ； PCT WO 01/40091和PCT WO 02Λ5588中，可達到全局(global)最優值，接著進一步對可能 出現的進行計算處理，其產生了額外的優化序列。在最簡單的實施方案中，設計計算無需組 合。即，在單個可變位置能量計算單獨用于評估氨基酸取代。對于其它計算而言，優選在多 于一個的可變位置上評估氨基酸取代。在一個優選的實施方案中，在組合優化前計算所有 可能的相互作用能。在一個可選地優選的實施方案中，在組合優化過程中視需要可進行能 量計算。文庫產生本發明提供了用于產生文庫的方法，所述文庫可隨后用實驗方法篩選以挑選優化 的Fc變體。本文中使用的“文庫”意指一種或多種Fc變體的組。文庫可指以任何形式存 在的變體組。在一個實施方案中，所述文庫是一列核酸或氨基酸序列，或在可變位置的一列 核酸或氨基酸取代物。例如，如下用于說明本發明的實例提供了在可變位置的氨基酸取代 物的文庫。在一個實施方案中，文庫是至少一種序列的一列(a list)，所述序列是對所需特 性優化的 Fc 變體。例如參見，Filikov 等.，2002，Protein Sci 11 1452-1461 和 Luo 等.， 2002，Protein Sci 11:1218-1226。在一個可選的實施方案中，文庫可確定為組合的列，意 指對于每個可變位置產生一列氨基酸取代物，暗示每個取代物要與在所有其它可變位置上 所有其它設計的取代物組合。在該情況下，在所有可變位置的所有可能性的組合的擴大產 生了大的清楚定義的文庫。文庫可指多肽的物理組合物，所述多肽包含Fc區或一些結構域 或該Fc區片段。因此文庫可指以純化或未純化形式存在的抗體或Fc融合體的物理組合物。 文庫可指編碼該文庫序列的核酸的物理組合物。所述核酸可以是編碼該文庫成員的基因、 具有任意可操作連接的核酸的編碼該文庫成員的基因、或編碼該文庫成員和任意其它可操 作地連接的調節序列、可選標記、融合構建體和/或其它元件的表達載體。例如，所述文庫可以是一組編碼Fc文庫成員的哺乳動物表達載體，其蛋白質產物可隨后通過實驗方法得 到表達、純化及篩選。作為另一個實例，所述文庫可以是展示文庫。上述文庫可以，例如，包 含一組編碼可操作地連接有一些融合伴侶的文庫成員的表達載體，所述融合伴侶能實現噬 菌體展示、核糖體展示、酵母展示、細菌表面展示等等。可使用輸出序列或來自計算篩選的序列產生所述文庫。如上所討論，計算產生的 文庫明顯具有更多的穩定性、正確折疊以及相對于隨機產生的文庫更多的功能序列。因 此，計算篩選增加了對所述設計目的優化的蛋白質的鑒別機率。文庫中的序列組通常，但 不總是，明顯地不同于親本序列，盡管在一些例子中所述文庫優選含有親本序列。本領域 公知具有多種可使文庫源自計算篩選計算輸出的方法。例如，描述于US 6，403，312;USSN 09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 01/40091 和 PCT WO 02/25588 中的產生文庫的方法可供本發明使用。在一個實施方案中，序列分數在一定范圍內的全局 最優化序列(global optimum sequence)可包括于文庫中。例如，所有序列都在IOkcal/ mol內的最低能量序列可作為文庫。在一個可選的實施方案中，可以使用序列分數在一定 范圍內的一種或多種局部極小值序列(local minima sequence) 0在一個優選的實施方案 中，所述文庫序列獲得自過濾組(filtered set)。通過多種方法可產生上述列或組，為本領 域所公知，例如使用諸如蒙特卡羅、B&B或SCMF的算法。例如，在過濾組中上限為IO3或上 限為IO5的序列可包含在所述文庫。可選地，通過所有突變組合所限定的序列總數可用于 終止文庫的評判標準。對于重組序列的總數而言，優選值范圍在10-102°，特別優選值范圍 在100-109。可選地，當預先確定每個位置突變數達到時可強迫終止。在一些實施方案中， 并不進行終止的序列包括在文庫中。在一些情況下其是所需的，例如以評估產生文庫的方 法，以提供對照或比較，或對額外序列空間采樣。例如，在文庫中可包括親本序列，即使其沒 有進行終止(cutoff)。聚類算法(Clustering algorithms)可用于將來自計算篩選方法的序列分類為具 有代表性的組。舉例來說，描述于USSN 10/218，102和PCT WO 02/25588的聚類方法及其 應用可供本發明使用。例如通過相似性可定義具有代表性的組。相似性的測量包括，但不 限于對序列相似性和能量相似性的測量。因此計算篩選的輸出序列可在局部極小值(local minima)周圍聚類，在本文中稱為序列的聚類組(clastered set)。例如，封閉序列空間的 序列組可與其它組區分。在一個實施方案中，通過在文庫中包括了一些、大多數或所有的序 列，在一聚類組或其子集范圍內覆蓋范圍可最大化，所述序列組成一種或多種序列聚類組。 例如，通過在這些組所在文庫的范圍內包括大多數的序列，有利于在一、二或三最低能量聚 類組范圍內最大化覆蓋范圍。在一個可選的實施方案中，通過在文庫范圍內僅包括在每一 聚類組范圍內的序列子集，可對貫穿于序列聚類組多樣性采樣。例如，通過在文庫中包括來 自每個聚類組的最低能量序列，可對所有或大多數聚類組廣泛地采樣。序列信息可用于指導用于文庫產生的過濾計算篩選結果。如所討論的，通過比較 和對比蛋白質序列的比對，在位置上的可變性程度以及可自發出現在該位置的氨基酸類型 可得到觀察。在本發明中獲得自上述分析的數據是有用的。已討論了使用序列信息的好處， 那些好處可同樣地適用于指導文庫產生的序列信息的使用。序列比對中出現的氨基酸組可 視為通過進化預篩選的，對于與蛋白質的結構、穩定性、溶解性、功能以及免疫原性的相容 性而言，其較隨機的具有更高機率。已討論了序列來源的多樣性，以及用于產生序列比對的方法，其可用在以序列信息來指導文庫的產生。同樣地，如上所討論，在比對中各種標準 可應用于確定某些殘基的重要性或權重。這些方法也可供用序列信息來指導文庫的產生。 使用序列信息從計算篩選結果中指導文庫產生可供本發明廣泛使用。在一個實施方案中， 序列信息用于從計算篩選輸出中過濾序列。換言之，一些取代從計算輸出(computational output)中減去以產生文庫。例如所產生的計算篩選計算或各種計算的輸出可被過濾使得 該文庫僅包括符合某些標準的那些氨基酸，或那些氨基酸的子集，例如在序列比對中在該 位置上所觀察到的。在一個可選的實施方案中，序列信息用于將序列添加到計算篩選輸出 中。即，序列信息用于指導額外氨基酸的選擇，所述氨基酸被添加到計算輸出中以產生文 庫。例如，對于給定位置而言，來自計算篩選計算的氨基酸輸出組可得到擴大以包括一種或 多種氨基酸，所述氨基酸在蛋白質序列比對中在該位置被觀察到。在一個可選的實施方案 中，基于序列比對信息，一種或多種氨基酸可添加到或從計算篩選序列輸出中減去以便最 大化覆蓋范圍或多樣性。舉例來說，具有類似于那些在序列比對中所發現的氨基酸的性質 的額外的氨基酸可添加入文庫中。例如，如果在序列比對中觀察到位置上具有不荷電極性 氨基酸，在該位置的額外的不荷電極性氨基酸可包括于該文庫中。可對文庫處理以進一步產生隨后文庫。因此，來自計算篩選計算的輸出可視為初 級文庫(primary library)。所述初級文庫可與來自其它計算或其它文庫的其它初級文庫 組合，使用隨后的計算、序列信息或其它分析或實驗處理以產生隨后文庫，在本文中稱為二 級文庫。從所述描述中應當理解，上述討論的使用序列信息以指導或過濾文庫自身是從初 級文庫產生二級文庫的一種方法。在文庫范圍內，二級文庫的產生給使用者以對參數更多 的控制。能使實驗篩選更有效率，并可容許來自實驗結果的反饋以更容易得到解釋，提供了 更有效的設計/實驗循環。許多方法可用于從初級文庫產生二級文庫。