專利名稱：超人源化抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及將抗體人源化的方法，特別涉及通過生成含有來自非人抗體的CDR序 列以及人抗體的構架序列(framework sequences)的嵌合抗體將抗體人源化的方法，更特 別涉及選擇用于進行人源化的適宜的人抗體構架序列的方法，以及仍更特別涉及用非人抗 體的規范CDR結構類型(canonical CDR structure types)與人抗體的胚系的規范CDR結 構類型的比較作為選擇用于人源化抗體的適宜的人構架序列的基礎。
背景技術：
抗體是天然蛋白質，是脊椎動物免疫系統對外來物質(抗原)的反應形式，主要用 于對抗感染。一個多世紀以來，已經在人工條件下在動物體內誘導出抗體并收集用于疾病 的治療或診斷，或用于生物學研究。每一個單個的產生抗體的細胞產生在化學上具有明確 組成成分的單一類型的抗體，然而，直接從反應于抗原接種的動物血清中獲得的抗體事實 上包括各不相同的一群產生抗體的細胞所產生的一群不完全一樣的分子(也就是，多克隆 抗體)。雜交瘤技術提供了繁殖單個產生抗體的細胞無數代的方法以及識別能與特殊抗 原相互作用的產生抗體的細胞克隆的篩選方法。本技術的發展容許生成無限量的具有幾乎 任何所需的抗原特異性的結構完全一致的抗體。這些抗體通常被稱作為單克隆抗體，并且 絕大多數都來源于嚙齒動物。對單克隆抗體基因的測序可以定義抗體的一級氨基酸結構。重組DNA方法學的出現使得可以對抗體基因進行結構改造并產生具有雜交瘤技 術所不能獲得的特性的經改造的抗體分子。在治療領域，該方法學的一個目標是通過改造 嚙齒動物的單克隆抗體的一級氨基酸結構以減少這些抗體在人體內的免疫原性。減弱治療 性抗體的免疫原性是合乎需要的，因為所誘導的免疫反應可引起患者的多種副作用，范圍 從治療性抗體被加速清除并因此造成的作用喪失，到最極端的致死性過敏反應。減弱外源性單克隆抗體的免疫原性的一個策略是用人源的類似功能區取代單克 隆抗體的輕鏈和重鏈恒定區，只留下完整的外源性抗體的可變區。輕鏈和重鏈的可變區負 責抗體與抗原之間的相互作用。連接可變區與恒定區的鉸鏈區位于遠離抗原結合部位的區 域，因此可變區與恒定區之間的鉸鏈區通常不干擾抗原結合。小鼠可變區連接到人恒定區 的嵌合分子通常與嵌合分子所起源的小鼠抗體以相同的親和常數與抗原結合。這些嵌合 抗體比它們的完全的鼠對應物在人體內具有更少的免疫原性。雖然如此，保留有整個鼠可變區的抗體仍在相當一部分患者中引發了免疫反應。例如，INFLIXIMAB ，一種被廣泛處方 的被認為是安全的嵌合抗體，它在47個克隆病患者的7個患者中誘導了人抗嵌合抗體反 應(Rutgeerts，P.，et al (1999)Efficacy and safety of retreatment with anti-tumor necrosis factor antibody(INFLIXIMAB)to maintain remission in Crohn' sdisease. Gastroenterology 117，761-769)0人會發動對整個鼠可變區的免疫反應是在預料之中的，因此甚至在報道這些標準 嵌合抗體的臨床試驗之前已經開始獲得具有更多人特征的可變區的嘗試。常被稱為“人源 化”的方法的一個策略旨在通過重組地構建具有鼠與人特征的抗體可變區將鼠單克隆抗體 的可變區轉變為更多的人的形式。人源化策略依照于對抗體結構數據的一些共識。首先， 可變區含有在同一物種內是保守的而在進化遙遠的物種之間例如鼠和人之間是不同的肽 序列的毗鄰束(contiguous tracts) 0第二，其它毗鄰束在同一物種內是不保守的，而且甚 至在同一個體的產生抗體的細胞之間甚至都不同。