專利名稱：GM-CSF/TNF-α膜表面修飾的前列腺癌治療性疫苗的制作方法
技術領域：
本發明屬基因工程和細胞工程應用領域，GM-CSF/TNF-a膜表面修飾的前列腺癌 治療性疫苗，其特征在于鏈親合素標記的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(SA-GM-CSF)雙 功能融合蛋白和腫瘤壞死因子a (SA-TNFa)雙功能融合蛋白同時修飾錨定在已生物素化 且滅活的前列腺癌細胞表面，并且這些錨定在前列腺癌細胞表面的GM-CSF和TNF- a仍然 能保持相應的生物活性。
背景技術：
當前，前列腺癌的發病率在不斷升高，已成為危害我國老年男性健康的最常見惡 性腫瘤之一。前列腺癌常常容易發展為雄激素非依賴，而目前對此類前列腺癌尚無有效的 治療方法。GM-CSF基因修飾的前列腺癌細胞治療性疫苗對晚期激素非依賴的轉移性前列腺 癌II期臨床試驗顯示接受疫苗組的病人中位生存期為35. 2個月，而常規紫杉醇化療組的 病人中位生存期僅為18個月。該疫苗是用腺病毒作載體將GM-CSF基因導入前列腺癌細 胞株PC-3(對雄激素不敏感)和LNCaP(對雄激素敏感)腫瘤細胞內，篩選出能高效分泌 GM-CSF的腫瘤細胞克隆、射線滅活后制成的前列腺癌治療性疫苗。但是，用基因修飾法制備腫瘤細胞疫苗存在如下固有缺陷修飾效率一般都較低， 并取決于腫瘤細胞的類型；腫瘤細胞疫苗接種到機體后，因經射線滅活作用瘤苗細胞 已進入凋零程序，從而導致導入基因的表達效率較低，致使表達產物的有效濃度在局部常 常不能達到且不能較長時間地維持，從而實際抗腫瘤的臨床效果有限；往往有潛在的病毒 載體安全性問題和免疫原性問題(反復使用同一病毒載體會影響導入基因的表達效率)； 很難同時高效表達多個具有協同作用的免疫刺激因子(如GM-CSF和TNFa )，不能對它們的 表達量進行有效控制。此外，制備基因修飾的自體腫瘤細胞疫苗比較費時，成本較高，不易 大規模開展。為了克服目前基因修飾法制備腫瘤細胞疫苗存在的諸多固有缺陷，我們建立了一 種快速、高效、安全的細胞膜表面錨定修飾技術。這個技術平臺的基本原理是充分利用了細 胞膜表面蛋白質的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素與鏈親和素高效而強有力、幾乎 不可逆的結合——這兩個特性。該技術有二個步驟先用生物素化試劑將生物素交聯到欲 修飾的腫瘤細胞表面，然后鏈親和素標記的免疫刺激因子(如細胞因子或/和免疫共刺激 分子等)雙功能融合蛋白借助鏈親和素與生物素的特異結合將免疫刺激因子錨定在腫瘤 細胞表面。利用該技術平臺，可在體外對腫瘤細胞進行快速表面錨定修飾(4小時內完成)， 使多種具有免疫協同作用的免疫刺激因子共同迅速永久地錨定修飾在腫瘤細胞的表面，且 錨定修飾的量可進行精確控制。因此，本發明將制備的SA-GM-CSF和SA-TNF a雙功能融合蛋白、同時修飾錨定在 已生物素化且酒精滅活的前列腺癌細胞表面，制備成新型的前列腺癌治療性疫苗。
發明內容
GM-CSF/TNF- a膜表面修飾的前列腺癌治療性疫苗的發明過程如下首先制備SA-GM-CSF和SA-TNF a雙功能融合蛋白(參見發明專利 2004100525364)；用30%酒精滅活腫瘤細胞，因該處理能使細胞的形態不改變和細胞 膜保持完整；用生物素化試劑將生物素化學交聯到酒精滅活的腫瘤細胞表面；最后，將 SA-GM-CSF和SA-TNF a這兩個雙功能融合蛋白持久錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，制備 成前列腺癌治療性疫苗。
