專利名稱：一種合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法
技術領域：
本發明屬于海產品加工技術領域，具體涉及一種合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備 方法。
背景技術：
合浦珠母貝，屬珍珠貝科珠母貝屬，是世界上生產養殖珍珠的主要貝種。我國海 南、廣東、廣西等省馬氏珠母貝資源豐富。自六十年代中期我國合浦珠母貝人工育苗取得成 功并大批量生產之后，合浦珠母貝養殖業得到快速發展，養殖產量從1981年14. 5公斤增到 2009年的10000公斤。目前海南有海水珍珠養殖場1000多個，出產的珍珠占全國海水珍珠 總產量的30 40%。合浦珠母貝開珠后產生大量的貝肉，合浦珠母貝肉富含蛋白質、脂肪 含量低，營養價值很高，目前只有少量加工為珍珠貝肉干，產品形式單一，高值化加工幾乎 沒有。如何合理高值化利用珍珠貝肉資源，是合浦珠母貝養殖產業急需解決的問題。隨著現代社會的發展，生存環境的惡化以及社會壓力的加大使現代人的健康受到 嚴重的威脅，自由基引起機體損傷變性，導致機體各種疾病產生，已經引起人們強烈的重 視。抗氧化劑的消費量越來越大，低價、高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開發成為研究熱 點，其中以分子量小、易吸收、活性強，能有效地清除體內過剩的活性氧自由基，保護細胞和 線粒體的正常結構和功能，防止脂質過氧化的發生等研究為主。天然抗氧化劑在醫藥、化妝 品、保健品和食品與飼料添加劑等方面應用前景廣闊，篩選具有強抗氧化活性的天然資源 已成為食品科學、生物學、醫學等研究的新趨勢。目前關于合浦珠母貝貝肉抗氧化寡肽的制 備工藝方面的研究較少，還存在很大的開發空間。
發明內容
本發明的目的是提供一種合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，該方法操作簡單 安全環保，使合浦珠母貝開珠后的貝肉得到高值化利用，可提高生產企業的經濟效益。本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的一種合浦珠母貝肉抗氧化寡肽 的制備方法，含以下步驟(1)冷勻漿選取貝肉置于預冷水中勻漿后得貝肉勻漿液；(2)超聲波復合酶解處理在貝肉勻漿液中加入堿性蛋白酶，混勻，將上述貝肉勻 漿液和堿性蛋白酶的混合液置于超聲儀器中，調節頻率為35kHz、功率為280 360W，并調 節溫度為45 65°C進行酶解50 70min ；(3)進一步酶解將超聲波復合酶解后的貝肉勻漿液置于45 60°C的水浴中進行 繼續恒溫酶解0. 5 2h，酶解完畢進行滅酶處理、冷卻后離心分離得含合浦珠母貝肉抗氧 化寡肽的上清液；(4)膜分離和純化處理將含合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的上清液依次采用截留分 子量為5 lOkDa和lkDa的超濾膜進行逐步分離，收集濾液，即得到合浦珠母貝肉抗氧化 寡肽液，經純化處理得合浦珠母貝肉抗氧化寡肽粉末。
上述制備方法中步驟(1)中所述的貝肉需經預處理，所述的預處理過程為選取冷凍貝肉解凍或 鮮貝肉，除去內臟，用清水清洗2 3次，浙水5min以上。步驟(1)中所述的貝肉與預冷水的重量體積比為1 0. 5 1. 0。步驟(1)中預冷水的溫度為0 10°C，勻漿時間為2 5min。步驟(2)中所述的堿性蛋白酶的添加量為每克貝肉勻漿液中加入1800 2500U。步驟(3)中滅酶的溫度為100°C，滅酶的時間為5 lOmin。步驟(3)中離心分離的過程是調節冷凍離心機的轉速為10000 15000r/min， 在0 4°C下離心15 25min。步驟⑷中超濾膜分離的條件是操作壓力為3 4bar，溫度為3 10°C。優選的，步驟(4)中的純化處理過程為將所得的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液經 冷凍干燥得合浦珠母貝肉抗氧化寡肽粉。優選的，步驟(4)中的純化處理過程為將所得的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液采 用無水乙醇脫水后再經減壓濃縮得合浦珠母貝肉抗氧化寡肽粉。本發明與現有技術相比，具有以下的優點(1)本發明通過超聲波復合酶解及超濾技術相結合的集成技術，將合浦珠母貝肉 通過堿性蛋白酶進行酶解，利用超聲波技術具有波動和能量的雙重屬性，一是空化現象，即 在液體介質中表現為泡的形成和破裂及伴隨的能量釋放，二是介質和容器也可以通過聲的 吸收產生共振性質的二級效應，所以在超聲波的輔助作用下促進堿性蛋白酶對合浦珠母貝 肉進行水解，通過控制酶解的時間、溫度、加酶量、料水比例，獲取具有高抗氧化活性的寡 肽。不僅對南海主要養殖珍珠貝_合浦珠母貝開珠后大量的貝肉進行高值化利用，而且得 到具有功能保健作用的抗氧化寡肽，可廣泛應用于食品、化妝品等輕工行業及醫藥保健，促 進海水養殖珍珠產業的可持續發展，具有重要的經濟意義和社會意義。(2)合浦珠母貝肉通過堿性蛋白酶進行酶解，水解度約為33.8%，平均肽鏈長度 約為3. 2，得到的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液體為透明無色，固體為淺黃色粉末。產品具有 較強的抗氧化活性，特別是對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基等的清除能力較強，具有 良好的吸濕能力與保濕能力。(3)該工藝操作簡單，超聲波輔助酶解可以大大提高水解率，縮短水解時間，生產 成本低，產品安全，可提高生產企業的經濟效益。