第三，抗體與抗原的接觸主要通過可變 區的非保守區域發生。第四，抗體可變區的分子結構在不同物種之間是十分相似的，因此只 根據位置而無需試驗數據，就可以定義不同物種之間的相應的氨基酸殘基的位置。人源化策略的前體是用在人抗體的相應位置上發現的殘基取代鼠序列的特征性 氨基酸殘基將減少所形成的抗體在人體內的免疫原性。然而，不同物種之間的序列取代常 造成抗體與抗原的結合能力的下降。因此人源化的技術在于平衡為減少免疫原性而對原始 鼠序列的取代與人源化抗體所需的保持治療有用的足夠多的抗原結合性。用兩種方法已經 達到這種平衡。在一個方法中，如Studnicka 的美國專利 No. 5,869,619 以及 Padlan (1991)A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand binding properties, Molecular Immunology 28 489-498所例示的，用于特征性取代鼠可變區殘基的人殘基被認為或被預計是(i)在與抗 原的相互作用上不發揮重要的化學作用，以及(ii)定位于延伸到溶劑的側鏈上，因此，遠 離于抗原結合位點的外在殘基被人源化，而內在殘基、抗原結合殘基以及形成可變區之間 的接觸面的殘基仍是鼠的。它的方法的一個缺點是需要相當多的試驗數據來確定殘基在抗 原結合上是否發揮不重要的化學作用或殘基在特殊的三維抗體結構上是否位于溶劑中。在一個更常用的方法中，如Winter的美國專利No. 5，225，539以及Jones et al (1986)Replacing the complementarity determining regions in ahuman antibody with those from a mouse,Nature 321 :522_525所例示的，被認為是保守的鼠可變區肽序 列的毗鄰束被人抗體的相應的毗鄰束所取代。在這個更常用的方法中，除了涉及抗原結合 的非保守區域外，所有可變區殘基都被人源化。為了確定用于取代的適宜的毗鄰束，Winter 和Jones等(1986)利用了 Wu和Kabat (1970)先前已經開發的抗體可變區序列的分類。Wu和Kabat首創對抗體肽序列的線性排列，并且他們在這方面的貢獻是多方面 的首先，通過對可變區之間的序列相似性的研究，他們識別了在所有脊椎動物物種的所有 抗體之間是更大或更少程度同源的相應的殘基，因為這些殘基采用了同樣的三維機構、起 到了同樣的功能作用、與周圍殘基同樣的相互作用以及存在于相同的化學環境中。第二，他 們創造了肽序列編號系統，其中同源的免疫球蛋白殘基被賦予相同的位置號碼。本領域人 員不依賴于除外序列本身的其它任何的試驗數據就可以明確地指定任何可變區序列的現在常被稱為Kabat編號的號碼。第三，對于每個Kabat編號的序列位置，Kabat和Wu計算變 異性，它指的是將可變區序列線性排列時的少數或許多可能的氨基酸的所見。他們識別出 隱藏于四個較少變異的毗鄰區域內的三個高變異性的毗鄰區域。其它研究者先前已經注意 到近乎在這些區域(高變區)的變異性并斷言高變區代表著用于抗原結合的氨基酸殘基。 Kabat和Wu正式區分構成這些可變束的殘基，并將它們稱為“互補決定區(OTR) ”，指的是抗 體與抗原之間的化學互補性。剩余的較少變異功能區，現在被命名為“構架區”的作用是可 變區的三維折疊，而不是抗原識別。第四，Kabat和Wu建立了抗體肽和核酸序列的公用數 據庫，該數據庫被持續地維護并為本領域人員所熟知。Wrinter和Jones使用Kabat分類所闡述的人源化方法生成了一種嵌合抗體，其包 含來自一種抗體的CDR以及另一種在物種起源、特異性、亞型或其它特性上都有所不同的 抗體的構架區。