專利名稱：一種具有抑制血管生成活性的多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，更具體地，涉及新的具有抑制新生血管作用的多肽 (H-KI系列多肽)。該多肽可抑制體外血管內皮細胞增殖、遷移、管腔形成和可抑制體內雞胚尿囊膜和小鼠視網膜新生血管。本發明還涉及所述多肽的制法和應用以及含所述多肽的藥物組合物。
背景技術：
血管新生是指在原有毛細血管網的基礎上，通過血管內皮細胞增殖、遷移進而形成新生血管的過程。血管新生在體內胚胎發育、損傷修復等生理過程中發揮重要作用，同時也是眾多新生血管性疾病，如腫瘤生長與轉移、增殖性糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變、類風濕關節炎等疾病的主要病理變化。因此新生血管抑制劑的研究與應用對于一些難治性新生血管相關疾病具有重要意義。眼部新生血管與多種眼病都有密切的關系，它常常導致嚴重的視力損害并最終致盲，例如糖尿病視網膜病變(DR)，年齡相關性黃斑變性(AMD)，角膜新生血管，新生血管性青光眼等。目前臨床上的治療手段主要包括手術、激光和藥物。手術需要一定的指征，患者痛苦大，且風險和并發癥相對較高；激光治療亦存在一定的痛苦，可造成局部視野缺損、誘發新生血管，中長期療效也不甚理想。因此，一種無痛苦、便捷、有效、患者依從性高的藥物治療眼部新生血管的方法成為了近十余年來國內外研究的熱點。血管內皮生長因子(VEGF)是相當重要的血管生長刺激因子，目前臨床中已經得到應用或者仍在實驗研究中的藥物主要是一些針對VEGF或者其受體(VEGFR)的抗新生血管制劑。包括抑制VEGF表達的VEGF反義寡核苷酸；抑制VEGF受體表達的VEGF受體反義寡核苷酸；中和血循環中VEGF的抗VEGF抗體、可溶性VEGF受體、VEGF !"rap、抗VEGFR抗體、酪氨酸激酶抑制劑等，這些制劑在腫瘤治療中應用廣泛。在開發有效的血管新生抑制劑時，應充分考慮到眼科用藥的特殊性。第一，眼部存在多個解剖性和功能性的屏障。全身給藥常常由于血-房水屏障和血-視網膜屏障而無法在眼組織局部達到足夠的藥物濃度；局部給藥，如玻璃體腔注射，大于76. 5kDa的大分子在理論上很難穿透視網膜作用于視網膜和脈絡膜新生血管。對于眼表給藥，藥物必須要先后穿透親脂性的角膜上皮細胞緊密連接和親水性的角膜基質，因此只有具備適當脂溶性、低分子量或能與眼表組織內的轉運體(如氨基酸轉運體、寡肽轉運體等)結合的藥物才能到達前房發揮作用。第二，藥物在親水的淚液、房水、玻璃體液中溶解的程度與其有效性呈正相關。第三，基于上述主要原因，眼科用藥的生物利用度很低；要使之提高，可加大給藥的濃度。用于治療腫瘤新生血管的化合物毒副作用較為明顯，全身和局部均無法高劑量給藥。第四，目前雖然已經有一系列相對安全的內源性血管新生抑制劑被先后證實，如血管抑素(angiostatin)可明顯抑制血管依賴性腫瘤的生長，但由于其分子量較大且空間構象復雜，故在制備過程中存在重組表達純化工藝繁瑣和內毒素殘留等不足。正是由于上述種種條件的限制，目前用于治療眼部新生血管的藥物十分有限，比如重組抗人VEGF單克隆抗體Bevacizumab (Avastin,最初用以治療轉移性結腸直腸腫瘤)、 重組抗人VEGF單克隆抗體片段Ranibizumab (Lucentis，)等。雖然這幾種藥物抑制眼部新生血管的作用已經得到肯定，但它們價格高昂，已報道有多種眼部或全身不良反應，且穿透血眼屏障能力低，給藥方式受到限制。多肽類新生血管抑制劑與目前研究廣泛的蛋白類新生血管抑制劑相比具有合成方法簡單、容易進行化學修飾、免疫原性低、溶解性好、生物利用率高、組織穿透性強、給藥途徑多樣、價格低廉等突出優勢。然而，目前尚沒有來自肝細胞生長因子(HGF)的、效果令人滿意的小分子多肽。因此，本領域迫切需要開發一種適于眼球組織的有效安全的小分子新生血管抑制劑。
發明內容
本發明的目的是提供一類適于眼球組織的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、類似物和衍生物。本發明的另一目的是提供含所述多肽的制法和應用。在本發明的第一方面，提供了一種下式I表示的多肽，或其藥學上可接受的鹽[XaaO]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9 ]-[XaalO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8]-[X
