專利名稱：一種小麥凝集素類蛋白TaJRL1及其編碼基因與應用的制作方法
一種小麥凝集素類蛋白TaJRLI及其編碼基因與應用
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及一種來源于小麥的凝集素蛋白 TaJRLl及其編碼基因與應用。
背景技術：
植物在整個生命周期中會面臨各種細菌、真菌、病毒、蚜蟲、蝗蟲、螟蟲、飛蛾等病 蟲害的危害等，這些病蟲害對植物生長發育產生諸多不利的影響。為了應對各種病蟲害， 植物自身形成了一系列調控機制除了通過在侵染部位合成和積累木質素、植保素等物質 來阻止病菌的入侵和擴展之外，植物還通過誘導防衛反應產生廣譜抗性來應對病原菌的侵 入。研究表明，植物的防衛反應受兩類基因的控制，一類是R基因，一類是病程相關基因，前 者屬于基礎抗性，后者屬于誘導型抗性。R基因產物作為受體，直接或者間接的參與病原蛋 白互作，從而啟動植物體內的抗病信號途徑。這類抗病反應產生的抗病性較強，但是由于R 基因的資源有限，尤其是對某些復雜的數量性狀抗病性如小麥的赤霉病抗性，這類R基因 的獲得尤其困難。除開資源有限較難獲得之外，R基因介導的抗性具有病原種類和病原生 理小種的特異性，抗譜不廣，抗性易于喪失。與R基因相比較，病程相關基因介導的抗性具 有抗性持久、抗譜廣泛和資源豐富等優點。在缺乏R基因的情況下，通過克隆病程相關基因 提高植物的抗性顯得尤為重要。這類病程相關基因的共同特點是在經過病原菌誘導后表達 量明顯升高或減少。小麥是世界上重要的糧食作物之一，但病蟲害的影響往往導致產量和品質的下 降。病原菌對植物的侵害及引起的一系列防衛反應在不同植物與病原菌之間存在相似性， 因此，我們可以通過抗病反應相關基因的應用來提高植物廣譜及長效的抗性。抗病反應的 調控因子分為正調控因子和負調控因子兩類。正調控因子的超量表達，可以快速而有效的 啟動抗病反應，提高植物的抗病性，拓寬植物的抗譜；而抑制該基因的表達則會導致抗病性 的減弱。凝集素是一類非免疫起源的糖結合蛋白，各種生物中分布廣泛、種類眾多，家族內 各成員的結構和功能亦差異懸殊。根據特征性質的不同可以將植物凝集素分為七個亞家 族莧科凝集素、葫蘆科韌皮部凝集素、橡膠蛋白結構域凝集素、豆科凝集素、單子葉植物甘 露糖結合凝集素、II型核糖體失活蛋白凝集素和jacalin相關凝集素。值得說明的是，本 發明的TaJRLl蛋白是來源于小麥的jacalin相關凝集素，在本發明提出之前，Genbank中 與TaJRLl的同源性最高的多肽鏈為大麥的mJRL蛋白LEM2，兩者的同源性僅為48%。
發明內容
技術要求本發明所要解決的技術問題是提供一種抗病蟲相關的小麥凝集素類蛋白TaJRLl。本發明還要解決的技術問題是提供上述蛋白的編碼基因。本發明還要解決的技術問題是提供上述基因在培育抗病蟲品種中的應用。
技術方案為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下—ft/J^II^S^SS TaJRLKTriticum aestivum Jacalin Related Lectin), 它是具有序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO :2的氨 基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO 2的氨 基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白質。 所述的小麥凝集素類蛋白TaJRLl優選具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸 序列。該蛋白包含301個氨基酸，等電點為6. 36，含有2個jacalin結構域，一個結構域為 AA21-AA148，第二個結構域為AA163-AA298。在NCBI網站上進行序列比對沒有發現與該多 肽鏈同源性超過50%的蛋白序列公布。在已公布的蛋白序列中，與該多肽鏈同源性最高的 蛋白質序列是大麥mJRL蛋白LEM2，兩者之間的同源性僅為48%。因此，TaJRLl是一個新 的jccalin類似蛋白。上述小麥凝集素類蛋白TaJRLl的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO :1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸 序列。小麥凝集素類蛋白TaJRLl的編碼基因優選序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸 序列。小麥凝集素類蛋白TaJRLl的編碼基因含有906bp的核苷酸。