然而，構架區沒有被賦予任何特殊的序列或特性，事實上，Winter認為任何 的構架組都可以與任何的CDR組結合。目前已經認識到構架序列對于形成保持較好的抗原 結合所必須的抗體可變區的三維結構是至關重要的。因此，Winer和Jones所描述的常用 的人源化方法的缺點是頻繁地生成無活性抗體，因為這些參考文獻沒有提供在許多可能的 人構架序列中合理地選擇出那些最可能支持非人抗體的特殊CDR區域所需的抗原結合的 構架序列所必需的信息。本領域隨后的發展是在Winter的范圍內的改進，以解決在一些人 源化抗體中所觀察到的相對于相應的鼠抗體的對抗原的抗體親抗原性(avidity)的丟失 (抗體親抗原性是在接近化學平衡的條件下，在存在抗原時，對抗體在游離形式與抗原結合 形式之間的分布的定量測定。對于溶液中的非多價結合作用的反應，抗體親抗原性與親和 力一樣就是生化平衡常數)。Queen等的美國專利No. 5，693，761闡述了一種對Winter的將抗體人源化的改進 方法，所依據的前提是把抗體親抗原性的丟失歸結于人源化構架中的結構基序的問題，它 因為空間或其它的化學不兼容性而干擾CDR折疊成在鼠抗體中所見的可結合的構象。為了 解決這個問題，Queen所使用的人構架序列在線性肽序列上非常同源于被人源化的鼠抗體 的構架序列。因此，Queen的方法集中于比較物種之間的構架序列。通常將所有可獲得的人 可變區序列與特殊的鼠序列進行比較，并計算出對應的構架殘基之間的相同性百分比。選 擇具有最高百分比的人可變區用作為提供進行人源化操作的構架序列。Queen也認為在人 源化構架中保留有鼠構架的對支持CDR的可結合構象是關鍵的特定氨基酸殘基是重要的。 用分子模型評價潛在的重要性。所保留的候選的殘基通常是那些在線性序列上鄰近于CDR 或物理地在任何⑶R殘基的6A以內的殘基。在其它方法中，一旦得到低抗體親抗原性的人源化構建體，如Riechmarm等 (1988)等描述的通過將單個殘基恢復為鼠序列并測定抗原結合性，可以試驗性地確定出特 殊的構架氨基酸殘基的重要性。另一個用于識別構架序列的氨基酸重要性的實例方法是 Carter等的美國專利No. 5，821，337以及Adair等的美國專利No. 5，859，205所闡述的方 法。這些參考文獻闡述了構架中的特殊的Kabat殘基位點，人源化抗體中的這些殘基可能 需要用相應的鼠的氨基酸取代以保留抗體親抗原性。Queen的改進方法以及Ricechmarm、 Carter和Adair的方法的缺點之一都是需要非常大量的人構架序列進行比較和/或指引， 因為所保留的關鍵氨基酸不能完全充分地預測出功能性。因此，所構建形成的部分是人和 部分是鼠的構架仍經常表現出人免疫原性或抗原結合性的減弱，所以需要大量重復的構架
6構建以獲得用于治療的適宜的構架。Padlan 等(1995)Identification of specificity-determining residues inantibodies, FASEB J. 9 133-139 ；以 及 Tamura 等(2000)Structural correlates of an anti-carcinoma antibody :identification of specificity-determining residues (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only. J. Immunol. 164 :1432-1441 例舉了對 Winter 的第二種類型的改 進方法。這些參考文獻共有的前提是增加人源化抗體中的人特征性序列的比例將減弱抗體 的免疫原性，并因此闡述了移植部分CDR序列的方法。