aal9]-[Xaa20]-[Xaa21] (I)
式中，
XaaO是無，或1-3個氨基酸構成肽段；
Xaal是選自下組的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 Ala ；
Xaa2是選自下組的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 Ala ；
Xaa3是選自下組的氨基酸Gly 或 Ala ；
Xaa4是選自下組的氨基酸Lys 或 Arg ；
Xaa5是選自下組的氨基酸Gly 或 Ala ；
Xaa6是選自下組的氨基酸Arg, Lys 或 Gly ；
Xaa7是選自下組的氨基酸Ser 或 Thr ；
XaaS是選自下組的氨基酸Tyr 或 Phe ；
Xaa9是選自下組的氨基酸Lys 或 Arg ；
XaalO是選自下組的氨基酸:Gly 或 Ala ；
Xaall是選自下組的氨基酸:Thr 或 Ser ；
Xaal2是選自下組的氨基酸:Val, Leu, lie, Met 或 Ala
Xaal3是選自下組的氨基酸:Ser 或 Thr ；
Xaal4是選自下組的氨基酸:Ile, Leu, Val, Met 或 Ala
Xaal5是選自下組的氨基酸:Thr 或 Ser ；
Xaal6是選自下組的氨基酸:Lys 或 Arg ；
Xaa 17是選自下組的氨基酸Ser或Thr ；XaalS是選自下組的氨基酸Gly或Ala;Xaal9 是選自下組的氨基酸Ile，Leu，Val，Met 或 Ala ；Xaa20是選自下組的氨基酸Lys或Arg ；Xaa21是無，或1-3個氨基酸構成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為2046個氨基酸。在另一優選例中，所述多肽的長度為20-23個氨基酸。在另一優選例中，XaaO和/或Xaa21是1_3個氨基酸構成的肽段。更佳地，XaaO 為 C、NC、或 RNC ；禾口 / 或 Xaa21 為 C、CQ 或 CQP。在另一優選例中，Xaal是選自下組的氨基酸Ile或Leu ；)(aa2是選自下組的氨基酸Ile或Leu ；Xaa3是選自下組的氨基酸Gly或Ala ；Xaa4是選自下組的氨基酸Lys或Arg ；Xaa5是選自下組的氨基酸Gly或Ala ；Xaa6是選自下組的氨基酸Arg或Lys ；Xaa7是選自下組的氨基酸Ser或Thr ；Xaa8是選自下組的氨基酸Tyr或Phe ；Xaa9是選自下組的氨基酸Lys或Arg ；XaalO是選自下組的氨基酸Gly或Ala;Xaall是選自下組的氨基酸Thr或kr ；Xaa 12是選自下組的氨基酸Val或Leu ；Xaa 13是選自下組的氨基酸Ser或Thr ；Xaal4是選自下組的氨基酸Ile或Leu ；Xaa 15是選自下組的氨基酸Thr或kr ；Xaa 16是選自下組的氨基酸Lys或Arg ；Xaa 17是選自下組的氨基酸Ser或Thr ；Xaal8是選自下組的氨基酸Gly或Ala;Xaal9是選自下組的氨基酸Ile或Leu ；和/或Xaa20是選自下組的氨基酸Lys或Arg。在另一優選例中，Xaa6為Gly。在另一優選例中，所述多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQID NO 1所示氨基酸序列經過1_5個(較佳地1_3，更佳地1_2個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。在另一優選例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQID NO 1的所示多肽的抑制血管新生活性。在另一優選例中，所述的衍生多肽與SEQ ID NO 1的相同性彡80 %，較佳地 ^ 90%；更佳地彡95%。