含有上述基因TaJRLl的表達載體和轉基因細胞系也在本發明的保護范圍之內， 利用現有分子生物學的方法可以得到不同的表達載體和轉基因細胞系。上述基因TaJRLl在培育抗病蟲品種中的應用。利用任何一種可以引導外源基因 在植物中超量表達的載體，將本發明所提供的凝集素類基因TaJRLl導入植物細胞，可獲得 改變植物對白粉病、赤霉病和棉鈴蟲的抗性的轉基因細胞系及轉基因植株。為了便于對轉 基因植物或轉基因植物細胞進行篩選，可以對載體進行加工，如加入抗生素標記基因(如 潮霉素、卡那霉素和慶大霉素)，加入抗生素標記基因之后的載體用于轉化，可以在轉化后 的植物培養基中加入抗生素，抑制非轉基因細胞系和植株的生長，有助于快速和有效的獲 得轉基因植株。為了便于觀察外源基因的表達，可以在載體中啟動子和外源基因之間加入 報告基因(GUS基因、GFP和熒火蟲熒光素酶報告基因)，構建報告基因和外源基因融合表 達的載體，該載體用于遺傳轉化，可以通過觀察報告基因的表達與否和表達量高低，推測外 源基因在植物體內表達情況。為了轉基因植物釋放的安全性，也可以構建載體時不攜帶任 何篩選標記基因，而在苗期進行PCR檢測。含有本發明的TaJRLl表達載體可通過使用基因 槍法、農桿菌介導法、花粉管通道，電擊，顯微注射，Ti質粒，Ri質粒或植物病毒等常規生物 學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化后的植物細胞培育成完整的植株。被轉化的植株材 料既可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，如水稻、棉花、小麥、大豆、煙草、擬南芥、大 麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等。TaJRLl基因可提高南芥對赤霉菌的抗性。TaJRLl基因可提高煙草對棉鈴蟲的抗性。TaJRLl基因可提高小麥對白粉病的抗性。
有益效果通過基因工程的方法將本發明提供的小麥凝集素類蛋白轉入植物中，可以提高植 物對棉鈴蟲、赤霉病和白粉病的抗性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內源基因，因 此，該基因的超量表達不會影響植物的食品安全性，可以廣泛應用于各種植物的抗病蟲性 育種過程。
四
圖IA為轉基因擬南芥的PCR檢測。圖IB為轉基因擬南芥的赤霉菌抗性得到了提高。圖2A為轉基因煙草的PCR檢測。圖2B為轉基因煙草對棉鈴蟲的抗性得到了提高。圖3為構建的TaJRLl基因的體外轉錄載體結構。圖4A為VIGS處理后小麥中TaJRLl基因表達豐度降低。圖4B為TaJRLl基因被沉默后小麥的白粉病抗性降低。
五具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發 明。實施例1 =TaJRLl蛋白的獲得。在抗赤霉病材料望水白開花期，將赤霉菌孢子液用噴霧器噴灑到穗部，所用孢子 液為江蘇省范圍內強致病力赤霉菌菌株F4、F15, F17及F34的分生孢子混合液，接種后立即 將穗子套上塑料袋，保持濕度，以保證赤霉菌發病。在接種后6小時、12小時和24小時后 分別取麥穗，同時用水接種做為對照，取材后立即用液氮冷凍。取700mg凍存的麥穗，加入 70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL 10%三氯醋酸/丙酮振蕩混勻、-20°C沉淀1小 時；4°C 15，00(^離心151^11，沉淀重新懸浮于51^冷丙酮中，-201放置2小時；4°C 15，OOOg 離心15min，沉淀懸浮于80%的冷丙酮中，_20°C放置1小時，離心去丙酮，將沉淀干燥成 粉。按每mg干粉加入10 μ L裂解液(7Μ脲，2Μ硫脲，4% CHAPS，1% CA，0. 3%蛋白酶抑制 劑，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C攪拌抽提15min后加入14mM的DTT ；4°C再攪 拌20min，然后35，00(^離心10!^11，上清即為蛋白抽提液。將蛋白提取液進行等電聚焦后， 進行SDS-PAGE電泳。電泳緩沖液用Tris-Glycine-SDS緩沖液，溫度設為17°C;先用2. 5W/ 膠預電泳30min后，再用5W/膠電泳至溴酚藍到玻璃板下緣為止。電泳結束后，取下凝膠進 行銀染。分析在侵染后蛋白點的豐度與對照相比超過3倍的蛋白點，取一個分子量為31. 1 千道爾頓，等電點為6. 36的蛋白點即為TaJRLl蛋白。實施例2 編碼TaJRLl蛋白的cDNA序列的獲得。