專利名稱：：新型志賀氏菌蛋白抗原及方法
技術領域：
：本發明涉及志賀氏菌(Shigellaspp.)的新型蛋白抗原，所述蛋白抗原還存在于大腸桿菌(Escherichiacoli)腸侵襲性菌株上，本發明還涉及將這些抗原用于開發疫苗的方法，所述疫苗針對志賀氏菌種和血清型所引起的志賀氏菌病及腸侵襲性大腸桿菌(EIECs)細菌所引起的疾病。本發明還涉及所述新型抗原和相應抗體在志賀氏菌病診斷和志賀氏菌細菌鑒定中的用途。
背景技術：
：志賀氏菌是通過感染結腸上皮細胞引起人的桿菌性痢疾的革蘭氏陰性細菌病原體。志賀氏菌主要感染腸上皮細胞(IECs)。志賀氏菌表達提供用于傳遞效應子的機制的數種蛋白，所述效應子誘導通過噬菌作用進入宿主細胞的細菌性攝取。為實現效應子的注入，志賀氏菌利用III型分泌(TTS)系統誘導它們進入上皮細胞，觸發受感染巨噬細胞的凋亡。包括痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志賀氏菌(S.flexneri)、鮑氏志賀氏菌(S.boydii)和宋內志賀氏菌(S.sonnei)的志賀氏菌的細菌引起人的志賀氏菌病，該疾病的特征在于破壞結腸上皮，造成每年1百萬人死亡，大多數為發展中國家的兒童。痢疾志賀氏菌有15種血清型，弗氏志賀氏菌中鑒定了14種血清型和亞型，鮑氏志賀氏菌有20種血清型，宋內志賀氏菌內存在單一血清型，不過它們的流行率并不是平均分布的。宋內志賀氏菌是在工業化國家最為流行并在一些拉美國家越發流行的志賀氏菌。1型痢疾志賀氏菌能夠產生志賀毒素，所述志賀毒素能造成高發病率和高死亡率。弗氏志賀氏菌在發展中國家的地方性區域最為流行。世界衛生組織(WHO)將抗志賀氏菌病的疫苗的開發視作發展中國家的首要問題。盡管有可能利用抗生素控制并治療志賀氏菌病的爆發，但是抗生素的高成本以及抗生素抗性的志賀氏菌種的持續出現(其甚至對最新的抗生素產生抗性)提高了對有效疫苗的需求，以幫助控制全世界發展中地區的志賀氏菌病及相關的腸侵襲性大腸桿菌疾病(12)。為建立成功的感染，志賀氏菌精妙地調節宿主的免疫應答，尤其是那些導致炎癥的應答。與鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)不同，志賀氏菌無法侵襲極化的腸上皮細胞的頂極(apicalpole)。相反，志賀氏菌需要多形核白細胞(PMN)的游出(transmigration)以破壞上皮屏障，促進經上皮細胞基底外側極(basolateralpole)的細胞侵襲06)。由天然免疫系統的細胞推動的宿主炎癥應答將PMN吸引至炎癥部位。因此，志賀氏菌的細胞侵襲需要在感染早期觸發炎癥。抵達細胞胞內區隔的細菌生長并在細胞間擴散，免受宿主的免疫防御。然而，受感染的上皮細胞在炎癥過程中發揮了重要作用，它既是檢測細菌侵襲的哨兵，也是介體(mediator)(特別是引發并調控粘膜炎癥的細胞因子和趨化因子)的主要來源。上皮細胞對細菌的識別主要經細胞質分子Nodl/CARD4在胞內發生，Nodl/CARD4感應微生物基序肽聚糖(8)。Nodl的活化誘導其它促炎癥信號通路，所述促炎癥信號通路包括引起趨化因子(如白介素8(IL-8))表達的NF-KB和c-JimN-端激酶(JNK)。因而，觸發過度的炎癥對志賀氏菌在宿主中的生存有害。天然志賀氏菌感染賦予了免疫力，提供針對隨后的同源毒力志賀氏菌感染的防護(5)。這種人類特有的疾病通過受感染患者的糞-口途徑直接傳播或通過受污染的食物和水間接傳播。它是高接觸性的感染，能夠利用少至100個微生物進行傳播(6)。流行病學研究和志愿者研究已經揭示，針對志賀氏菌的保護性免疫力是針對LPS或0-特異性抗原，因此涉及血清型。