專利名稱：小分子rna的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種小分子RNA的提取方法，具體地，本發明涉及無酚/氯仿抽提的小分子RNA的提取方法。
背景技術：
由于小分子RNA可能參與分化、發育、組織生長、脂肪代謝等生理過程，在不同的組織和發育階段的表達水平有所不同，進一步了解小分子RNA的生物功能具有重要意義。微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)是生物體內源長度約為20-23個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶mRNA的互補配對而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控， 導致mRNA的降解或翻譯抑制。由于微小RNA存在的廣泛性和多樣性，提示微小RNA可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對微小RNA的研究還處于初級階段，據推測微小RNA在高級真核生物體內對基因表達的調控作用可能和轉錄因子一樣重要并可能代表在一個新發現的層次上的基因表達調控方式。對一部分微小RNA的研究分析提示微小RNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發育，細胞增殖，細胞凋亡，細胞死亡，脂肪代謝和細胞分化以及和癌癥的發生發展密切相關。可見，對小分子RNA的研究日益受到重視。然而，進行小分子RNA分析的第一個關鍵步驟就是從生物樣本中純化小分子RNAs。多數傳統RNA分離試劑盒目的是為回收mRNA 而設計的，往往會棄去較小的RNA分子以減少干擾提高mRNA得率。因此這些步驟會導致一些小分子RNAs，如微小RNAs的損失。另外，此類方法往往涉及酚/氯仿等有毒化學物質的抽提。多數RNA純化試劑盒采用的標準玻璃纖維濾膜或者硅膠濾膜，不能有效的回收更小的小分子RNA，如微小RNA。例如，利用這些方法雖然能有效回收5. 8S rRNA,但微小RNA部分或者全部被棄除。隨著對小分子RNA，尤其是微小RNA研究的逐漸深入，小分子RNA的分離技術逐漸成為一種需求。微小RNA的分子量相對較小，對于常規的核酸提取法都不適用。微小RNA只有在乙醇濃度很高的條件下(大于70% )才能與核酸提取柱相結合，從而得到分離。但在該濃度的乙醇條件下，絕大多數的其他分子，特別是大分子都會被沉淀，使分離無法進行。 目前多采用利用毒性很強的酚以及氯仿等有機試劑，首先將大分子沉淀除掉，然后純化總的核酸。除了使用的試劑有毒外，大分子的DNA和RNA仍然會影響對微小RNA的進一步分析。因此，有必要開發新的小分子RNA的提取方法。
發明內容
因此，本發明的目的是提供一種小分子RNA的提取方法。本發明的方法是通過以下技術方案來實現的。本發明提供一種小分子RNA的提取方法，其不使用酚/氯仿處理樣品，具體地，所述方法包括以下步驟1)采用裂解液處理樣品后，再用濾膜過濾樣品，除去樣品中的大分
3子組分，得到小分子組分；2)進一步純化小分子組分，得到小分子RNA。優選地，所述步驟1)中濾膜的截流分子量為20K到100K，優選為30K和50K。優選地，所述步驟2、中小分子組分的純化是通過以下方法來實現的先采用有機溶劑處理小分子組分，再直接通過核酸結合柱純化。優選地，所述有機溶劑選自乙醇和異丙醇。優選地，所述核酸結合柱選自RNA結合柱和DNA結合柱。優選地，所述小分子RNA包括微小RNA、小干擾RNA和小核RNA。優選地，所述樣品為生物樣品，選自細胞、組織提取物、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液、腹水、腦集液及淚液分泌物。由此可見，本發明采用濾膜法，首先將樣品中含量豐富的大分子組分如DNA和蛋白與分子量較小的小分子組分分開，微小RNA存在于小分子組分中。含有微小RNA的小分子組分經乙醇處理后，直接通過RNA的特異結合柱(RNA特異結合柱包括所有RNA結合柱) 加以純化，具體的提取過程如圖1所示。本發明對于液態生物樣品，例如組織，血清，血漿， 唾液和尿液等更有其特點。可直接經樣品裂解液作用將樣品中的微小RNA與其結合的大分子蛋白或DNA分子分離，游離的微小RNA在高濃度的乙醇存在下可以與微小RNA的特異結合柱結合，并得以純化。更重要的是，本發明不涉及有毒的化學成分，如酚和氯仿等的使用。