對抗體-抗原復合物的三維結構的 測定表明許多被指定為Kabat和Wu所定義的CDR的殘基位點很少直接參與抗原結合。這 些參考文獻顯示移植CDR殘基亞組將使得人源化抗體具有足夠高的抗原結合性。然而，仍 需要人源化的構架序列，這些參考文獻沒有說明用于選擇足夠多的與給定的鼠CDR組一起 使用的人構架序列的方法。因此，在本領域需要一種將抗體人源化的方法，它能可靠地識別支持非人的CDR 區的適宜的人構架序列，并提供保留有高抗原結合性以及人體內低免疫原性的人源化抗 體，且不需要對構架序列的直接比較，不需要確定構架中的關鍵重要的氨基酸殘基，以及不 需要重復η次構建來獲得具有適宜的治療特性的人源化抗體。
發明內容
本發明通過提供不需要比較非人與人抗體之間的構架序列而制備具有高親和力 以及低免疫原性的人源化抗體的方法滿足了這種需求，以及也提供了所制備的人源化抗 體。在此所提供的方法不是依賴于將人構架序列作為分析點，而是依賴于比較非人抗體的 規范CDR結構類型和人抗體的CDR結構類型，尤其是人胚系序列所編碼的人抗體，識別出從 中可以得到適宜的人構架序列的候選的人抗體序列。更具體地，提供了一種制備人源化抗體的方法，包括獲得非人的成熟抗體基因編 碼的被研究的可變區的肽序列，以及鑒別出非人抗體可變區內的至少兩個CDR的一個第一 組規范CDR結構類型。然后也得到人抗體的人抗體可變區的肽序列文庫。在一個優選的實 施方案中，文庫包括胚系核酸片段編碼的人胚系可變區序列。然而，在其它的實施方案中， 文庫可以包括成熟的人抗體序列。在這兩種情況中，方法都包括鑒別出人可變區序列文庫 內的每個序列的至少兩個CDR的規范CDR結構類型(也就是，一個第二組規范CDR結構類 型)。通過比較第一組規范⑶R結構類型與第二組規范⑶R結構類型(也就是比較在可變 區內的相應位點的小鼠的規范CDR結構類型與人的規范CDR結構類型)并選擇那些其中在 非人與人的可變區內的相應位點的CDR序列的第二組規范CDR結構與第一組規范CDR結構 類型一樣的人序列，從該文庫中選擇出候選的序列的亞組。本方法用這些候選的人可變區 序列作為構建嵌合分子的基礎，嵌合分子包括結合了候選的人可變區序列的構架區的至少 兩個非人可變區的CDR序列(例如小鼠CDR)。該構建體的結果是嵌合蛋白，該蛋白包括在 可變區的相應位點取代了每一個人CDR序列的每一個非人CDR序列，如此使得嵌合抗體的 構架序列與候選的人構架序列的差異不超過10個氨基酸。在特定的實施方案中，嵌合抗體 的構架序列與人構架序列的差異不超過5個氨基酸。在其它實施方案中，嵌合抗體的構架 序列與人構架序列的差異不超過2個氨基酸。在絕大多數實施方案中，構建嵌合抗體分子包括構建編碼嵌合抗體序列的核酸序列。在典型的實施方案中，本方法進一步包括根據評級標準通過比較非人CDR序列與 相應的人CDR序列的位點對位點的氨基酸殘基的相似性，對候選的人序列亞組的成員進行 評級。在特定的實踐中，人序列的候選的序列只包括前25%的經評級的成員。在一些實施 方案中，評級標準包括非人與人CDR序列之間在至少一個CDR、或至少兩個CDR、或最常見的 每個相應的CDR的相應殘基位點上的氨基酸相同性的積分。在其它實施方案中，評級標準 包括非人與人CDR之間在至少一個、至少兩個或每個相應的CDR的相應殘基位點上的氨基 酸同源性的積分。仍在其它實施方案中，積分標準同時包括至少一個、至少兩個或每個相應 的CDR的氨基酸相同性積分以及氨基酸同源性的積分。使用不同體系所定義的CDR都可以 實踐本方法。例如，在特定的實施方案中，CDR是Kabat定義的CDR，在其它實施方案中，CDR 是Chothia定義的CDR袢。本方法不局限于嚴格地使用非人源的精確的CDR序列或來自成員組的人構架的 精確序列。