許多方法被用于志賀氏菌疫苗，包括應用活的減毒志賀氏菌(16，22)；滅活的志賀氏菌全細菌(18)；以及綴合至載體(carrier)(如蛋白體(M)、破傷風類毒素05)和核糖體(31))的志賀氏菌脂多糖(LPS)或0-多糖。盡管已進行了多年的廣泛研究，但仍未有針對所述志賀氏菌種的有效且廉價的疫苗。使用志賀氏菌減毒菌株用作活的口服疫苗引起的保護性功效已得到證實。遺傳上良好表征的侵襲性志賀氏菌疫苗的臨床試驗結果是有前景的。在志愿者試驗中，經口服給藥的CVD1208、SC602、WRSSl和WRSdl侯選疫苗是安全且具有免疫原性的，并且就SC602而言，已證明它能抗痢疾(11，16，17，33)。CVD1208的臨床試驗證明，可以通過將sen和set基因從疫苗菌株中清除來減輕由某些活的志賀氏菌疫苗引起的輕微發熱和腹瀉癥狀。將一種血清型中的成功策略復制至其它血清型是正在進行的研究領域，但最終會需要使用不同血清型志賀氏菌菌株的多價混合物，所述多價混合物能夠抵御大多數志賀氏菌01)。最近在6個亞洲國家進行的多中心志賀氏菌腹瀉研究表明，從患者分離的志賀氏菌種的相對分布在不同國家和地點各不相同。此外，弗氏志賀氏菌血清型的分布在地點間及甚至在年份間是高度不均勻的。志賀氏菌種和血清型的不均勻分布提示，需要多價的或交叉保護性的志賀氏菌疫苗，以在全世界范圍預防志賀氏菌病(35)。旨在提供廣譜覆蓋的疫苗會需要包括所有重要的志賀氏菌血清型01)。為解決這一難題，已提倡基于應用“五價制劑”的疫苗策略，所述“五價制劑”包括弗氏志賀氏菌2a、弗氏志賀氏菌3a和弗氏志賀氏菌6這些菌株以及減毒的宋內志賀氏菌菌株和痢疾志賀氏菌1菌株(Noriega等人，1994)。或者，可以將復雜結構的應用視作針對最常見的志賀氏菌種和血清型所造成的感染的疫苗接種方法，所述復雜結構由志賀氏菌的血清型特異性抗原和交叉反應抗原(如滅活的全細菌或活的減毒全細菌)組成。已提出鼻內給藥的Irwaplex，目前處于沃爾特里德陸軍研究所(WalterReedArmyInstituteofResearch,WRAIR)的I期試驗階段，所述hvaplex為來自志賀氏菌水提取物的純化復合物，所述純化復合物由Ipa蛋白和LPS組成03)。因而，需要有效的疫苗以幫助控制世界發展中地區的志賀氏菌和相關的腸侵襲性大腸桿菌疾病。
發明內容在某些實施方式中，本發明涉及用于使哺乳動物針對志賀氏菌產生免疫的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含對引發針對志賀氏菌的免疫應答有效量的志賀氏菌及藥學上可接受的載體(carrier)或稀釋劑，所述志賀氏菌來自于由IcsP2蛋白和SigA2蛋白組成的組。在某些實施方式中，所述志賀氏菌IcsP2蛋白和SigA2蛋白與其它蛋白化學綴合或基因融合。在另外的實施方式中，本發明涉及用于使哺乳動物針對志賀氏菌產生免疫的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含對引發針對志賀氏菌的免疫應答有效量的志賀氏菌IcsP2及藥學上可接受的載體或稀釋劑。在其它另外的實施方式中，本發明涉及用于使哺乳動物針對志賀氏菌產生免疫的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含對引發針對志賀氏菌的免疫應答有效量的志賀氏菌SigA2及藥學上可接受的載體或稀釋劑。在其它另外的實施方式中，本發明涉及用于使哺乳動物針對志賀氏菌產生免疫的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括一定量的化學綴合或基因融合的IcsP2和SigA2。在某些實施方式中，所述疫苗組合物還包含佐劑。在某些實施方式中，所述佐劑是乳狀液的油相，所述乳狀液選自于由油包水乳狀液和雙油乳狀液(doubleoilemulsion)組成的組。