專利名稱：一種分離純化淡水魚致敏蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質純化技術領域，具體涉及一系列的層析步驟分離純化淡水魚致 敏蛋白的方法。
背景技術：
隨著社會發展，人們飲食結構的變化，食品過敏發病率日益增高，在全世界范圍內 呈逐年增加的趨勢。在美國，近5%的3歲以下的兒童和1.5%的成人受到食物過敏的困擾， 這意味著約400萬人患有食物過敏癥。英國成人的患病率在1. 4% 1. 9%，兒童為5%，大 約有100萬人反應嚴重。中國疾控中心營養與食品安全所的調查表明在15至24歲年齡 段健康人群中，約有6%的人曾患有食物過敏。過敏癥狀在臨床上表現為蕁麻疹、哮喘、腹痛 和腹瀉等多種癥狀，嚴重的可導致休克。它已經越來越影響到人類的生活質量，甚至給人們 的生命健康造成了巨大威脅。目前，過敏性疾病已經成為各國政府高度關注的一個全球性 的問題，食品過敏已成為世界衛生組織(WHO)和世界糧農組織(FAO)關注的重大衛生學問 題。魚類是世界上公認的8類高致敏食物之一。在亞洲，由于飲食習慣的問題，魚類致敏的 現象顯得更為突出，對魚類和甲殼過敏的人占總人口的2%，5. 9%的家庭中至少有一個人 對水產品過敏，對魚類的特異性過敏在嬰幼兒中尤為常見。因此研究魚類致敏蛋白就顯得十分重要，其首要解決的問題就是魚類致敏蛋白的 分離純化。蛋白質的功能性質不僅與其來源、加工方法等有關，而且與蛋白質的物理化學性 質、結構特征等密切相關，包括蛋白質的大小、形狀、氨基酸組成及序列、帶電情況及其分 布、疏水/親水比例、二級結構及其含量分布、三級及四級結構、分子內或分子間交聯以及 蛋白質在溶液環境中的分子伸展情況(即分子柔性)等..·，而蛋白質的分離純化研究對其 結構特性研究極為重要。蛋白質的分離純化是研究蛋白質結構、化學組成和生物功能的基礎。蛋白質在自 然界中存在于復雜的混合體系中，而且許多重要的蛋白質在細胞中的含量極低。要把蛋白 質從復雜的體系中分離出來，同時又要防止其組成、結構的改變和生物活性的喪失，顯然是 有相當難度的。目前蛋白質的分離純化技術的發展趨向于精細而多樣化技術的綜合運用， 但基本原理均是以蛋白質的性質為依據的。破碎組織細胞，提取蛋白質混合物，利用鹽析 法、有機溶劑沉淀法等對蛋白質進行粗提；電泳和色譜技術則可對粗提蛋白質進行進一步 的分離純化，而且可對純化蛋白質進行制備。實際工作中應按不同的要求和條件選用不同 的方法。目前，國內外有關魚類致敏蛋白分離純化報道較少，現有的分離方法主要采用樹 脂填料對致敏蛋白進行初步分離純化，純度不高，并且分辨率低、重復性差。本發明采用柱 層析與高效液相色譜分級層析，可以分離出純度極高的致敏蛋白。
發明內容
本發明的目是提供分離純化淡水魚致敏蛋白的方法，通過該方法獲得的魚類致敏 蛋白純度高、回收率高且蛋白活性佳。一種分離純化淡水魚致敏蛋白的方法，包括以下操作步驟(1)破碎淡水魚組織細胞，利用鹽析法提取蛋白質混合物；(2)透析去除蛋白質混合物中的鹽；(3)采用雙層功能的可耐受高鹽型的陽離子交換柱對蛋白質混合物進行初步分 離，具體方法如下將步驟(2)除鹽的蛋白質混合物加入到平衡后的陽離子交換柱中，用PH 7. 5的含0. 5-1. 5mol/L NaCl的IOmmol Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為3mL/ min，收集保留時間為21min的洗脫峰；(4)對收集的洗脫液進行反向高效液相色譜分離，所用色譜柱為AscentisExpress peptide ES-C18HPLC，所用流動相為乙腈、三氟乙酸、雙蒸水，參數條件為B泵雙蒸水 +70%三氟乙酸，D泵30%乙腈，流動相體積比B D = 25 75，流速為0. 