專利名稱：腦苷脂的制備、純化及含量檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種鞘脂類化合物的制備方法，尤其涉及一種腦苷脂的制備及純化方法，本發明還涉及一種檢測腦苷脂含量的方法，屬于腦苷脂的制備領域。
背景技術：
腦苷脂是一種糖基鞘脂類化合物(又名cerebroside或glycoceramide)，主要存在于哺乳動物的腦組織、表皮，以及心臟、肝臟、紅細胞的膜組織中；在一些大型真菌和高等植物以及一些海洋生物(海盤車、海星等)中也有分布。其結構特征是由神經酰胺和糖兩部分組成，神經酰胺是由長鏈脂肪酸中的羧基與神經鞘氨醇(又稱長鏈堿)的氨基經脫水以酰氨鍵相連形成的一類酰胺類化合物。神經酰胺通過C-I位上羥基與已糖通過β-糖苷鍵連接而成腦苷脂。存在于真菌、陸生植物、海洋生物中的腦苷脂類基本上只含有1個糖基且糖的種類較為固定，多為葡萄糖、半乳糖或氨基糖。葡萄糖腦苷脂的結構式如下圖所示腦苷脂據報道其具有調控細胞生長，抗腫瘤、調節免疫、心血管保護、肝保護、 保濕、等功能(Pharmacol Res 2003 ；47 (5) :383-392, Fitoterapia 2007;78:490-495， Vaccine 2008 ；26(15) :1807-1816,J Ethnopharmacol 2001 ；77(1) :129-131,JAgric Food Chem, 2002, 50 (5) :1150-1160)越來越廣泛地應用于醫藥、食品和化妝品領域中，可用于抗衰老、抗腫瘤、調節免疫功能藥物的研究，化妝品的開發等。目前應用的腦苷脂多為天然提取物，取自豬皮、牛腦、雞蛋、血細胞、植物(如小麥)和酵母細胞等，但產量低，工業提取價值不高，這些因素導致了腦苷脂的價格高昂。因此尋找一種適合大規模工業化生產腦苷脂的技術和方法，成為腦苷脂研發的重中之重。塊菌(truffle)在生物分類學上屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、塊菌目 (Tuberales)、塊菌科(Tuberaceae)、塊菌屬(Tuber)。常見的塊菌有黑孢塊菌(Tuber melanosporum)、夏塊菌(Tuber aestivum)、白塊菌(Tuber magnatum)、￡口度塊菌(Tuber indicum)和中國塊菌(Tuber sinense)。目前，市場上的塊菌主要來源于野生及半人工模擬栽培。野生的塊菌資源相當有限，而且地域局限性和生長環境要求苛刻。半人工模擬栽培塊菌，從接種到形成子實體需要7-9年，而且人工栽培過程的質量無法控制。物以稀為貴，素有“黑色鉆石”之稱的黑孢塊菌在國際市場上價格高達1000多美元每公斤。高錦明等曾對印度塊菌子實體的活性成分進行分析鑒定，首次分離得到4個新的神經酰胺類化合物(未命名)(Chin Chem Lett 2002 ； 13 (4) :325-326, Chem Phys Lipids 2004 ；131 :205-213)。總之，目前腦苷脂的制備方法普遍存在規模小、產量低、成本高等一系列問題，有待改進，開發出一種廉價易行、可規模化工業生產的腦苷脂的制備方法將具有廣闊的應用前景。
發明內容
本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術所存在的規模小、產量低、成本高等不足，提供一種新的腦苷脂的制備方法，該方法切實可行、操作簡單、周期短、質量可控、無毒性、成本低、易規模化工業生產。本發明首先所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種腦苷脂的制備方法，包括將塊菌屬(Tuber)菌株進行生物發酵，得到含有腦苷脂的菌絲體。所述的塊菌屬(Tuber)優選為中國塊菌(Tuber sinense)、印度塊菌(Tuber indium)、黑抱塊菌(Tuber melanosporum)、白塊菌(Tuber magnatum)或夏塊菌(Tuber aestivum)；這些塊菌屬菌株都可從商業途徑購買得到。其中，所述的生物發酵依次包括以下步驟斜面菌種培養、一級液體種子培養、二級液體種子培養、液體發酵；其中所述的液體發酵包括搖瓶或生物反應器規模的發酵過程。上述各個步驟中所用到的培養基和培養條件可以是塊菌屬(Tuber)菌株在進行液體發酵時所常用的培養基和培養條件。作為參考，所述的培養基和培養條件分別如下(1)斜面菌種培養培養基葡萄糖10-500克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1_40克/升、 瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液1. 