專利名稱：一種丙型肝炎病毒特異性抗原及其在血清分型中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種丙型肝炎病毒血清型檢測技術，具體地說涉及一種丙型肝炎特異 性抗原以及采用酶聯免疫技術檢測丙型肝炎病毒血清型特異性抗體的方法。
背景技術：
丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus，HCV)是引起輸血后病毒性非甲非乙型肝炎的 主要病原，主要通過輸血、靜脈吸毒傳播，也可通過密切接觸和母嬰傳播。目前全世界約有 1. 7億HCV感染者。一般地，15 20%左右的HCV感染者為自限性感染，超過80 85%的 感染者發展為慢性丙型肝炎，其中又有20%的可發展為肝纖維化，最終有4 5%的肝纖維 化患者發生肝細胞性肝癌，危害十分嚴重。!1(^基因組全長94001^，共編碼(』132、賂3、賂4、賂5等蛋白。目前，慢性丙型 肝炎主要治療方案是干擾素加利巴韋林聯合治療。治療前應進行HCV RNA基因分型(1型 和非1型)和血中HCV RNA定量，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量。因此，HCV 基因型的檢測在慢性丙型肝炎的治療中具有重要作用。由于HCV基因組具有極高的變異性，根據選擇的區段的不同，不同學者采用不同 的HCV分型方法，命名也不盡相同。一般說，國際上通常采用的分型方法有兩種，一種是 Simmonds基因分型法，主要是采用測序法分析NS5區222bp的變異情況，將HCV基因型分為 la、lb、lc、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a、6a等6個主要的基因型和11個亞型，伴隨大量新HCV基 因的克隆測序工作的進行，目前，HCV已經發現有30多個亞型；另一種是Okamoto基因分型 法，主要采用型特異性引物擴增C區基因，根據擴增片斷的長度，將HCV分為I-IV四個主要 的基因型。不同分型方法之間有一定的關聯性，象Simmonds確定的Ib亞型相當于Okamoto 分型的II型；而2a亞型相當于III型。除此以外，對El區的測序分析可以正確的區分 I/la、II/lb、III/2a、IV/2b、2c (V)、3a、4a、4b、4c、4d、5a、6a 共 12 種不同的基因型或亞型。 臨床研究顯示1b型HCV感染者IFN療效較差，而2a型感染者IFN敏感性較好。來自流行 病學的研究顯示，在我國，lb,2a兩種亞型感染率接近97%，因此，如何區分lb、2a感染在我 國臨床HCV治療中具有獨特的重要作用。目前，對HCV基因分型的方法除了序列分析法外，還增加了型特異性引物PCR擴增 法、型特異性探針雜交法、限制酶切多態性分析等方法，盡管后續方法降低了測序費用及縮 短了檢測時間，但仍需要HCV基因提取等過程，一般實驗室難以開展。另外，當HCV-RNA陰 性或由于保存不當及處理過程中HCV-RNA遭到破壞時，則不能進行基因分型。鑒于上述情況，有些學者提出了血清學分型，即篩選HCV各基因型特異性抗原表 位，合成相應多肽，采用間接酶聯免疫技術，根據患者體內型特異性抗體的存在情況，進行 HCV的血清學分型。目前，日本學者根據不同HCV基因型中C區氨基酸序列的差異，人工合 成2條多肽，血清1型多肽代表Okamoto分型的I和II型(Simmonds分型的la、lb)，血清 2號多肽代表Okamoto分型的III和IV型(Simmonds分型的2a、2b)，基于C區的血清分型 與基因分型具有較高的符合率，但分型率只有45 %，但具有很高的特異性；基于NS4血清分型試劑可以檢測1-6型，分型率為83% ；與基因分型的符合率為87%，目前，Murex已經推 出NS4血清分型的商品化試劑，但價格昂貴，且結果判斷復雜。造成血清分型率低的原因主要在于單獨使用C區、NS4抗原進行血清學分型，其抗 體檢出率偏低。事實上，HCV感染者體內針對HCV病毒產生的抗體情況十分復雜，存在針對 多個不同區的抗體，因此，HCV診斷通常通過采用多抗體聯合診斷的手段提高HCV抗體的檢 出率。