專利名稱：一種重組蛋白a的分離純化方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種以IgG的Fc片段為親和配基的親和層析 技術純化重組蛋白A的方法。
背景技術：
金黃色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcus aureus protein A, SPA)為金黃色葡萄 球菌細胞壁相關蛋白，為單鏈多肽結構，具有與人類和其它哺乳動物血液中免疫球蛋白分 子的Fc段特異性結合的能力，主要吸附IgG和含IgG的免疫復合物。正是因為蛋白A與 人類和其他哺乳動物的多種免疫球蛋白具有特異性結合能力，因此被廣泛用作免疫學試劑 (與多種報告分子偶聯后用于組織化學、WesterruELISA等的抗體檢測)；與固相載體相連， 用于抗體的分離純化；臨床上用于治療抗體相關性疾病的血液凈化吸附劑等等。最早獲得蛋白A的方法是從金黃色葡萄球菌中直接純化獲得，然而這種方法存在 一些問題，例如天然蛋白A只占菌體總蛋白的1.7%，難以滿足大規模生產的需要，且金黃 色葡萄球菌為致病菌，大規模生產危險性較大。為避免這些問題，另一基于基因工程方法生 產重組蛋白A的工藝最近已經得到了開發。蛋白A的用途廣，需求量大，但目前的情況是蛋白A主要依靠進口，如美國的 Repligen Corporation，價格昂貴。而國內在蛋白A研發方面起步較晚，產量低，成本高，產 品質量不穩定，遠遠不能滿足市場的需求，其中最關鍵的問題就是純化工藝還有待提高，因 此急需建立一種改進的適合于大規模生產的分離純化工藝，以降低成本，提高產品質量。目前，報導的對蛋白A的純化方法主要有兩種，一種是采用IgG親和層析的方法， 第二種則采用的是多步純化的方法。早在1972年，Hjelm等人就提出了采用IgG親和層析的方法純化蛋白A。具體方法 是以交聯瓊脂糖凝膠為載體，采用溴化氰活化工藝，以IgG為功能基制成親和層析柱，親 和層析純化蛋白A。該方法操作簡單，且一步層析操作即可使純化的蛋白A純度達到95%。 然而，由于IgG屬生物大分子，分子量大(Mr = 150000)，因此為減少空間位阻，單位體積載 體上只能偶聯少量的IgG，造成親和層析柱動態載量低，難以大規模生產，多用于實驗室規 模純化。而且偶聯IgG時利用的是IgG表面大量的氨基，屬于多點偶聯工藝，必然導致固定 化的蛋白空間取向不均一，增大了空間位阻。US 5075423公開了一種純化蛋白A的方法。該方法是在IgG親和層析的基礎上， 通過增加一步離子交換層析以去除痕量的污染物。然而，與上述方法存在相似的問題，IgG 親和層析柱空間位阻大，動態載量低，成本高，難以大規模應用。Sjoquist等人在1972年提出了多步操作組合的方法純化蛋白A，主要包括酸沉 淀，硫酸銨沉淀，超濾，DEAE弱陰離子交換層析以及凝膠過濾層析。該方法操作步驟多，純 化過程復雜，回收率低，周期長成本高，而且凝膠過濾層析生產能力有限，這些都限制了其 大規模應用的可能。US 5314993公開了一種能大規模純化重組蛋白A的方法，該方法包括加熱處理，離子交換層析及乙醇沉淀三個步驟。該方法工藝簡單，但產品回收率不高。Hammond等人也發表了一種能大規模純化重組蛋白A的方法，該方法包括加熱處 理，除鹽柱除鹽，DEAE弱陰離子交換層析以及苯基疏水作用層析，該方法操作復雜，總回收 率低。WO 2007/035341A1，公開了一種純化蛋白A的方法，該方法包括過濾，滲濾，以及 兩步連續的層析操作，第一步為陰離子交換層析、疏水作用層析或陶瓷羥基磷灰石層析中 的一種，第二步為陽離子交換層析。該方法同樣操作復雜，效率低。CN 1432578A，公開了一種人工合成的蛋白A基因及其表達產物的制備方法。所用 的純化方式為一步分子篩純化，處理量小，產品純度不高，不適宜大規模生產。CN 101050464A和CN 101298476A公開的重組蛋白A純化方法類似。其都是在基 因構建時加入了由6個組氨酸組成的標簽，因此采用鎳離子螯合層析純化重組蛋白A。但 這種方法需要在純化過程中加入特定的酶來切除組氨酸標簽，且這種方法得到的產品純度 低。綜上所述，利用IgG為配基的親和層析方法雖然存在一些缺陷，但在單次獲得產 品純度上仍高于其他方法。因此，本發明針對IgG為配基的親和層析柱在重組蛋白A純化 中存在的吸附柱空間位阻大、載量低等不足，提出了一種以定向固定化IgG的Fc片段為親 和配基的親和層析技術純化重組蛋白A的新方法。