在特定的實施方案中，方法也可以包括用不同的氨基酸取代非人CDR序列中的 至少一個氨基酸，但是設定在任何一個非人的輕鏈⑶Rl、輕鏈⑶R2、輕鏈⑶R3、重鏈⑶Rl或 重鏈⑶R3上的取代不超過4個殘基，以及在非人的重鏈⑶R2上的取代不超過10個氨基酸。 在其它的實施方案中，方法也包括用不同的氨基酸殘基取代人構架序列上的至少一個但不 超過10個的氨基酸殘基。本方法也承認在某些時候非人可變區可以包括人可變區所缺少的規范類型的CDR 序列。對于三個非人CDR的每一個都是輕鏈CDR的情況，如果三個非人CDR序列的其中一 個序列是人可變區序列文庫中所缺少的規范結構類型，那么選擇人序列包括，在相應位點 選擇與所缺少的非人CDR類型具有不同規范類型的CDR的人可變區序列，條件是該不同的 規范人CDR類型的長度比所缺少的非人CDR的規范CDR結構類型的長度短或長不超過2個 氨基酸。通常如果缺少的CDR序列是規范類型1，那么可選擇在相應的位點為規范類型2的 CDR的人序列，或如果非人的CDR序列為規范類型5，那么可選擇在相應的位點為規范類型 4或3的⑶R的人序列。在絕大多數實施方案中，非人可變區是鼠可變區。同樣的，在絕大多數實施方案 中，人可變區序列的文庫包括作為人構架來源的人￥1；、￥;^、￥11、1、1或夂序列。在絕大多 數實施方案中，方法包括通常用Vk和Vh序列的人構架裝配具有嵌合的可變輕鏈及嵌合的 可變重鏈的嵌合抗體。在典型的實施方案中，嵌合的可變輕鏈和嵌合的可變重鏈被合成為 Fab片段、或(Fab)，2分子、或單鏈Fv分子、或者可變輕鏈和可變重鏈與人抗體的恒定區一 起被裝配形成完整的抗體。本方法適用于通過制備含有結合了被研究的物種的CDR的目標物種的構架序列 的嵌合抗體，將任何被研究的物種的被研究的抗體序列轉化成適合于在目標物種中使用的 具有更弱免疫原性的形式。在這些情況中，前述的方法在執行技術上是一樣的，其中可變區 可來自任何被研究的物種以及目標可變區可以來自任何被應用抗體的目標物種。因此，例 如，在不同的實施方案中，可以將被研究的抗體與牛、豬、鼠或馬來源的構架序列嵌合，相應 地形成牛源化、豬源化、鼠源化或馬源化抗體。在另一方面，本發明提供了包含根據所述的方法制備的嵌合抗體分子的組合物。 因為，方法利用了鑒別與被研究的⑶R序列結合的適宜的目標構架序列的新方法，所以制
8備得到的嵌合抗體也是新的。因此，在此提供了一種人源化抗體，它包括一個含有至少兩個 鄰近融合于(fused adjacent to)人可變區構架序列的非人⑶R序列的嵌合抗體可變區。 該人構架序列選自一個構架序列亞組，所述構架序列的特點是與人抗體可變區的構架序列 有著不超過10個氨基酸殘基的差異，所述人抗體可變區在嵌合抗體與人抗體之間的至少 兩個相應位點上具有至少兩個與非人CDR序列相同的規范結構類型的人CDR序列。非人可變區⑶R通常來自小鼠。人可變區序列通常是VK、VA、VH、JH、Jk或夂序 列。最典型地，嵌合抗體包括每一個可變輕鏈以及可變重鏈的嵌合抗體序列。在常見實施方 案中，嵌合的可變輕鏈和嵌合的可變重鏈形成Fab片段、或(Fab)’ 2分子、或單鏈Fv分子、 或者可變輕鏈和可變重鏈與人抗體的恒定區一起被裝配形成完整抗體的形式。最典型地， 人可變區序列是來自人胚系可變區片段的序列。在其它實施方案中，人可變區序列是來自 人成熟抗體的序列。在優選的實施方案中，人源化抗體與它的抗原的解離常數至少是106Μ_\優選至少 IO7Mi以及更優選至少IO8MA當施用于人后，人源化抗體通常不引發免疫反應。舉例說明 本發明的具體的實施方案包括與蝎毒抗原結合、與人CD28受體結合、與人溶菌酶結合、與 人谷氨酸脫羧酶(GAD65)結合的人源化抗體。
