專利名稱：使用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分離技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種使用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法。
背景技術(shù)：
抗生素發(fā)明以來(lái)，不僅在人類疾病的治療和預(yù)防方面效果顯著，同時(shí)在畜牧業(yè)飼料添加劑方面也發(fā)揮著巨大的作用。抗生素對(duì)動(dòng)物的促生長(zhǎng)作用是在20世紀(jì)40年代后期由Stocktadt等人發(fā)現(xiàn)，以后相繼發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β -內(nèi)酚胺類等抗生素加入飼料中，都有促進(jìn)生長(zhǎng)、增重、增產(chǎn)、提高飼料報(bào)酬作用。1950年美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)允許在飼料中添加抗生素?？股貙?duì)于畜禽的生長(zhǎng)和提高生產(chǎn)性能的作用是肯定的，而且很穩(wěn)定，許多國(guó)家的畜禽業(yè)都長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素添加劑。實(shí)踐證明，合理地使用抗生素添加劑能促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率。同時(shí)也有報(bào)告顯示，不允許在飼料中添加抗生素或其他抗菌促生長(zhǎng)劑的國(guó)家，會(huì)造成畜牧業(yè)生產(chǎn)成本增加，盈利減少，同時(shí)也有可能引發(fā)諸如生態(tài)環(huán)境及國(guó)家之間的貿(mào)易戰(zhàn)等問(wèn)題。但為了避免由于抗生素的濫用引起耐藥菌株大量繁殖或使藥物在畜產(chǎn)品中的殘留量增大，對(duì)畜禽生長(zhǎng)及人體健康造成直接危害，應(yīng)用畜禽專用的抗生素飼料添加劑已迫在眉睫。由于恩拉霉素具有優(yōu)良的促生長(zhǎng)和改善飼料利用率的作用，因此被世界上許多國(guó)家推薦作為抗生素促生長(zhǎng)劑。恩拉霉素(Enramycin)，又名恩來(lái)霉素、恩霉素、安來(lái)霉素、持久霉素，是由土壤中分離出來(lái)的放線菌Mi^ptomyces fungicidious NO. BM77發(fā)酵產(chǎn)生的一種多肽類抗生素， 易溶于稀鹽酸，微溶于水、甲醇、乙醇。市場(chǎng)上主要的來(lái)源是先靈葆雅公司的菌絲體預(yù)混劑。作為飼料添加劑恩拉霉素有如下優(yōu)點(diǎn)1.臨床應(yīng)用研究方面，與其他抗生素添加劑相比，用量少的情況下飼料系數(shù)更低， 生長(zhǎng)速度更快。2.藥效學(xué)研究方面，恩拉霉素對(duì)主要的革蘭氏陽(yáng)性菌都具有強(qiáng)大的殺菌作用。恩拉霉素對(duì)乙肝病毒(HBV)抗原有較強(qiáng)的抑制作用，包括對(duì)乙肝e抗原(HBeAg)也有較好的抑制效果。恩拉霉素與臨床上現(xiàn)有的抗生素或抗菌藥之間不存在交叉耐藥性。敏感菌幾乎不對(duì)恩拉霉素產(chǎn)生耐藥性，在實(shí)驗(yàn)條件下，耐藥性的產(chǎn)生也非常緩慢，即使出現(xiàn)，耐藥性也不穩(wěn)定，而且極易丟失。3.藥物殘留研究方面，恩拉霉素內(nèi)服極不易被吸收，藥物主要通過(guò)糞便排出體外。4.毒理學(xué)研究方面，恩拉霉素毒性很低。急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，恩拉霉素在口服、皮下或肌肉注射給藥時(shí)實(shí)際無(wú)毒。5.恩拉霉素的鹽酸鹽對(duì)熱、光照和潮濕有極好的穩(wěn)定性。恩拉霉素在飼料中具有很高的穩(wěn)定性，在室溫條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)藏很少降解，在制成顆粒料過(guò)程中也非常穩(wěn)定，與飼料混合后在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)藏效價(jià)下降甚微。恩拉霉素在腸道內(nèi)不被降解，能夠保持原有的抗菌活性。抗生素的提取主要有以下幾種途徑有沉淀法、溶媒萃取法、吸附法、離子交換色譜法、高效液相色譜法、膜分離技術(shù)、 毛細(xì)管電泳、雙水相技術(shù)、反膠束、超臨界萃取等。其中膜分離技術(shù)、毛細(xì)管電泳、雙水相技術(shù)、反膠束、超臨界萃取等為近幾年新開始應(yīng)用的方法，成本高，沒(méi)有較為成熟的工業(yè)化模式，大多在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模對(duì)個(gè)別品種進(jìn)行探索。