圖1.不同濃度酒精處理的腫瘤細胞免疫原性。圖2. GM-CSF和TNF- a同時錨定在酒精滅活且已生物素化的RM_1前列腺癌細胞表面。圖3.錨定在生物素化的RM-1前列腺癌細胞表面的SA-GM-CSF之GM-CSF生物活 性測定。圖4.錨定在生物素化的RM-1前列腺癌細胞表面的SA-TNF a之TNF_ a生物活性 測定。圖5. GM-CSF/TNF- a膜表面修飾RM-1前列腺癌細胞疫苗免疫原性的檢測，觀察腫 瘤的發生率(A圖)、腫瘤體積(B圖)、小鼠的生存時間(C圖)。圖6. GM-CSF/TNF- a膜表面修飾RM-1前列腺癌疫苗對小鼠正位前列腺癌模型的 療效(生存曲線)。圖7. GM-CSF/TNF- a膜表面修飾RM-1前列腺癌疫苗治療正位前列腺癌模型后第 1周，取小鼠脾行細胞毒性試驗，比較各組裂解前列腺癌靶細胞的能力。圖8.脾細胞、IL-2和絲裂霉素處理過的腫瘤細胞三者共同孵育5天，各組上清含 有IFN- y、IL-4的定量分析及比較。圖9.治療后脾細胞流式分析。圖10.免疫組化分析治療后腫瘤組織⑶4和⑶8T淋巴細胞的浸潤情況。
具體實施例方式通過下述實施例對本發明的技術特征作詳細描述。材料(1)細胞因子SA-GM_CSF和SA-TNF a本實驗室制備。(2)細胞株、動物前列腺癌細胞RM-1，C57BL/6雄性小鼠，C57BL/6小鼠的骨髓細 胞。(3)主要生化試劑及材料FITC_抗GM-CSF、FITC-抗TNF_ a、抗CD4、抗CD8抗 體(BDBiosciences Pharmingen) ；RMPI-1640、放線菌素(上海化工)；胎牛血清、胰酶 (Sigma) ；Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) ；GM-CSF 和 TNF-a 標準品(R&D Systems) ；30% 的酒精。實施例1. SA-TNF a雙功能融合蛋白的制備參照SA-GM-CSF的制備方法(發明專利2004100525364)，從人體的外周血的單核
4細胞提取總RNA，通過RT-PCR的實驗后得到hTNF a的基因片段，克隆于6His-SA-pET24a載 體中，構建重組質粒6His-SA-L-hTNFa-pET24a，L為富含甘氨酸、絲氨酸的鏈接肽(15AA)； 鑒定后轉化入E. coli BL21(DE3)中，優化表達條件，獲得高效表達的SA_hTNF a雙功能融
合蛋白o實施例2.優化RM-1細胞酒精滅活的條件(圖1)方法用100%，70%，50%，30%酒精與lX106/ml冊_1腫瘤細胞室溫孵育1小 時，0. 4%臺盼藍染色，觀察細胞的形態，并計數統計分析，實驗重復三次。結果30%酒精處理腫瘤細胞，1天內100%細胞形態保持不變，并保持細胞膜完 整；10天內，90%細胞形態保持不變；16天內，仍然有72%細胞形態保持不變，具有顯著性 差異(P < 0. 05)。實施例3. GM-CSF和TNF a同時錨定在酒精滅活且已生物素化的RM_1前列腺癌細 胞表面(圖2)RM-1細胞收獲0. 25%胰酶消化，800rpm，離心5min，收集細胞，調整細胞濃度 1 X 107/ml ；RM-1腫瘤細胞與30%酒精滅活孵育lh，PBS洗3次；生物素化試劑作用0. 5h， PBS洗3次；加入等分子摩爾濃度的SA-GM-CSF、SA-TNF a雙功能融合蛋白混合物(按 200ng/106 細胞)，孵育 lh, PBS 洗 3 次。取上述制備好的RM-1腫瘤細胞疫苗100ml，分別與帶有FITC標志的抗GM-CSF抗 體和抗TNF- a抗體，以及這兩種單克隆抗體混合物孵育30分鐘，用PBS+1 % BSA洗三遍； 經流式細胞儀分析表明，GM-CSF和TNF-a雙功能融合蛋白能同時錨定在生物素化的RM_1 細胞表面。實施例4. GM-CSF/TNF- a膜表面修飾的前列腺癌疫苗之TNF- a的活性測定(圖 3)方法1.將上述制備的GM-CSF/TNF-a膜表面修飾的前列腺癌疫苗，調整細胞濃 度IX 107/ml，放入凍存管中，將凍存管放入液氮中反復6-8次，使細胞膜破碎，并對胞膜碎 片進行超聲10次，15000rpm/min,離心15min，取上清與L929細胞孵育，觀察上清對L929細 胞的殺傷作用，以檢測該前列腺癌疫苗的TNF-a的活性。2.收集呈對數生長期的L929，用 10%FBS-RPMI 1640調整細胞濃度為1\106/1111;將含1順[1的上清疫苗樣品按不同稀釋濃 度(1 2，1 4...)加入96孔板，100 ill/孔，設三復孔；每孔加入L929細胞懸液100 iil， 同時設空白對照組、標準品hTNF- a單克隆抗體、單獨細胞組對照組；每孔加入0. 