在另外的實施方式中，本發明涉及分離的多肽，所述多肽包括如序列編號2所示的氨基酸序列(代表志賀氏菌IcsP2)。在另外的實施方式中，本發明涉及分離的多肽，所述多肽包括如序列編號4所示的氨基酸序列(代表SigA2)。在另外的實施方式中，本發明涉及分離的核酸序列，所述核酸序列編碼志賀氏菌IcsP2多肽。在另外的實施方式中，本發明涉及分離的核酸序列，所述核酸序列編碼SigA2多肽。在另外的實施方式中，本發明涉及分離的核酸序列，所述核酸序列編碼志賀氏菌IcsP2多肽和SigA2多肽。在另外的實施方式中，本發明涉及包含權利要求8、9或10的核酸序列的載體(vector)。在另外的實施方式中，本發明涉及利用本文所述的任意載體轉染的宿主細胞。在另外的實施方式中，本發明涉及產生志賀氏菌IcsP2多肽和SigA2多肽的方法，所述方法包括在適于蛋白表達的條件下，培養本文所述的任意宿主細胞，并從所培養后的細胞收集所述多肽。在另外的實施方式中，本發明涉及免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包括a)志賀氏菌IcsP2和SigA2;以及b)佐劑，其中，聯用的a)和b)的量有效地引發針對志賀氏菌的免疫應答。在另外的實施方式中，本發明涉及治療患有或易患病原體感染的哺乳動物的方法，所述方法包括給予有效量的本文所述的疫苗組合物。在某些實施方式中，所述疫苗組合物的有效量為約10微克至約2毫克。在另外的實施方式中，本發明涉及調節哺乳動物免疫應答的方法，所述方法包括給予有效量的本文所述的任意一種疫苗組合物。在某些實施方式中，所述疫苗組合物的有效量為約10微克至約2毫克。在另外的實施方式中，本發明涉及與志賀氏菌IcsP2多肽特異結合的抗體。在另外的實施方式中，本發明涉及與SigA2多肽特異結合的抗體。在某些實施方式中，所述抗體還包含標記。在另外的實施方式中，所述標記選自于由酶、蛋白、肽、抗原、抗體、凝集素、碳水化合物、生物素、親和素、放射性同位素、毒素和重金屬組成的組。在另外的實施方式中，所述抗體是人源化抗體。在另外的實施方式中，所述抗體是CDR移植抗體。在另外的實施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在另外的實施方式中，所述抗體是抗體片段。在另外的實施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在另外的實施方式中，所述抗體是多克隆抗體。在另外的實施方式中，本發明涉及含糖的綴合物分子，所述糖包含志賀氏菌細菌的0抗原，且所述糖共價結合到志賀氏菌IcsP2或SigA2蛋白。在另外的實施方式中，本發明涉及含糖的綴合物分子，所述糖包含志賀氏菌細菌的0抗原，且所述糖共價結合到本文所述的多肽。在另外的實施方式中，本發明涉及用于使哺乳動物針對志賀氏菌病產生免疫的疫苗，所述疫苗包含本文所述的綴合物分子。在另外的實施方式中，本發明涉及含有糖的綴合物分子，所述糖來自與志賀氏菌屬無關的細菌，且所述糖共價結合到志賀氏菌IcsP2或SigA2蛋白。在另外的實施方式中，本發明涉及含有糖的綴合物分子，所述糖來自與志賀氏菌屬無關的細菌，且所述糖共價結合到本文所述的多肽。在另外的實施方式中，本發明涉及用于使哺乳動物針對志賀氏菌病和傷寒病產生免疫的疫苗，所述疫苗包含本文所述的綴合物分子。圖1顯示受IcsP2蛋白免疫接種保護的動物免受弗氏志賀氏菌加對肺的攻擊。該結果還顯示受弗氏志賀氏菌減毒活疫苗菌株(SC602)的鼻內給藥保護的小鼠免受攻擊。圖2顯示受IcsP2粘膜免疫接種保護的小鼠免受弗氏志賀氏菌不同血清型誘導的肺炎。圖3顯示受IcsP2粘膜免疫接種保護的小鼠免受1型痢疾志賀氏菌誘導的肺炎。