例如USSN 10/218，102和PCT WO 02/25588中所描述的用于產生二級文庫的方法可供本發明使用。通常出現在初級文庫中 的一些選擇步驟以一些方式進行處理。例如，在一個實施方案中，出現了選擇步驟，在該 步驟中一些組的初級序列被選擇以形成二級文庫。在一個可選的實施方案中，選擇步驟 是計算步驟，通常還包括一個選擇步驟，其中一些初級文庫的子集被選擇并接著進行進一 步的計算分析，包括進一步的計算篩選和諸如“在計算機環境中”改組或重組的技術(參 見，例如 US 5, 830, 721 ；US 5, 811, 238 ；US 5，605，793 和 US 5，837，458、易錯 PCR，例如使 用修飾的核苷酸；包括使用多個盒式的已知誘變技術；以及DNA改組(Crameri等.，1998， Nature 391 288-291 ；Coco 等.，2001，Nat Biotechnol 19 354-9 ；Coco 等.，2002，Nat Biotechnol，20 1246-50)，異源 DNA 采樣(US 5, 939, 250) ； ITCHY(Ostermeier 等.，1999， Nat Biotechnol 17:1205-1209) ；StEP (Zhao 等.，1998，Nat Biotechnol 16:258-261)， GSSM(US 6，171，820和US 5，965，408)；體內同源重組，連接酶輔助基因裝配，末端互 補 PCR，前融合(profusion) (Roberts 禾口 Szostak，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94 12297-12302)；酵母 / 細菌表面展示(Lu 等.，1995，Biotechnology 13:366-372) ；Seed 和 Aruffo, 1987, Proc Natl Acad Sci USA 84(10) :3365_3369 ；Boder 和 Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15:553-557)。在一個可選的實施方案中，出現的選擇步驟是一種實驗步驟， 例如如下的任一文庫篩選步驟，其中一些初級文庫的子集被選擇并接著用實驗方法重新組 合，例如使用一種如下討論的定向進化(directed evolution)方法，以形成二級文庫。在一個優選的實施方案中，如US 6，403，312所概述的產生并處理初級文庫。二級和隨后文庫的產生可供本發明廣泛使用。在一個實施方案中，不同的初級文 庫可組合產生二級或隨后文庫。在另一個實施方案中，二級文庫可通過在高度突變或高度 保守的位置對序列多樣性采樣而產生。可分析該初級文庫以確定在模板蛋白質中哪些氨基 酸位置具有高突變頻率，以及哪些位置具有低突變頻率。例如，在計算篩選中顯示了大量 突變多樣性的蛋白質中的位置在后一輪設計計算中可得到固定。當在第一輪時，同樣大小 的過濾組在第一文庫中很大程度上保守的位置上將顯示多樣性。可選地，二級文庫可通過 在具有眾多突變的位置上改變氨基酸而產生，但是使突變頻率不超過某水平的位置保持不 變。該討論并不意味著約束文庫的產生，即初級文庫隨后產生二級文庫。應當理解，初 級和二級文庫可進一步得到處理以產生三級文庫、四級文庫等。可見，文庫產生是一種迭代 過程。例如，將多種額外步驟應用于一種或多種二級文庫可構建三級文庫；例如，可進行進 一步計算處理，二級文庫可得到重組，或不同二級文庫的子集可得到組合。在一個優選的實 施方案中，可通過組合二級文庫產生三級文庫。舉例來說，分析了蛋白質不同部分的初級 和/或二級文庫可組合產生三級文庫，該文庫處理蛋白質的組合的部分。在一個可選的實 施方案中，來自初級文庫的變體可與來自另一個初級文庫的變體組合以提供組合的三級文 庫，具有較創建一個極長過濾組更低的計算成本。這些組合可用于，例如，分析大的蛋白質， 特別是大的多結構域的蛋白質，Fc就是一個實例。因此將對上述二級文庫產生的描述應用 于產生初級文庫之后的任意文庫，最后結果是得到最終文庫，該文庫可用實驗方法篩選以 獲得對設計目的而言優化的蛋白質變體。這些實例并不意在將二級文庫的產生限制于要針 對任何特定應用或本發明操作理論。反而，這些實例意在舉例說明二級文庫，以及諸如三級 文庫等的隨后文庫的產生，其可廣泛地用于計算篩選方法學中，用于產生文庫。實驗生產和篩選本發明提供了用于生產和篩選Fc變體文庫的方法。所述的方法無意將本發明限 制于任何特定應用或操作理論。反而，所提供的方法意在舉例說明通常一種或多種Fc變 體或一種或多種Fc變體文庫可用實驗方法產生并篩選以獲得最優化的Fc變體。Fc變體 可在任意背景中得到生產和篩選，無論Fc區、結構域或其片段，或包含Fc的更大的多肽是 否在本文中明確定義為抗體或Fc融合體。用于抗體分子生物學、表達、純化以及篩選的 常規方法描述于 Antibody Engineering, Duebel 禾口 Kontermann 編輯，Springer-Verlag, Heidelbergjooi5H^sHayhurstipGeorgioujooLCurr Opin Chem Biol 5:683—689; Maynard 禾口 Georgiou，2000，Annu Rev Biomed Eng 2:339—76 中。在本發明的一個實施方案中，文庫序列用于創建編碼序列成員的核酸，接著所述 核酸可克隆入宿主細胞，如果需要的話，表達并分析。因此，編碼每個成員蛋白質序列的核 酸，特別是DNA可得到制備。使用眾所周知的方法完成這些實驗。例如，描述于Molecular Cloning-Α Laboratory Manual，第 3 片反·(Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)， 以 及 Current Protocols in Molecular Biology (John ffiley&Sons)的多種方法可供本發明使用。本領域技術人員應當理解對于包含大量序列 的文庫而言，恰當序列的產生可能花費巨大并且耗費時間。因此，有多種技術可用于有 效產生本發明的文庫。可供本發明使用的上述方法描述于或引用于US 6,403,312;USSN09/782, 004 ；USSN 09/927, 790 ；USSN 10/218, 102 ；PCT WO 01/40091 和 PCT WO 02/25588 中。上述方法包括但不限于基因裝配方法、基于PCR的方法和使用PCR變化形式的方法、基 于連接酶鏈式反應的方法、諸如那些用于改組合成的匯集寡核苷酸的方法(pooled oligo method)、易錯擴增方法和使用具有隨機突變寡聚物的方法、經典的定位誘變方法、盒式突 變以及其它擴增和基因合成方法。本領域公知有多種商業上可獲得的試劑盒以及用于基因 裝配、誘變、載體亞克隆等等的方法，上述商品可供本發明使用以產生編碼文庫Fc變體成 員的核酸。通過培養用核酸轉化的宿主細胞，優選用含有編碼Fc變體的核酸的表達載體轉 化，在合適條件下誘導或引發蛋白質的表達可生產本發明的Fc變體。所述適于表達的條件 可隨著表達載體和宿主細胞的選擇而變化，并可容易地為本領域技術人員通過常規實驗方 法而確定。可使用許多合適的宿主細胞，包括但不限于哺乳動物細胞、細菌、昆蟲細胞以及 酵母。例如，多種可供本發明使用的細胞系描述于ATCC 細胞系目錄，可從美國典型培養 物保藏中心獲得。在一個優選的實施方案中，在哺乳動物表達系統中表達Fc變體，包括在該系統中 使用諸如逆轉錄病毒或腺病毒的病毒將表達構建體導入哺乳動物細胞。可使用任何哺乳動 物細胞，特別優選人、小鼠、大鼠、倉鼠以及靈長類動物細胞。