75 u g/ml 放線菌素，空白對照組不加。37°C，5% C02培養24小時后，每孔加20 yl MTT振板混勻； 37°C ,5%C02培養4h后，終止培養，小心吸取孔內培養上清液，每孔加入150 u 1 DMS0,脫色 搖床振蕩lOmin，使甲瓚溶解，選擇0D570nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值， 記錄結果，以rhTNFa標準品和待檢樣品的稀釋度為橫坐標標，MTT的測定值0D57(1為縱坐 標，以直接作圖法確定樣品濃度。結果疫苗與標準品TNF-a —樣具有對L929細胞殺傷的特性，根據標準品活性單 位及濃度大約估計106細胞可錨定60ng TNF- a。實施例5. GM-CSF/TNF- a膜修飾的前列腺癌疫苗之GM-CSF的活性測定(圖4)方法GM-CSF/TNF-a膜修飾的前列腺癌疫苗的上清制備同例3 ；無菌取小鼠骨 髓細胞，用含血清培養液調骨髓細胞至IX 106/ml ；將含GM-CSF的疫苗上清樣品按不同稀釋濃度(1 2，1 4...)加入96孔板，100 yl/孔，設三復孔；每孔加入骨髓細胞懸液 100 yl，同時設空白對照組、單獨細胞組、標準品mGM-CSF單克隆抗體對照組；37°C，5% C02 培養96h后，每孔加20 u 1 MTT振板混勻；37°C ,5% C02培養4h后，終止培養，小心吸取孔 內培養上清液，每孔加入150 yl DMS0，脫色搖床振蕩lOmin，使甲瓚溶解，選擇0D57Q波長， 在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。結果疫苗與標準品GM-CSF —樣具有對骨髓細胞增殖的特性，根據標準品的活性 單位和濃度大約估計106細胞可錨定60ng GM-CSF。實施例6. GM-CSF/TNF- a膜修飾的RM_1前列腺癌疫苗的免疫原性檢測(圖5)方法建立小鼠前列腺癌皮下移植瘤模型用RM-1前列腺癌細胞IX 105/只 (200 u 1 PBS)右側皮下注射。免疫治療方案分為五組，治療組GM-CSF/TNF-a膜修飾的 RM-1前列腺癌細胞疫苗治療組。對照組(1) SA-GM-CSF膜修飾的RM-1前列腺癌細胞疫苗 治療組；(2)SA-TNF-a膜修飾的RM-1前列腺癌細胞疫苗治療組；(3)酒精滅活RM_1前列 腺癌細胞疫苗組；(4) PBS組。一周一次，連續3次，每次疫苗細胞數1X106個/200iil，PBS 組給予200 u 1 PBS治療；最后一次治療后一周進行攻擊，每只1 X 105RM-1活細胞(200 u 1 PBS)右側皮下注射。每周測腫瘤大小兩次，腫瘤直徑超過2mm處死，試驗反復三次。結果GM-CSF/TNF_ a膜修飾的RM-1前列腺癌疫苗組腫瘤生長緩慢，生存期較長； 與各對照組比較，聯合錨定疫苗的免疫原性最強，具有顯著性差異(P < 0. 05)。 實施例7. GM-CSF/TNF- a膜修飾的RM-1腫瘤疫苗治療正位前列腺癌的研究(圖 6)方法正位前列腺癌模型的建立C57BL/6小鼠用0. 6%戊巴比妥鈉0. 25ml麻 醉，取仰臥位，下腹部正中橫切口 l_2cm，暴露膀胱和精囊腺，用無菌棉簽輕壓膀胱頂 壁、腹側壁，并向下游離至膀胱頸，推開肌肉及生殖腺進一步暴露前列腺可見其大小約
1.OmmX2. OmmXl. 5mm，分左右2葉，呈粉紅色，有明顯的腺體組織特征。在一側前列腺包 膜，緩慢進針，再緩慢推注冊-1細胞懸液25 yl (5X 103個)，以包膜向上鼓起，脫離腺體 表面為滿意標準.恢復臟器的解剖位置，用非吸收線分別間斷縫合腹壁肌肉層和皮膚層。