0升；培養條件培養溫度為15_40°C。(2) 一級液體種子培養培養基葡萄糖10-500克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1_100克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升、PH值2-9 ；培養條件培養溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘。(3) 二級液體種子培養培養基葡萄糖10-500克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1_100克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升；PH值2-9 ；培養條件培養溫度15_40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘；(4)液體發酵培養基蔴糖10-1000克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1-100克/升，硫酸鎂 0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升、pH值2-9 ；搖瓶中的發酵條件發酵溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘；生物反應器中的發酵條件發酵溫度為15_40°C、pH值2-9、攪拌轉速為50-1500 轉/分鐘、通氣速率為0.01-100升/分鐘。為了使微生物發酵朝著更有利于腦苷脂生物合成的方向發展，本發明以黑孢塊菌作為上述各個菌株的代表，對其各個階段的培養基和培養條件進行了優化，最終發現，當各個培養階段分別采用以下培養基和培養條件時，相比于其它的培養基和培養條件，發酵產物中腦苷脂的含量有了明顯的提高一、斜面菌種培養培養基葡萄糖20克/升、硫酸鎂2克/升、磷酸二氫鉀2克/升、瓊脂20克/升、 馬鈴薯提取液ι. O升；培養條件培養溫度為30°C。二、一級液體種子培養一級液體種子的培養基的組成優選為葡萄糖100-500克/升、蛋白胨30-100克/ 升、酵母膏30-100克/升、硫酸鎂10-40克/升、磷酸二氫鉀20-40克/升；pH值為7. 0-9. 0 ； 更優選的，一級液體種子的培養基的組成為葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏 60克/升、硫酸鎂20克/升、磷酸二氫鉀30克/升；pH值為8. 0 ；培養條件優選為培養溫度35_40°C，搖床轉速為200-300轉/分鐘；更優選為培養溫度35 °C，搖床轉速為250轉/分鐘；三、二級液體種子培養培養基組成優選為葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸鎂1克/升、磷酸二氫鉀2克/升；pH值為5. 5 ；培養條件優選為培養溫度30°C，搖床轉速為150轉/分鐘。四、液體發酵(一 )搖瓶規模(1)培養基組成蔴糖100-400克/升、蛋白胨20-40克/升、酵母膏30-50克/ 升、硫酸鎂2-10克/升、磷酸二氫鉀2-10克/升；pH值為6-7 ；更優選的，培養基的組成為 蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升、硫酸鎂2克/升、磷酸二氫鉀2克/ 升；PH值為7 ；(2)發酵條件發酵溫度30-35°C，搖床轉速為150-200轉/分鐘；更優選的，發酵溫度30°C，搖床轉速為150轉/分鐘。( 二)生物反應器規模(1)培養基組成蔴糖100克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、硫酸鎂10 克/升、磷酸二氫鉀10克/升；PH值為7 ；發酵條件發酵溫度30°C，搖床轉速為600轉/ 分鐘，通氣速率為50升/分鐘。塊菌作為一種高等真菌具有可培養性，通過控制培養條件，塊菌的菌絲體能夠在營養成份豐富的培養基迅速生長。因此，采用發酵的方法，利用廉價的培養基在搖瓶和生物反應器中培養塊菌菌絲體，具有周期短、成本低、操作簡單、易培養、能夠按照需求人為的控制原料供應量等眾多優勢。