專利名稱：一種從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種以魚膠原蛋白為原料分離功能多肽
的方法。
背景技術：
我們知道，魚膠原蛋白是指以魚鱗或魚皮為原料采用熱處理、酸/堿處理、酶法降 解或結合多種方式降解獲得的混合物，其主要成份是魚鱗或魚皮中膠原降解后形成的分子 量不均一的多肽類物質。魚膠原蛋白可作為功能食品或保健品，具有提高人體免疫力、促進 鈣的吸收、改善血液微循環以及補充氨基酸營養成份等功能，從魚膠原蛋白中有效識別與 分離不同功能的多肽組份是近年來魚膠原蛋白產品開發中的盲點。 傳統的魚膠原蛋白產品開發的重點主要集中于魚膠原蛋白制備工藝及其對產品 分子量范圍及性能的影響。韓國Hee-GukByun利用離子交換色譜和凝膠過濾色譜的方 法從膠原蛋白中分離出具有抑制血管緊張素轉化酶活性的多肽(ProcessBiochemistry， 2001,36 :1155-1162);日本MaruyamaS從膠原蛋白中分離出可抑制血小板活性的多肽 (Biochimi. Biophysi. Acta ;1993， 1164， 215-223);韓國KimSK采用凝膠過濾色譜結合離 子交換和反相色譜的方法從魚皮明膠中分離出具有抗氧化功能的組份(JAgricFoodChem， 2001,49(4) :1984-9)。傳統的魚膠原蛋白中不同多肽的分離方法主要基于分子量范圍、帶 電荷狀態等性質進行分離，存在分辨率低和特征性不強等缺點。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種步驟合理、具
有分辨率高和特征性強的基于親和層析的從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法。 本發明解決上述技術問題采用的技術方案是一種從魚膠原蛋白中分離功能多肽
的方法，其步驟是
(1) 將魚膠原蛋白溶于水，制成膠原蛋白溶液，并將該溶液的pH值調至6. 0-9. 0 ;
(2) 將膠原蛋白溶液上親和層析柱，循環上樣至親和層析柱吸附樣品達到飽和；
(3) 使用淋洗劑將未與層析介質配基結合的多肽淋洗出；
(4) 使用洗脫劑將與親和層析介質配基結合的多肽洗脫出，洗脫過程的溫度可控制在 15 — 37°C ;
(5) 利用凝膠過濾層析法或膜超濾的方法將得到的洗脫液濃縮，得到濃縮液；(6)將濃縮液冷凍干燥，所得白色粉末即魚膠原蛋白中的功能多肽。
本發明基于親和層析的從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法中，如果待分離的膠 原蛋白原料是水溶液，則省去(l)所述的膠原蛋白溶解過程，直接將膠原蛋白溶液的pH值 調制6. 0-9.0。 本發明所述的魚膠原蛋白可以是魚鱗膠原蛋白或魚皮膠原蛋白。 本發明所述的親和層析柱中層析介質的配基可以是纖維連接蛋白。 本發明所述的洗脫劑可以是含2 — 8mol/L脲、pH值為3. 0 — 8. 0的緩沖液，也可
以是含5 — 50%乙醇的水溶液或5 — 50%乙腈的水溶液。如果采用5 — 50%乙醇的水溶
液或5 — 50%乙腈的水溶液作為洗脫劑，則省去(5)所述的利用凝膠過濾層析法或膜超濾
的方法將得到的洗脫液濃縮，得到濃縮過程，洗脫液直接進行冷凍干燥。 本發明中纖維連接蛋白可與膠原蛋白降解物中的許多多肽特異性結合，利用纖維
連接蛋白等作為配基，采用親和層析的方法分離魚膠原蛋白中的部分多肽，對照現有技術，
本發明步驟合理、方法簡單，具有分辨率高和特征性強等優點。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例1 :
一種從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法，其以2mg/ml的魚鱗膠原蛋白水溶液為原 料，從該魚鱗膠原蛋白中分離功能多肽的方法步驟是
(1) 將原料魚鱗膠原蛋白水溶液的PH調至7. 0 ;
(2) 將魚鱗膠原蛋白水溶液上樣至親和層析柱，循環上樣至親和層析柱吸附樣品達到 飽和，也就是說直至透過液中檢測出膠原蛋白。親和層析柱配基人血漿纖維連接蛋白，柱 填料體積40ml，填料粒徑60 — 120微米；
