專利名稱：提取光合膜蛋白(光系統Ⅰ)的方法
技術領域：
本發明屬于生物分離工程與技術領域，具體是應用超濾技術從類囊體中分離提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，產品純度達84%以上。
背景技術：
光合膜蛋白(光系統I)是兩個具有光化學活性的生物復合體之一，主要參與光合作用中的電子轉移，從而實現光合作用將光能轉化為化學能。研究發現，光合膜蛋白(光系統I)的光電轉化效率高達95%，是人類研發新型生物太陽能電池的重要材料。然而基于光合蛋白復合體的新型光電器件距實際應用還有很長的一段路要走。其中，如何大量制備高活性光合膜蛋白(光系統I)并長時間保持其穩定性，對光系統I基光電器件的光電效率和壽命具有重要影響，是光系統I基太陽能電池開發的重要前提和保障。目前，從類囊體中分離光合膜蛋白(光系統I)的主要方法有蔗糖梯度離心法、層析法和等電聚焦法等。然而這些技術均存在一定的局限性，其中，蔗糖梯度離心法需要進行長時間的超速離心，容易引起蛋白質的失活和變性；層析法和等電聚焦法，成本昂貴，且難于工業放大。膜分離法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化學位差為推動力， 對雙組份或多組分的混合物進行分離、提純和富集的方法。膜分離技術是20世紀50年代發展起來的一項高效分離技術，與傳統的分離技術相比，具有分離效率高、能耗低、可連續操作、易于放大、無污染等優點。超濾膜是指膜孔徑在I-IOOnm之間，具有不對稱結構的復合膜。由于其孔徑尺寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質等的分離與純化。超濾分離是分子級的，即可截留溶液中的大分子溶質，同時使小分子溶質透過；有時也可以通過調節溶液中微環境，使預分離的蛋白質分子和膜表面帶有不同性質的電荷，再通過蛋白質分子之間、蛋白質與膜表面之間的靜電作用，達到分離的目的。目前，在生物加工領域，超濾技術常用于蛋白質的純化與濃縮，在工業上已有較多應用，但由于自然體系中蛋白質種類復雜， 且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高純度的功能蛋白質的實例極少，且這方面的研究仍處于實驗室規模。
發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡單，易于放大的光合膜蛋白(光系統I)超濾提取方法。本發明采取的技術路線是1.將含有葉綠素的藻類或高等植物葉子等，在IOO-SOOmM山梨醇Trich-HCl緩沖液(pH5-9)下勻漿；2.利用紗布對步驟1得到的勻漿液過濾，將濾液進行離心，離心條件為4°C，離心力大于1000g，離心時間大于10分鐘；
3.利用蒸餾水將步驟2得到的沉淀進行懸浮，并使葉綠素濃度在0. 2-1. Omg/mL ；4.向步驟3得到的葉綠素溶液中滴加表面活性劑，使表面活性劑濃度在0-5% (w/ ν)，將溶液在4°C下攪拌30分鐘以上，再離心，離心條件為4°C，離心力大于6000g，離心時間大于20分鐘；5.利用截留分子量為100-300kDa的超濾膜對步驟4得到的上清液進行超濾分離， 分離條件為表面活性劑濃度為0-5% (w/v)，溶液pH值6-10，離子強度0-1M。上述步驟均在4°C黑暗中進行。本發明直接應用超濾分離技術從類囊體中提取獲得高純度的光合膜蛋白(光系統I)，由于超濾膜是指膜孔徑在Ι-lOOnm，具有不對稱結構的復合膜。其孔徑尺寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質等的分離與純化。本發明工藝僅涉及勻漿、增溶、離心和超濾四個簡單步驟，相對目前的實驗室提取工藝，具有操作簡單、分離濃縮同步進行、活性損失小、回收率高、能耗低、分離效率高、產品純度可調控、控制因素單一， 便于工業放大等特點。
具體實施例方式下面結合實施例進一步描述本發明。實施例1，從菠菜中提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，步驟取新鮮無斑的菠菜葉1kg，用蒸餾水洗凈，加入400mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 8)緩沖溶液200mL，用組織搗碎機搗碎，勻漿，勻漿液用4層紗布過濾，濾液在4°C離心15min(離心力1400g)，取沉淀。用蒸餾水將沉淀懸浮，使葉綠素濃度至0. 