專利名稱：一種人甲狀旁腺激素(1-34)的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽的純化方法，尤其涉及來匹盧定的純化方法。
背景技術：
來匹盧定(L印irudin)是一種用于治療血栓栓塞性疾病、腦血腫、皮下血腫等病癥的多肽藥物，其效果好且副作用小，具有很好的市場前景。在已公開的文獻和專利中，未有報道適用于大規模生產、且具有高收率的純化方法。
發明內容
本發明提出了一種適于產業化的來匹盧定的純化方法，純度高且收率好。
為實現上述目的，本發明提供的技術方案包括以下步驟 1)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以pH值為2. 5-3. 5的磷酸鹽緩沖溶液為A相，乙腈為B相，梯度B% :17% 32%，將粗肽溶液進行梯度洗脫；A相的磷酸鹽緩沖溶液物質量濃度小于0. 2% mol/L。 所述"粗肽"是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未經過精制處理的來匹盧定粗肽或者純度不能滿足藥用的來匹盧定。"粗肽溶液"是指粗肽溶于水所得到的溶液，水優選符合注射用水標準，更優選超純水。"乙腈"的純度級別優選色譜純。步驟l)下文也表述為純化。 2)采用反相高效液相色譜法將來匹盧定轉成醋酸鹽。步驟2)下文也表述為"轉
^! . o 轉鹽的方法優選為所述"反相高效液相色譜"的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以質量濃度0. 05% —0.2X醋酸水溶液為A相；乙腈為B相，梯度B% :6% 36%，進行梯度洗脫。A相醋酸水溶液的濃度優選O. 1%。"乙腈"的純度級別優選色譜純。
本發明提供的來匹盧定肽純化方法，操作簡單、純度高、收率好，達到產業化要求。
純化規模包括以下規格色譜柱(柱子直徑X長度)50mmX300mm、150mmX300mm、300mmX300mm。
具體實施方式
實施例一 1.樣品處理粗肽用水溶解，使樣品完全溶解后用濾膜過濾，收集濾液備用。
2.純化 純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為50mmX300mm。流動相A相物質量濃度為0. 2% mol/L磷酸溶液用三乙胺調pH至2. 5 3. 5 ;B相乙腈，流速70-80ml/min，梯度B%:17% 32%，檢測波長230nm。進樣量為1.3-1.5g。 純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為1. 3-1. 5g。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的來匹盧定溶液于水溫不超過3(TC條件下減壓旋蒸濃縮至約100 120mg/ml后備用。 3、轉鹽以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為50mmX300mm。流動相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色譜純乙腈，流速70-80ml/min，檢測波長230nm，梯度B% :6% 36%。進樣量為1. 6-2. Og。 轉鹽過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為150-200ml樣品溶液。線性梯度洗脫30min，收集目的峰，將收集的來匹盧定溶液合并旋蒸濃縮至約50-80mg/ml后轉至合適大小西林瓶，然后進行冷凍干燥，即可得到純度大于98%的來匹盧定。 實施例二 1.樣品處理粗肽用水溶解，使樣品完全溶解后用濾膜過濾，收集濾液備用。
2.第一次純化純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為150mmX300mm。流動相A相0. 2% mol/L磷酸溶液用三乙胺調pH至
2. 5 3. 5 ;B相乙腈，流速450-550ml/min，梯度B%:17% 32%，檢測波長230nm。進樣量為13-15g。 純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為13-15g。線性梯度洗脫60min，收集目的峰，將收集的來匹盧定溶液于水溫不超過30°C條件下減壓旋蒸濃縮至約70-80mg/ml后備用。 3、轉鹽以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為150mmX300mm。流動相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色譜純乙腈，流速450-550ml/min，檢測波長230nm，梯度B% :6% 36%。進樣量為15_20g。 轉鹽過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為1200-1600ml樣品溶液。線性梯度洗脫60min，收集目的峰，將收集的來匹盧定溶液合并旋蒸濃縮至約50-80mg/ml后轉至合適大小西林瓶，然后進行冷凍干燥，即可得到純度大于98%的來匹盧定。
實施例三 1.樣品處理粗肽用水溶解，使樣品完全溶解后用濾膜過濾，收集濾液備用。
2.第一次純化純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為300mmX300mm。流動相A相0. 2% mol/L磷酸溶液用三乙胺調pH至2. 5 3. 5 ;B相乙腈，流速1900-2200ml/min，梯度B% :17% 32%，檢測波長230nm。進樣量為55-75g。 純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為55-75g。線性梯度洗脫120min，收集目的峰，將收集的來匹盧定溶液于水溫不超過3(TC條件下減壓旋蒸濃縮至約70-80mg/ml后備用。 3、轉鹽以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為300mmX300mm。流動相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色譜純乙腈，流速1900-2200m1/min，檢測波長230nm。梯度B% :6% 36% 。進樣量為55_75g。 轉鹽過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為1200-1600ml樣品溶液。線性梯度洗脫90min，收集目的峰，將收集的來匹盧定溶液合并旋蒸濃縮至約
450-80ml/g后轉至合適大小西林瓶，然后進行冷凍干燥，即可得到純度大于98X的的來匹盧定。
權利要求
一種來匹盧定的純化方法，包括以下步驟1)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以pH值為2.5-3.5的磷酸鹽緩沖溶液為A相，乙腈為B相，梯度B％17％～32％，將粗肽溶液進行梯度洗脫；2)采用反相高效液相色譜法將來匹盧定轉成醋酸鹽。
2. 根據權利要求l所述的方法，其特征在于步驟l)中A相的磷酸鹽緩沖溶液由磷酸溶液采用三乙胺調pH獲得。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中A相的磷酸鹽緩沖溶液物質量濃度小于O. 2% mol/L。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)中A相的磷酸鹽緩沖溶液物質量 濃度小于0. 2% mol/L。
5. 根據權利要求1至4任意一項所述的方法，其特征在于實現步驟2)的方法為所述 "反相高效液相色譜"的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以質量濃度0. 05% —O. 2%醋酸水溶液為A相；乙腈為B相，梯度B% :6% 36%，進行梯度洗脫。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于A相的醋酸水溶液濃度為0. 1%。
全文摘要
一種人甲狀旁腺激素(1-34)的純化方法。本發明提出了一條適于產業化純化來匹盧定的方法，包括以下步驟1)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以pH值為2.5-3.5的磷酸鹽緩沖溶液為A相，乙腈為B相，梯度B％17％～32％，將粗肽溶液進行梯度洗脫；2)采用反相高效液相色譜法將來匹盧定轉成醋酸鹽。本發明提供的來匹盧定的純化方法，操作簡單、產品純度高、收率好，達到產業化要求。
文檔編號C07K14/815GK101781367SQ20101011639
公開日2010年7月21日 申請日期2010年2月26日 優先權日2010年2月26日
發明者付信, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業股份有限公司