圖4顯示SigA2的粘膜免疫接種防止弗氏志賀氏菌^^2457T)攻擊，但不防止弗氏志賀氏菌fe(M90T)攻擊。圖5顯示與CT佐劑一起給予的SigA2或IcsP2的粘膜給藥誘導了血清抗體應答。圖6A-B是說明SigA2免疫接種的動物在脾(圖6A)和肺(圖6B)中均主要出現IgA-ASC和IgG-ASC應答的圖。圖7是說明SigA2的全身(腹膜內(i.p·))免疫接種和粘膜(鼻內(i.n·))免疫接種誘導了肺和血清中的抗體應答的圖。圖8顯示了針對SigA2蛋白產生的小鼠抗血清對志賀氏菌菌株中SigA2蛋白的識別。圖9顯示SigA2的測試抗血清抑制了弗氏志賀氏菌誘導的菌斑形成。圖10是顯示SigA基因和icsP基因在志賀氏菌的各血清型中的存在的凝膠照片。圖IlA-D顯示抗SigA2的抗體抑制了弗氏志賀氏菌加引起的角膜結膜炎。圖12顯示了IcsP2片段的DNA序列及其在全長IcsP序列內的位置。該IcsP2片段提取自弗氏志賀氏菌加2457T菌株全長基因組序列的全長iscP基因。圖13顯示SigA2片段的DNA序列及其在全長SigA序列內的位置。該SigA2片段提取自弗氏志賀氏菌加2457T菌株全長基因組序列的全長SigA基因。具體實施例方式本發明涉及在抗志賀氏菌感染的疫苗組合物中作為候選蛋白抗原的IcsP和SigA的鑒定。更具體地，本發明涉及志賀氏菌IcsP和SigA的特定多肽部分或片段，所述多肽部分或片段能夠誘導針對毒力志賀氏菌細菌引起的感染的保護性免疫應答。下文將所述特定多肽分別稱作IcsP2和SigA2。IcsP2對所有志賀氏菌是常見的，并且還存在于EIEC上。SigA2存在于弗氏志賀氏菌加菌株上以及鮑氏志賀氏菌菌株和宋內志賀氏菌菌株上。本發明涉及鑒定為與志賀氏菌表面結合的和/或由志賀氏菌分泌的蛋白抗原IcsP2和SigA2，所述蛋白抗原IcsP2和SigA2對于包括弗氏志賀氏菌、宋內志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌在內的志賀氏菌類型和種是常見的，并能夠在作為疫苗給予時，防止志賀氏菌病和其它腸道感染。此外，本發明涉及在志賀氏菌種和EIEC間也常見的特定的所述抗原。本發明還涉及針對這些抗原所產生的抗體的用途及DNA探針在志賀氏菌和EIEC感染診斷中的用途。抗原鑒定和所述抗原的表征可獲得志賀氏菌的全基因組序列，所述志賀氏菌包括弗氏志賀氏菌加菌株2457T(37)和Sf301(15)；弗氏志賀氏菌5b菌株Sf8401(20)；痢疾志賀氏菌1菌株Sdl97；鮑氏志賀氏菌血清型4菌株SId227和宋內志賀氏菌菌株&046(38，39)。除所述志賀氏菌菌株的全基因組序列外，還可以獲得來自多種志賀氏菌的毒力質粒的全核苷酸序列(3，14)。IcsP志賀氏菌在宿主細胞胞質內的運動依賴于該細菌將宿主細胞肌動蛋白募集至其表面而形成肌動蛋白尾的能力，所述肌動蛋白尾將該細菌從一個細胞推動至另一個細胞(2).肌動蛋白尾的組裝由單一細菌蛋白IcsA介導，所述IcsA存在于細菌一極的外表面，而肌動蛋白的組裝發生在該極07)。所述IcsA蛋白集中于細菌的成熟極(oldpole)，且所述IcsA蛋白對肌動蛋白的組裝而言是必要且充分的(9)。icsA基因位于志賀氏菌毒力質粒上，由于它是細菌運動所必需的，因而在所有血清型和種中均存在(38)。所述IcsA蛋白由2個域組成α-域(53-758位的殘基)含有肌動蛋白組裝的決定簇，α-域從細菌表面延伸至胞外環境，而β-域(759-1102位的殘基)嵌入外膜(32)。外膜蛋白酶IcsP將IcsA從細菌表面緩慢切割下來(7)。志賀氏菌的大(230-1Λ)毒力質粒上的單順反子操縱子編碼IcsPC3)。IcsP的缺失導致表面IcsA的分布改變，使得極帽(polarcap)維持，一些IcsA沿細菌側壁分布。