2.免疫治療方案分為五組，治療組GM-CSF/TNF-a膜修飾的RM-1前列腺癌細胞疫苗治 療組。對照組(1)GM-CSF膜修飾的RM-1前列腺癌細胞疫苗治療組；(2)TNF-a膜修飾的 RM-1前列腺癌細胞疫苗治療組；(3)酒精滅活RM-1前列腺癌細胞疫苗組；(4)PBS組。在前 列腺癌模型建立后，同時皮內給予疫苗細胞數2X106個/200iil，PBS組給予200iU PBS治 療，每周一次，連續3次，觀察生存期。結果GM-CSF/TNF_ a膜修飾的RM-1前列腺癌細胞疫苗組生存期明顯延長，與對 照組比較，具有顯著性差異(P < 0. 05)。實施例8. CTL的檢測(圖7)方法1.脾細胞的制備在上述第三次治療后第1周，每組隨機取一只小鼠，脫 臼處死，無菌狀態下分離小鼠脾臟，將脾臟置于200目篩網上，研磨，4°C，1000rpm，離心 8min，收獲單細胞懸液；用無血清RPMI-1640洗滌，加紅細胞裂解液2ml，室溫孵育2分，加 RPMI-1640至10ml，離心去除紅細胞，洗滌2次，獲得脾細胞懸液，與rhIL2孵育5天，離 心1000rpm，10min，調整脾細胞濃度為2X107ml。同時，取生長狀態良好的靶細胞RM_1， 0. 25%胰酶消化，調整細胞濃度2X105/ml。
2.分為五組a.實驗組(孔)效靶比為 100 1,50 1,25 1,12. 5 1， 6.25 1終體積為100 iU，靶細胞為50 iU，設復孔三個。b.效應細胞釋放組效應細胞與 實驗組相同，加50 ill全陪使終體積100 ill。c.靶細胞自發釋放LDH組靶細胞50 ill，加 入培養基50 yl。d.靶細胞最大釋放LDH組50 u 1靶細胞+10 u 1裂解液+40 u 1培養基。 e.空白對照組100 ill培養基。收集上清前45min加入10 yl裂解液，37 °C，5 % C02孵育4小時后，離心 250gX4min，取上清。將上清轉移到新96孔板，加50 yl Substrate Mix到每孔，避光，室 溫孵育30min，每孔加50 u 1終止液。在1小時內，測490nm的0D值，取平均值。卞艮 ig & $ : % Cytotoxicity = 100X (Experimental-Effector Spontaneous-Target) / (TargetMaximum-Target Spontaneous)，if 冑！^會且^；貞細的百i 率，采用析因方差分析，比較各組細胞毒性淋巴裂解靶向細胞能力。結果經LDH試劑盒檢測，運用SPSS17.0統計軟件，析因方差分析表明。各組脾 細胞的殺傷毒性實驗具有顯著性差異，F = 281. 475，P < 0. 001 ；不同效靶比毒性不同F = 63. 802，P < 0. 001 ；在此基礎上進行多重比較(SNK)，實驗組(GM-CSF/TNF-a膜表面修飾 RM-1細胞疫苗組)發現一部分裂解靶細胞RM-1，與對照組的比較，脾細胞毒性裂解靶向細 胞能力具有顯著性意義(P < 0. 05)；對照組PBS組和酒精滅活細胞組極小部分裂解靶細 胞，GM-CSF膜表面修飾細胞組和TNF- a膜表面修飾細胞組裂解靶細胞RM-1均無顯著差異 (P > 0. 05)，但后兩組細胞毒性優于前兩組(P < 0. 05)。實施例9. INF- y和IL-4的檢測(圖8)方法取上述實施例7實驗中，取攻擊(建模)后21天的小鼠脾細胞IX 106/ml與 rhIL2以及MMC處理過的冊_1細胞共同孵育48小時，離心250gX4min，收集上清。加樣 96孔板，加入上清100 iU，標準品100 iU于反應在孔中，并設復孔兩個，空白1個；洗板用 洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，用濾紙吸干。每孔加入第一抗體工作液100 Pl，將反應板 置37°C，30min。洗板同前。每孔加酶標抗體工作液100 yl，將反應板置37°C，30min。洗 板同前。每孔加底物工作液100111，置371，暗處反應15min。每孔加入100 yl終止液混 勻。30min內用酶標儀在450nm處測吸光值。將測出0D值做縱坐標，以標準品濃度為橫坐 標，繪制曲線，根據樣品的0D值可在標準曲線上查出其濃度。多個樣品均數比較，采用單因 素方差分析。IL-4檢測的按INF- y檢測步驟操作。結果運用3 5517.0軟件，采用單因素方差分析斤=518.9，？ = 0.000，在此基礎 上行多重比較(LSD)。