合適的細胞也包括已知的研究 細胞，包括但不限于Jurkat T細胞、NIH3T3、CH0、C0S和293細胞。在一個可選地優選的實 施方案中，文庫蛋白質可在細菌細胞中得到表達。細菌表達系統為本領域所眾所周知，包括 大腸桿菌(E. coli)、枯草芽孢桿菌、乳脂鏈球菌(Str印tococcus cremoris)和鏈鎖狀球菌 (Streptococcus lividans)。在可選的實施方案中，Fc變體在昆蟲細胞或酵母細胞中產生。 在一個可選的實施方案中，使用無細胞翻譯系統在體外表達Fc變體。體外翻譯系統源自原 核細胞(例如，大腸桿菌)和真核細胞(如，小麥胚(wheat germ)、兔網織紅細胞)，所述細 胞可獲得并可基于表達水平以及感興趣蛋白質的功能而得到選擇。例如，本領域技術人員 應當理解，體外翻譯是一些展示技術所必需的，例如核糖體展示。此外，Fc變體可通過化學 合成方法產生。編碼本發明Fc變體的核酸可摻入表達載體中以便表達蛋白質。許多表達載體可 用于蛋白質表達。表達載體可包含染色體外自主復制載體或整合入宿主基因組的載體。應 構建與宿主細胞類型相容的表達載體。因此可供本發明使用的表達載體包括但不限于能使 蛋白質在哺乳動物細胞、細菌、昆蟲細胞、酵母以及體外系統中表達的那些。本領域公知多 種表達載體可從商業上或以其它方式獲得，可供本發明用于表達Fc變體蛋白。表達載體通常包含與控制或調節序列、可選標記、任意融合伴侶和/或額外元件 可操作地連接的蛋白質。本文中“可操作地連接”意指所沭核酸與其它核酸序列以功能關 系放置。一般來說，包括轉錄和翻譯調節核酸可操作地連接于編碼Fc變體的核酸的這些表 達載體，其通常適于宿主細胞使用以表達蛋白質。一般而言，所述轉錄和翻譯調節序列可包 括啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，以及增強子 或激活子序列。本領域也公知，表達載體通常含有選擇基因或標記以容許對含有表達載體 的轉化宿主細胞選擇。選擇基因為本領域眾所周知并可隨著所使用的宿主細胞而改變。Fc變體能可操作地連接于融合伴侶，使所表達的蛋白質的靶向、純化、篩選、展示 等能夠實現。融合伴侶可通過接頭序列與Fc變體序列連接。所述接頭序列通常包含較少數量的氨基酸，一般少于10，盡管也可使用更長的接頭。一般地，所選擇的接頭序列應具有柔性并能抗降解。本領域技術人員應當理解，許多序列可用作為接頭。例如，常用的接頭序 列包含氨基酸序列GGGGS。融合伴侶可具有靶向作用或可以是信號序列，將Fc變體蛋白質 與任一相關的融合伴侶送往所需的細胞位置或細胞外介質。本領域公知某些信號序列可將 蛋白質靶向分泌到培養基或位于細胞的內外膜之間的壁膜間隙。融合伴侶也可以是編碼使 純化和/或篩選可能的肽或蛋白質的序列。上述融合伴侶包括但不限于多組氨酸標簽(His 標簽)(例如H6和Hltl或其它用于固定化金屬親和層析(IMAC)系統(如，Ni+2親和柱)的標 簽)GST融合體、MBP融合體、Str印標簽、細菌酶BirA的BSP生物素化靶序列以及靶向抗體的附加表位(例如c-myc標簽、flag標簽等等)。本領域技術人員應當理解上述標記可用于 純化、篩選、或兩者。例如，Fc變體可通過使用His標簽將其固定在Ni+2親和柱上而得到純 化，接著在純化后同樣的His標簽可用于將抗體固定在Ni+2包被的培養板上，以進行ELISA 或其它結合測定(如下所述)。融合伴侶可使利用選擇方法篩選Fc變體成為可能(參見 如下)。能用于多種選擇方法的融合伴侶為本領域眾所周知，所有這些融合伴侶都可供本 發明使用。舉例來說，通過將Fc變體文庫的成員融合到基因III蛋白質上，噬菌體展示能 i^iLliliffl (Kay ^ . , Phage display of peptides and proteins -.a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA,1996 ；Lowman 等，1991, Biochemistry 30 10832-10838 ； Smith，1985，Science 228:1315-1317)。融合伴侶能使Fc變體得到標記。可選地，融合 伴侶可結合表達載體上的特定序列，能使該融合伴侶和相關的Fc變體與編碼它們的核酸 共價或非共價連接。例如，USSN 09/642, 574 ；USSN 10/080, 376 ；USSN 09/792, 630 ；USSN 10/023，208 ；USSN 09/792，626 ；USSN 10/082，671 ；USSN 09/953，351 ；USSN 10/097，100 ； USSN 60/366, 658 ；PCT WO 00/22906 ；PCT WO 01/49058 ；PCT WO 02/04852 ；PCT WO 02/04853 ；PCT WO 02/08023 ；PCT WO 01/28702 ；和 PCT WO 02/07466 描述了這樣的融合伴 侶和技術，其可供本發明使用。本領域眾所周知向宿主細胞中導入外源核酸的方法，所述方法可隨著所使用的宿 主細胞而變化。技術包括但不限于葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、氯化鈣處理、1，5_ 二甲 基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、病毒或噬菌體感 染、在脂質體中多核苷酸的膠囊化(encapsulation)、以及直接將DNA微注射入細胞核。就 哺乳動物而言，轉染可以是瞬時的或穩定的。在一個優選的實施方案中，Fc變體蛋白質在表達后得到純化或分離。以本領域 技術人員公知的各種方法可分離或純化蛋白質。標準的純化方法包括色譜技術，包括離子 交換、疏水相互作用、親和力、大小或凝膠過濾、以及反相，在大氣壓或高壓下使用諸如FPLC 和HPLC的系統進行。純化方法還包括電泳、免疫學技術、沉淀、透析以及色譜聚焦技術。超 濾和滲濾技術與蛋白質濃縮也是有用的。本領域眾所周知許多天然蛋白質結合Fc和抗體， 這些蛋白質可供本發明用于純化Fc變體。例如，細菌蛋白A和G結合Fc區。同樣地，細菌 蛋白L結合某些抗體的Fab區，當然抗體的靶抗原也能結合Fab區。通過特定的融合伴侶純 化通常能得到實施。例如，如果采用GST融合，則Fc變體蛋白質可使用谷胱甘肽樹脂進行 純化，如果使用His標簽，則可使用Ni+2親和層析，或如果使用flag標簽，則可使用固定化 抗-flag抗體。關于適合的純化技術的常規指導，參見Protein Purification principles and Practice，第 3 版·，Scopes，Springer-Verlag，NY，1994。所需的純化程度可基于 Fc 變體的篩選或用途而變化。在一些情況下無需要純化。例如在一個實施方案中，如果Fc變體 被分泌，可直接從培養基中篩選。本領域眾所周知，一些選擇方法并不包括蛋白質的純化。 因此，舉例來說，如果Fc變體文庫制成噬菌體展示文庫，則不需要進行蛋白質純化。Fc變體可使用多種方法篩選，包括但不限于使用體外分析法、體內和基于細胞分 析法以及選擇技術的那些。在篩選程序中可利用自動化和高通量篩選技術。可使用融合伴 侶或標記進行篩選。如上已討論了融合伴侶的使用。本t中“標記的”意指本發明的Fc奪 體具有一種或多種附在其上使篩選中的檢測成為可能的元件、同位素或化合物。一般而言， 標記分成三類a)免疫標記，可以是摻入作為融合伴侶的表位，該表位被抗體識別，b)同位 素標記，可以是放射性同位素或重同位素，以及c)小分子標記，可包括熒光和比色染料，或 諸如生物素的使其它標記方法運作的分子。標記可以摻入化合物中任何位置，并可在蛋白 質表達過程中在體外或體內摻入。在一個優選的實施方案中，在體外分析法中Fc變體的功能和/或生物物理特性 得到篩選。