圖1描述了人胚系Vh基因片段文庫。圖2描述了人胚系Vk基因片段文庫。圖3描述了小鼠Dl. 3 (抗雞溶菌酶)抗體可變輕鏈序列的一部分以及所選定的在 相應位點上具有與鼠Dl. 3輕鏈序列同樣類型的規范CDR的人胚系Vk可變區序列的亞組。 用Dl. 3CDR與人CDR之間的氨基酸相似性對亞組評級，并首先描述了評級最高的序列。圖4描述了鼠Dl. 3抗體可變重鏈序列的一部分以及所選定的具有與Dl. 3同樣類 型的規范CDR的人胚系Vh可變區序列的亞組。用類似于圖3的相應的CDR的氨基酸序列 的相似性對亞組評級。圖5描述了人源化Dl. 3抗體的嵌合Vk可變區以及Vh可變區的氨基酸序列，舉例 說明了本發明的一個方面。圖6描述了編碼(和表達)圖5的人源化嵌合Dl. 3抗體的DNA構建體的核酸序 列，舉例說明了本發明的另一個方面。圖7是舉例說明人源化Dl. 3抗體的抗原結合性的圖表，它具有的親和常數大于 Ι ΛΤ1，舉例說明了本發明的一個實施方案。圖8描述了鼠的被稱為9. 3的抗人CD28抗體的可變輕鏈序列的一部分，以及所選 定的在相應的位點上具有與鼠9. 3可變輕鏈序列同樣類型的規范CDR的人胚系Vk可變區 序列的亞組，用與圖3類似的氨基酸序列的相似性對亞組評級。圖9描述了鼠9. 3抗體的可變重鏈序列的一部分，以及所選定的在相應的位點上 具有與鼠可變重鏈序列同樣類型的規范⑶R的人胚系Vh可變區序列的亞組，也用氨基酸序 列的相似性評級。圖10描述了具有嵌合可變重鏈及可變輕鏈的人源化的抗人⑶28 (Hu. 9. 3) Fab片 段，舉例說明了本發明的另一個實施方案。
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圖11是舉例說明Hu. 9. 3Fab片段的抗原結合性的圖表，它的親和常數大于lOl1， 舉例說明了本發明的一個實施方案。圖12描述了具有嵌合的可變重鏈及可變輕鏈的人源化抗蝎毒素Fab片段，舉例說 明了本發明的一個實施方案。圖13描述了具有嵌合的可變重鏈及可變輕鏈的人源化抗入谷氨酸脫羧酶 (GAD65)Fab片段，舉例說明了本發明的另一個實施方案。圖14是舉例說明人源化抗GAD Fab片段的抗原結合性的圖表，它的親和常數大于 IO11M-1,舉例說明了本發明的一個實施方案。
具體實施方案在下面的描述中，對各種參考文獻的引用將有助于本領域人員完全理解并實施發 明。因此，將下面描述中所引用的每篇參考文獻的全部內容一起并入本文作為參考。為了 更好地幫助理解發明的各個實施方案，解釋在此使用的特定術語的意義可能是有幫助的。“成熟抗體基因”是編碼例如淋巴細胞比如B細胞、雜交瘤或任何已經經歷成熟過 程的產生抗體的細胞所表達的免疫球蛋白的基因序列，因此表達的是特異免疫球蛋白。該 術語包括成熟基因組的核酸序列、cDNA的核酸序列或其它編碼這些成熟基因的核酸序列， 這些核酸序列已經被分離并/或重組加工到其它細胞類型進行表達。成熟抗體基因已經經 歷各種成熟及重排，使得能從結構上將它們與除淋巴細胞以外的所有細胞所編碼的抗體基 因區別開來。人、嚙齒動物以及許多其他哺乳動物的成熟基因對于抗體輕鏈是由V與J基 因片段融合形成，而對于抗體重鏈是由V、D與J基因片段融合形成。許多成熟抗體基因獲 得融合后的點突變，一些點突變增加了抗體蛋白對特異抗原的親和力。“胚系抗體基因”或基因片段是由非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列，它沒有經歷 導致表達特異免疫球蛋白的遺傳學重排及成熟的成熟過程。本發明的各種實施方案所提 供的一個優點來源于一種認識，那就是胚系抗體基因比成熟抗體基因更多地保留了動物物 種個體的特征性的重要氨基酸序列結構。因此當被治療性應用于該物種時，更少地被該物 種識別為外源物質。圖1和圖2顯示了編碼人可變重鏈區(Vh)以及可變輕鏈區(Vk)抗體 (也就是，免疫球蛋白)的人胚系抗體基因的肽序列。