專利名稱：菲律賓蛤仔酶解多肽及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種菲律賓蛤仔酶解多肽，本發明還涉及該多肽的分離方法。
背景技術：
菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)，隸屬于軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱 (Bivalvia)、簾蛤科(Veneridae)的海洋生物，俗稱花蛤，是我國四大養殖貝類之一。花蛤肉組織蛋白含量高，脂肪含量低，并含有豐富的維生素和微量元素，具有良好的營養保健功能。中醫認為，蛤肉有滋陰明目、軟堅化痰之功效。近代研究證明，菲律賓蛤仔提取物具有提高免疫力、抑制細胞微核形成、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗菌等作用[1_6]。大量研究已證實，機體代謝所產生的超氧化物陰離子(02_)、過氧化氫(H2O2)、過氧化自由基(ROO)和羥自由基(-0H)等自由基可以造成細胞膜、DNA和蛋白活性的損傷，并與動脈硬化、腦卒中、阿爾茨海默病、肥胖、白內障以及肝臟疾病等多種人類疾病相關[7_11]。因此，近些年來，對于抗氧化活性物質的分離提取及作用機理成為研究熱點。飲食中的蛋白質在腸道主要以多肽和氨基酸形式被吸收，其中多肽在機體抗氧化過程中起著重要的作用[1°]。截止目前，利用酶解方法從陸地生物蛋白中獲取了大量的抗氧化活性肽，而對于酶解海洋生物蛋白得到抗氧化多肽的報道相對較少，其中，對菲律賓蛤仔肉蛋白進行酶解提取抗氧化多肽的研究尚為見報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述的技術現狀而提供一種抗氧化活性高的菲律賓蛤仔酶解多肽。本發明所要解決的又一個技術問題是提供一種抗氧化活性高的菲律賓蛤仔酶解多肽制備方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種菲律賓蛤仔酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Trp Pro His。—種如上述的菲律賓蛤仔酶解多肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟①取菲律賓蛤仔的均漿液加水稀釋后用胰蛋白酶進行酶解，酶解后離心、過濾，取上層酶解液；②將上層酶解液經過超濾膜，截取3KDa分子量以下的酶解液，用 DEAEkpharoseFF陰離子交換柱進行洗脫，出現前、后兩個肽峰，分別用磷酸緩沖液和 0. lmol/L的NaCL進行洗脫，并分別進行收集；③對前肽峰經反相高效液相色譜，出現一主峰，并對該主峰進行收集，然后收集的樣品進行氨基酸序列檢測，確認為Asp Trp Pro His。作為優選，步驟①中所述的胰蛋白酶pH值為7. 8，酶解問題為37°C，酶解時間為M 小時，90°C滅酶15分鐘，4°C下離心。
作為優選，步驟②中所述陰離子交換柱的柱型為2. 6X 50cm，上樣體積為3mL，洗脫速度為lml/min，用220nm進行紫外檢測。作為優選，步驟③中的所述反相高效液相色譜的色譜條件為C18反相柱，填料 ODS ；柱型10 X 250mm ；乙腈/水為流動相，流速為0. 8ml/min，上樣體積為20 μ L，檢測波長 220nm。與現有技術相比，本發明的優點在于菲律賓蛤仔酶解多肽抗氧化性高，具體表現在羥自由基清除率、DPPH自由基和還原力均可高于VitC，經過超濾、陰離子交換、及反相高效液相色譜純化，可分離出目標活性肽，工藝簡單可靠。