對實施例1得到的蛋白點進行質譜分析獲得其氨基酸組成信息，根據對應肽片段 的EST用來搜索小麥EST數據庫，得到了 3條EST序列CK163175，CK163203和CK163203， 將上述3條EST序列進行拼接，然后用MacVector軟件設計引物Pl，Pl引物對如下F_5'-ATGGCCGGCGCTGTGAAGATTGGT-3 ‘ ；R-5' -GTCATCCAGCGGCACGACATA-3 ‘。以抗病種質望水白的穗部cDNA作為模板，用英俊公司的Trizol試劑盒提取小麥穗部的總RNA，采用Promega 公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄，合成單鏈cDNA。用引物Pl進行PCR擴增，擴增體系為 25 μ L,包括 5ng 模板，F 和 R 引物各 5pmol，dATP, dTTP, dCTP 和 dGTP 各 5nmol，37. 3nmol MgCl2,0. 5單位的DNA聚合酶，Ix PCR緩沖液。擴增的程序是94°C變性3分鐘；30個循環， 94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸1. 2分鐘；最后72°C延伸5分鐘。通過PCR擴 增，獲得了包含開放讀碼框的906bp的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1所示。該序列編碼301 個氨基酸，如SEQ ID N0:2所示，等電點為6.36，含有2個扭(^1111結構域，一個結構域為 AA21-AA148，第二個結構域為 AA163-AA298。
實施例3 轉TaJRLl基因擬南芥的赤霉菌抗性得到提高。以抗病種質望水白的穗部cDNA作為模板，利用引物P2進行PCR擴增，P2弓丨物對 如下F-5' -TAATCTAGAATGGCCGGCGCTGTGAAGATT-3 ‘ ；R 5' -TAAGGATCCGTCATCCAGCGGCA CGACATA-3 ‘。將擴增得到的PCR產物用限制性內切酶XbaI和BamHI進行酶切后，與經過 同樣限制性內切酶進行酶切的PBI121表達載體進行連接，獲得由CaMV35S啟動子啟動的 TaJRLl超量表達的質粒載體。構建好的載體通過電擊法轉化到LBA4404農桿菌菌株中，通 過含有50 μ g/mL的卡那霉素和50 μ g/mL的利福平的LB培養基進行篩選，獲得陽性克隆。 參照1998年Clough和Bent發表在Plant Journal第16期735-743頁上的文章中的材料 與方法，在擬南芥花期將攜帶有TaJRLl超量表達載體的農桿菌菌液浸泡花器官進行遺傳 轉化，收獲到的擬南芥種子種植于含有50 μ g/mL卡那霉素的1/2MS培養基上進行篩選，獲 得TaJRLl超量表達的抗卡那霉素的轉基因擬南芥。擬南芥自交繁殖后，將T3代轉基因擬 南芥葉片和非轉基因葉片同時接種赤霉菌，3天后進行赤霉病抗性鑒定，所用赤霉菌為江蘇 省內感染小麥的強赤霉菌(F4，F15，F17，F34)菌株的混合物。結果表明，轉基因植株對赤 霉菌的抗性增強，葉片上赤霉菌菌絲生長變慢(圖1)。實施例4 轉TaJRLl基因煙草對棉鈴蟲的抗性得到提高。按照Khodakovskaya 在 2006 年發表在 Plant Cell R印ort 第 25 期 1181-1192 頁 的文章中的實驗方法，取幼嫩的煙草葉片進行消毒后，于添加2mg/L 2,4-D的MS培養基上 進行誘導愈傷組織，15天后，將上述攜帶有TaJRLl超量表達載體的農桿菌菌液浸泡誘導獲 得的愈傷組織，進行遺傳轉化，轉化后用含有100 μ g/mL卡那霉素的培養基進行篩選，獲得 抗性轉基因植株。通過人工飼喂得到棉鈴蟲的3齡幼蟲，停止喂食棉鈴蟲2小時后，稱量棉 鈴蟲的初始體重，分別用T2代轉基因煙草和野生型非轉基因煙草葉片飼喂，每個葉片飼喂 6頭3齡棉鈴蟲，36小時后再次稱量棉鈴蟲的重量。用飼喂過程中增加的棉鈴蟲重量占棉 鈴蟲初始重量的比例來表示相對生長量，實驗設置了 3次重復。發現轉基因煙草飼喂的棉 鈴蟲的生長明顯受到抑制(表1，圖2)。表1轉基因煙草和非轉基因煙草飼喂棉鈴蟲對棉鈴蟲生長的影響 實施例5 沉默TaJRLl基因降低小麥對白粉病的抗性。以抗病種質望水白的穗部cDNA作為模板，用引物P3進行PCR擴增，引物P3如下 F-5' -ATATTAATTAACCTTCATCAGCGGCACCTAC-3' ；R-5' -CAGATAGCTAGTCATCCAGCGGCACGACA AAG-3 ‘。擴增產物用NotI和PacI進行雙酶切，酶切后的基因片段和同樣經NotI和PacI雙 酶切的野生型BSMV ND18 γ質粒連接，(BSMV ND18 α、β及γ載體，引自美國堪薩斯州立大 學Scofield實驗室)，構建體外轉錄載體(圖3)，通過熱激法將該載體轉化大腸桿菌DH5 α 菌株中。