這個327個氨基酸的多肽的氨基酸序列與大腸桿菌蛋白酶OmpP和OmpT都具有58%的序列一致性，與鼠傷寒沙門氏菌(SalmonelIaTyphimurium)蛋白酶E前體I^rtA具有42%的序列一致性，并與鼠疫耶氏菌Yersiniapestis)纖維蛋白溶酶前體Pla具有40%的序列一致性09)。SigAsigA基因位于弗氏志賀氏菌加染色體DNA的毒力島(pathogenicityisland)上。雖然SigA被認為僅存在于弗氏志賀氏菌血清型加中，但在鮑氏志賀氏菌和宋內志賀氏菌中也報道過sigA的存在(38)。序列分析表明SigA編碼139kDa的蛋白，該蛋白屬于自主轉運蛋白的SPATE(腸桿菌科(Enterobacteriaceae)絲氨酸蛋白酶自主轉運蛋白)亞家族(1)。與腸聚集性大腸桿菌自主轉運蛋白Pet(腸毒性的細胞病變性蛋白酶)相比，SigA蛋白的氨基酸一致性是58%(I)0與野生型志賀氏菌相比，SigA突變細菌表現出積液的減少，但是所述突變體細菌仍然能夠誘導大量積液，暗示SigA僅是弗氏志賀氏菌加產生的多種腸毒素中的一種。倘若所述抗原確實是保護性的，這對志賀氏菌的大部分(如果不是所有)種和血清型中常見的新抗原的鑒定會是理想的。基因組學和蛋白組學對于發現新的疫苗靶標和開發有效疫苗的能力具有顯著影響，一些志賀氏菌的表面蛋白被認定為可能的志賀氏菌病候選疫苗(13，19，36)。本發明還涉及目的志賀氏菌蛋白的克隆、表達和純化。所純化的蛋白用于免疫和評價三種動物模型中的保護性免疫力，所述三種動物模型為1)小鼠肺炎模型；幻豚鼠角膜結膜炎模型和3)豚鼠結腸炎模型(所述模型記載于10，28，30)。在某些實施方式中，本發明提供了用于篩選志賀氏菌常見蛋白抗原的方法，本發明所使用的方法可用于粘膜病原體的蛋白抗原的篩選。在某些實施方式中，本發明提供了用于產生所述志賀氏菌IcsP2多肽和SigA2多肽的特異性抗體及用于制備特異性地針對所述常見抗原的相應的DNA探針的方法。所述抗體和DNA探針可以用于對表達所述常見抗原或相應基因的細菌進行檢測及用于志賀氏菌和EIEC所引起的桿菌性痢疾的診斷。治療性抗體還可以用于治療患有急性桿菌性痢疾的患者，所述急性桿菌性痢疾由表達相應蛋白抗原的細菌引起。桿菌性痢疾的診斷除志賀氏菌之外，大腸桿菌的某些菌株能夠引起痢疾。當前，已公認的引起人腸胃炎的致瀉性大腸桿菌(enterovirulentΕ.coli)(總稱為EEC組)有4種。大腸桿菌是人和其它靈長類中正常腸內菌群的一部分。少數大腸桿菌菌株能夠通過數種不同機制引起人類的疾病。這其中便有腸侵襲性(EIEC)菌株。何種食物能夠攜有這些能夠引起桿菌性痢疾的病原性腸侵襲性(EIEC)菌株還是未知的。腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)可以產生稱作桿菌性痢疾的疾病。引起該綜合癥的EIEC菌株與志賀氏菌密切相關。攝入EIEC后，該生物體侵襲腸上皮細胞，導致輕型痢疾，其常被誤認為是志賀氏菌種引起的痢疾。該疾病的特征在于受感染個體的糞便中出現血和粘液。由于必須從糞便中分離該細菌，而志賀氏菌和EIEC的感染劑量被認為是少至10-100個生物體，因此，志賀氏菌和EIEC感染的診斷相對困難。來自受感染個體糞便的生物體的培養以及證實組織培養物或適當動物模型中分離物的侵襲性，對于該生物體所引起的痢疾的診斷是必需的。然而，這樣的方法麻煩且耗時。EcheverriaP.等人記載道，“(…)通過在選擇培養基上培養糞便標本并借助種特異性抗血清檢測分離物的凝集，經典地鑒定了四個志賀氏菌種(痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內志賀氏菌)。