而近些年對膜區E1、E2抗原的研究進展，超過90%以上的HCV慢性感染者體內都存 在針對膜區的抗體，但由于E1、E2抗原難以大量純化，直接影響膜區抗體在HCV檢測中的應 用，也影響其在HCV血清分型中的進一步應用。C區型別特異性抗原表位的位置主要位于65-81aa區間，但不同研究中選擇的序 列并不相同，缺少進一步核實；NS4型別特異性抗原表位的位置并不固定，其大體范圍位于 1690-1711范圍類，有15-21個氨基酸組成，尚需要對其型別特異性表位進行精確分析。而 關于膜區型別特性抗原的鑒定至今未見報道。為了提高HCV血清分型的分型率，本研究在對C、NS4、E1型別特異性抗原表位進行 分析鑒定的基礎上，利用基因序列拼接技術，克隆表達含有C、NS4、E1三個區段的融合型別 特異性抗原，并再此基礎上采用雙孔測試酶聯法對HCV血清進行分型。
發明內容
為了解決HCV基因分型技術難以用于臨床的目的，本發明提供一種建立在免疫酶 聯檢測技術基礎之上的HCV血清分型技術。為了提高HCV血清分型的分型率，本發明公開 了一種基于嵌合多區段型別特異性抗原進行多表位HCV血清分型的方法，克服了原有技術 中單獨使用C區、NS4抗原造成的檢出率偏低的問題。本發明除了對現有HCV血清分型通 常采用的C、NS4型別特異性抗原表位進行分析鑒定外，還增加了對El型別特異性抗原表位 篩選，利用基因序列拼接技術，克隆表達含有C、NS4、El三個區段的嵌合型別特異性抗原， 并在此基礎上建立多表位HCV血清分型技術，提高HCV血清分型的分型率。本發明提供一種丙型肝炎病毒(HCV)的lb、2a型別特異性的多表位嵌合抗原，其 特征在于，所述Ib型別抗原El區段包含氨基酸序列1、3、5，同時所述2a型別抗原El區段 包含氨基酸序列2、4、6，即，1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS2VEVRNISSSYYATNDCSNN3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA4QGHITGHRMAffDMMLNWSPTLT5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH所述Ib型別抗原NS4區段包含氨基酸序列7，同時所述2a型別抗原NS4區段包含 序列8，即，7VVAPDKEVLYEAFDEM8AIIPDREVLYQEFDEM所述Ib型別抗原C區段包含氨基酸序列9，同時所述2a型別抗原序列10，即，9KARRPEGRTWAQPGY
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10KDRRSTGKSWGKPGY。本發明還提供一種一種利用如上所述抗原進行丙型肝炎病毒(HVC)血清分型檢 測的方法，利用所述Ib型別抗原和2a型別抗原分別形成抗原包被酶聯板，并進一步分別形 成HCV-Ib孔板條和2a孔板條，將待測HCV血清分別加入兩孔內，利用間接ELISA法檢測 HCV血清于上述兩種抗原的反應性，根據每份血清與HCV-Ib和2a抗原孔反應的OD比值判 斷HCV的血清型，當0D-lb/0D-2a之間的比值大于等于1肝炎病毒血清型為Ib型，否則為 2a型。本發明是建立在對HCV膜區抗原表位和分子進化分析的基礎上目前，HCV血清分型試劑中主要采用的是C區和NS4區型別特異性抗原，在至今未 見對HCV-El區型別特異性抗原的報道。本發明在對HCV膜區抗原表位進行生物信息學分 析的基礎上，篩選主要的抗原表位區間；進一步采用分子進化的方法對上述抗原序列進行 同源比較，篩選其中的主序列，并通過血清學檢測驗證篩選表位的抗原性。同時，本發明發明是建立在含有HCV聯合多區段型別特異性嵌合抗原基礎之上。目前國際上廣泛采用的HCV分型檢測試劑均是建立在單抗原檢測的基礎上，其試 劑盒包被抗原只有C區或NS4區中的一種，由于感染者對HCV不同區段的抗體的產生情況 并不相同，因此，采用單一抗原對HCV型別特異性抗體進行檢測存在檢出率低的問題。故本 發明采用基因融合的方法，將C、NS4、El區進行多表位嵌合表達，在此基礎上建立HCV血清 分型技術，獲得較單一抗原檢測更高的血清分型率。