專利名稱：高表達量的溶血素基因及其分泌表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人工改造合成的高表達量的化膿鏈球菌溶血素基因nslo，屬于 醫學微生物基因工程領域。本發明還涉及一種依上述基因構建的分泌型表達載體及其應 用，屬于基因工程領域。
背景技術：
溶血素主要來自鏈球菌、金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌等。來自化膿鏈球菌 (Streptococcuspyogenes)的溶血素(Streptolysin O，SLO)是膽固醇依賴性的，能夠與人及
其它動物的細胞膜上的膽固醇相結合，結合到細胞膜上的SLO蛋白分子會形成環狀寡聚 體，形成大的孔道，導致細胞膜溶解，而且介導一些大分子(如NADase)通過細胞膜， 所以SLO是鏈球菌感染宿主過程中的重要毒素蛋白。SLO在醫學研究和應用中具有廣泛的應用價值，首先在醫學與生物學研究中， SLO作為成孔蛋白，被用作打孔工具；其次，在診斷醫學中，作為檢測試劑，用來檢測 被Streptococcuspyogenes感染的患者體內的抗SLO的抗體(anti-SLO)；再其次，可以用 做細胞自殺基因和自殺蛋白，研究其在控制腫瘤細胞繁殖中的應用。從天然鏈球菌中獲得SLO的工藝成本高，得率低，具有不安全性。自1984年 以來，前人一直研究SLO在大腸桿菌原核系統中的表達，至目前，國內外研究人員已經 在原核系統中實現了 SLO與maltose-binding protein、GST-tag和6His_tag等表達標簽的 融合表達。但是，在目前SLO的重組表達方法中，存在的顯著缺點是表達產量始終比較 低，在0.3mg/mL以下，導致后期純化應用難度較大。
發明內容
本發明所要解決的一個技術問題是提供一種人工改造合成的，可在大腸桿菌中 高效表達的新的化膿鏈球菌溶血素基因nslo及其表達載體，該人工改造合成的nslo基 因，具有SEQ IDN0.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列使用了使用了大腸桿菌偏愛性密碼子。使用所述溶血素基因nslo構建的表達載體。所述表達載體為分泌型載體，優選為pET_20b(+)。使用所述溶血素基因nslo或表達載體構建的轉基因細胞系或基因工程菌。本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種所述溶血素基因nslo或含有溶血 素基因nslo的表達載體在醫學研究、疾病診斷和SLO抗體制品生產中的應用。本發明設計并合成了編碼化膿鏈球菌溶血素的新基因nslo，構建了含該nslo基因 的分泌型表達載體和含該分泌型表達質粒的工程菌。表達結果表明，溶血素蛋白產量可 以達到3mg/ml，酶活達到2.4xl06HU/mL，Western和Elisa實驗表明其抗原性顯著，實 現了 SLO蛋白在原核生物大腸桿菌中高效率分泌性表達，適合工業化生產。
圖lnslo/pET_20b (+)酶切鑒定圖1 .DNA Marker ； 2.nslo/pET_20b (+) ； 3.nslo/pET_20b (+)雙酶切。圖2nslo/pET_20b (+)物理圖譜圖3重組表達SLO搖瓶發酵的SDS-PAGE圖譜1.蛋白 Marker ； 2.pET_20b (+) /BL21 (DE3)的胞內上清；3.nslo/pET_20b (+) / BL21(DE3)的胞內上清。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制 本發明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆 手冊所述的條件進行操作。實施例Insl0基因設計以 Streptococcus pyogenes NZ131 菌株 slo 基因序列 232_1673bp 為起始序列(1-231 序列編碼的氨基酸序列與SLO的溶血活性與抗原性不相關)，在mRNA的二級結構分析 的基礎上，用65個大腸桿菌偏愛密碼子替換slo基因內部的大腸桿菌稀有密碼子，得到新 的人工改造設計的化膿鏈球菌溶血素基因nslo，序列見SEQIDN0.1，全長1485個核苷 酸，編碼495個氨基酸，替換的堿基和相關的密碼子在nslo和NZ131菌株slo基因的比對 圖(圖1)中進行了標記。實施例2nslo基因合成與克隆由于nslo基因與原slo基因相比，變動較大，不便于使用突變技術，因此使用 化學合成法一步合成nslo基因，將合成的nslo基因與pMD18T (Takara)載體連接，轉化 JM109，轉化產物涂布含lOOg/mL氨芐青霉素的LB平板，經過37°C培養過夜，得到單克 隆轉化子nslO/pMD18T/JM109，經過菌落PCR鑒定，質粒酶切鑒定和測序鑒定，表明新 合成的nslo基因全長為1485bp，編碼495氨基酸，測定的序列和設計序列完全相同。實施例3分泌表達SLO蛋白的載體構建用于實現nslo基因在大腸桿菌中分泌性表達的載體是pET_20b⑴，該載體帶有 pelB信號肽和His-tag標簽，將pET_20b(+)質粒和nslo/pMD18T用NocI和NotI切，酶切 產物切膠回收，再用T4連接酶連接，連接產物轉化E.coliJM109感受態細胞，經過37°C 培養過夜，挑選轉化子，通過菌落PCR鑒定，質粒酶切鑒定(見圖2)和測序鑒定，保存 鑒定的 nslo/pET_20b (+) /E.coli JM109 菌，提取 nslo/pET_20b (+)備用。實施例4分泌表達SLO蛋白的工程菌構建將質粒nslo/pET_20b (+)轉化大腸桿菌宿主BL21 (DE3)，再在100g/mL氨芐 青霉素的LB平板，經過37°C培養過夜，經過菌落PCR鑒定，得到單克隆轉化子nslo/ pET-20b (+) /BL21 (DE3)。實施例5發酵與SLO蛋白的分離純化1、搖瓶發酵