這些序列列表中的每一個序列都舉例 說明了人抗體基因文庫，特別是人胚系抗體基因文庫。“CDR”是抗體可變序列中的互補決定區。在每個可變重鏈和可變輕鏈序列中都各 有三個⑶R，被稱為每個可變區的⑶R1、⑶R2和⑶R3。依照不同體系已經不同地定義這些 CDR的準確界限，然而，所有的CDR都有重疊殘基，它們構成了可變序列內所謂的“高變區”。 Kabat描述的系統(CITE)不僅提供了明確的適用于抗體的任一可變區的殘基編號系統，也 提供了定義了這三個⑶R的準確的殘基界限。這些⑶R可以被稱作為Kabat⑶R。Chathia 和合作者(CITE)發現Kabat⑶R內的某些亞部分采用幾乎完全一樣的構架構象，盡管它們 在氨基酸序列水平上有著很大的不同。這些亞部分被稱作為Li、L2和L3或HI、H2和H3， 其中“L”和“H”相應指的是輕鏈和重鏈區。這些區域可以被稱為Chothia⑶R，它們具有 與Kabat⑶R有重疊的界限。表I舉例說明了根據Kabat殘基編號系統Chotia與Kabat ⑶R的重疊殘基編號。表 I
權利要求
一種嵌合抗體分子，包括重鏈目標可變區，所述重鏈目標可變區含有三個移植到目標可變區構架序列中的來自重鏈被研究可變區的CDR序列，其中所述目標可變區構架的特征在于與所述被研究可變區構架序列具有不超過10個氨基酸殘基的差異，并在相應位置上有兩個目標可變區CDR與所述被研究可變區CDR具有相同的規范結構類型，條件是所述重鏈目標可變區的CDR2的殘基61 65是來自所述重鏈被研究可變區的殘基61 65；和輕鏈目標可變區，所述輕鏈目標可變區含有三個移植到目標可變區構架序列中的來自輕鏈被研究可變區的CDR序列，其中所述目標可變區構架的特征在于與所述被研究可變區構架序列具有不超過10個氨基酸殘基的差異，并在相應位置上有兩個目標可變區CDR與所述被研究可變區CDR具有相同的規范結構類型，其中所述嵌合抗體分子的CDR邊界和殘基編號是通過Kabat定義的。
2.一種嵌合抗體分子，包括重鏈目標可變區，所述重鏈目標可變區含有三個移植到目標可變區構架序列中的來自 重鏈被研究可變區的CDR序列，并在相應位置上有兩個目標可變區CDR與所述被研究可變 區CDR具有相同的規范結構類型，條件是所述重鏈目標可變區的CDR2的殘基61-65可以是 來自所述重鏈被研究可變區的殘基61-65，且構架序列的殘基27-30可以是來自所述被研 究可變區的構架序列的殘基27-30 ；和輕鏈目標可變區，所述輕鏈目標可變區含有三個移植到目標可變區構架序列中的來自 輕鏈被研究可變區的CDR序列，并在相應位置上有兩個目標可變區CDR與所述被研究可變 區CDR具有相同的規范結構類型，其中所述嵌合抗體分子的CDR邊界和殘基編號是通過Kabat定義的。
3.權利要求2的嵌合抗體分子，其中所述被研究可變區是非人可變區。
4.權利要求2的嵌合抗體分子，其中所述非人可變區是小鼠的可變區。
5.權利要求3的嵌合抗體分子，其中所述目標可變區是人可變區。
6.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述人可變區構架序列選自由Vk、νλ、VH、JH、Jk 和Ja序列所組成的組。
7.權利要求5的嵌合抗體分子，其同時包含嵌合可變輕鏈區和嵌合可變重鏈區。
8.權利要求7的嵌合抗體分子，其中將所述嵌合可變輕鏈區和嵌合可變重鏈區裝配形 成選自Fab片段、(Fab)，2分子和單鏈Fv分子中的一種分子。
9.權利要求2或5的嵌合抗體分子，其進一步包括人抗體恒定區。
10.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述候選人可變區由人胚系可變區基因編碼。