圖1為各種蛋白酶對每克菲律賓蛤仔后可得到氨基氮值的柱狀圖。圖2為各種酶解物對羥自由基清除率的柱狀圖。圖3為DEAE SepharoseFF柱洗脫后的峰值圖。圖4為RT-HPLC洗脫后的峰值圖。圖5為目標肽羥自由基清除率坐標圖。圖6為目標肽DPPH自由基清除能力坐標圖。圖7為目標肽還原力測定器吸光值坐標圖。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。酶解工藝流程取-20°C冷藏的菲律賓蛤仔肉組織放入30°C水浴鍋中解凍，勻菜，將勻漿液加3倍體積蒸餾水，木瓜白酶pH為5，溫度為50°C，加酶量為1200u/g ；胰蛋白酶pH為7. 8，溫度為37°C，加酶量為1200u/g ；胃蛋白酶pH為2. 4，溫度為37°C，加酶量為1200u/g ；堿性蛋白酶PH為8. 5，溫度為45°C，加酶量為1200u/g ；分別保溫酶解Mi，90°C滅酶15min，4°C下 8500r/min離心15min，取上清液。水解度測定水解度的測定參照趙新淮等方法(趙志淮，馮志彪.蛋白質水解物水解度的測定 [J].食品科學，1994，179(11) :65-67.)，并稍作修改。取20ml酶解溶液置于燒杯中，加水 60mL,開動磁力攪拌器，用0. 05mol/L氫氧化鈉標準液滴定至pH為8. 2。加入IOmL甲醛溶液混勻，再用0. 05mol/L氫氧化鈉溶液繼續滴定至pH為9. 2，記下消耗氫氧化鈉標準的毫升數，同時取水80mL做試劑空白試驗。按下列公式計算氨基氮(ANN)含量，氨基氮含量與水解度成正相關。X= (V1-V2) X CX0. 014X100 (5 X V)式中，X為樣品中氨基氮的含量(g/100mL) ；Vl為測定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標準液(HiL) ；V2為試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準溶液的體積 (mL)；V為樣品液取用量(mL) ；C為氫氧化鈉標準液的濃度(mol/L) ；0. 014為氮的毫摩爾質量(g/mmoL)。
抗氧化活性的測定羥自由基清除率的測定參考金鳴等所述方法(金鳴，蔡亞欣，李金榮，等.鄰二氮菲_Fe2+氧化法檢測 H202/Fe2+產生的羥自由基[J].生物化學與生物物理進展，1996，23 (6) :553-555.)，并做適當調整。取濃度為0. 75mmol/L鄰二氮菲ImL于試管于，依次加入pH值為7. 4的磷酸緩沖液2mL，樣品液lmL，充分混勻，然后加入濃度為0. 75mol/L的硫酸亞鐵lmL，混勻， 加入0. 12% H2021mL，37°C水浴90min，于536nm處測其吸光度，為As ；用ImL蒸餾水代替 lmLH202,為Ab ；用ImL蒸餾水代替ImL樣品液，為Ap。清除率(%) = (As-Ap)/(Ab-Ap) X 100%還原力的測定參照 Oyaizu 方法(Song LY, Li TF, Yu RM, et al. Antioxidant activities of hydrolysates of Area subcrenata prepared with three proteases[J]. Mar Drugs, 2008,6(4) =607-619.)并略有改動。取樣品溶液2mL加入到2mL0. 2mol/L(PH6. 6)磷酸鹽緩沖液和2mL 1 %的鐵氰化鉀中充分混合，50°C保溫20min后加入2mL10%的三氯乙酸混合， 取aiiL，加入2mL蒸餾水和0. 4mL0. 1 %的三氯化鐵，反應IOmin后，在700nm處測定吸光值， 吸光值高表明還原力高。同時測定不同濃度Vit C的還原力作為對比。DPPH自由基清除能力的測定取樣品液2mL及lX10-4mol/L DPPH溶液2mL加入一具塞試管中搖勻，在室溫下閉光反應30min，用純溶劑作參比，于517nm波長下測定吸光度。根據下列公式計算清除率清除率=[I-(AS-ASB)/AC] X 100%其中AS為加樣品液后DPPH溶液的吸光度；ASB為樣品液的吸光度；ASB為未加樣品液時DPPH溶液的吸光度。測定抗氧化劑Vit C對DPPH自由基的清除率作為對比。抗氧化多肽的制備酶解物按分子量大小分級分離取400g花蛤肉經胰蛋白酶酶解，離心后取上清液，使用超濾杯及截取分子量分別為3KDa和5KDa的超濾膜，在20°C環境中將上清液分別超濾llh，截取獲得3KDa以下、3 5KDa和5KDa以上分子量的酶解液，冷凍干燥后分別測抗氧化活性。