8mg/mL,向溶液中滴加非離子型表面活性劑Triton X-100，至Triton X_100終濃度為 0.2% (w/v)，在4°C下攪拌30min，離心(4°C，6000g，20min)，取上清液(1.8L)，利用截留分子量為300kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，0. 09m2)進行分離，分離條件=TritonX-IOO濃度為0.2% (w/v)，溶液pH值8.0，NaCl濃度300mM，截留液即為光合膜蛋白(光系統I)溶液，純度為83%。實施例2，從鈍頂螺旋藻中提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，步驟取基因改造的鈍頂螺旋藻^g，用蒸餾水洗凈，加入200mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 0)緩沖溶液500mL，用組織搗碎機搗碎，勻漿，勻漿液用4層紗布過濾， 濾液在4°C離心15分鐘(離心力2500g)，取沉淀。用蒸餾水將沉淀懸浮，使葉綠素濃度至 0. 6mg/mL，向溶液中滴加非離子型表面活性劑Triton X-100，至Triton X_100終濃度為 0.3% (w/v)，在4°C下攪拌30min，離心(4°C，6000g，20min)，取上清液(3. 5L)，利用截留分子量為IOOkDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，0. 09m2)進行分離，分離條件TritonX-100濃度為0.3% (w/v)，溶液pH值7.0，NaCl濃度200mM，截留液即為光合膜蛋白(光系統I)溶液，純度為86%。實施例3，從菠菜中提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，步驟取新鮮無斑的菠菜葉1. 5kg,用蒸餾水洗凈，加入400mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 8)緩沖溶液300mL，用組織搗碎機搗碎，勻漿，勻漿液用6層紗布過濾，濾液在4°C離心10min(離心力4000g)，取沉淀。用蒸餾水將沉淀懸浮，使葉綠素濃度至0. 8mg/mL,向溶液中滴加非離子型表面活性劑Triton X-100，至Triton X_100終濃度為0.2% (w/v)，在4°C下攪拌30min，離心(4°C，8000g，15min)，取上清液(2. 5L)，利用截留分子量為300kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，0. 09m2)進行分離，分離條件=TritonX-IOO濃度為0.2% (w/v)，溶液pH值7.8，妝(1濃度3001111，截留液即為光合膜蛋白(光系統I)溶液，純度為84. 1%。
權利要求
1.一種提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，是以截留分子量為100-300kDa的超濾膜超濾處理光系統I的粗酶液，最終獲得高純度的光合膜蛋白(光系統I)；所述光系統I的粗酶液是將類囊體膜增溶、離心后得到的上清液。
2.根據權利要求1所述的提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，其特征在于所述用截留分子量為100-300kDa的超濾膜處理時，表面活性劑濃度為0_5% (w/v)，溶液pH值6_10， 離子強度0-1M。
3.根據權利要求1或2所述的提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，其特征在于所述表面活性劑為離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑或兩親性肽分子表面活性劑。
4.根據權利要求1或2或3所述的提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，其特征在于 所述用截留分子量為100-300kDa的超濾膜的組件形式為中空纖維素膜、平板膜或卷式膜。
全文摘要
本發明提供了一種提取光合膜蛋白(光系統I)的方法，屬于生物分離工程技術領域，主要是應用超濾分離技術，經過破碎、離心、增溶和超濾四個簡單步驟，即可從葉綠體中提取高純度的光合膜蛋白(光系統I)，在提取過程中，未使用層析及蔗糖梯度離心技術，大幅度縮短了提取周期，實現了光合膜蛋白(光系統I)的快速大規模制備。
文檔編號C07K1/34GK102344484SQ201010240728
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者劉建國, 呂建仁, 崔占峰, 張曙光 申請人:中國石油大學(華東)