(3) 使用20ml0. 2mol/L碳酸氫銨作為淋洗劑淋洗層析柱，流速lml/min，將未與層析介 質配基結合的多肽淋洗出；
(4) 使用20X乙醇溶液在3(TC下洗滌層析柱，將與親和層析介質配基結合的多肽洗脫 出，流速lml/min，收集前30min組份;
(5) 將收集到的組份直接冷凍干燥，獲得的白色粉末即為魚鱗膠原蛋白中的功能多肽。
本發明中利用纖維連接蛋白等作為配基，采用親和層析的方法分離魚膠原蛋白中 的部分多肽，步驟合理、方法簡單，具有分辨率高和特征性強等優點。 實施例2:
一種從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法，其步驟是
(1) 其以魚皮膠原蛋白水溶液為原料，將原料魚皮膠原蛋白水溶液的pH調制為7. O，濃 度控制在3-10mg/mL ;
(2) 將魚鱗膠原蛋白水溶液上樣至親和層析柱，至透過液中檢測出膠原蛋白。親和層析 柱配基為人血漿纖維連接蛋白，柱填料體積40ml，填料粒徑60 — 120微米；
(3) 使用20ml0. 2mol/L碳酸氫銨作為淋洗劑淋洗層析柱，流速lml/min，將未與層析介質配基結合的多肽淋洗出；
(4)使用8M脲素溶液(含0. 1NH4HC03)在2(TC下洗滌層析柱，將與親和層析介質配基 結合的多肽洗脫出，流速lml/min，收集前35min組份；
(5 )將收集到的洗脫液使用凝膠過濾層析柱(S印hadexGlO )除去溶液中的脲素，得到洗 脫液濃縮；
(6)脫鹽后的多肽直接冷凍干燥，獲得的白色粉末即為魚鱗膠原蛋白中的功能多肽。
本發明中利用纖維連接蛋白等作為配基，采用親和層析的方法分離魚膠原蛋白中 的部分多肽，步驟合理、方法簡單，具有分辨率高和特征性強等優點。
權利要求
一種從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法，其特征是其步驟為(1)將魚膠原蛋白溶于水，制成膠原蛋白溶液，并將該溶液的pH值調至6.0-9.0；(2)將膠原蛋白溶液上親和層析柱，循環上樣至親和層析柱吸附樣品達到飽和；(3)使用淋洗劑將未與層析介質配基結合的多肽淋洗出；(4)使用洗脫劑將與親和層析介質配基結合的多肽洗脫出，洗脫過程的溫度可控制在15－37℃；(5)利用凝膠過濾層析法或膜超濾的方法將得到的洗脫液濃縮，得到濃縮液；(6)將濃縮液冷凍干燥，所得白色粉末即魚膠原蛋白中的功能多肽。
2. 根據權利要求1所述的從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法，其特征是所說的魚膠原蛋白是魚鱗膠原蛋白或魚皮膠原蛋白。
3. 根據權利要求1所述的從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法，其特征是所說的親 和層析柱中層析介質的配基是纖維連接蛋白。
4. 根據權利要求1所述的從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法，其特征是所說的洗脫劑是含2 — 8mol/L脲、pH值為3. 0 — 8. 0的緩沖液或含5 — 50%乙醇的水溶液或5 — 50%乙腈的水溶液。
全文摘要
本發明涉及一種從魚膠原蛋白中分離功能多肽的方法，其步驟是(1)將魚膠原蛋白溶于水，制成膠原蛋白溶液，溶液pH值為6.0-9.0；(2)將膠原蛋白溶液上親和層析柱，循環上樣至親和層析柱吸附樣品達到飽和；(3)使用淋洗劑將未與層析介質配基結合的多肽淋洗出；(4)使用洗脫劑將與親和層析介質配基結合的多肽洗脫出，洗脫過程的溫度控制在15－37℃；(5)利用凝膠過濾層析法或膜超濾法將得到的洗脫液濃縮，得到濃縮液；(6)將濃縮液冷凍干燥，所得白色粉末即魚膠原蛋白中的功能多肽。本發明中利用纖維連接蛋白作為配基，采用親和層析的方法分離魚膠原蛋白中的部分多肽，步驟合理、方法簡單，具有分辨率高和特征性強等優點。
文檔編號C07K1/22GK101747427SQ20101011730
公開日2010年6月23日 申請日期2010年3月4日 優先權日2010年3月4日
發明者張貴鋒, 白義化, 蘇志國, 苗強 申請人:威海市宇王集團有限公司;中國科學院過程工程研究所