具體實施例方式以下列舉具體實施例對本發明進行說明。需要指出的是，實施例只用于對本發明 作進一步說明，不代表本發明的保護范圍，其他人根據本發明的提示做出的非本質的修改 和調整，仍屬于本發明的保護范圍。實施例1本實施例提供的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法如下(1)貝肉預處理將凍貝肉解凍，除去內臟，用清水清洗2次，放在不銹鋼或塑料框 中浙水5min以上；(2)冷勻漿將水先預冷到4°C，稱取貝肉，按重量體積比為1 0.5加入預冷水，置于組織搗碎機中勻漿5min，得到貝肉勻漿液；(3)加酶、超聲波處理將貝肉勻漿液置于不銹鋼杯中，添加諾維信食品級堿性蛋 白酶Alcalase 2. 4L蛋白酶，丹麥NOVO公司產品，酶活為2. OX 104U/g，按貝肉勻漿液的重 量添加酶，每克貝肉勻漿液中添加2000U的Alcalase 2. 4L蛋白酶，攪勻后，放在超聲波儀 器中，調節超聲波工作頻率為35kHz、超聲波的強度為280W、控制處理溫度為45°C，時間為 70min ；(4)進一步酶解經超聲波處理后，將步驟(3)中的貝肉勻漿液繼續在45°C恒溫水 浴酶解2h，在100°C下滅酶lOmin，滅酶后迅速冷卻；(5)離心將步驟(4)中的酶解液在冷凍離心機中離心，離心機的轉速為10000r/ min，4°C下離心25min，取上清液；(6)超濾利用膜分離技術對步驟(5)中的上清液進行分離，膜分離的操作壓力為 3. 5bar，超濾溫度為4°C，先用截留分子量為lOkDa的超濾膜進行分離，收集濾液，濾液再用 截留分子量為5kDa的超濾膜進一步分離，收集濾液，濾液再用截留分子量為lkDa的超濾膜 進一步分離，收集濾液，即得到合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液，呈無色透明；(7)純化將上述合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液經凍干得到白色抗氧化寡肽粉。實施例2本實施例提供的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法如下(1)冷勻漿選取鮮貝肉，除去內臟，用清水清洗3次，浙水5min以上，然后按除去 內臟的鮮貝肉與預冷水的重量體積比為1 1.0，置于5°C的預冷水中勻漿5min后得貝肉 勻漿液；(2)超聲波復合酶解處理在貝肉勻漿液中加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶可采用 市售地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶，其酶活力為2.0\105 10\10力/^，其它可達到類似效果 的堿性蛋白酶也可，地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶的添加量為每克貝肉勻漿液中加入2500U，混 勻，將上述貝肉勻漿液和地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶的混合液置于超聲儀器中，調節頻率為 35kHz、功率為300W，并調節溫度為50°C進行酶解50min ；(3)進一步酶解將超聲波復合酶解后的貝肉勻漿液置于50°C的水浴中進行繼續 恒溫酶解1. 5h，酶解完畢進行滅酶處理，滅酶的溫度為100°C，滅酶的時間為8min，冷卻后 離心，離心機的轉速為12000r/min，2°C下離心20min，取含合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的上
清液；(4)膜分離和純化處理將含合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的上清液進行膜分離，膜 分離的操作壓力為4. Obar，超濾溫度為5°C，先用截留分子量為8kDa的超濾膜進行分離，收 集濾液，濾液再用截留分子量為5kDa的超濾膜進一步分離，收集濾液，濾液再用截留分子 量為lkDa的超濾膜進一步分離，收集濾液，即得到合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液，將所得的 合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液采用無水乙醇脫水后再經減壓濃縮得合浦珠母貝肉抗氧化寡 肽粉。實施例3本實施例提供的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法如下(1)貝肉預處理將凍貝肉解凍，除去內臟，用清水清洗3次，放在塑料框中浙水 lOmin ；