GM-CSF/TNF a膜表面修飾冊-1細胞疫苗組產生的INF Y明顯多于 對照組，具有極顯著性差異(P< 0.001)；對照組中GM-CSF或TNF a錨定細胞疫苗組優于 酒精滅活組和PBS，具有顯著性差異(P < 0. 05)；但酒精滅活組和PBS比較，產生的INFY 無顯著性差異(P > 0. 05)。5組動物實驗所產生的IL4無顯著性差異(P > 0. 05)。說明腫 瘤疫苗產生的免疫反應以I型免疫反應為主，疫苗刺激DC的成熟，將抗原提呈于CD8+T淋 巴細胞，產生大量IFN y，直接介導抗腫瘤免疫反應。實施例10.治療后脾細胞的流式分析(圖9)方法從實施例7的實驗中，取攻擊(建模)后21天的小鼠，將其處死，取脾器官， 研磨，加入紅細胞裂解液孵育2分鐘，離心除去紅細胞，加入帶有FITC標志的抗CD4和抗
7⑶8的抗體孵育30分鐘，用PBS+1 % BSA洗一遍，經流式細胞分析儀檢測脾細胞含有的⑶4+ 和⑶8+T淋巴細胞。結果GM-CSF/TNF_ a膜修飾的RM-1前列腺癌細胞疫苗組脾組織里含有大量的 ⑶4+和⑶8+T細胞，與對照組比較，具有顯著性差異(P < 0. 05)。實施例11.免疫組化分析腫瘤組織浸潤的⑶4和⑶8淋巴細胞(圖10)方法從實施例7的實驗中，取腫瘤組織，在液氮中氣化，放入_80°C，24小時后， 冰凍切片4 8mm，室溫放置30分鐘后，放入4°C丙酮固定15分鐘，PBS洗，5分鐘X3。用 3%過氧化氫孵育10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘X2次。10%正 常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一 抗⑶4或⑶8，37°C孵育2小時。PBS沖洗，5分鐘X 3次。滴加適當比例稀釋的生物素標記 二抗(1 % BSA-PBS稀釋)，37°C孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X 3次。滴加適當比例稀釋 的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37°C孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X3次。滴加 DAB顯色劑顯色。自來水充分沖洗，復染，封片。結果GM-CSF/TNF_ a膜修飾的RM-1前列腺癌細胞疫苗組腫瘤組織里含有大量的 浸潤⑶4+和⑶8+T細胞，與對照組比較，具有顯著性差異(P < 0. 05)。
權利要求
一種融合蛋白，該蛋白是鏈親合素標記的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(SA-GM-CSF)雙功能融合蛋白。
2.一種融合蛋白，該蛋白是鏈親合素標記的腫瘤壞死因子α (SA-TNFa)雙功能融合 蛋白。
3.一種新型的腫瘤疫苗，即GM-CSF/TNF-a膜表面修飾的前列腺癌治療性疫苗，是由 鏈親合素標記的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子雙功能融合蛋白和腫瘤壞死因子α雙功 能融合蛋白同時修飾錨定在已生物素化且滅活的前列腺癌細胞表面而獲得的。
全文摘要
GM-CSF/TNF-α膜表面修飾的前列腺癌治療性疫苗，其特征在于鏈親合素標記的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子雙功能融合蛋白和腫瘤壞死因子α雙功能融合蛋白同時修飾錨定在已生物素化且滅活的前列腺癌細胞表面，并且這些錨定在前列腺癌細胞表面的GM-CSF和TNF-α仍然能保持相應的生物活性；該疫苗可用于前列腺癌的預防和治療。
文檔編號C07K19/00GK101863984SQ201010195260
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月27日 優先權日2010年5月27日
發明者何秋山, 尹衛華, 李金龍, 許曉玲, 高基民 申請人:溫州醫學院