本發明利用微生物代謝工程的原理，可以有針對性地對塊菌菌絲體的生長進行代謝調控，使發酵朝著有利于腦苷脂生成的方向發展。上述制備方法中還可包括從含有腦苷脂的菌絲體中分離純化出腦苷脂的方法，包括以下步驟(1)將生物轉化基質離心，收集發酵菌絲體沉淀；菌絲體真空干燥；備用；( 制備發酵菌絲體待分離純化樣品；C3)使用硅膠柱層析和凝膠柱層析進行分離純化，即得。優選的，步驟( 所述菌絲體待分離純化樣品的制備方法，包括將菌絲體蒸餾回流提取，用有機溶劑富集蒸餾液中的活性成分，得菌絲體待分離純化樣品；優選的，步驟(3)中所述硅膠柱層析為正相硅膠柱層析或反相硅膠柱層析；正相硅膠以中極性有機溶劑拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；反相硅膠以甲醇拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；更優選的，步驟(3)中將待分離純化的樣品以洗脫液溶解，采用硅膠柱層析吸附，然后用洗脫液洗脫，收集洗脫液，將樣品揮干并重結晶；將凝膠以二氯甲烷-甲醇浸泡，將處理好的凝膠裝柱，以二氯甲烷-甲醇平衡；將經硅膠柱層析初步分離后的樣品溶于二氯甲烷-甲醇中，進行上樣吸附，然后用二氯甲烷-甲醇洗脫，收集洗脫液，將樣品中溶劑揮干并重結晶，即得。本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種從上述發酵菌絲體中檢測腦苷脂含量的方法。本發明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現的一種從上述發酵菌絲體中檢測腦苷脂含量的方法，包括(1)收集樣品將發酵產物離心，收集菌絲體沉淀；(2)制備待測樣品將菌絲體蒸餾回流提取，用有機溶劑富集蒸餾液中的活性成分，得菌絲體待測樣
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m ；(3)檢測待測樣品使用液相色譜-紫外檢測器或二極管陣列檢測器或熒光檢測器或電化學檢測器或蒸發光檢測器或示差折光檢測器或質譜檢測器檢測，色譜柱為高效反相液相色譜住或高效正相液相色譜柱或^novation高效液相色譜柱；通過對比相同色譜條件下腦苷脂對照品出峰時間和離子碎片信息對樣品中腦苷脂進行定性，通過內標法或外標法對待測樣品中腦苷脂的含量進行定量。優選的，步驟(1)中將發酵產物在8000-15000轉/分鐘的轉速下離心；優選的，步驟O)中所述的菌絲體待測樣品優選按照以下步驟制備將菌絲體進行回流提取，控制溫度在30-100°C ；用氯仿-甲醇有機溶劑富集活性成分，得菌絲體待測樣
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m ；步驟(3)中所述的檢測優選按照以下條件進行色譜柱溫度為0-80°C ；進樣方式為分流或不分流方式，體積1-20微升，流速0. 2-2毫升/分鐘；紫外檢測器的檢測波長為 200-400nm ；質譜所采用的電離方式為ESI電離，掃描離子質荷比范圍為300-900，特征碎片離子質荷比分別為815、744、754。按照上述方法對本發明所制備的發酵液或菌絲體中的腦苷脂含量進行檢測，其結果為菌絲體(干重計)中三種腦苷脂總量達到0. 01-30毫克/100毫克菌絲體。當然，上述檢測方法中，供試樣品可用其他的預處理方法進行處理，如對樣品衍生化等；對供試樣品進行分析時，也可采用其它的檢測方法，如用氣相色譜-碳同位素燃燒質譜聯用、氣相色譜-電子捕獲檢測器聯用、液相色譜-質譜聯用、液相色譜-熒光檢測器聯用等。本發明采用塊菌液體發酵方法生產腦苷脂至少從兩方面解決了腦苷脂產業化的難題。一是，液體發酵技術應用于塊菌，從根本上解決了現有塊菌資源稀缺。二是，液體發酵技術屬于綠色技術，避免了化學合成導致有機殘留、規模小、產量低、成本高等不利因素。 同時作為一種綠色安全的大規模生產方式有著無可比擬的巨大優勢，利用塊菌發酵法生產腦苷脂具有成本低、周期短、操作簡單、易培養、質量可控、分離過程簡單等優勢。本發明方法在很大程度給腦苷脂的大規模工業化生產提供了一種新思路，改換了現有的腦苷脂生產模式。