本發明還提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚體和多聚體形式。在本發明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發明上述的多肽。在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有(a)本發明上述的多肽或其藥學上可接受的鹽；和(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。在另一優選例中，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑(如眼周和眼內注射液)、眼用凝膠或眼藥膏。在另一優選例中，所述的組合物為緩釋劑型。在本發明的第四方面，提供了一種本發明所述多肽或藥學上可接受的鹽的用途， 它們被用于制備用于抑制血管新生或防治與血管新生相關疾病的藥物。在另一優選例中，所述的與血管新生相關疾病的選自下組新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動脈硬化、閉塞性動脈硬化、動脈栓塞、動脈血栓、 Berger's病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風濕性關節炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥或肉瘤狀病等。在另一優選例中，所述的新生血管性眼病包括累及脈絡膜、視網膜、角膜或虹膜， 包括老年性黃斑變性、增生性糖尿病視網膜病變、視網膜血管阻斷性疾病、早產兒視網膜病變、角膜感染、新生血管性青光眼等。在本發明的第五方面，提供了一種抑制哺乳動物血管新生的方法，包括步驟給需要的對象施用本發明所述的多肽或其藥學上可接受的鹽。在另一優選例中，所述的對象是人。在另一優選例中，所述的血管新生是與新生血管性眼病相關的血管新生。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1顯示了 MTS細胞增殖實驗中各組OD值均值。對照組(control)和VEGF組差異有顯著性(P = 0. 001)，VEGF組和多肽組差異有顯著性(P < 0.001)，加入IOnM, IOOnM, 1 μ M，10 μ M H-KI20后的OD值，呈遞減趨勢。星號表示該組與VEGF組之間差異具有統計學意義(F = 7. 684，P < 0. 001)。(con :H_KI20濃度；1 =IOnM ； 2 =IOOnM ； 3 :1μΜ;4 :10 μ Μ)。圖2顯示了 Transwell細胞遷移實驗中VEGF組和VEGF+不同濃度多肽組通過多孔膜的細胞數量(條柱圖)以及VEGF組和加不同濃度的Η-ΚΙ20組遷移過多孔膜的細胞情況(彩色照片)。在條柱圖中可以看到，多肽組較VEGF組細胞數目明顯減少，且隨濃度增加呈遞減趨勢。組間差異具統計學意義(F = 562. 3，P < 0. 001)。星號表示該組與VEGF組之間差異具有統計學意義。照片中透明的小圓孔為多孔膜的孔，藍紫色的細胞是被蘇木蘇著染的通過小孔遷移過濾膜的細胞。圖3顯示了內皮細胞體外管腔形成實驗中空白對照組、VEGF組和VEGF+不同濃度多肽組每100倍視野形成管腔的平均總長度(條柱圖)，以及空白對照組、VEGF組和VEGF+10 μ M Η-ΚΙ20組的內皮細胞管腔形成情況(照片)。在條柱圖中可以看到，VEGF+多肽組較VEGF組管腔形成總長度明顯下降，且隨濃度增加呈遞減趨勢。組間差異具統計學意義(F = 294. 9，Ρ < 0. 001)。星號表示該組與VEGF 組之間差異具有統計學意義。(con :H-KI20濃度；1 =IOnM ； 2 =IOOnM ； 3 :1μΜ;4 :10 μ Μ)。圖4顯示了 PBS組和多肽組雞胚尿囊膜(CAM)上血管生長情況(彩色照片)以及評估實驗中各組CAM血管計數情況(條柱圖)。照片中白色的圓片為濾紙片，黑色的線圈劃定的范圍為血管計數范圍，橙黃色的血管膜為雞胚尿囊膜，可以看到加有10μ g/μ 1H-KI20的濾紙片周圍的血管數目顯著少于 PBS組。條柱圖中control表示對照組(PBS組)，可以看到5 μ g/μ 1H-KI20組以及10 μ g/ μ 1Η-ΚΙ20組血管數量較PBS組顯著下降，且隨濃度增加呈遞減趨勢。星號表示該組與對照組之間差異具有統計學意義(F = 54. 762，P < 0. 001)。圖5是視網膜新生血管模型的視網膜鋪片、眼球切片照片以及對眼球切片中新生血管管腔數目的統計結果(條柱圖)。在正常氧濃度下飼養的對照組幼鼠視網膜血管發育良好，未見無灌注區和新生血管，通過高氧環境誘導的視網膜新生血管模型組幼鼠的視網膜鋪片中央可見大面積無灌注區以及新生血管團(橢圓圈標示)，經過玻璃體腔注射Η-ΚΙ20干預后的視網膜新生血管模型組幼鼠的視網膜鋪片中新生血管團數目明顯減少。