DNA探針已經用于鑒定不在抗血清中凝集的乳糖發酵和非乳糖發酵的EIEC和志賀氏菌分離物。如果可利用具有志賀氏菌抗血清的、有能力的細菌學實驗室，那么所述DNA探針對于志賀氏菌的鑒定不是必需的。與EIEC感染相關的臨床疾病與志賀氏菌病相似。然而，與患有志賀氏菌病的兒童相比，患有EIEC感染的兒童大便潛血(36%對82%)及每個高倍視野中多于10個糞便白細胞(36%對67%)的情況較少。目前，標準的細菌學方法及對大腸桿菌分離物與志賀氏菌/EIEC探針雜交的測試是診斷由這些腸病原體造成的感染的最靈敏的手段。在不能利用細菌學實驗室的情況下，鑒定志賀氏菌和EIEC感染的更為快速的方法涉及免疫學測定法”GO)，Rev.Infect.Dis.1991三月-四月；13增補4:S220-5)。本發明部分涉及這樣的發現，即EIEC也表達IcsP2，且IcsP2的序列與志賀氏菌IcsP2高度同源，但不與致瀉性大腸桿菌(EEC)的其它3類基因高度同源。因此，本發明的一個方面涉及作為針對EIEC的保護性試劑的IcsP2，還涉及針對志賀氏菌IcsP2的DNA探針和特異性抗體，所述DNA探針和特異性抗體能夠用于志賀氏菌和EIEC引起的痢疾的診斷。在一種實施方式中，本發明所公開的志賀氏菌多肽抗原與藥學上可接受的稀釋劑一起給藥。可以通過注射(皮下、皮內、肌內)或使用粘貼片(adhesivepatch)局部施用至皮膚上來給予這樣的制劑。或者，使用藥學上可接受的媒介(vehicle)，通過粘膜途徑(口服途徑、含服(buccal)途徑、舌下途徑、滴鼻劑、氣霧劑、直腸途徑)給予所述疫苗。還可以將所述抗原與佐劑混合以增強隨后發生的免疫應答。所述佐劑的實例非限制性地是鋁鹽、免疫刺激復合物(ISCOM)、基于皂角苷的佐劑、水包油型和油包水型乳狀液、Toll樣受體配體(如胞壁酰二肽)、大腸桿菌LPS、由非甲基化DNA組成的寡核苷酸、多聚I:C、脂磷壁酸、肽聚糖。腸毒素和它們的佐劑活性衍生物，如霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素、百日咳毒素、志賀毒素和類似物。在本發明的另一種實施方式中，在非毒力或減毒細菌中克隆和表達所公開的抗原，減毒細菌被用作載體(vectors)，所述載體包含能夠起始mRNA合成的DNA啟動子元件，所述啟動子元件與含有編碼志賀氏菌IcsP和SigA的基因之一或兩者的開放閱讀框可操作地連接。所得的一種或多種蛋白被輸出并在細菌表面和/或周質被組裝。隨后，這樣的非毒力或減毒細菌可以用作口服或粘膜疫苗。細菌載體的實例為本領域已知，如大腸桿菌、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、志賀氏菌、霍舌L弧菌(Vibriocholera)、桿菌(Bacillusspp·)、梭狀芽胞桿菌(Clostridiumspp.)、單增李其jf特菌(Listeriummonocytogenes)>分支桿菌(Mycobacteriumspp·)、乳酸桿菌(Lactobacillusspp·)、乳球菌(Lactococcusspp.)、格氏鏈球菌(Str印tococcusgordonii)。在另一種實施方式中，在已裝配有合適啟動子的志賀氏菌非毒力菌株或突變體菌株中過表達IcsP和SigA抗原。隨后，表達IcsP抗原或SigA抗原或表達這兩者的細菌可以用作抗志賀氏菌病的活疫苗。或者，可以用福爾馬林或通過加熱使所述過表達菌株失活，而所得細菌可以用作滅活疫苗。本發明另外的實施方式是用于轉化志賀氏菌種的載體，所述載體導致異源抗原的周質表達。該表達不大可能改變口服后的志賀氏菌的天然組織向性(結腸上皮)或不大可能顯著降低菌株的侵襲性。