圖1塊菌發酵菌絲體中所得到的三種腦苷脂的結構式。圖2用于制備本發明菌絲體待測樣品的回流提取裝置。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。試驗材料1、±夬菌菌種中國塊菌(Tuber sinense)、印度塊菌(Tuber indium)、黑孢塊菌 (Tuber melanosporum)、白塊菌(Tuber magnatum)、夏塊菌(Tuber aestivum)，均從四川省綿陽市食用菌研究所購買得到，其商品名稱分別為“中國塊菌”、“印度塊菌”、“黑孢塊菌”、 “白塊菌”和“夏塊菌”。實施例1采用的菌種黑孢塊菌(Tuber melanosporum)1、第一階段制備含有腦苷脂的塊菌菌絲體1)、斜面菌種培養本實施例中所采用的斜面菌種培養基配方為葡萄糖20克/ 升、硫酸鎂2克/升、磷酸二氫鉀2克/升、瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液1. 0升；滅菌條件為121°C、20分鐘。培養溫度為30°C，培養時間為7天；2)、一級液體種子培養培養基配方為葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏60克/升、硫酸鎂20克/升、磷酸二氫鉀30克/升；pH值為8. 0 ； (2)培養條件培養溫度35°C，搖床轉速為250轉/分鐘；將斜面菌種轉接入裝有一級液體種子培養基的搖瓶中即可進行一級液體種子培養。培養溫度30°C，搖床轉速為150轉/分鐘，培養時間為7天；3)、二級液體種子培養培養基配方為葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏 10克/升、硫酸鎂1克/升、磷酸二氫鉀2克/升；PH值為7 ；培養條件培養溫度30°C，搖床轉速為150轉/分鐘，培養時間為3天；4)、搖瓶中的液體發酵培養基的配方為蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升，硫酸鎂2克/升、磷酸二氫鉀2克/升、pH值7. 0 ；發酵溫度為30°C，搖床轉速為150轉/分鐘。接種量按體積比計為10%，裝液量為每500毫升搖瓶裝200毫升液體。2、塊菌菌絲體中腦苷脂的分離純化1)、制備待分離樣品取步驟1所得塊菌菌絲體置于60°C烘箱中4天，待菌絲體完全干燥后以粉碎機粉碎至粉末狀樣品，取1000克該樣品于2升的圓底燒瓶中并加入少量碎瓷片，加入氯仿-甲醇(85/15，ν/ν) 1升，圓底燒瓶上端連接回流提取器，提取器上端連接冷凝管冷水回流(圖幻。加熱至沸騰保持2小時后結束為一次，共回流提取三次。將經過過濾后的氯仿-甲醇旋轉蒸發，并對樣品進行真空干燥，保存于4°C的冰箱中作為菌絲體供分尚樣品。2)分離純化腦苷脂依次使用硅膠柱層析和凝膠柱層析分離純化。A)用正相硅膠柱(正相硅膠中國青島海洋化工有限公司，HG/T23M-92 ；分離系統瑞士步琪等度快速色譜系統色譜柱瑞士步琪玻璃柱C-690，長460毫米，內徑15毫米)或者相似極性柱分離；氯仿甲醇(85 15)系統作為洗脫液，流速恒流1.0毫升/分鐘；每2毫升洗脫液作為一個餾分進行收集。用正相硅膠薄層(德國莫克高效硅膠薄層) 或相似極性薄層檢視各餾分；氯仿甲醇(85 15)系統作為展開劑，將Rf值0.3的餾分進行合并；將合并后的樣品真空干燥，避光條件下保存于4°C的冰箱中作為供純化樣品。B)用凝膠柱層析(凝膠S印hadex LH-20 ；分離柱玻璃柱，長480毫米，內徑30 毫米)分離；將處理好的kphadex LH-20凝膠濕法裝柱，以二氯甲烷甲醇G 6)平衡。 將待純化樣品以溶于5毫升二氯甲烷甲醇G 6)中，以0.5毫升/分鐘的流速上樣吸附，然后用400毫升二氯甲烷甲醇G 6)以0.5毫升/分鐘的流速洗脫，每10毫升洗脫液收集1瓶，用正相硅膠薄層(德國莫克高效硅膠薄層)或相似極性薄層檢視各餾分；氯仿甲醇(85 15)系統作為展開劑，將Rf值0.3的餾分進行合并；將合并后的樣品真空干燥并以氯仿重結晶，避光條件下保存于4°C的冰箱中作為供鑒定樣品。3、腦苷脂含量的測定1)、制備待分離樣品取步驟1所得塊菌菌絲體置于60°C烘箱中4天，待菌絲體完全干燥后以粉碎機粉碎至粉末狀樣品，取100毫克該樣品于50毫升的圓底燒瓶中并加入少量碎瓷片，加入氯仿-甲醇(85/15，ν/ν) 20毫升，圓底燒瓶上端連接回流提取器，提取器上端連接冷凝管冷水回流(圖幻。加熱至沸騰保持2小時。將經過過濾后的氯仿-甲醇旋轉蒸發，并對樣品進行真空干燥，取10毫升甲醇進行復溶，保存于4°C的冰箱中作為菌絲體供分析樣品。2)、供試樣品用液相色譜進行檢測進樣量20微升，用反相高效色譜柱(Venusil XBP, 4. 6 X 250mm, 5 μ m)或者相似極性柱分離；紫外檢測波長210納米；甲醇系統作為流動相，流速恒流1毫升/分鐘；色譜柱溫度40°C。根據與同樣條件下腦苷脂對照品的出峰時間確定腦苷脂后，根據兩者的峰面積比與濃度比，通過外標法得出原菌絲體中腦苷脂的濃度。3)、檢測結果實施例1所制備的菌絲體中，腦苷脂產量為120. 6毫克/升。實施例2將中國塊菌(Tuber sinense)、印度塊菌(Tuber indium)、黑孢塊菌(Tuber melanosporum)、白塊菌(Tuber magnatum)禾口夏塊菌(Tuber aestivum)分別在不同規模下進行液體發酵。發酵培養基成分及培養條件見表1。斜面菌種培養，一級液體種子培養和二級液體種子培養同實施例1。腦苷脂含量的檢測方法同實施例1。所得塊菌發酵液及菌絲體中腦苷脂的產量見表2所示。表1.不同發酵規模的培養基成分及培養條件
