專利名稱：一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥提取技術領域，尤其是涉及一種從眼鏡蛇蛇毒中提取神經毒 素并通過修飾使其神經毒性的降低方法。
背景技術：
眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白，其化學成分非常復雜，含有 多種蛋白質、多肽、酶類和其他小分子物質，具有廣泛的生物學活性。隨著現代生物技術的 發展，眼鏡蛇毒的許多組分已得到分離純化和序列測定，各種成分廣泛應用于生物化學、分 子生物學、毒理學和藥物學理論研究和臨床應用。自1933年Monaelesser和Taguet首次報道眼鏡蛇毒對癌組織壓迫神經引起疼痛 的病例的顯著療效以來，眼鏡蛇毒的鎮痛作用得到了深入的研究，其中眼鏡蛇毒神經毒素 (neurotoxin, NTX)顯示了獨特的鎮痛作用，NTX的鎮痛機理與嗎啡類似，鎮痛效果大于嗎 啡，持續時間長，無麻醉作用，無成癮性和耐藥性，但起效較嗎啡慢；同時NTX還能戒除嗎啡 毒癮，所以在癌痛或戒毒等方面具有獨特的治療作用。原有的眼鏡蛇蛇毒神經毒素的制備方法通常采用兩步式純化，分別使用離子交換 樹脂和分子篩進行粗純和精純，步驟較多、生產周期長，并因此導致回收率較低。并且眼鏡 蛇蛇毒神經毒素雖然具有很好的鎮痛效果，但本身也具有相當的神經毒性，使用中會產生 安全隱患。
發明內容
本發明的目的在于改進已有技術的不足而提供一種生產周期短、生產效率高、采 用一步式階段洗脫方式來制備眼鏡蛇蛇毒神經毒素適于規模化生產的方法，并且通過過氧 化氫對神經毒蛋白的氨基酸殘基進行弱氧化修飾，在保持其鎮痛活性的同時降低其神經毒 性。本發明的目的是這樣實現的，一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神 經毒性的方法，其特點是該方法包括以下步驟1)將眼鏡蛇蛇毒凍干粉溶于pH7. 5,20mmol/L的Tris緩沖液中，lOOOOrpm離心 20min，取出后小心倒出上清液。將上清液過0. 22 ii m濾膜；2)將過膜后的上清液上樣到pH7. 5，20mmol/L的Tris緩沖液平衡的CM Sepharose FF層析柱，分別用緩沖液中加NaCL濃度為0. 1，0. 2，0. 4M的溶液洗脫，流速lOml/min，收集 目的蛋白；3)用3K分子量的超濾膜膜包將目的蛋白脫除緩沖鹽，成為無鹽蛋白溶液；4)根據純水溶液中神經毒素的濃度加入30% H202溶液，按照lmg蛋白加入1ml 30%過氧化氫，靜置12 48h后用二氧化錳催化降解過氧化氫，再用0. 22 ym的微孔濾膜 過濾去除二氧化錳，即為神經毒素蛋白原液，真空冷凍干燥后保存。
二氧化錳催化降解過氧化氫所使用的高錳酸鉀是取高錳酸鉀充分灼燒，且灼燒 殘留物反復清洗，洗去紫色可溶高錳酸鉀和褐色可溶錳酸鉀，待洗至溶液澄清時將固體不 溶物濾出待用，此為催化降解過氧化氫的新制備二氧化錳。本發明方法與原有方法相比大大縮短了生產周期，提高了處理量和得率，適用于 規模化生產，且處理后的眼鏡蛇蛇毒神經毒素安全可靠，具有極高的藥用價值。本發明使用超濾膜膜包有如下特點1、超濾過程在常溫下進行，能耗低，不需加 熱，無熱效應及相態變化，不需加入其它物質即可達到分離、濃縮、純化即分級等目的，故特 別適用于1)熱敏性物質(生物制品、菌體、蛋白質)的濃縮分離。2)極稀溶液的濃縮回 收。3)恒體積恒濃度下的脫鹽純化。2、超濾膜耐化學侵蝕，PH適應范圍廣。3、處理量大， 速度快，適合于工業化生產和放大。采用瓊脂糖凝膠介質，有以下特點1、介質載體為剛性材料，粒度90 μ m，流速快， 結合量大，線速度可達到300-500cm/h，對粗提液處理速度快。2、該介質再生效果好。活性 部分洗脫后，可用0. 5MNa0H溶液進行在位清洗，洗脫雜質效果好。同時避免了拆柱和再次 裝柱，節省時間。3、該介質裝填不需要特殊設備，效果重現性好，可以按比例放大適合工業