提取野生型BSMV ND18 α、β、γ及BSMV =TaJRL的質粒DNA。用MluI單酶切BSMV ND18 α、γ及BSMV :TaJRL2質粒DNA，用SpeI單酶切BSMV ND18 β質粒DNA。將酶切完全的 線性化質粒DNA用體積比為25 24 1的苯酚氯仿；異戊醇進行純化。以純化好的線性 化質粒DNA為模板，用Ambion公司的Τ7. mMessage Machine Kit試劑盒的實驗步驟體外合 成RNA。在小麥生長一周后，用體積比為0. 05%的Tween20溶液將葉片洗2_3遍，除去葉片 表面的蠟質，然后再用無菌水清洗2-3遍，待葉片表面晾干。配制FES溶液0. 2mol/L甘氨 酸，0. 6mol/L磷酸氫二鉀，10g/L焦磷酸鈉，10g/L膨潤土(美國Fluka公司，貨號#11959)和 10g/L硅藻土(美國Fluka公司，貨號#22141)。將分別以野生型BSMV ND18 α、β及Υ為 模板體外轉錄的3種RNA與FES按1 1 1 22的比例混合，將以野生型BSMV ND18 α、 β及BSMV =TaJRLl為模板體外轉錄的3種RNA與FES也按1 1 1 22的比例混合。 用上述兩種混合液分別涂抹處于同一生長期不同植株的葉片。涂抹病毒RNA 7天后取部分 接種植株的葉片提取RNA，反轉錄為cDNA，進行實時定量PCR檢測，發現涂抹攜帶TaJRLl病 毒的植株中TaJRLl的表達明顯受到抑制(圖4A)。接著，接種白粉菌生理小種Bgtl9，7天 后，對每株接種白粉病的材料進行抗性調查，以未進行接種的材料和只接種不攜帶TaJRLl 的病毒作為對照，發現TaJRLl的沉默降低了小麥對白粉病的抗性(圖4B)。
權利要求
一種小麥凝集素類蛋白TaJRL1，它是具有序列表中SEQ IDNO2所示的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNO2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的小麥凝集素類蛋白TaJRLl，其特征在于，所述的小麥凝集素 類蛋白TaJRLl具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.小麥凝集素類蛋白TaJRLl的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 1所示的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQID NO 2所示的氨基酸序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO 1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的小麥凝集素類蛋白TaJRLl的編碼基因，其特征在于小麥凝集 素類蛋白TaJRLl的編碼基因是序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
5.權利要求3所述的基因在培育抗病蟲品種中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于TaJRLl基因在提高南芥對赤霉菌抗性中的應用。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于TaJRLl基因在提高煙草對棉鈴蟲抗性中的應用。
8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于TaJRLl基因在提高小麥對白粉病抗性中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種小麥凝集素類蛋白TaJRL1，它是具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO2衍生的蛋白質。本發明還公開了上述小麥凝集素類蛋白TaJRL1的編碼基因及該基因的應用。通過基因工程的方法將本發明提供的小麥凝集素類蛋白轉入植物中，可以提高植物對棉鈴蟲、赤霉病和白粉病的抗性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內源基因，因此，該基因的超量表達不會影響植物的食品安全性，可廣泛應用于各種植物的抗病蟲性育種過程。
文檔編號C07K14/42GK101885765SQ20101022682
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者向陽, 宋敏, 賈海燕, 馬正強 申請人:南京農業大學