本發明首先利用生物信息學軟件分析丙型肝炎病毒El、NS4區型別特異性抗原表 位，并利用多序列比較分析其中的共同序列，作為型別特異性抗原表位；由于C區型別特異 性表位明確，可直接采用多序列比較分析獲得其型別特異性抗原即可。HCV-C、NS4、E1三個 區段的lb、2a型別特異性抗原其氨基酸序列如序列1-序列10所示。采用合成肽技術合成上述El抗原表位，分別包被酶聯板，采用30分陽性血清對其 抗原表位的抗原性進行分析，選擇其中高抗原活性的El多肽。將Ib及2a型別特異性抗原按C、E1、NS4區的順序進行串聯后，采用大腸桿菌優勢 密碼子獲得嵌合lb、2a型別特異性抗原基因序列，采用退火延伸PCR法獲得嵌合lb、2a型 別特異性抗原基因，插入PGEX-4T-2載體。測序法鑒定陽性克隆，并保存菌種。大量培養后， IPTG誘導后，采用親和層析法和葡聚糖凝膠法純化相應的嵌合抗原。嵌合抗原的氨基酸序 列分別如序列表中序列11、12所示，SP11:AIIPDREVLYQEFDEMYEVRNVSGVYHVTNDCSNSKARRPEGRTWAQPGY12 :VVAPDKEVLYEAFDEMVEVRNISSSYYATNDCSNNKDRRSTGKSWGKPGY以上述嵌合抗原包被酶聯板，檢測每份HCV血清與Ib及2a型別特異性抗原，根據 OD-Ib與0D-2a的雙孔測試的比值判斷HCV的血清型。實驗結果證明，本發明所提供的HCV的血清分型檢測試劑能正確檢測34份Ib血 清中29份，16份2a血清中的9份，僅有2份Ib血清和3份2a血清未進行分型，總體分型 率達到90%，正確率為85%，均高于活接近國外報道。顯示HCV的血清分型檢測試劑具有 較高的正確率和分型率，在我國HCV臨床治療評價具有一定的應用價值。
圖1是HCV-El區序列的抗原表位的生物信息學分析圖2HCV-NS4區序列的抗原表位的生物信息學分析圖3HCV純化重組表位抗原SDS-PAGE鑒定結果
具體實施例方式以下結合附圖詳細說明本發明的具體實施方式
。本發明是通過以下技術方案得以實現的用生物信息學軟件對HCV抗原El、NS4區表位進行預測，確定El、NS4區主要的抗 原表位的氨基酸位置；采用分子進化軟件對比抗原序列，獲得相應的lb、2a型別特異性序 列；由于C區抗原表位明確，直接采用分子進化軟件分析其型別特異性抗原即可。利用合成 多肽和30份HCV內質控血清對上述多肽的抗原性進行鑒定，選擇其中高抗原活性的El多 肽，并按C、E1、NS4區的順序串聯lb、2a型別特異性嵌合抗原。本發明為了有利于lb、2a型別特異性嵌合抗原基因在E. coli中獲得高效的表達， 選擇大腸桿菌的偏性密碼子設計并合成嵌合抗原基因；為了便于基因克隆到表達載體，在 連接臂的兩端引入BamHI和EcoRI兩個酶切位點，以適合表達載體pGEX_4T_2 (參見中國專 利ZL00100695. 9 表達載體pBVILl及其構建方法和用途)。雙酶切后插入載體pGEX_4T_2 中，構建相應的表達質粒。測序法證明各基因片段已獲正確地插入。HCV-lb,2a型別特異性嵌合抗原表達質粒，轉化E. coli HBlOl后，通過熱誘導培 養，取全菌液進行SDS-PAGE鑒定，證明各表達質粒均已獲得了高效的表達，再經采用親和 層析及凝膠過濾純化，均可獲得電泳純的HCV-lb、2a型別特異性嵌合抗原純品。用ELISA 檢測HCV感染者血清與上述2種抗原與之間的反應性，并根據每份血清與HCVlb、2a型別特 異性抗原之間雙孔測試的比值判斷HCV的血清型。步驟1、HCV型別特異性抗原表位的選擇我們通過生物信息學軟件對HCV-El區序列的抗原表位進行預測，結果如圖1所 示，含有192-207aa、292-312aa和310-331aa共3個主要的抗原區段，采用CLUSTAL ff(l. 8) multiple sequence alignment對比獲得其型別特異性序列分別如如下序列1_序列6所