化生產。采用過氧化氫對眼鏡蛇神經毒蛋白進行修飾，有操作簡單，安全可靠，效果穩定的 特點。經過減毒后的眼鏡蛇神經毒素經動物實驗比為減毒前的眼鏡蛇神經毒素神經毒性降 低30% -40%。這大大提高了眼鏡蛇神經毒素的藥用價值和安全性。本發明通過使用CM-S^harose FF層析樹脂通過一步式層析、階段式洗脫以及使 用流速更快、分辨率更高的層析介質達到了節約生產時間、生產成本，提高了原料處理量， 獲得高品質、高得率產品的目的。所采用的過氧化氫蛋白質修飾方案具有操作簡單，安全可 靠，效果穩定的特點，對眼鏡蛇蛇毒神經毒素的神經毒性降低效果明顯。適用于規模化生 產。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。實施例，一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性的方法，該方 法包括以下步驟(1)處理眼鏡蛇蛇毒原料將IOg眼鏡蛇蛇毒凍干粉溶于100ml pH7. 5，20mmol/L的Tris緩沖液中，為加速 溶解可適當攪拌，注意不要攪起過多的泡沫，充分溶解后的原料溶液IOOOOrpm離心lOmin， 取出后小心倒出上清液，用0. 22 μ m無菌濾膜將其過濾以除去雜質顆粒和細菌；(2)CM S印harose FF 層析過膜后的上清液用蠕動泵以lOml/min的流速上樣到pH 7. 5，20mmol/L的Tris緩 沖液平衡的CM Sepharose FF層析柱(5. 0X 30cm)，并用平衡緩沖液洗脫完流穿峰，之后的 洗脫緩沖液中加入NaCL分別洗脫。加入的NaCL濃度為0. 1M，0. 2M，0. 4M，所有步驟流速均 為lOml/min，收集目的蛋白；(3)制備二氧化錳催化劑取灼燒皿一個，置于鐵架臺上，取 高錳酸鉀少許，倒入灼燒皿，置于酒精燈上灼燒至顏色由紫色變為褐色，將灼燒殘留物反復清洗，洗去紫色可溶高錳酸鉀和褐色可溶錳酸 鉀，待洗至溶液澄清時將固體不溶物濾出待用，此為二氧化錳；(4)眼鏡蛇毒神經毒素修飾將目的蛋白用3K超濾膜膜包脫除緩沖鹽，使之成為純水溶液，根據純水溶液中神經毒素的濃度加入30%過氧化氫溶液，按照Img蛋白加入Iml 30%過氧化氫，靜置24小 時，將二氧化錳作為催化劑以每升IOg比例加入到神經毒素-過氧化氫溶液中，緩慢攪動至 無泡沫冒出，催化過氧化氫降解，將處理后的溶液用0. 22 μ m無菌濾過濾，真空冷凍干燥后 既得減毒后的眼鏡蛇神經毒素成品510mg。
權利要求
一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性的方法，其特征是該方法包括以下步驟1)將眼鏡蛇蛇毒凍干粉溶于pH7.5，20mmol/L的Tris緩沖液中，10000rpm離心20min，取出后小心倒出上清液，將上清液過0.22μm濾膜；2)將過膜后的上清液上樣到pH7.5，20mmol/L的Tris緩沖液平衡的CMSepharose FF層析柱，柱尺寸為5.0×30cm。分別用緩沖液中加NaCL濃度為0.1，0.2，0.4M的溶液洗脫，流速10ml/min，收集目的蛋白。3)用3K分子量的超濾膜膜包將目的蛋白脫除緩沖鹽，成為無鹽蛋白溶液；4)根據純水溶液中神經毒素的濃度加入30％ H2O2溶液，按照1mg蛋白加入1ml 30％過氧化氫，靜置0～48h后用二氧化錳催化降解過氧化氫，再用0.22μm的微孔濾膜過濾去除二氧化錳，即為神經毒素蛋白原液，凍干保存。
2.根據權利要求1所述的一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性 的方法，其特征在于二氧化錳催化降解過氧化氫使用的高錳酸鉀是取高錳酸鉀充分灼燒， 且灼燒殘留物反復清洗，洗去紫色可溶高錳酸鉀和褐色可溶錳酸鉀，待洗至溶液澄清時將 固體不溶物濾出待用，此為催化降解過氧化氫的新制備二氧化錳。
全文摘要
本發明公開了一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性的方法，是將眼鏡蛇蛇毒干粉溶解于pH7.520mmol/L的Tris緩沖液中，離心，過0.22μm微孔濾膜后上樣到同溶液平衡的CM Sepharose FF層析柱，分別用含氯化鈉的平衡緩沖液洗脫，收集目的蛋白以3K超濾膜膜包超濾脫除緩沖液，脫鹽后的蛋白溶液按比例加入適量的過氧化氫，靜置后用二氧化錳催化降解過氧化氫，再用0.22μm的微孔濾膜過濾去除二氧化錳，即為成品準備凍干，本發明與現有技術方法相比減少了純化步驟，提高了處理量和得率，適用于規模化生產，且處理后的眼鏡蛇蛇毒神經毒素在鎮痛效果不變的情況下神經毒性大為降低。
文檔編號C07K14/435GK101845089SQ20101001146
公開日2010年9月29日 申請日期2010年1月15日 優先權日2010年1月15日
發明者劉志強, 呂憲峰, 張坤, 曹恒, 林峰, 王東 申請人:中鑫東泰(萊陽)納米基因生物技術有限公司