從眼球切片中可以看到，正常組視網膜前未見新生血管管腔，視網膜新生血管模型幼鼠的視網膜前可以看到較多新生血管管腔(黑色箭頭所示)，經Η-ΚΙ20干預后這些新生血管管腔數目顯著減少，星號表示該組與 VEGF組之間差異具有統計學意義(F = 79. 320，P < 0. 001)。(con :H_KI20濃度；1 =IOmM ； 2 :50mM)。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次制備了一類源自肝細胞生長因子(HGF) 的、具有抑制血管新生功能的，分子量小于5kD (如僅約2kD)的小分子多肽。具體而言，本發明人應用生物信息學的方法，基于同源性分析和生物學特性等分析，設計了數個候選序列， 采用固相法將其合成后，再經雞胚尿囊膜血管模型、VEGF誘導的細胞株增殖模型和缺氧誘導小鼠視網膜新生血管模型篩選，獲得了一類新型的、具有預防和治療血管新生功能的小分子多肽。本發明的小肽的分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；安全性高，對生物組織毒副作用小；眼局部用藥生物利用度高，能穿透血眼屏障、可減少劑量，從而減小全身副作用。在此基礎上完成了本發明。活性多肽在本發明中，術語“本發明多肽”、“H-KI20多肽”、“H-KI20小肽”、“短肽H-KI20”或 “肽H-KI20”可互換使用，都指具有血管新生抑制活性的肽H-KI20氨基酸序列(SEQ ID N0 1)的蛋白或多肽。此外，所述術語還包括具有抑制血管新生功能的、SEQID NO :1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)1-5個(通常為1-4個，較佳地1-3個，更佳地1-2個，最佳地1個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個(通常為5個以內，較佳地為3個以內，更佳地為2個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的結構和功能。此外，所述術語還包括單體和多聚體形式本發明多肽。該術語還包括線性以及非線性的多肽(如環肽)。本發明還包括H-KI20多肽的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽， 或(iii)H_KI20多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導序列、分泌序列或6His等標簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。一類優選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多5個，較佳地至多3 個，更佳地至多2個，最佳地1個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行氨基酸替換而產生。表 I
權利要求
1. 一種下式I表示的多肽，或其藥學上可接受的鹽[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]_[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xa alO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8]-[Xaal9]-[Xaa20]-[Xaa21] (I) 式中，XaaO是無，或1-3個氨基酸構成肽段；Xaal是選自下組的氨基酸:Ile, Leu，Val，Met或Ala ；Xaa2是選自下組的氨基酸11 e，Leu，Val，Met或Ala ；Xaa3是選自下組的氨基酸Gly或Ala ；Xaa4是選自下組的氨基酸Lys或Arg ；Xaa5是選自下組的氨基酸Gly或Ala ；Xaa6是選自下組的氨基酸Arg，Lys或Gly ；Xaa7是選自下組的氨基酸Ser或Thr ；XaaS是選自下組的氨基酸Tyr或Wie ；Xaa9是選自下組的氨基酸Lys或Arg ；XaalO是選自下組的氨基酸Gly 或 Ala ；Xaall是選自下組的氨基酸Thr 或 Ser ；Xaa 12是選自下組的氨基酸Val, Leu, lie, Met 或 AlaXaa 13是選自下組的氨基酸Ser 或 Thr ；Xaa 14是選自下組的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 AlaXaa 15是選自下組的氨基酸Thr 或 Ser ；Xaa 16是選自下組的氨基酸Lys 或 Arg ；Xaa 17是選自下組的氨基酸Ser 或 Thr ；Xaa 18是選自下組的氨基酸Gly 或 Ala ；Xaa 19是選自下組的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 AlaXaa20是選自下組的氨基酸Lys 或 Arg ；Xaa21是無，或1-3個氨基酸構成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為2046個氨基酸。