對于篩選感興趣的特性而言，體外分析法可給予廣闊的動態范圍。可篩選的Fc 變體特性包括但不限于穩定性、溶解性和對Fc配體的親和力，例如對Fc YRs的。可同時或 分別篩選多種特性。取決于測定所需，蛋白質可以是純化的或未純化的。在一個實施方案 中，所述篩選是用于Fc變體與蛋白質或非蛋白質分子的結合的定性或定量的結合測定，這 些非蛋白質分子已知或視為結合Fc變體。在一個優選的實施方案中，所述篩選是用于測 量抗體或Fc融合體的靶抗原結合的結合測定。在一個可選地優選的實施方案中，所述篩選 是用于Fc變體與Fc配體結合的測定，Fc配體包括但不限于Fc y Rs家族、新生受體FcRru 補體蛋白Clq、以及細菌蛋白A和G。所述Fc配體可來自任何生物體，優選人、小鼠、大鼠、 兔子和猴子。可使用多種本領域公知的方法進行結合分析，包括但不限于基于FRET(熒光 能量共振轉移)和BRET (生物發光能量共振轉移)的分析法、AlphaScreen (增強發光均 質鄰近分析法(Amplified luminescent proximity homogeneous Assay))、閃爍鄰近分析 法(Scintillation proximity Assay)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、SPR(表面胞質團共 振(Surface ρlasmon Resonmce)，也已知為 BIAC0RE )、等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry)、差不掃描量熱法(differential scanning calorimetry)、凝膠 電泳以及包括凝膠過濾的色譜法。這些方法和其它方法可利用某些Fc變體的融合伴侶或 標記。可使用多種檢測方法進行測定，包括但不限于發色的、熒光的、發光的或同位素標記。Fc變體蛋白質的生物物理特性，例如穩定性和溶解性，通過使用多種本領域已知 的方法可得到篩選。蛋白質穩定性通過測量在折疊和非折疊狀態之間的熱力學平衡可得到 確定。例如，使用化學變性劑、加熱或PH方法，本發明的Fc變體蛋白質可以解折疊，該轉換 可使用包括但不限于圓二色譜法、熒光光譜法、吸收光譜法、NMR波譜法、熱量測定法以及蛋 白質水解法的方法來監測。本領域技術人員應當理解，通過使用這些技術和其它技術，折 疊和解折疊轉換的動力學參數也可得到監測。通過使用許多本領域公知的方法，Fc變體蛋 白質的溶解性和總體結構完整性可得到定量或定性測定。可供本發明用于鑒定Fc變體蛋 白質生物物理特性的方法包括凝膠電泳、諸如大小排阻層析和反相高效層析的色譜法、質 譜法、紫外吸收光譜分析法、熒光光譜法、圓二色譜法、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、 超速離心分析法、動態光散射法、蛋白質水解法以及交聯法、濁度測量法、過濾阻滯分析法 (filter retardation assays)、免疫分析法、熒光染料結合分析法、蛋白質染色法、顯微鏡法以及通過ELISA或其它結合分析法對聚集的檢測。使用X-射線晶體學技術分析結構，也 可使用NMR波譜法。在一個實施方案中，通過在規定的某一段時間后測定溶液蛋白質量，可 測定穩定性和/或溶解性。在該測定中，蛋白質可以暴露于或可以不暴露于某些極端條件 下，例如提高溫度、低PH或存在變性劑。因為行使功能通常需要穩定、可溶和/或適當折疊 /結構的蛋白質，前述的功能和結合分析法也提供了用于執行上述測量的方法。例如，包含 Fc變體的溶液可對其與靶抗原的結合能力進行測定，接著在極端溫度下暴露一段或多段規 定的時間，然后再測定與抗原的結合。因為預期解折疊和聚集的蛋白質無法結合抗原，所以 保留的活性量提供了對Fc變體的穩定性和溶解性的量度。在一個優選的實施方案中，使用一種或多種基于細胞或體內分析法對文庫進行篩 選。對于上述分析法，純化的或未純化的Fc變體蛋白質通常作為外源物添加，使得細胞暴 露于屬于文庫的單個變體或變體庫。這些分析法通常，但并不總是，基于包含Fc變體的抗 體或Fc融合體的功能；即抗體或Fc融合體結合靶抗原和介導某些生化反應的能力，例如 效應器功能、配體/受體結合抑制、細胞凋亡等等。上述分析法通常包括監測細胞對抗體或 Fc融合體的應答，例如細胞生存、細胞死亡、細胞形態學變化或諸如天然基因或報道基因細 胞表達的轉錄激活。例如，上述分析法可測量Fc變體引發ADCC、ADCP或⑶C的能力。對于 某些分析法而言，可能需要添加除靶細胞之外的額外的細胞或組分，例如血清組分或諸如 外周血單個核細胞(PBMCs)、NK細胞、巨噬細胞等的效應細胞。上述額外的細胞可來自任何 生物體，優選人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。抗體和Fc融合體可引發表達了所述抗體靶抗原 的某些細胞系的細胞凋亡，或它們可通過已添加到該分析中的免疫細胞介導對靶細胞的攻 擊。用于監測細胞死亡或生存能力的方法為本領域所公知，包括使用染料、免疫化學、細胞 化學和放射性試劑。例如，半胱天冬酶染色分析法能測定細胞凋亡，攝取或釋放放射性底物 或諸如alamar藍的熒光染料能監測細胞生長或激活。在一個優選的實施方案中，使用了基 于EuTDA的DELFIA 細胞毒性測定法(Perkin Elmer，MA)。可選地，可通過測量一種或多 種天然胞內蛋白質的釋放，例如乳酸脫氫酶的釋放，以監測死亡或損傷的靶細胞。在基于細 胞的測定法中轉錄激活也可用作為分析功能的方法。在該情況下，通過對可能是增量調節 的天然基因或蛋白質的分析以監測應答，例如可測定某些白細胞介素的釋放，或可選地通 過報道構建體讀出結果。基于細胞的測定法也可包括對細胞形態學改變的測定，該形態學 改變作為Fc變體存在的應答。用于上述測定法的細胞類型可以是原核或真核的，可采用本 領域公知的多種細胞系。可選地，使用已轉化或轉染編碼所述Fc變體核酸的細胞，可進行基于細胞的篩 選。即，Fc變體蛋白質并不作為外源物添加到細胞中。例如，在一個實施方案中，所述基 于細胞的篩選使用了細胞表面展示。可使用融合伴侶以使Fc變體在細胞表面得到展示 (ffitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12 :395_399)。可供本發明使用的細胞表面展示方 法包括但不限于在細菌(Georgiou 等.，1997，Nat Biotechnol 15 :29_34 ；Georgiou 等.， 1993, Trends Biotechnol 11 6-10 ；Lee 等.，2000， Nat Biotechnol 18 645-648 Jun 等.，1998，Nat Biotechnol 16 :576_80)、酵母(Boder 和 Wittrup，2000，Methods Enzymol 328 430-44 ；Boder 和 Wittrup, 1997，Nat Biotechnol 15 :553_557)以及哺乳動物細胞 (Whitehorn 等，1995，Bio/technology 13 1215-1219)上展示。在一個可選的實施方案中， Fc變體蛋白質并不在細胞表面展示，反而在細胞內或在某些其它細胞區室中被篩選。例如，周質表達和細胞計數篩選(Chen等.，2001，Nat Biotechnol 19 :537_542)、蛋白質片段 互補測定(Johnsson 和 Varshavsky，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 10340-10344.