本發明為高效快捷的微小RNA分離純化方法，對各種不同來源的樣品(動物、植物、細胞等)，尤其是液體樣本，均能取得滿意的提取效果。對各種小分子RNA，包括微小核糖核酸(微小RNA， mi RNA)、小干擾核糖核酸(小干擾RNA，small interfering RNA, si RNA)、小核核糖核酸(小核RNA，small ημ lcear RNA, snRNA)均能實現較好的回收。具體到微小RNA，目前的微小RNA提取方法普遍采用酚/氯仿抽提除去大分子，然后經乙醇沉淀加過柱的方法。大分子的存在直接影響乙醇沉淀和過柱，因此本發明采用濾膜法，首先用裂解液將將樣品中含量豐富的DNA和蛋白大分子和分子量較小的小分子組分分開，然后經濾膜將DNA和蛋白大分子和分子量較小的小分子組分分離，微小RNA存在于小分子組分。含有微小RNA的小分子組分則可以由乙醇處理。這時的微小RNA在高濃度的乙醇幫助下可以與微小RNA的特異結合柱結合，即游離的微小RNA在高濃度的乙醇存在下可以與微小RNA的特異結合柱結合，從而進行分離純化。本發明在克服了已有方法缺點，例如使用有毒的化學成分的同時，有效保持了微小RNA分離的快捷，有效和純度。采用本發明的方法提取出的MiRNA含量與酚/氯仿抽提法(ΑΜΒΙ0Ν試劑盒)相當。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1為本發明提供的小分子RNA的提取方法，一個體積的樣品首先與一個體積的樣品裂解液混合，然后經超濾膜將大分子除去，收集的小分子組分再經乙醇處理并由RNA 柱將小分子RNA特異性吸附，漂洗后小分子RNA由DEPC處理的純化水洗脫。圖2為本發明實施例1和2分別從血漿和組織中提取的微小RNA的實時PCR檢測結果，分別取上述實施例中提取的微小RNA，加入5pm莖環引物逆轉錄得到的cDNA，實時PCR 分析樣品中的microRNA-miRM。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。實施例1血漿中微小RNA的提取取100 μ 1新鮮或_80°C冷凍的血漿加入至1. 5ml塑料離心管中，向離心管中加入100 μ 1鹽酸胍裂解液，渦旋混合10秒后室溫孵育10分鐘，再將混合液加入30Κ超濾離心管(Pall Corporation, Cat. #0D030C33)，經 15000rpm 室溫離心 20 分鐘。根據離心后的體積向離心管內加入2. 5倍無水乙醇，用移液器吹打混勻。將混合后的液體移至核酸純化柱(Bioer2ml)，13000rpm離心1分鐘。棄掉收集管液體，在柱內加入600 μ 1洗脫液 (0. OlMTris-HCl pH 7. 5,0. 2Μ NaCl, 0. 2mM EDTA，80% 乙醇，上述試劑均用 DEPC 處理的純凈水配制)，13000rpm,離心1分鐘。棄掉收集管液體，將核酸純化柱按13000rpm離心甩干1 分鐘。將純化柱柱移至新的收集管內，柱內加入50μ 1預先在90°C水浴中預熱的無RNA酶的去離子焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的純凈水，室溫孵育1分鐘。13000rpm離心2分鐘， 離心后得到的液體即為微小RNA，-20°C保存。實施例2組織中微小RNA的提取取50mg成人肝組織在液氮中研磨成粉末，加入至2ml組織裂解液(4M異硫氰酸胍，0. 5%十二烷基肌酸鈉，8% β -巰基乙醇，26mM檸檬酸鈉)，渦旋混合10秒后室溫孵育 5分鐘，經15000rpm室溫離心10分鐘。取500 μ 1的上清液加入30K(Pall Corporation, Cat. #0D030C33)超濾離心管，15000rpm室溫離心20分鐘。根據離心后的體積向離心管內加入2. 5倍無水乙醇，用移液器吹打混勻。將混合后的液體移至核酸純化柱，13000rpm離心1 分鐘。棄掉收集管液體，在柱內加入600 μ 1洗脫液(0. OlMTris-HCKpH 7. 5),0. 2M NaCl, 0. 2mM EDTA, 80%乙醇，上述試劑均用DEPC處理ddH20配制)13000rpm，離心1分鐘。棄掉收集管液體，將核酸純化柱按13000rpm離心甩干1分鐘。將純化柱移至新的收集管內，柱內加入50 μ 1預先在90°C水浴中預熱的無RNA酶的去離子DEPC處理過的純凈水，室溫孵育 1分鐘。13000rpm離心2分鐘，離心后得到的液體即為微小RNA，-20°C保存。