權利要求
1.一種制備腦苷脂的方法，其特征在于將塊菌屬(Tuber)菌株進行生物發酵，得到含有腦苷脂的菌絲體。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述的塊菌屬選自中國塊菌(Tuber sinense)、度塊菌(Tuber indium)、漂抱塊菌(Tuber melanosporum)、白塊菌(Tuber magna turn)或夏塊菌(Tuber aestivum)。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物發酵方法依次包括以下步驟 斜面菌種培養、一級液體種子培養、二級液體種子培養和液體發酵。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的斜面菌種培養的培養基和培養條件分別為(1)斜面菌種培養基組成葡萄糖10-500克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升、瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液1. 0升；優選的，所述斜面菌種培養基的組成為葡萄糖20克/升、硫酸鎂2克/升、磷酸二氫鉀2克/升、瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液1. 0升；⑵培養條件培養溫度為15-40°C，優選為30°C。
5.按照權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的一級液體種子培養的培養基組成和培養條件分別為(1)培養基組成葡萄糖10-500克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏 1-100克/升，硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升；pH值2_9 ；優選的，所述培養基組成為葡萄糖100-500克/升、蛋白胨30-100克/升、酵母膏30-100克/升、硫酸鎂 10-40克/升、磷酸二氫鉀20-40克/升；pH值為7. 0-9. 0 ；更優選的，所述培養基的組成為 葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏60克/升、硫酸鎂20克/升、磷酸二氫鉀30 克/升；PH值為8. 0 ； (2)培養條件培養溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘；優選為培養溫度35-40°C，搖床轉速為200-300轉/分鐘；更優選為培養溫度35°C，搖床轉速為250轉/分鐘。
6.按照權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的二級液體種子培養的培養基和培養條件為(1)培養基組成葡萄糖10-500克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1-100克 /升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升；PH值2-9 ；優選的，培養基組成為葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸鎂1克/升、磷酸二氫鉀2克/ 升；PH值為5. 5 ； (2)培養條件培養溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘；優選為 培養溫度30°C，搖床轉速為150轉/分鐘。