； Pelletier 等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146)以及酵母雙雜交篩選 (Fields和Song，1989，Nature 340:245-246)可供本發明使用。可選地，如果多肽包含所 述Fc變體，例如抗體或Fc融合體，可賦予細胞一些可選擇的生長有利條件，所述特性可用 于對Fc變體篩選或選擇。本領域公知，篩選方法的子集是對文庫的有利成員進行選擇的那些。所述方法在 本文中稱為“^S^法”，這些方法可供本發明用于篩選Fc變體文庫。當使用選擇方法篩 選文庫時，僅有那些有利的文庫成員，即符合某些篩選標準，得到增殖、分離和/或觀察。應 當理解，因為僅有最恰當的變體得到觀察，所以通過單獨測定文庫成員的適合度(fitness) 的方法，能使大于該方法可篩選的那些的文庫得到篩選。通過任何方法、技術，或共價或非 共價地連接的融合伴侶、具有其基因型的Fc變體的表型(即具有編碼其核酸的Fc變體的 功能)，能使選擇得到實施。例如通過將文庫成員與基因III蛋白質融合，能使噬菌體展示 用作選擇方法。可見，變體蛋白質的選擇或分離符合某些標準，例如對Fc γ R的結合親和 力，也用于選擇或分離編碼其的核酸。一旦分離了，所述編碼Fc變體的基因可接著被擴增。 該分離和擴增過程，稱為淘選(panning)，可重復進行，容許有利的Fc變體在文庫中得到富 集。最后對附在其上的核酸進行測序的核酸可供基因鑒定使用。本領域公知的多種選擇方法可供本發明用于篩選Fc變體文庫。這些方法包括但 ^·KT-UMliiΙΦM(Phage display of peptides and proteins -.a laboratory manual, Kay 等.,1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996 ；Lowman 等.,1991, Biochemistry 30 10832-10838 ；Smith, 1985, Science 228 1315-1317)和其衍生的方法，諸如選擇性噬 菌體感染(Malmborg 等.，1997，JMol Biol 273 :544_551)、選擇性感染噬菌體(Krebber 等·，1997，J Mol Biol 268 :619_630)以及延遲感染性淘選(Benhar 等，2000，J Mol Biol 301 :893-904)、細胞表面展示(ffitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol，12 :395_399)、 如在細菌(Georgiou 等，1997，Nat Biotechnol 15 29-34 ；Georgiou 等，1993， Trends Biotechnol 11 6-10 ；Lee ，2000， Nat Biotechnol 18 645-648 Jun 等.,1998, Nat Biotechnol 16 :576_80)、酵母(Boder 和 Wittrup,2000, MethodsEnzymol 328 :430_44 ； Boder 和 Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15 :553_557)和哺乳動物細胞(Whitehorn 等.， 1995，Bio/technology 13 :1215_1219)上展示、以及體外展示技術(Amstutz 等·，2001， Curr Opin Biotechnol 12 :400_405)，如多核糖體展示(Mattheakis 等.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 :9022_9026)、核糖體展示(Hanes 等.，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94 :4937-4942)、mRNA 展示(Roberts 和 Szostak，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94 12297-12302 ；Nemoto 等·，1997，FEBS Lett 414 405-408)和核糖體失活展示系統(Zhou 等，2002，J Am Chem Soc 124,538-543)。其它可供本發明使用的選擇方法包括不限于展示的方法，諸如體內方法，包括但 不限于周質表達和細胞計數篩選(cytometric screening) (Chen等，2001，Nat Biotechnol 19 :537-542)、蛋白質片段互補測定(Johnsson 和 Varshavsky，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91 :10340-10344 ;Pelletier等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 12141-12146)和 在選擇模式中使用的(Visintin等，1999，Proc Natl Acad Sci USA 96 :11723_11728)酵母雙雜交篩選(Fields和Song，1989，Nature 340 :245_246)。在一個可選的實施方案中，可 通過在表達載體上結合有特定序列的融合伴侶使選擇能夠進行，因此能使該融合伴侶和相 關的Fc變體文庫成員與編碼它們的核酸共價或非共價連接。例如，USSN 09/642, 574 ；USSN 10/080，376 ；USSN 09/792，630 ；USSN 10/023，208 ；USSN 09/792，626；USSN 10/082，671 ； USSN 09/953,351 ；USSN 10/097, 100 ；USSN 60/366, 658 ；PCT WO 00/22906 ；PCT WO 01/49058 ；PCT WO 02/04852 ；PCT WO 02/04853 ；PCT WO 02/08023 ；PCT WO 01/28702 ；和 PCT W002/07466中描述了上述可供本發明使用的融合伴侶和技術。在一個可選的實施方案 中，如果諸如抗體或Fc融合體的包含Fc變體的多肽表達可賦予細胞一些生長、復制或生存 的優點，則可進行體內選擇。稱為“定向進化(directed evolution) ”方法的選擇方法的子集是在選擇過程 中包括有利序列雜交(mating)或傳代(breading)的那些，有時有新突變摻入。本領域 技術人員應當理解，定向進化方法能使在文庫中最有利序列的鑒定更容易，并能增加所篩 選的序列的多樣性。許多定向進化方法為本領域所公知，并可供本發明用于篩選Fc變 體文庫，包括但不限于DNA改組(PCT WO 00/42561 A3 ；PCT WO 01/70947 A3)、外顯子改 組(US 6，365，377 ；Kolkman 和 Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19 :423_428)、家族改組 (Crameri 等·，1998，Nature 391 :288_291 ；US 6，376，246)、RACHITT (Coco 等·，2001， Nat Biotechnol 19 :354_359 ；PCT WO 02/06469)、STEP 和隨機引發體外重組(Zhao 等·， 1998，Nat Biotechnol 16 :258_261 ；Shao 等.