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO和/或Xaa21是1_3個氨基酸構成的肽段。
3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaal是選自下組的氨基酸Ile或Leu； Xaa2是選自下組的氨基酸IIe或Leu ；Xaa3是選自下組的氨基酸Gly或Ala ； Xaa4是選自下組的氨基酸Lys或Arg ； Xaa5是選自下組的氨基酸Gly或Ala ； Xaa6是選自下組的氨基酸Arg或Lys ； Xaa7是選自下組的氨基酸Ser或Thr ； XaaS是選自下組的氨基酸Tyr或Wie ； Xaa9是選自下組的氨基酸Lys或Arg ；XaalO是選自下組的氨基酸Gly或Ala ； Xaall是選自下組的氨基酸Thr或kr ； Xaal2是選自下組的氨基酸Val或Leu ； Xaal3是選自下組的氨基酸Ser或Thr ； Xaal4是選自下組的氨基酸IIe或Leu ； Xaa 15是選自下組的氨基酸Thr或kr ； Xaal6是選自下組的氨基酸Lys或Arg ； Xaal7是選自下組的氨基酸Ser或Thr ； Xaal8是選自下組的氨基酸Gly或Ala ； Xaal9是選自下組的氨基酸Ile或Leu ；和/或 Xaa20是選自下組的氨基酸Lys或Arg。
4.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自下組(a)具有SEQIDNO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQID NO :1所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權利要求1所述的多肽。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有(a)權利要求1所述多肽或其藥學上可接受的鹽；和(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑、 眼用凝膠或眼藥膏。
8.如權利要求1所述的多肽或藥學上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備用于抑制血管新生或防治與血管新生相關疾病的藥物。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的與血管新生相關疾病的選自下組新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動脈硬化、閉塞性動脈硬化、動脈栓塞、動脈血栓、Berger' s病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風濕性關節炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥和肉瘤狀病。
10.一種抑制哺乳動物血管新生的方法，其特征在于，包括步驟給需要的對象施用本發明所述的多肽或其藥學上可接受的鹽。
全文摘要
本發明涉及一種具有抑制血管生成活性的多肽。具體地，本發明涉及源自肝細胞生長因子(HGF)的具有抑制新生血管作用的多肽。本發明還涉及所述多肽的制法和應用以及含所述多肽的藥物組合物。本發明多肽具有多種優點，例如分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度等。
文檔編號C07K7/08GK102336812SQ20101023916
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者徐藝, 許迅, 趙卉 申請人:上海市第一人民醫院