7.按照權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液體發酵的培養基組成和發酵條件為(一)搖瓶規模(1)培養基組成蔗糖100-400克/升、蛋白胨20-40克/升、酵母膏30-50克/升、硫酸鎂2-10克/升、磷酸二氫鉀2-10克/升；pH值為6-7 ；(2)搖瓶中的發酵條件發酵溫度30-35°C，搖床轉速為150-200轉/分鐘；優選的培養基組成和培養條件為培養基蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升、硫酸鎂2克/升、磷酸二氫鉀2克/升；pH值為7 ；培養條件發酵溫度30°C，搖床轉速為150 轉/分鐘；(二)生物反應器規模(1)培養基組成蔴糖100克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、硫酸鎂10克 /升、磷酸二氫鉀10克/升，PH值為7 ； (2)發酵條件發酵溫度30°C，攪拌轉速為600轉/分鐘，通氣速率為50升/分鐘。
8.由權利要求1-7任何一項方法所制備得到的含有腦苷脂的菌絲體。
9.從權利要求8所述的產物中分離純化腦苷脂的方法，其特征在于，包括(1)將生物轉化產物離心，收集發酵菌絲體沉淀；菌絲體真空干燥；備用；( 制備發酵菌絲體待分離純化樣品；C3)使用硅膠柱層析和凝膠柱層析等進行分離純化，即得。
10.按照權利要求9所述的方法，其特征在于步驟(1)中將發酵產物在8000-15000轉/分鐘的轉速下離心； 步驟( 所述菌絲體待分離純化樣品的制備方法，包括將菌絲體蒸餾回流提取，用有機溶劑富集蒸餾液中的活性成分，得菌絲體待分離純化樣品；步驟(3)中所述硅膠柱層析為正相硅膠柱層析或凝膠柱層析；正相硅膠以中極性有機溶劑拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；凝膠以二氯甲烷-甲醇拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；優選的，步驟(3)中將待分離純化的樣品以洗脫液溶解，采用硅膠柱層析吸附，然后用洗脫液洗脫，收集洗脫液，將樣品揮干并重結晶；以體積比為85 15的氯仿甲醇系統作為洗脫液； 將凝膠以二氯甲烷-甲醇浸泡，將處理好的凝膠裝柱，以甲醇平衡；將經硅膠柱層析初步分離后的樣品溶于二氯甲烷-甲醇中，進行上樣吸附，然后用二氯甲烷-甲醇洗脫，收集洗脫液，將樣品中溶劑揮干并重結晶，即得。
11.檢測權利要求8所述菌絲體中腦苷脂含量的方法，包括(1)收集樣品將發酵產物離心，收集菌絲體沉淀；(2)制備待測樣品將菌絲體蒸餾回流提取，用有機溶劑富集蒸餾液中的活性成分，得菌絲體待測樣品；(3)檢測待測樣品使用液相色譜-紫外檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、蒸發光檢測器、示差折光檢測器或質譜檢測器檢測，色譜柱為高效反相液相色譜住、高效正相液相色譜柱或^novation高效液相色譜柱；通過對比相同色譜條件下腦苷脂對照品出峰時間和離子碎片信息對樣品中腦苷脂進行定性，通過內標法或外標法對待測樣品中腦苷脂的含量進行定量。
12.按照權利要求11的方法，其特征在于步驟(1)中將發酵產物在8000-15000轉/分鐘的轉速下離心； 步驟O)中所述的菌絲體待測樣品按照以下步驟制備將菌絲體進行蒸餾回流提取， 控制溫度在30-150攝氏度；用氯仿-甲醇富集蒸餾液中的中極性成分，得菌絲體待測樣Pm ；步驟(3)中所述的檢測按照以下條件進行色譜柱溫度為0-80°C ；進樣方式為分流或不分流方式，體積1-20微升，流速0. 2-2毫升/分鐘；紫外檢測器的檢測波長為200-660nm ； 質譜所采用的電離方式為ESI電離，掃描離子質荷比范圍為300-900，特征碎片離子質荷比分別為815、744、7M ；核磁共振譜用核磁共振儀測定，TMS為內標，氘代甲醇和氘代氯仿為溶劑，質譜數據以離子阱質譜儀測定。
全文摘要
本發明公開了一種腦苷脂的制備、純化及含量檢測方法，屬于腦苷脂的制備領域。本發明所述腦苷脂的制備方法包括將塊菌屬(Tuber)菌株進行生物發酵，得到含有腦苷脂的菌絲體。本發明對液體發酵中各步驟中的培養基的組成和培養條件進行了優化和篩選，最大限度的提高了腦苷脂的產率。本發明還公開了一種從上述菌絲體中分離純化腦苷脂及其含量檢測的方法。本發明利用塊菌液體發酵生產腦苷脂與現有的腦苷脂生產方法相比，具有成本低、周期短、操作簡單、質量可控、分離過程簡單等優點。
文檔編號C07H15/10GK102382866SQ201010268280
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者李園園, 湯亞杰 申請人:湖北工業大學