，1998，Nucleic AcidsRes 26 :681_683)、 核酸外切酶介導的基因裝配(US 6, 352, 842 ；US 6，361，974)、基因定位飽和誘變(Gene Site Saturation)Mutagenesis (US 6，358，709)、基因重裝配(Gene Reassembly ) (US 6，358，709)、SCRATCHY(Lutz 等.，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253)、 DNA 斷裂法(DNA fragmentation method) (Kikuchi 等.，Gene 236 :159-167)、單鏈 DNA 改組(Kikuchi等·，2000，Gene 243 133-137)以及AMEsystem 定向進化蛋白質工程技 術(應用分子進化)(US US 5, 824, 514 ；US 5, 817, 483 ；US 5, 814, 476 ；US 5，763，192 ； US5, 723，323)。在細胞、組織以及全生物體實驗中，包含本發明Fc變體的抗體和Fc融合體的生物 學特性可得到鑒定。本領域公知，藥物常在動物中測試，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、 貓、豬和猴子，以便測定藥物對疾病或疾病模型的處理的有效性，或測定藥物的藥物代謝動 力學、毒性以及其它特性。所述動物可稱為疾病模型。治療劑通常在小鼠中測試，包括但不 限于裸鼠、SCID小鼠、異種移植小鼠和轉基因小鼠(包括敲進和敲除)。例如，預計作為抗 癌治療劑的本發明的抗體或Fc融合體可在小鼠癌模型中測試，例如在異種移植小鼠中。在 該方法中，腫瘤或腫瘤細胞系移植或注射入小鼠，隨后該小鼠用治療劑處理以測定抗體或 Fc融合體減緩或抑制癌生長的能力。上述實驗方法可提供有意義的數據用于確定所述抗體 或Fc融合體用作為治療劑的可能性。任何生物體，優選哺乳動物，皆可用于測試。例如因 為猴子與人的遺傳相似性，所以它們可以是合適的治療模型，并因此可用于測試本發明抗 體和Fc融合體的有效性、毒性、藥物代謝動力學或其它特性。對于正式批準藥物而言，最終 必需在人類中測試本發明的抗體和Fc融合體，因此當然要考慮這些實驗。因此本發明的抗 體和Fc融合體可在人類中測試以確定它們的療效、毒性、藥物代謝動力學和/或其它臨床 特性。實施例提供如下實施例以舉例說明本發明。這些實施例無意將本發明限制于任何特定應 用或操作理論。對于所有討論于本發明中的位置而言，編號方式依照Kabat的EU標引方式(Kabat 等·，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版·，United States Public Health Svice, National Institutes of Health, Bethesda)。本領域技術人員應 當理解該慣例由免疫球蛋白序列的特定區域中非連續編號方式組成，能夠得到免疫球蛋白 家族保守位置的標準化參考。因此，通過EU標引方式規定的任何給定免疫球蛋白的位置 無需與其連續序列對應。圖3顯示了對于阿侖單抗抗體而言的連續的和EU標引的編號方 案，以便更清楚地闡明該主題。也應當指出在許多Fc位置上已觀察到多態性，包括但不限 于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此在本發明序列和科學文獻序列之間可能存在 微小差別。實施例1. Fc文庫的計算篩選和設計進行計算篩選計算以設計優化的Fc變體。在幾次計算/實驗循環中，對Fc變體 進行計算篩選、構建和實驗研究。對于每次連續循環而言，提供的實驗數據反饋入下一組計 算篩選計算和文庫設計中。所有的計算篩選計算和文庫設計呈現于實施例1中。對于每組 計算而言，提供了列出結果和提供有關信息和參數的表格。結合Fc γ Rs胞外域的Fc的幾種不同結構作為模板結構用于計算篩選計算。可 公開獲得的Fc/FcyR復合物結構包括pdb登記號1E4K(Sondermann等.，2000，Nature 406 267-273.),以及 pdb 登記號 IIIS 和 IIIX (Radaev 等·，2001，J Biol Chem 276 16469-16477)。Fc γ RIIIb和Fc γ RIIIa的胞外區具有96 %同一性，因此使用Fe/ Fc YRIIIb結構與使用Fc YRIIIa基本上等效。雖然如此，對于某些計算而言，通過在 IIIS和1Ε4Κ結構中對D129G突變模建(稱為D129G IIIS和D129G 1Ε4Κ模板結構)，構 建更精確的Fc/FcR y IIIa模板結構。此外，使用標準方法，可獲得的Fc γ R序列信息， 前述的Fc/FcyR結構，以及未結合復合物(pdb登記號1H9V) (Sondermann等.，2001， J Mol Biol 309 :737_749) (pdb 登記號 1FCG) (Maxwell 等·，1999，Nat Struct Biol 6 437-442)、Fc y RIIb (pdb 登記號 2FCB) (Sondermann 等.，1999，Embo J 18 1095-1103)和 Fc γ RIIIb (pdb 登記號 1 E4J) (Sondermann等.,2000, Nature 406 :267_273.)的結構信息， 對與人Fc y Rllb、人F158 Fc y RIIIa和小鼠Fc γ RIII胞外結構域結合的人Fc結構模建。通過圖像檢查前述Fc/Fc γ R和Fc γ R結構，并使用溶劑可接觸性信息及序列信 息，可變位置和在那些位置要被考慮的氨基酸得到選擇。對于確定在此處取代可提供激活 性和抑制性受體之間區別的親和力的可變位置而言，Fcs和Fc y Rs的序列信息是特別有用 的。事實上，對所有的C Y2位置都用計算方法進行篩選。Fc結構是兩條重鏈的同型二聚 體(在1IISUIIX和1E4K結構中標記的鏈A和B)，每條鏈包括鉸鏈和C γ 2-C γ 3結構域 (顯示于圖2)。因為Fc γ R(在1IIS、IIIX和1Ε4Κ結構中標記的鏈C)不對稱結合Fc同型 二聚體，所以在設計計算中通常分別考慮每條鏈。對于某些計算而言，鄰近可變位置殘基 的Fc和/或Fc γ R殘基是漂浮的，即在蛋白質設計計算中容許氨基酸構象改變，但不容許 氨基酸同一性改變，以供構象調整使用。在下表中列出了對每組計算相關的這些殘基。除非另有指示，所考慮的氨基酸通常屬于核內(Core)、核內XM (Core ΧΜ)、表面(Surface)、邊 界(Boundary)、邊界XM (Boundary ΧΜ)或所有20種分類的任一種。這些分類定義如下核 內(Core)=丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸； 核內XM(Core ΧΜ)=丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；表 面(Surface)=丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、 賴氨酸以及組氨酸；邊界(Boundary)=丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨 酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨 酸以及甲硫氨酸；邊界XM(Boundary ΧΜ)=邊界(Boundary)=丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天 冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、 苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；所有20種=所有20種天然存在的氨基酸。