發明內容
本發明提供了一種以定向固定化IgG的Fc片段為親和配基的親和層析介質的制 備方法，在實現重組蛋白A的高選擇性分離純化的同時，顯著提高層析柱的載量和使用壽 命，降低生產成本。本發明的技術方案包括以下步驟(1)采用木瓜蛋白酶酶解IgG為Fc片段和Fab片段，并通過固定重組蛋白A的親 和層析柱純化Fc片段；(2)采用高碘酸鈉氧化Fc片段糖側鏈，利用反應后得到的醛基實現Fc片段的定向 固定化；(3)采用瓊脂糖凝膠為基質，以羰基二咪唑(⑶I)活化，通過雙功能團間隔臂分子 將氧化后的Fc片段固定，合成了可以特異性結合重組蛋白A的親和層析材料，該材料對重 組蛋白A的吸附容量為10-20mg/ml gel。本發明的有益效果如下1、采用Fc片段為親和配基制備成親和層析柱，由于Fc片段大小只占完整IgG分 子的三分之一，因此單位體積載體上可以偶聯更多的配基，相比IgG親和層析介質動態載 量明顯提高，從而降低了生產成本；2、采用高碘酸鈉氧化Fc片段糖側鏈，利用反應后得到的醛基實現Fc片段的定向 固定化。由于采用了定向偶聯工藝，降低了空間位阻，因此可以在使用更高流速的條件下增 加動態載量；3、相對于傳統的IgG親和層析和其他多步純化的方法，該工藝的特點是低成本、 高效率和操作簡便，該工藝既可用于實驗室規模純化蛋白A，也可用于工業化蛋白A的生產。按上述方法，最終獲得的蛋白A利用SDS-PAGE和HPLC檢測產物純度達95%以上。
附圖1為通過重組蛋白A親和層析柱純化Fc片段的SDS-PAGE凝膠電泳結果，其 中泳道1為IgG，泳道2為木瓜蛋白酶酶解液，泳道3為穿透，泳道4為雙蒸水沖洗樣，泳道 5為純化后的Fc片段。附圖2為純化后SDS-PAGE凝膠電泳結果，其中泳道1為低分子量蛋白marker，泳 道2為純化后的重組蛋白A。
具體實施例方式以下結合技術方案和附圖詳細敘述本發明的具體實施例。實施例1Fc片段的制備(1)木瓜蛋白酶酶解IgG以IOmM pH 7. 4的PBS緩沖液溶解適量的木瓜蛋白酶一定時間，過濾。加入一定量 的激活劑半胱氨酸和螯合劑EDTA，使其終濃度分別達到0. 02mol/L和0. 01mol/L,加入IgG 使其濃度保持在0. 5-10mg/ml，加入反應物后調節pH值到6_7之間，40°C水浴反應3_6h。最 后加入終止劑碘乙酰胺使其濃度達到0. 03mol/L。(2)利用重組蛋白A親和層析柱純化Fc片段取以重組蛋白A為配基的親和層析填料裝柱，用5倍柱體積平衡緩沖液(IOmM PBS，pH 7.4)平衡柱子，檢測280nm吸光度，直到基線平衡為止。將上述所得的酶解液緩慢 過柱，接著用5倍柱體積平衡緩沖液沖洗柱子，再改用雙蒸水沖洗，以洗去因疏水作用而非 特異吸附的雜蛋白，最后使用2-4倍柱體積的洗脫緩沖液(IOOmM檸檬酸，pH 2. 3)洗脫，收 集洗脫峰，并立即用中和緩沖液(500mM Tris-HCl，pH 8.0)中和至中性。Fc片段的定向固定化(I)Fc片段的氧化反應對上述洗脫液進行透析除鹽，濃縮后轉入鋁箔紙包裹的錐形瓶中，加入高碘酸鈉 至終濃度為2-10mg/ml，輕微搖晃，室溫避光反應20-40min后快速透析除去高碘酸鈉以終 止反應，并對透析后的溶液進行濃縮。(2)⑶I法活化瓊脂糖凝膠取5ml全沉降后的S印harose CL-4B凝膠，用蒸餾水洗去膠中的防腐劑等。稱取 0. 5g⑶I溶解在約IOml丙酮中。將洗好的凝膠加到⑶I丙酮溶液中，300C、150rpm,恒溫搖 床反應lh。反應后的凝膠用丙酮反復沖洗，除去反應過程中產生的咪唑。