沉淀法、溶媒萃取法、吸附法等傳統(tǒng)方法，由于活性炭和大多數(shù)溶媒不能很好的將雜質(zhì)分離，得到的物質(zhì)純度不夠，從而達(dá)不到分離提取要求的效果，目前大多應(yīng)用于粗提， 粗品預(yù)處理階段，配合其他方法共同應(yīng)用。高效液相色譜法中，大多通過(guò)使用預(yù)柱來(lái)排除部分相關(guān)雜質(zhì)，預(yù)柱常因不能再生利用而造成耗損成本比較高。目前大多數(shù)抗生素品種在分離、提取、濃縮、純化、脫色等方面廣泛應(yīng)用的是色譜法。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)《一種安來(lái)霉素產(chǎn)生菌及利用大孔樹脂提取的方法》 (200910032340. 1)中記載用大孔吸附樹脂安伯萊特XAD-4、安伯萊特XAD-16等來(lái)分離提取恩來(lái)霉素。大孔吸附樹脂的吸附實(shí)質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。同時(shí)由于大孔吸附樹脂的多孔結(jié)構(gòu)使其對(duì)分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過(guò)上述這種吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定溶劑洗脫而達(dá)到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的。其理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，對(duì)有機(jī)物選擇性好，不受無(wú)機(jī)鹽類及強(qiáng)離子、低分子化合物存在的影響，近年來(lái)也廣泛應(yīng)用于中藥、微生物的分離提取。但該發(fā)明方法對(duì)于菌絲體中恩拉霉素的產(chǎn)率只能控制在60% 71 %，回收率較低，對(duì)于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)耗損太多，含量檢測(cè)方面也難滿足準(zhǔn)確度要求。離子交換色譜法應(yīng)用到的離子交換樹脂分為陽(yáng)離子樹脂和陰離子樹脂兩大類，它們可分別與溶液中的陽(yáng)離子和陰離子進(jìn)行離子交換。按照孔隙結(jié)構(gòu)分凝膠型和大孔型兩種，凡具有物理孔結(jié)構(gòu)的稱大孔型樹脂。陽(yáng)離子樹脂又分為弱酸性和強(qiáng)酸性，其中弱酸性陽(yáng)離子樹脂含弱酸性基團(tuán)，如羧基-C00H，能在水中離解出H+而呈酸性。樹脂離解后余下的負(fù)電基團(tuán)，能與溶液中的其他陽(yáng)離子吸附結(jié)合，從而產(chǎn)生陽(yáng)離子交換作用。這種樹脂的酸性即離解性較弱，但比強(qiáng)酸性樹脂較易再生。但針對(duì)恩拉霉素，一般認(rèn)為無(wú)法使用離子交換樹脂純化，主要使用吸附樹脂(《飼料中恩拉霉素的微生物學(xué)含量測(cè)定方法研究》中國(guó)獸藥雜志 2008,42(9) :17 21顧欣等)。本領(lǐng)域需要尋找更好的方法來(lái)分離提取恩拉霉素，提高回收率和純度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為恩拉霉素的分離純化提供一種有效的方法。解決該問(wèn)題的技術(shù)方案是提供了一種使用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法。本發(fā)明大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法的技術(shù)方案包括以下步驟a、由恩拉霉素粗品提取得含恩拉霉素提取液備用；b、將大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂用足量甲醇浸泡后，去掉上層甲醇液體，再加入足量水，靜置以備裝柱；C、將預(yù)處理的大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂裝層析柱，使用pH 8.0的1 1甲醇水過(guò)柱，平衡后待用；d、將步驟a所述含恩拉霉素提取液調(diào)至pH 8.0，再過(guò)濾，用上清液上柱；用1 1 甲醇水溶液過(guò)柱，洗滌去除雜質(zhì)；再用7 3甲醇水溶液過(guò)柱，收集洗脫液，濃縮，蒸干得到
恩拉霉素產(chǎn)品。其中，上述方法中所述大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂為HD-2型。
其中，上述方法步驟a所述的恩拉霉素粗品提取的方法為將恩拉霉素粗品加入 PH3.0的1 1甲醇水適量，充分?jǐn)嚢杌旌虾箪o置，過(guò)濾，取上清液體作為提取液備用。其中，上述方法步驟d所述蒸干的溫度不超過(guò)45°C。另，所述7 3甲醇水是指體積比為70%甲醇和30%水的混合溶液，1 1甲醇水