DEAE SepharoseFF 陰離子交換對抗氧化活性最強的組分用DEAE SepharoseFF陰離子交換柱洗脫，柱型 2. 6 X 50cm,上樣體積3mL,分別用磷酸緩沖液、0. Imol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L的NaCL溶液進行階段洗脫，洗脫速度為加丨/！^！！，于觀此!!!進行紫外監測，自動部分收集器每管4mL進行收集，將不同肽峰分別收集冷凍干燥后貯存備用。反相高效液相色譜(RT-HPLC)RT-HPLC進行純化。色譜條件C18反相柱，填料0DS ；柱型10 X 250mm ；乙腈/水為流動相，流速為0. 8ml/min,上樣體積為20 μ L，檢測波長220nm。洗脫條件乙腈濃度為15%，洗脫20min，重復上樣。目標肽的氨基酸序列檢測數據處理各組實驗數據測定均做3個平行實驗，結果取其平均值。各組數據之間采用單因素方差分析，用t檢驗進行組間均數的比較，使用SPSS 13. 0進行數據分析。水解度及抗氧化活性胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶分別對菲利賓蛤仔肉酶解后，每克肉可得到的氨基氮依次為6. 2418mg,6. 3648mg、5. 2637mg、7. 456ang(如圖1所示)；當濃度為2. 5mg/mL時，各酶解物對羥自由基的清除率分別為46. 55%,65. 43%、34. 31 %和 57. 27%，而經典抗氧化劑維生素C的羥自由基清除率為72. 04%，各數據間差異顯著(P <0.05=(如圖2所示)。由于胰蛋白酶酶解物清除羥自由基能力最強，故對其進行分離純化。抗氧化多肽分離胰蛋白酶酶解液經超濾后，得到3個組分，即3KDa以下(Il)、3 5KDa(I2)、5KDa 以上(13)，冷凍干燥后分別得到3. 9g、2. 8g和3. 2g淡黃色粉末狀樣品，得率分別為0. 7%, 1.0%和0.8%。測定II、12和13的抗氧化活性，當濃度為lmg/mL時，它們對羥自由基的清除率分別為49. 36%、41. 65%和29. 44%，具有顯著性差異(P < 0. 05)。對抗氧化活性較強的Il經DEAE kpharoseFF柱洗脫后，出現2個峰，即峰I(IIl)和峰22 (112)(圖3)，分別為緩沖液和0. lmol/L NaCL溶液的洗脫組分，0. 3mol/L和0. 5mol/L的NaCL溶液沒有明顯的洗脫峰。收集IIl和112，冷凍干燥后分別得到1. 3g和0. 9g干燥樣品，得率分別為0. 33% 和 0. 23%o 設置 0. 2mg/mL、0. 4mg/mL、0. 8mg/mL、1. 6mg/mL 和 3. 2mg/mL 共 5 個濃度組測定 III和112的羥自由基清除率(表1)。根據表1分析，IIl與112均有較強清除羥自由基的能力，且隨著濃度增加，二者羥自由基清除率也增加。在各個濃度組，IIl對羥自由基的清除率大于Π2。表1
sample concentration(mg/ml)II1 clearance rate of hydroxy 1 radical(%)II2 clearance rate of hydroxy 1 radical(%)0.220.3819.620.432.2122.130.845.0127.761.656.1935.983.272.2553.76RT-HPLC 洗脫結果將IIl經反相高效液相色譜柱洗脫(圖4)，在保留時間約為4. 5min時，出現一主峰(峰4)，峰高為1021. 8，峰面積為5190. 1，收集該峰，冷凍干燥后得到0. 37g樣品III，得率為0. 1%，該目標肽的氨基酸序列為ASp-Trp-pro-HiS。目標肽抗氧化活性測定將樣品設置為0. 5mg/mL、1. Omg/mL、1. 5mg/mL、2. 0mg/mL、2. 5mg/mL 共 5 個濃度梯度所測得的羥自由基清除率依次為42. 