實施例3微小RNA的檢測本實施例對實施例1和實施例2中得到的微小RNA逆轉錄合成miR-McDNA，并進行實時定量PCR檢測其中的miR-M，具體方法如下取12μ 1上述實施例1或2中提取的microRNA加入1. 5ml塑料離心管中，向離心管中加入5pm逆轉錄引物1 μ 1，混合后放置70°C水浴，5分鐘。迅速放置冰上5分鐘。向離心管中加入5X逆轉錄緩沖液(promegaJ800Woods Hollow Road. Madison, WI 53711-399USA)4y 1，1 μ 1 IOmM dN TPs, RNA 酶抑制劑 1 μ 1 (40 活性單位)，逆轉錄酶 1 μ 1 (200活性單位)，42°C水浴60分鐘，取出離心管，70°C水浴10分鐘，得到的液體即為 cDNA。取 Ιμ 00離，加入5\卩0 緩沖液(卩1~01116區&，2800100(18 Hollow Road. Madi son, WI 53711-399USA[PR0MEGA，地址])5μ 1，0. 625U Taq 酶，Ιμ IOmM dNTPs,5y 1 25mM MgCl2, 1 μ 1 5uM上下游PCR 引物(由 invitrogen合成，上游引物為5，ACACTGGAGCTGGGTGGCTCAGT TCAGCAGG3，；下游引物為5，TGGTGTCGTGGAGTCG3，)，1 μ 1 20 XEva green，用去離子水補足至25 μ 1，開始實時定量PCR檢測(檢測條件如下:95°C 5m ；95°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ； (95°C 20s-64°C 20s_72°C 20s) X40, Roche LightCycler 480)。 數據處理方法為Δ Ct法。高濃度的微小RNA會有較小的Ct值，而低濃度的微小 RNA會出現較大的Ct值。實驗結果如圖2所示，表明實施例1中提取的血漿樣品微小RNA 中的miR-MCt值為23. 70，實施例2中提取的組織樣品微小RNA中的miR-MCt值為15. 49。
權利要求
1.一種小分子RNA的提取方法，其特征在于，所述方法不使用酚/氯仿處理樣品，其包括以下步驟1)采用裂解液處理樣品后，再用濾膜過濾樣品，除去樣品中的大分子組分，得到小分子組分；2)進一步純化小分子組分，得到小分子RNA。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中濾膜的截流分子量為 20K 100K，優選為30K和50K。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟幻中小分子組分的純化是通過以下方法來實現的先采用有機溶劑處理小分子組分，再直接通過核酸結合柱純化。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑選自乙醇和異丙醇。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述核酸結合柱選自RNA純化柱和 DNA純化柱。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述小分子RNA包括微小 RNA、小干擾RNA和小核RNA。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品為生物樣品，選自細胞、組織提取物、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液及其他分泌物。
8.采用權利要求1至7中任一項所述方法提取的小分子RNA，優選地，所述小分子RNA 包括微小RNA、小干擾RNA和小核RNA。
全文摘要
本發明提供一種小分子RNA的提取方法。本發明采用濾膜法，首先將樣品中的大分子組分如DNA和蛋白與小分子組分分開，小分子RNA存在于小分子組分中。將小分子組分經有機物處理后，直接通過特異結合柱加以純化。本發明不涉及有毒的化學成分如酚和氯仿等的使用。本發明為高效快捷的微小RNA分離純化方法，對各種不同來源的樣品(動物、植物、細胞等)，尤其是液體樣本均取得滿意的效果，適用于各種小分子RNA，包括微小RNA、小干擾RNA、小核RNA的提取。
文檔編號C07H21/02GK102191238SQ20101012627
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月15日 優先權日2010年3月15日
發明者夏東元, 張穎, 維克多·韓, 范盤生 申請人:博爾誠(北京)科技有限公司