7J\ ο通過生物信息學軟件對HCV-NS4區序列的抗原表位進行預測，結果如圖2所示，其 抗原表位主要位于 1693-1708aa，采用 CLUSTAL ff(l. 8)multiple sequencealignment 對比 獲得其型別特異性序列分別如序列7和序列8所示；C區抗原表位主明確位于65-81aa，直 接采用CLUSTAL W分析其型別特異性抗原序列如序列9和序列10所示。序列1-10如下所示 1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS2VEVRNISSSYYATNDCSNN3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA4QGHITGHRMAffDMMLNWSPTLT5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH
7 :VVAPDKEVLYEAFDFM8 :AIIPDREVLYQEFDEM9 =KARRPEGRTffAQPGY10 =KDRRSTGKSffGKPGY采用合成肽技術合成上述HCV-El區6條型別特異性多肽，包被酶聯板，步驟2、HCV-lb,2a型別特異性嵌合多表位抗原的克隆與表達1. HCV-lb,2a型別特異性嵌合多表位抗原表達質粒的構建1. 1HCV-Ib、2a型別特異性嵌合多表位抗原基因的合成根據上述HCV_lb、2a型別特異性嵌合多表位抗原的氨基酸序列，采用大腸桿菌優 勢密碼子委托上海英駿生物技術服務有限公司合成上述序列的基因。1. 2HCV_lb、2a型別特異性嵌合多表位抗原表達質粒的構建1. 2. IPCR產物及表達載體pGEX_4T_2雙酶切取以上合成基因產物及PGEX-4T-2表達載體各30 μ 1分別放于E印pendorf離心 管中，各加入 10Xbuffer (H) 4 μ 1、BamH I(10u/y 1)和 EcoR I (12u/μ 1)各 1 μ 1，加滅菌 蒸餾水至40 μ 1，置37 °C水浴酶切過夜。酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收PCR產物及載體pBVILl經雙酶切后，用 1.2%瓊脂糖凝膠進行純化，具體方法按《分子克隆》(科學出版社，第二版)的方法進行。 純化基因再用上海華舜生物工程有限公司生產的小量膠回收試劑盒回收即在紫外燈下分 別切下含質粒和目的基因的瓊脂糖，放于E印pendorf離心管中，各加入Sl液，置55°C水浴 10分鐘使膠溶解，加入等量異丙醇，混勻，55°C溫浴1分鐘，然后分別移入吸附柱后，按試劑 盒說明書進行純化。1. 2. 2連接于滅菌E印pendorf離心管中加入上述酶切后的載體及目的基因 各 1 μ 1、10XT4DNA Ligase buffer 1 μ 1, T4DNA Ligase (12u/ul) 1 μ 1，加滅菌蒸溜水至 10μ 1，置 16°C 過夜。1. 2. 3轉化在超凈工作臺中，用無菌吸頭取100 μ 1感受態細胞(感受態細胞按 《分子克隆》(科學出版社，第二版)的方法進行)懸液于Eppendorf中，加入上述連接物 5 μ 1，輕輕旋轉混勻，冰浴30分。立即轉移到42°C水浴中放置2分鐘，每管加入0. 5ml LB 培養基(不加抗生素)，30°C水浴搖床培養60分鐘后，各取0. 2ml分別涂于LB瓊脂培養基 平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37°C恒溫箱倒置培養過夜。挑選數個菌落，分別接種 于LB中(5ml/管)，培養過夜，次日各取0. Iml轉移到LB中(2ml/管)，32°C培養3小時， 42°C水浴搖床中誘導培養4h，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇目的基因獲得高表達菌株，并測 序鑒定。2.抗原的表達與純化2. 1表達菌株的培養取_70°C保存的表達菌株20 μ 1接種于LB培養基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30°C空氣搖床培養過夜，次日按5 %的比例轉種于LB培養基(同上)， 30°C空氣搖床培養約3小時，當0D600值達到0. 7時，立即將培養瓶轉到42°C水浴搖床中， 誘導培養4小時。將菌液合并，6000rpm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。 2. 2提取包涵體將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/L pH8. OTE緩沖液將沉淀 懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次