16%,55. 26%,63. 05%,69. 85%和79. 41%, DPPH 自由基清除能力為18. 13%,36. 86%,53. 39%,70. 04%和85. 91 %，還原力測定其吸光值分別為0. 129,0. 294,0. 429,0. 601,0. 736(圖5，圖6，圖7)，各數據間具有顯著性差異(P< 0. 05)。 本發明研究了菲律賓蛤仔組織蛋白經不同蛋白酶水解后的水解度及羥自由基清除率，其中，堿性蛋白酶酶解物水解度最大，而胰蛋白酶酶解物對羥自由基的清除力最強， 可見，不同蛋白酶對菲律賓蛤仔組織蛋白進行水解時，所得到的酶解多肽的抗氧化活性與其氨基酸組成及其結構有關，而與水解度之間沒有必然的關聯。用超濾膜截取胰蛋白酶酶解液得到3個不同分子量的組分都具有清除羥自由基活性，但以Il活性最大，由此可推測，酶解物的抗氧化性能除了與其組成及結構有關外，可能還與其分子量大小有關。Il經 DEAE-sepharoseFF陰離子交換和RP-HPLC分離純化后，最終得到1個抗氧化性能較好的多肽III，該肽對羥自由基的清除率隨著濃度增加而增大，IC50約為0. 8mg/mL ；當濃度為 2. 5mg/mL時，與Vit C相比，III的羥自由基清除率、DPPH自由清除率及氧化還原力相對較高，具有開發為食品添加劑及醫藥品的潛能。但是本研究僅僅考查了酶解多肽的體外抗氧化活性，因此，進一步研究酶解多肽對體內各種自由基的清除能力，對于將其開發成新型抗氧化產品十分必要。
權利要求
1.一種菲律賓蛤仔酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列 Asp Trp Pro His。
2.一種如權利要求1所述菲律賓蛤仔酶解多肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟①取菲律賓蛤仔的均漿液加水稀釋后用胰蛋白酶進行酶解，酶解后離心、過濾，取上層酶解液；②將上層酶解液經過超濾膜，截取3KDa分子量以下的酶解液，用DEAEkpharoseFF陰離子交換柱進行洗脫，出現前、后兩個肽峰，分別用磷酸緩沖液和0. lmol/L的NaCL進行洗脫，并分別進行收集；③對前肽峰經反相高效液相色譜，出現一主峰，并對該主峰進行收集，然后收集的樣品進行氨基酸序列檢測，確認為Asp Trp Pro His。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟①中所述的胰蛋白酶pH值為 7. 8，酶解溫度為37°C，酶解時間為24小時，90°C滅酶15分鐘，4°C下離心。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟②中所述陰離子交換柱的柱型為 2. 6 X 50cm，上樣體積為3mL，洗脫速度為lml/min，用220nm進行紫外檢測。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟③中的所述反相高效液相色譜的色譜條件為CW反相柱，填料0DS ；柱型10 X 250mm ；乙腈/水為流動相，流速為0. 8ml/ min，上樣體積為20 μ L，檢測波長220nm。
全文摘要
一種菲律賓蛤仔酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Trp Pro His。本發明還公開了該多肽的制備方法。與現有技術相比，本發明的優點在于菲律賓蛤仔酶解多肽抗氧化性高，具體表現在羥自由基清除率、DPPH自由基和還原力均可高于VitC，經過超濾、陰離子交換、及反相高效液相色譜純化，可分離出目標活性肽，工藝簡單可靠。
文檔編號C07K1/18GK102372765SQ20101025374
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者丁國芳, 莊黛娜, 徐銀峰, 楊最素, 楊永芳, 郁迪, 鄭玉寅, 閆海強, 黃芳芳 申請人:浙江海洋學院