11.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述候選人可變區是來自人成熟抗體的序列。
12.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述分子與其抗原的解離常數至少為IO6M-1或至 少為IO7M.1或至少為IO8M4。
13.權利要求5的嵌合抗體分子，其中當所述分子被施用于人體時不會引發免疫反應。
14.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述分子結合人CD28抗原。
15.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述人可變區的構架序列與所述候選人抗體可 變區的構架序列的差異不超過5個氨基酸殘基。
16.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述人可變區的構架序列與所述候選人抗體可變區的構架序列的差異不超過2個氨基酸殘基。
17.權利要求4的嵌合抗體分子，其中所述非人CDR序列的至少一個氨基酸殘基被不同 的氨基酸取代，條件是對于非人輕鏈CDRl，不超過4個殘基被取代，對于非人輕鏈CDR2，不超過4個殘基被取代，對于非人輕鏈CDR3，不超過4個殘基被取代，對于非人重鏈CDRl，不超過4個殘基被取代，對于非人重鏈CDR3，不超過4個殘基被取代，以及對于非人重鏈CDR2，不超過10個殘基被取代。
18.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述的人構架序列的至少一個但不超過10個氨 基酸殘基被不同的氨基酸殘基取代。
19.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述嵌合抗體可變區含有移植到所述的人可變 區構架序列中的來自被研究的非人可變區的三個非人CDR。
20.權利要求5的嵌合抗體分子，其中所述嵌合抗體可變區含有移植到所述的人可變 區構架序列中的來自被研究的非人可變區的三個非人輕鏈CDR序列，且條件是如果所述三 個非人CDR序列中的一個序列與所述非人CDR序列在相應的CDR位點不具有相同的規范結 構類型時，那么所述候選的人可變區的不同的規范結構類型的長度長于或短于所缺乏的非 人規范結構類型均不超過2個氨基酸。
21.權利要求20的嵌合抗體分子，其中如果所缺乏的CDR序列為規范類型1，那么所 述候選的人可變區在相應位置上具有規范類型2的CDR ；或者，如果所述非人CDR序列為規 范類型5，那么所述候選的人可變區在相應位置上具有為規范類型4或3的CDR。
全文摘要
本發明公開了一種將抗體人源化的方法，其基于通過比較非人抗體的可變區的CDR序列的規范CDR結構類型與人抗體序列文庫的相應CDR的規范CDR結構類型而自人抗體基因中選出可變區構架序列，優選的是胚系抗體基因片段。具有與非人CDR相似的規范CDR結構類型的人抗體可變區形成了一種成員人抗體序列的亞組，從中可選出人構架序列。通過人與非人CDR序列之間的氨基酸相似性可以對亞組成員進一步評級。選擇評級靠前的人序列以提供構架序列，用于利用所選定的亞組成員人構架來構建嵌合抗體，該嵌合抗體用非人CDR對應物功能性取代了人CDR序列，因此提供了具有高親和力及低免疫原性的人源化抗體，且不需要比較非人與人抗體之間的構架序列。本發明還公開了根據本發明方法制備的嵌合抗體。
文檔編號C07K16/46GK101962408SQ201010236888
公開日2011年2月2日 申請日期2002年7月12日 優先權日2002年7月12日
發明者杰斐遜·富特 申請人:杰斐遜·富特