同理可配制。其中，上述方法中所述調(diào)節(jié)pH值的物質(zhì)為鹽酸和氫氧化鈉的水溶液。其中上述方法中，所述恩拉霉素粗品可為產(chǎn)恩拉霉素菌的菌絲體，也可為先靈葆雅公司市售的恩拉霉素菌絲體預(yù)混劑。本發(fā)明方法具體操作如下恩拉霉素粗品提取樣品加入用調(diào)pH 3.0的甲醇水(1 1)適量，充分?jǐn)嚢杌旌虾箪o置，過(guò)濾，取上清液體作為提取液備用；樹脂預(yù)處理將弱酸性陽(yáng)離子樹脂HD-2用甲醇浸泡后，去掉上層甲醇，再加入足量水，靜置以備裝柱；層析柱裝柱及處理將預(yù)處理的樹脂裝層析柱，使用pH 8.0的甲醇水(1 1)過(guò)柱，平衡后待用。在整個(gè)裝柱過(guò)程中，裝柱的柱子不能干枯；分離純化將前述提取液用NaOH調(diào)至pH 8. 0，再過(guò)濾后的上清液上柱，用甲醇水 (1 1)過(guò)柱，洗滌去除雜質(zhì)；再用甲醇水(7 3)過(guò)柱，收集洗脫液，濃縮，蒸干得到恩拉
毒素廣品。本發(fā)明分離提取恩拉霉素的主要是打破了常規(guī)，引入弱酸性陽(yáng)離子樹脂HD-2型進(jìn)行恩拉霉素的純化，并對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化，提取產(chǎn)物純度均達(dá)到98%以上，回收率高達(dá) 85%以上，適用于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，為本領(lǐng)域純化恩拉霉素提供了一種新的選擇。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明方法將大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂浸入足量的甲醇中，使充分活化，放置后，除去上層甲醇液體，加入足量的水，攪拌混合后裝柱，用弱堿性的甲醇溶液過(guò)柱平衡。恩拉霉素菌絲體經(jīng)乙醇水浴加熱回流得到粗品，粗品與弱酸性的甲醇水溶液混合，攪拌，過(guò)濾，濾液調(diào)至弱堿性，再次過(guò)濾，取該濾液流經(jīng)層析柱，發(fā)生吸附后，再用普通甲醇水洗去雜質(zhì)，然后用水洗為中性，最后用適量的甲醇水洗脫，收集全部洗脫液，濃縮，蒸干后得產(chǎn)品恩拉霉
ο上述方法中優(yōu)選使用HD-2型陽(yáng)離子樹脂，優(yōu)選使用甲醇水(1 1)和甲醇水 (7 3)進(jìn)行洗滌和洗脫。具體而言，本發(fā)明方法為恩拉霉素粗品提取樣品加入用調(diào)pH 3.0的甲醇水(1 1)適量，充分?jǐn)嚢杌旌虾箪o置，過(guò)濾，取上清液體作為提取液備用。調(diào)PH—般用濃鹽酸和氫氧化鈉。樹脂預(yù)處理將弱酸性陽(yáng)離子樹脂HD-2用甲醇浸泡后，去掉上層甲醇，再用加入甲醇同量水，靜置20分鐘以備裝柱。層析柱裝柱及處理將預(yù)處理的樹脂裝層析柱，使用的pH 8.0的甲醇水(1 1) 過(guò)柱，流速0. 4ml/min,平衡后待用。在整個(gè)裝柱過(guò)程中，裝柱的柱子不能干枯。
分離純化將前述提取液用NaOH調(diào)至pH 8. 0，再過(guò)濾后的上清液上柱，上柱流速 0. 5ml/min，用甲醇水(1 1)過(guò)柱，流速0. %il/min，洗滌去除雜質(zhì)，再用甲醇水(7 3)過(guò)柱，流速0. 3ml/min,收集洗脫液，濃縮，蒸干得到恩拉霉素產(chǎn)品。詳細(xì)實(shí)施過(guò)程及與現(xiàn)有方法的比較請(qǐng)見實(shí)施例。以下實(shí)例中使用的恩拉霉素粗品為先靈葆雅公司市售的恩拉霉素4%菌絲體預(yù)混劑。恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品為先靈葆雅公司市售，純度檢測(cè)使用常規(guī)HPLC進(jìn)行。大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂HD-2，河北滄恩化工生產(chǎn)。實(shí)施例一用HD-2型陽(yáng)離子樹脂分離純化恩拉霉素本實(shí)施例是移用的大孔吸附樹脂上使用的條件。1、恩拉霉素粗品10g+50ml的50%甲醇水(pH 3. 0)混合，攪拌，過(guò)濾，取上清液體作為提取液備用。2、分離純化，本實(shí)施例是移用的大孔吸附樹脂上使用的條件。(1)樹脂預(yù)處理HD-2型大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂浸入足量的甲醇中，緩緩攪拌，使充分混合，放置后，小心除去上層甲醇液體，加入足量的水，攪拌混合后，放置，備用。(2)層析柱處理選用lCmX20Cm規(guī)格的層析柱，將預(yù)處理好的樹脂裝柱，在整個(gè)裝柱過(guò)程中，使裝柱的柱子不能干枯。使用25ml的pH 8.0堿性的甲醇水(1 1)以0. %il/min流速過(guò)柱， 平衡后，待用。(3)分離純化將提取液用NaOH液調(diào)至PH為堿性(pH = 8. 