將nslo/pET-20b⑴/BL21 (DE3)接種在LB培養基中37 °C液體培養過夜，后接 入 TB (甘油 5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，K2HP04 12.54g/L, KH2P04 2.31g/L) 發酵液體培養基，37°C培養到細菌OD_到0.8，用0.5mM IPTG(異丙基硫代β-D半乳 糖苷)誘導，降溫至15°C培養，48h時產酶達3mg/mL以上，SDS電泳圖譜見圖4。2、分離純化將表達后的培養液離心，得到上清用0.45um膜過濾，過濾后的溶液按照1 1 的比例和 2X Binging buffer (IOmM 咪唑，lMNaCl，40mM Tris-HCL)混勻備用；His-tag 親和層析柱用5倍柱體積的IX charging buffer(50mM NiS04)處理后，再用倍柱體積IX Binding buffer(2.5mM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCL)平衡；上樣品后用 10 倍柱體 積 IX Binging buffer 洗柱，再用 5 倍柱體積 IX Washing buffer (60mM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCL)洗柱；用 6 倍柱體積 IX Elution buffer(lM 咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脫。實施例6酶活測定、Western、Elisa鑒定重組表達的SLO蛋白抗原性SLO 樣品可用溶液 A(溶液 A 36mM H3PO4, 126mM NaCl, lg/L BSA(bovine seramalbumin)，pH 7.0)進行系列梯度稀釋。將 0.5ml 的 I5OmM 2-mercaptoethanol 與 Iml
稀釋樣品混勻，30°C孵育15min，然后每管加0.5ml含綿羊紅細胞的A溶液(158X IO8ceIl/ ml)30°C下反應20min，離心后，用541nm檢測上清中血紅蛋白的濃度。IU定義為在該 實驗條件下，引起上述反應體系中50%紅細胞溶解的酶量所需要的酶量。經測定，ImL 菌液的酶活為2.4x106HU以上。Western和Elisa實驗結果為陽性，表明其具有抗原性。實施例7nsl0基因在醫學研究、疾病診斷中的應用用nslo基因構建SLO表達工程菌，通過發酵生產SLO蛋白。SLO蛋白是醫 學研究和臨床使用的重要生物學試劑。利用SLO蛋白，作為抗原，可以檢測患者體內 ASO (抗SLO蛋白的抗體)，以此診斷鏈球菌感染引起的變態反應和最近是否存在鏈球菌 感染。實施例Snslo基因SLO抗體制品生產中的應用將純化得到的SLO蛋白，免疫動物，純化免疫血清，得到SLO抗體。nslo基因SLO抗體制品生產中的應用可參考下列文獻1 .Kimoto H, Fujii Y，Hirano S，Yokota Y，Taketo A.Expression of recombinant StreptolysinO and specific antibody production.J Mol Microbiol Biotechnol.2005 ； 10(1) 64-8.2.Velazquez B, Massaldi H, Battistoni J, Chabalgoity JA.Construction and expression ofrecombinant streptolysin—o and preevaluation of its use in immunoassays.Clin Diagn Lab Immunol.2005 May ； 12(5) 683-4.
權利要求
1.一種人工改造合成的化膿鏈球菌溶血素基因nslo，具有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的溶血素基因nslo，其特征在于所述核苷酸序列使用大腸桿菌 的偏愛性密碼子。
3.含有權利要求1所述溶血素基因nslo的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述表達載體為分泌型載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于優選為pET_20b(+)。
6.含有權利要求1所述溶血素基因nslo或權利要求5所述表達載體的轉基因細胞系。
7.含有權利要求1所述溶血素基因nslo或權利要求5所述表達載體的基因工程菌，優 選為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.權利要求1所述溶血素基因nslo或權利要求5所述表達載體在醫學研究、疾病診斷 和溶血素抗體制品生產中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種高表達量的溶血素基因及其分泌表達載體和應用，屬于遺傳工程領域。本發明是以來自Streptococcus pyogenes NZ131菌株slo基因序列為模板(Streptococcuspyogenes NZ131，complete genomeNCBI accessionNC_011375.1)，利用大腸桿菌優化密碼子替換其56個大腸桿菌稀有密碼子，設計并合成了編碼化膿鏈球菌溶血素的新基因nslo，構建了含該nslo基因的分泌型表達載體和含該分泌型表達質粒的工程菌。表達結果表明，蛋白表達產量可以達到3mg/mL以上，酶活可達到2.4×106HU/mL。本發明實現了nslo的高效表達，可廣泛引用于與醫學研究和疾病診斷，適合工業化生產。
文檔編號C07K16/06GK102010870SQ201010211058
公開日2011年4月13日 申請日期2010年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者康貽軍, 王歡莉, 趙慶新 申請人:鹽城師范學院