8mL/min，操作 壓力為30-230pa，檢測波長為280nm，最終收集保留時間為33. 282min的洗脫峰，收集的洗 脫液即為淡水魚致敏蛋白。其中，三氟乙酸為色譜級純三氟乙酸，雙蒸水為超聲脫氣的雙蒸 水。步驟(1)中所述淡水魚組織為新鮮淡水魚肌肉組織。步驟(1)中所述鹽析法是指用40% (w/v)的硫酸銨水溶液沉淀雜質，取上清；再 用90% (w/v)的硫酸銨水溶液沉淀蛋白混合物。步驟(2)中所述透析使用的透析袋為截流Mr8000-14000 D16mm透析袋。步驟(3) 中所述陽離子交換柱中的填充物為瓊脂糖凝膠CL-6B(S印har0Se-CL-6B)。本發明的有益效果首先采用陽離子柱交換吸附的方法對魚類蛋白進行了初步分 離，此方法具有(1)離子交換柱有開放性支持骨架，大分子可以自由進入和迅速擴散，故吸 附容量大；(2)具有親水性，對大分子的吸附不大牢固，用溫和條件便可以洗脫，不致引起 蛋白質變性或酶的失活；(3)多孔性，表面積大、交換容量大，回收率高的優點。其次采用 反向高效液相色譜對其進行了進一步的分離純化，此方法可使用揮發性體系如水溶三氟乙 酸、乙腈，純化產物不必進行脫鹽，因此，可大大簡化操作步驟。該方法與傳統方法相比具有 分辨率和回收率高、重復性好、操作簡便，純化出的致敏蛋白純度高、活性極佳的特點。
圖1為經陽離子交換柱分離得到的致敏蛋白的SDS-PAGE蛋白電泳圖；泳道1為淡 水魚全蛋白；泳道2和3為經陽離子交換柱分離得到的致敏蛋白圖2是經反向高效液相色譜法分離后得到的致敏蛋白的色譜圖；圖3是經反向高效液相色譜法鑒定最終獲得的致敏蛋白純度的色譜圖。圖4是本發明方法制得的致敏蛋白的活性檢測結果圖。其中，1為本發明方法制得的致敏蛋白與正常人血清的ELISA結果；2為采用本發 明方法制得的致敏蛋白與魚過敏患者血清的ELISA結果，3為牛血清白蛋白與魚過敏患者 血清的ELISA結果
具體實施例方式本發明的方法通過以下實施例來進行詳細的說明。實施例(1)取新鮮淡水魚肌肉組織5g，加入IOmL 40Mm的Tris-HCl溶液，用組織搗碎機 充分破碎混勻，在4°C、12000r/min條件下離心20分鐘取上清；用40% (w/v)的硫酸銨水 溶液沉淀雜質，取上清；再用90% (w/v)的硫酸銨水溶液沉淀蛋白混合物；(2)用重蒸水透析上述蛋白混合物48小時，其中，透析袋為截流Mr8000-14000 D16mm透析袋(購自北京拜爾迪生物科技有限責任公司公司)；(3)采用陽離子柱交換吸附的方法對蛋白質混合物進行初步分離，具體如下A、瓊脂糖凝膠CL-6B離子交換色譜柱裝柱；分離范圍10000-4000000 ；顆粒大小 (微米)45-65B、采用Ι 7. 0,0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液對S印harose-CL_6B離子交換柱進行平衡；C、取2ml透析后的蛋白樣品上至S印haroSe-CL-6B離子交換色譜柱，用PH7. 5含 0. 5-1. 5mol/L NaCl的IOmmol Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為3ml/min，收集 保留時間為21min的洗脫峰；對收集液進行SDS-PAGE蛋白電泳，結果如圖1所示，得到電泳純級別的致敏 蛋白。其中，泳道1為未經分離純化的淡水魚全蛋白。泳道2、3為經過瓊脂糖凝膠 Sepharose-cl-6B離子交換色譜柱分離后得到的致敏蛋白。 (4)反向高效液相色譜進一步分離純化致敏蛋白根據以下參數對步驟(3)的收集液進行分離純化所用色譜柱為AscentisExpress peptide ES-C 18HPLC粒徑(um)3um孔徑(A)120 A含碳量pH 范圍 2.0-8.0柱溫30°C所用流動相為乙腈(AN)、色譜級純三氟乙酸(TFA)、超聲脫氣的雙蒸水(ddH20)， 參數條件為B 泵ddH20+TFA 70% ;D 泵AN 30%，B D = 25 75 ；流速0. 8ml/min柱壓40pa檢測器及波長(紫外):280nm收集保留時間為33. 282min的洗脫峰，得到高純度的致敏蛋白，回收率為97. 6%.色譜圖如圖2所示，由圖2可以看出，反向高效液相色譜法可以更為精確的分離致 敏蛋白。把步驟(4)分離所得的蛋白100 μ L通過液相色譜進樣器進入分離柱，對致敏蛋白 的純度進行鑒定，結果如圖3所示，得到了液相級別純度的致敏蛋白。采用ELISA方法，以對魚過敏患者血清為抗體(HRP標記羊抗人IgE，購自美國KPL 公司)，以正常人血清為對照，對于致敏蛋白活性進行驗證，結果如圖4所示，可以看出分離 得到的致敏蛋白活性極佳。本實施例所分離純化的魚類致敏蛋白的分子量為32KD，N端序列為LDKENALDRA。
權利要求
一種分離純化淡水魚致敏蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟(1)破碎淡水魚組織細胞，利用鹽析法提取蛋白質混合物；(2)透析去除蛋白質混合物中的鹽；(3)采用雙層功能的可耐受高鹽型的陽離子交換柱對蛋白質混合物進行初步分離，具體方法如下將步驟(2)除鹽的蛋白質混合物加入到平衡后的陽離子交換柱中，用PH 7.5的含0.5-1.5mol/L NaCl的10mmol Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為3mL/min，收集保留時間為21min的洗脫峰；(4)對收集的洗脫液進行反向高效液相色譜分離，所用色譜柱為AscentisExpress peptide ES-C18HPLC，所用流動相為乙腈、三氟乙酸、雙蒸水，參數條件為B泵雙蒸水+70％三氟乙酸，D泵30％乙腈，流動相體積比B∶D＝25∶75，流速為0.8mL/min，操作壓力為30-230pa，檢測波長為280nm，最終收集保留時間為33.282min的洗脫峰，收集的洗脫液即為淡水魚致敏蛋白。
2.根據權利要求1所述的分離純化淡水魚致敏蛋白的方法，其特征在于，步驟(2)中所 述透析使用的透析袋為截流Mr8000-14000 D16mm透析袋。
3.根據權利要求1所述的分離純化淡水魚致敏蛋白的方法，其特征在于，步驟(3)中所 述陽離子交換柱中的填充物為瓊脂糖凝膠CL-6B。
全文摘要
本發明公開了一種屬于蛋白質純化技術領域的分離純化淡水魚致敏蛋白的方法。該方法將富含致敏蛋白的淡水魚組織經過粗提，在離子交換層析柱中進行梯度洗脫，并用高效液相色譜進一步的分離純化，提高純度，包括將原料經以下層析步驟(a)雙層功能的可耐受高鹽型的陽離子交換；(b)反向高效液相色譜分離。該方法與傳統方法相比具有分辨率高、重復性好、操作簡便，純化出的致敏蛋白純度高的特點。此方法具有以下優點(1)離子交換柱有開放性支持骨架，大分子可以自由進入和迅速擴散，故吸附容量大；(2)具有親水性，對大分子的吸附不大牢固，用溫和條件使可以洗脫，不致引起蛋白質變性或酶的失活；(3)多孔性，表面積大、交換容量大的優點。
文檔編號C07K1/18GK101885756SQ20101019534
公開日2010年11月17日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者劉楚怡, 劉蓉, 張惠, 薛文通 申請人:中國農業大學