(3)手臂的連接IOml無水丙酮中加入2ml的乙二胺、1，6-己二胺或二氨基二丙基亞胺(DADPA)，再 加入已經活化的⑶I凝膠，300C、150rpm,恒溫搖床反應2h。用大量的蒸餾水沖洗反應后的 凝膠，再用150mM pH 8. 2硼酸緩沖液抽濾。(4)Fc片段的固定取一定量活化后的凝膠，加入等體積的150mM pH 8. 2的硼酸緩沖液，加入含氧化后Fc片段的溶液，30°C、150rpm，恒溫搖床反應3h。反應后的凝膠用大量蒸餾水抽濾后， 放入乙醇胺溶液中封閉未反應的醛基，30°C，150rpm，恒溫搖床過夜。最后加入硼氫化鈉， 30°C，150rpm，搖床反應30min左右，還原后的凝膠用大量蒸餾水抽濾清洗，然后放入含有 0. 02%的疊氮鈉溶液中，4°C保存待用。合成的以Fc片段為配基的親和層析介質的配基密 度為 5-15mg/ml gel。重組蛋白A的分離純化(1)將發酵液4000rpm離心15min，去掉上清培養基，將菌體溶于5倍體積的裂 解液(50mM Tris, IOOmM NaCl, pH 8.0)中，加入溶菌酶使其終濃度為0. 2mg/mL，37°C溫浴 15min后超聲破碎，將破碎后的菌液IOOOOrpm離心20min，獲取上清液。(2)取以IgG的Fc片段為配基的親和填料裝柱，用5倍柱體積平衡緩沖液(IOmM PBS,0. 5M NaCl,pH 7.4)平衡柱子，檢測210nm吸光度，直到基線平衡為止。將上述處理后 的蛋白上清液緩慢過柱，接著用5-10倍柱體積平衡緩沖液沖洗柱子，直到210nm處吸光度 回到基線并穩定為止，再用2-4倍柱體積的洗脫緩沖液(IOOmM檸檬酸，pH 2. 3)洗脫，收集 洗脫峰，并立即用中和緩沖液(500mM Tris-HCl, pH 8.0)中和至中性。最終獲得的蛋白A經SDS-PAGE及HPLC檢測蛋白A純度為95%以上。
權利要求
一種重組蛋白A的分離純化方法，其特征包括如下步驟(1)采用木瓜蛋白酶酶解IgG為Fc片段和Fab片段，并通過固定重組蛋白A的親和層析柱純化Fc片段；(2)采用高碘酸鈉氧化Fc片段糖側鏈，利用反應后得到的醛基實現Fc片段的定向固定化；(3)采用瓊脂糖凝膠為基質，以羰基二咪唑活化，通過雙功能團間隔臂分子將氧化后的Fc片段固定，合成了特異性結合重組蛋白A的親和層析材料。
2.根據權利要求1所述的一種重組蛋白A的分離純化方法，其特征還在于所述木瓜 蛋白酶酶解IgG的條件為激活劑半胱氨酸和螯合劑EDTA的終濃度分別為0. 02mol/L和 0. 01mol/L,加入IgG的濃度保持在5-lOmg/ml，酶解pH值6-7，酶解溫度37-45°C，酶解時間 6h ；最后加入終止劑碘乙酰胺的濃度為0. 03mol/L。
3.根據權利要求1所述的一種重組蛋白A的分離純化方法，其特征還在于所述高碘 酸鈉氧化Fc片段糖側鏈條件為溶液IgG濃度為0. 5-10mg/ml，加入高碘酸鈉的終濃度為 2-lOmg/ml。
4.根據權利要求1所述的一種重組蛋白A的分離純化方法，其特征還在于雙功能團 間隔臂分子為乙二胺、1，6_己二胺或二氨基二丙基亞胺。
5.根據權利要求1所述的一種重組蛋白A的分離純化方法，其特征還在于合成的以 Fc片段為配基的親和層析介質的配基密度為5-15mg/ml。
全文摘要
本發明涉及一種重組蛋白A的分離純化方法，包括批量IgG Fc片段的制備，Fc片段的定向固定化以及利用以Fc片段為配基的親和色譜技術分離純化重組蛋白A的方法，屬生物工程技術領域。最終獲得的蛋白A經SDS-PAGE及HPLC檢測蛋白A純度為95％以上。該方法具有低成本、高效率和操作簡便的優點，既可用于實驗室規模純化蛋白A，也可用于工業化蛋白A的生產。
文檔編號C07K1/22GK101921320SQ201010227638
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者任軍, 侯率, 張嘉玉, 林雪, 謝鍵, 賈凌云 申請人:大連理工大學