(2)冷勻漿將水先預冷到8°C，稱取貝肉，按重量體積比為1 0.8加入預冷水， 置于組織搗碎機中勻漿4min，得到貝肉勻漿液；(3)加酶、超聲波處理將貝肉勻漿液置于玻璃燒杯中，添加諾維信食品級堿性蛋 白酶Alcalase 2. 4L蛋白酶，丹麥NOVO公司產品，酶活為2. OX 104U/g，按貝肉勻漿液的重 量添加酶，每克貝肉勻漿液中添加1800U的Alcalase 2. 4L蛋白酶，攪勻后，放在超聲波儀 器中，調節超聲波工作頻率為35kHz、超聲波的強度為360W、控制處理溫度為60°C，時間為 60min ；(4)進一步酶解經超聲波處理后，將步驟(3)中的貝肉勻漿液繼續在60°C恒溫水 浴酶解1. 0h，在100°C下滅酶5min，滅酶后迅速冷卻；(5)離心將步驟(4)中的酶解液在冷凍離心機中離心，離心機的轉速為15000r/ min，0°C下離心15min，取上清液；(6)超濾利用膜分離技術對步驟(5)中的上清液進行分離，膜分離的操作壓力 為3bar，超濾溫度為10°C，先分別用截留分子量為6kDa的超濾膜進行分離，收集濾液，濾液 再用截留分子量為lkDa的超濾膜進一步分離，收集濾液，即得到合浦珠母貝肉抗氧化寡肽 液，呈無色透明；(7)純化將上述合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液經凍干得到白色抗氧化寡肽粉。
權利要求
一種合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于含以下步驟(1)冷勻漿選取貝肉置于預冷水中勻漿后得貝肉勻漿液；(2)超聲波復合酶解處理在貝肉勻漿液中加入堿性蛋白酶，混勻，將上述貝肉勻漿液和堿性蛋白酶的混合液置于超聲儀器中，調節頻率為35kHz、功率為280～360W，并調節溫度為45～65℃進行酶解50～70min；(3)進一步酶解將超聲波復合酶解后的貝肉勻漿液置于45～60℃的水浴中進行繼續恒溫酶解0.5～2h，酶解完畢進行滅酶處理，冷卻后離心分離得含合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的上清液；(4)膜分離和純化處理將含合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的上清液依次采用截留分子量為5～10kDa和1kDa的超濾膜進行逐步分離，收集濾液，即得到合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液，經純化處理得合浦珠母貝肉抗氧化寡肽粉末。
2.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(1) 中所述的貝肉需經預處理，所述的預處理過程為選取冷凍貝肉解凍或鮮貝肉，除去內臟， 用清水清洗2 3次，浙水5min以上。
3.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(1) 中所述的貝肉與預冷水的重量體積比為1 0. 5 1. 0。
4.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(1) 中預冷水的溫度為0 10°C，勻漿時間為2 5min。
5.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(2) 中所述的堿性蛋白酶的添加量為每克貝肉勻漿液中加入1800 2500U。
6.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(3) 中滅酶的溫度為100°C，滅酶的時間為5 lOmin。
7.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(3) 中離心分離的過程是調節冷凍離心機的轉速為10000 15000r/min，在0 4°C下離心 15 25min。
8.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(4) 中超濾膜分離的條件是操作壓力為3 4bar，溫度為3 10°C。
9.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟(4) 中的純化處理過程為將所得的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液經冷凍干燥得合浦珠母貝肉抗 氧化寡肽粉。
10.根據權利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，其特征在于步驟 (4)中的純化處理過程為將所得的合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液采用無水乙醇脫水后再經 減壓濃縮得合浦珠母貝肉抗氧化寡肽粉。全文摘要
一種合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的制備方法，含以下步驟(1)冷勻漿選取貝肉于預冷水中勻漿得貝肉勻漿液；(2)超聲波復合酶解處理在貝肉勻漿液中加入堿性蛋白酶，混勻，在超聲波作用下進行酶解；(3)進一步酶解將超聲波復合酶解后的勻漿液于水浴中進行繼續恒溫酶解，酶解完畢滅酶，冷卻后離心分離得含合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的上清液；(4)膜分離和純化處理將含合浦珠母貝肉抗氧化寡肽的上清液依次采用5～10kDa和1kDa的超濾膜進行逐步分離，收集濾液，即得到合浦珠母貝肉抗氧化寡肽液，經純化處理得其粉末。該方法操作簡單，工藝新，超聲波輔助酶解可大大提高合浦珠母貝肉的水解率，縮短水解時間，降低生產成本。
文檔編號C07K1/14GK101892280SQ20101021453
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者刁石強, 吳燕燕, 尚軍, 岑劍偉, 李有寧, 李來好, 楊賢慶, 陳勝軍, 馬海霞, 黃卉 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所