大多數計算依照兩種常規類型計算篩選方法之一進行。在一種方法中，在可變位 置氨基酸的構象表示為一組不受主鏈約束的側鏈旋轉異構體，其來自Dimbrack&Cohen的 旋轉異構體文庫(Dunbrack等.，1997，Protein Sci 6:1661-1681)。通過使用含有描述 范德華、溶劑化、靜電和氫鍵相互作用的項(term)的力場(force field)，以及使用死端消 除(Dead End Elimination) (DEE)算法所確定的最優(基態)序列，在所選可變位置計算 所考慮的氨基酸的所有可能組合的能量。本領域技術人員應當理解，由于主要在打分函數 (scoring function)中存在錯誤，外加蛋白質中細小的構象差異能導致明顯的穩定性差異 的事實，所以所預測的最低能量序列并不必然是真實的最低能量序列。但是，所預測的基態 序列可能接近真實的基態，因此通過評估序列的能量(所述序列在序列空間和圍繞所預測 基態的能量方面是接近的)，額外有利的多樣性可得到探查。為實現該目的并產生文庫序 列多樣性，蒙特卡羅(Monte Carlo) (MC)算法可用于評估在所預測基態附近的1000個相似 序列的能量。在序列中可變區位置由取代占據，這樣的序列在1000個序列的組中的數量值 可反映該取代是如何有利。該計算篩選方法基本上類似于Protein Design Automation (PDA )技術，描述于 US 6, 188, 965 ；US 6, 269, 312 ；US 6, 403, 312 ；USSN 09/782, 004 ； USSN 09/927，790 ；USSN 10/218，102；PCT WO 98/07254 ；PCT WO 01/40091 ；和 PCT WO 02/25588，為便于描述，在所有實施例中稱為PDA. 技術。列出這些計算結果的表格提供了 在所指定鏈上的每個可變位置(欄1)、在每個可變位置上所考慮的氨基酸(欄2)、在每個 可變位置上野生型(WT)Fc氨基酸同一性(欄3)、在DEE基態(ground state)序列中每個 可變位置上氨基酸同一性(欄4)、以及在蒙特卡羅輸出中觀察到的氨基酸組和相應的取代 占據(欄5)。其它計算方法利用了遺傳算法(GA)來篩選低能量序列，對于序列被采樣的那些， 在每輪“進化”過程中計算能量。可變和漂浮位置(floated position)的氨基酸構象表示 為一組側鏈旋轉異構體，所述側鏈旋轉異構體源自不受主鏈約束的旋轉異構體文庫，所述 文庫使用了柔性旋轉異構體模型(Mendes等.，1999，Proteins 37:530-543)。使用含有描 述范德華、溶劑化(solvation)、靜電和氫鍵相互作用的項的力場計算能量。該計算產生了 具有300個序列的列(list)，預測其應具有低能量。為便于結果分析和文庫產生，使用最近 令P居單鍵分級聚類算法(nearest neighbor single linkage hierarchical clustering algorithm)基于相似性分數將序列分為相關的組，所述300個輸出序列通過計算聚類分 為10組相似序列(Diamond，1995，Acta Cryst D51 127-135)。即，所有組內序列是最相似于同組內所有其它的序列，并較少相似于其它組中的序列。來自這些十個簇(cluster) 的每一個中的最低能量序列用來代表每組，并作為結果呈現。該計算篩選方法基本上類似 于 Sequence Prediction Algorithm (SPA )技術，描述于(Raha 等.，2000，Protein Sci 9:1106-1119) ；USSN 09/877，695 ；和USSN 10/071，859，為便于描述，在所有實施例中稱為 SPA 技術。應用計算篩選設計能量有利的相互作用，所述相互作用位于可變位置組的Fe/ FcyR界面，其介導或可能介導與Fc γ R的結合。因為所述結合界面包括了在兩條不同鏈上 的大量Fc殘基，并因為Fc γ Rs不對稱地結合Fe，所以殘基分為不同的相互作用可變位置 組，并設計為獨立的計算組。在許多情況下，選擇這些組作為將耦合的(coupled)殘基組， 即一種或多種殘基的能量取決于與一種或多種其它殘基的同一性。可使用不同的模板結 構，在許多情況下，計算研究了在兩條鏈上的取代。對于大多數可變位置組而言，使用所描 述的利用了 PDA @和SPA 技術的計算篩選方法進行計算。這些計算的結果和有關參數以 及信息列于如下表1-30。列出這些計算結果的表格提供了在所指定鏈上的每個可變位置(欄1)、在每個 可變位置上所考慮的氨基酸(欄2)、在每個可變位置上的野生型(WT)Fc氨基酸同一性 (欄3)、以及對于來自每個聚類組的最低能量序列而言在可變位置上的氨基酸同一性(欄 4-13)。表1-59分為兩組，標記如下，PDA 和SPA 技術。PDA 表的欄4顯示了在PDA 運行過程中每個殘基在上限1000個序列中的出現頻率。因此，在表1的第一行，在位置328 處，當使用邊界氨基酸作為該位置可變殘基組運行時，在上限1000個序列中L出現330次、 M出現302次等。此外，包括在本發明組合物范圍內的是在所列位置中具有任一所列氨基酸殘基的 抗體，所述抗體可單獨或以任意組合存在(注意優選的組合列于權利要求、說明書概述和 附圖中)。一個優選的組合是處于基態的所列位置中所列的氨基酸殘基(有時在本文中稱 為“全局解(global solution)”，以區別于野生型)。同樣地，表格之間的殘基位置和在那 些殘基位置上的特定氨基酸可進行組合。對于SPA 技術的表格而言，諸如表4、欄4是SPA 運行結果，其產生了在六個所 列位置具有六個所列氨基酸的蛋白質(例如，欄4是具有除239E、265G、267S、269Y、270T和 299S外的野生型序列的單一蛋白質)。因此，每一個這些單獨的蛋白質都包括在本發明范 圍內。此外，在表格內及表格間SPA 蛋白質之間的組合也包括在本發明范圍內。此外，每張表顯示了糖的存在或不存在，但明確包括的是相反序列；如表1列出了 非糖基化變體，但這些同樣的氨基酸改變可在糖基化變體上進行。而且，每張表列出了所使用的模板結構，以及“漂浮的”殘基，例如，表2使用了 PDA 運行漂浮的C120，C132和C134。表權利要求
一種包含Fc變體部分的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區中包含至少一種氨基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調節與FcγR的結合。
2.根據項1所述的抗體，其中所述調節是所述抗體對所述FcYR親和力的增加。
3.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置的位置包含至少一 種取代，所述人序列位置選自 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、 266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333 和 334 組成的 組。
4.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體在相應于人序列位置的位置包含至少一種取 代，所述人序列位置選自由 240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328 和 332 組成的組。
5.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體包含在位置332的取代。