0)過(guò)濾，取濾液以0. 5ml/min速度流經(jīng)過(guò)層析柱，再用適量的PH值8.0甲醇溶液(濃度為1 1)流速以O(shè).^il/min過(guò)柱，洗滌去除雜質(zhì)，然后用50ml的pH3. O甲醇溶液(濃度7 3)以0. 3ml/min流速過(guò)柱，收集全部洗脫液體，濃縮，蒸干后得產(chǎn)品恩拉霉素。經(jīng)檢測(cè)所得恩拉霉素回收率為73. 1%，純度為 97. 4%。實(shí)施例二使用本發(fā)明方法用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂HD-2分離純化恩拉霉素1、樣品粗提恩拉霉素粗品130g+200ml (甲醇)+200mlH20 用濃鹽酸HCl調(diào)pH 3. O充分?jǐn)嚢?20min后靜置，過(guò)濾，取上清液體作為提取液備用。2、分離純化，本實(shí)例是使用本發(fā)明方法進(jìn)行中量純化。(1)樹脂預(yù)處理弱酸性陽(yáng)離子樹脂HD-2用甲醇浸泡60min后，去掉甲醇，再用水浸泡20min裝柱。(2)層析柱處理選用lcmX20cm規(guī)格的層析柱，將預(yù)處理好的樹脂裝柱，在整個(gè)裝柱過(guò)程中，使裝柱的柱子不能干枯。使用25ml的pH 8. O的甲醇水(1 1)以0. 5ml/min流速過(guò)柱，平衡后，待用。(3)分離純化將步驟1所得的提取液用NaOH調(diào)至pH 8. 0，過(guò)濾后的上清以0. 5ml/min上柱，用甲醇水(1 1)過(guò)柱，O.^il/min ；洗滌去除雜質(zhì)，洗滌共用650ml。再用650ml甲醇水 (7 3)0. 3ml/min過(guò)柱，收集洗脫液，濃縮，蒸干得到產(chǎn)品。經(jīng)檢測(cè)所得恩拉霉素回收率 86. 3%，純度為 98. 5%。
權(quán)利要求
1.使用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法，其特征在于包括以下步驟a、由恩拉霉素粗品提取得含恩拉霉素提取液備用；b、將大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂用足量甲醇浸泡后，去掉上層甲醇液體，再加入足量水，靜置以備裝柱；C、將預(yù)處理的大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂裝層析柱，使用PH 8.0的1 1甲醇水過(guò)柱，平衡后待用；d、將步驟a所述含恩拉霉素提取液調(diào)至pH 8.0，再過(guò)濾，用上清液上柱；用1 1甲醇水溶液過(guò)柱，洗滌去除雜質(zhì)；再用7 3甲醇水溶液過(guò)柱，收集洗脫液，濃縮，蒸干得到恩拉毒素廣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法，其特征在于所述大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂為HD-2型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法，其特征在于步驟a所述的恩拉霉素粗品提取的方法為將恩拉霉素粗品加入pH3. 0的1 1甲醇水適量，充分?jǐn)嚢杌旌虾箪o置，過(guò)濾，取上清液體作為提取液備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法，其特征在于步驟d所述蒸干的溫度不超過(guò)45°C。
全文摘要
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為恩拉霉素的分離純化提供一種有效的方法。解決該問(wèn)題的技術(shù)方案是提供了一種利用大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂分離提取恩拉霉素的方法。該方法即用甲醇將大孔弱酸性陽(yáng)離子樹脂充分活化，加入足量的水，攪拌混合后裝柱，用弱堿性的甲醇溶液過(guò)柱平衡；恩拉霉素菌絲體經(jīng)乙醇水浴加熱回流得到粗品，粗品與弱酸性的甲醇水溶液混合，過(guò)濾，調(diào)至弱堿性，上柱，吸附后用甲醇水洗去雜質(zhì)，再用適量的甲醇水洗脫，收集洗脫液，濃縮，蒸干后得產(chǎn)品恩拉霉素。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，回收率、純度高。
文檔編號(hào)C07K7/64GK102311486SQ20101021398
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者嚴(yán)玉寶, 余華, 葉健強(qiáng), 周岷江, 廖黨金, 文豪, 曹冶, 李江凌, 李紅, 胡娟, 謝晶, 趙素君 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)四川出入境檢驗(yàn)檢疫局, 四川省畜牧科學(xué)研究院