7超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8°C, 1，2000rpm,離心20分鐘，棄上清，沉淀用Imol/ L NaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8. OTE配制) 溶解，加β _巰基乙醇。再于20°C，1，2000rpm，離心10分鐘，去沉淀取上清。2. 3純化將上述溶解的包涵體溶液過Q-S印harose FF陰離子交換柱，用平衡液 (pH8.0,20mmol/L TE含6mol/L脲，0. 1 % β -巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl (用 平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經SDS-PAGE鑒定，收集0.05mol/L NaCl洗脫峰。再過 Sephardex G-50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰。各種純化重組表位抗原均用SDS-PAGE鑒 定，結果如附圖3。步驟3嵌合HCV-Ib、2a多表位抗原在血清分型檢測中的應用分別采用嵌合HCV_lb、2a多表位抗原包被酶聯板，形成HCV-Ib孔板條和2a孔板 條，將待測HCV血清分別加入兩孔內，利用間接ELISA法檢測HCV血清于上述兩種抗原的反 應性，根據每份血清與HCV-Ib和2a抗原孔反應的OD比值判斷HCV的血清型。當OD-Ib/ 0D_2a之間的比值大于等于1為Ib型，否則為2a型。采用上述方法對34份HCV-Ib和9份2a血清進行血清分型，結果如表1所示HCV 的血清分型檢測試劑能正確檢測中29份HCV-Ib血清和9份HCV-2a血清，僅有2份Ib血 清和3份2a血清未進行分型，總體分型率達到90% (45/50)，正確率為85% (38/45)，均高 于或接近國外報道，提示本發明提出的HCV的血清分型檢測試劑具有較高的正確率和分型 率，在我國HCV臨床治療評價具有一定的應用價值。表IHCV抗體分型檢測
權利要求
一種丙型肝炎病毒(HCV)的1b、2a型別特異性的多表位嵌合抗原，其特征在于，所述1b型別抗原E1區段包含氨基酸序列1、3、5，同時所述2a型別抗原E1區段包含氨基酸序列2、4、6，即，1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS2VEVRNISSSYYATNDCSNN3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH所述1b型別抗原NS4區段包含氨基酸序列7，同時所述2a型別抗原NS4區段包含序列8，即，7VVAPDKEVLYEAFDEM8AIIPDREVLYQEFDEM所述1b型別抗原C區段包含氨基酸序列9，同時所述2a型別抗原序列10，即，9KARRPEGRTWAQPGY10KDRRSTGKSWGKPGY。
2.一種利用如權利要求1所述抗原進行丙型肝炎病毒(HVC)血清分型檢測的應用。
全文摘要
本發明公開了一種丙型肝炎病毒特異性抗原及其在血清分型中的應用。具體公開了一對含有丙型肝炎病毒(HCV)膜區的型別特異性嵌合抗原序列，還公開了利用該抗原進行丙型肝炎病毒血清中分型檢測的方法。本發明主要采用免疫酶聯檢測技術，無需病毒基因的提取，可操作性強。含膜區嵌合抗原的使用較以往單抗原能提高HCV血清的分型率，本發明的檢測結果與基因檢測具有較好的一致性。
文檔編號C07K19/00GK101942021SQ20101022687
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者何競, 修冰水, 馮曉燕, 凌世淦, 宋曉國, 張賀秋, 楊錫琴, 王國華, 陳堃 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所