6.根據項1所述的抗體，其中至少一種取代位于選自由239、264、297和330的位置， 附帶條件是如果所述序列基本上是人的，所述取代不是S239A、V264A、N297A、N297Q、A330D、 A330Q、A330K，或 A330S。
7.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、234E、 234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、 235I、235V、235F、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、 241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、262I、 262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、 264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、 267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、 297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、 325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327N、327L、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、 328I、328V、328T、328H、328A、329F、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332E、 332N、332Q、332T、332H、332Y 和 332A 組成的組。
8.根據項1所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、264I、241W、241L、 243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、 243L/264I、243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、 241E/243Q/262T/264E、241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、 328F、332E、328M/332E、244H、245A、247V、313F、244H/245A/247V、247G、264I/332E、 241E/243R/262E/264R/332E.241E/243Q/262T/264E/332E.241R/243Q/262T/264R/332E, 241E/243Y/262T/264R/332E、298A/332E、239EI332E、239Q/332E、239E、265G、265N、 239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、327L、 329F、330L、330Y、332D、297S、297D、297S/332E、297D/332E、297E/332E、265Y/297D/332E、 265Y/297D/299L/332E、265F/297E/332E、328I/332E、328Q/332E、332N、332Q、264T、264F、 240I、263I、266I、299A、299S、299V、325Q、325L、325I、239D、239N、239F、239D/332D、 239D/332E、239D/332N、239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、 239N/332E、239N/332N、239NI332Q、239Q/332D、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、 241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、 235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、239T、239H、239Y、240A、240T、240M、263A、 263T、263M、264M、264Y、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、 298H、299H、330V、330I、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325T、325V、325H、328D/332E、 328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328V/332E、328T/332E、328H/332E、328I/332E、328A、 332T、332H、332Y、332A、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、 239E/264I/298A/330Y/332E,239D/297D/332E,239E/297D/332E,239D/265V/297D/332E, 239D/265I/297D/332E、239D/265L/297D/332E、239D/265F/297D/332E、 239D/265Y/297D/332E,239D/265H/297D/332E,239D/265T/297D/332E,264E/297D/332E, 296D/297D/332E,296E/297D/332E,296N/297D/332E,296Q/297D/332E,296H/297D/332E, 296T/297D/332E,297D/299V/332E,297D/299I/332E,297D/299L/332E,297D/299F/332E, 297D/299H/332E、297D/299E/332E、297D/330Y/332E、297D/298A/330YI332E、 239D/330Y/332E、239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、 239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E 禾口 239D/264I/330L/332E 組成的組。
9.根據項7所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應于人序列位置組成的組的位置， 進一步包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、329、 331、333、334和339組成的組。
10.根據項1所述的抗體，其中所述
全文摘要
本發明涉及優化的Fc變體、產生它們的方法、以及包含優化的Fc變體的抗體和Fc融合體。
文檔編號C07K16/28GK101987871SQ20101027126
公開日2011年3月23日 申請日期2003年9月26日 優先權日2002年9月27日
發明者黨偉, 奧米德·韋法, 希爾·B·卡基, 斯蒂芬·K·多伯斯坦, 格雷戈里·A·拉扎爾, 約翰·R·德斯賈萊斯, 羅伯特·J·海斯, 阿瑟·J·奇里諾 申請人:贊科股份有限公司