合適的志賀氏菌種包括宋內志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌和鮑氏志賀氏菌的減毒活疫苗菌株。示例性的轉化的志賀氏菌菌株包括志賀氏菌疫苗菌株，例如弗氏志賀氏菌2a(SC608(3098))、弗氏志賀氏菌2a(SC608(cfaAE))、弗氏志賀氏菌2a(SC608(pCFAI))和弗氏志賀氏菌加(30608(041/1^^))。這些菌株的特征在于在icsA和基因iucA中具有缺失，icsA是使志賀氏菌能夠在宿主上皮細胞的胞內和胞間擴散的基因，而基因iucA在細菌的鐵獲取中發揮作用。這些轉化的志賀氏菌菌株適用于免疫原性組合物，特別是口服或粘膜給藥的疫苗。用作載體系統的其它細菌已有記載，并在本領域中是公知的·出于包括開發活疫苗在內的多種目的，將沙門氏菌和大腸桿菌細菌表面蛋白用作外源抗原表位的載體或媒介(美國專利第5，348，867號，發明人660印1011，George,Francisco，JosephA，Earhart,CharlesF.)0攜帶編碼信號序列的表達盒的乳酸桿菌，其中，生物學上的活性多肽與異源羧基末端靶區域連接(W0/2005/012491，PCT/US2004/002460)發明人CHANG，Chia-Hwa，LIU,Xiaowen等人)。細菌表面蛋白表達Smit，John；禾口NinaAgabian；“CloningoftheMajorProteinoftheCaulobactercrescentusPeriodicSurfaceLayer-DetectionandCharacterizationoftheClonedPeptidebyProteinExpressionAssays"(1984)J.Bacteriol.160，1137-1145.美國專利第5，500，353號。重組多肽在宿主細胞中的區隔化。(07^00/00686，美國專利第6，610，517號，發明人WernerLubitz)。蛋白的酵母細胞表面展示及其用途(美國專利第6,423,538號)ffittrup,K.Dane等人)。重組分支桿菌、特別是重組牛分支桿菌BCG，其表達編碼目的產物(蛋白或多肽)的異源DNA(美國專利第5，591，632號)0'Donnell,MichaelA.等人)。革蘭氏陽件細菌在重組蛋白表汰中的用涂(美國專利第5,821,088號)Darzins,Aldis等人GianniPozzi等人，"DeliveryandExpressionofaHeterologousAntigenontheSurfaceofStreptococci",InfectionandImmunity(May1992)60:1902-1907。·桿菌中的表達和分泌方法(美國專利第5，032，510號)-S.Kovacevic等人。用于將IcsP多肽和/或SigA多肽導入哺乳動物細胞、組織、器官或生物體的載體還包括裝配有合適的啟動子元件的減毒病毒，所述啟動子元件控制編碼IcsP和/或SigA的轉基因的表達，所述載體可以被制備并用于產生IcsP和/或SigA。可以用于表達IcsP和/或SigA的病毒載體的實例包括但不限于腺病毒、脊髓灰質炎病毒、辛德畢斯病毒(sindbisvirus)載體、西門利克森林病毒(SemlikiForrestvirus)、痘病毒、乳頭狀瘤病毒、逆轉錄病毒或慢病毒。其它用于表達IcsP和/或SigA的載體包括病毒樣顆粒(VLP)和噬菌體。另外，IcsP和SigA可以被合并到包含選擇基因、酵母序列和編碼IcsP和/或SigA的多核苷酸的重組表達載體中，其中，所述多核苷酸與酵母啟動子可操作地連接，所述載體用于轉染產生本發明的IcsP多肽和/或SigA多肽的酵母細胞。可以為在酵母細胞中表達本發明的蛋白設計本發明的重組表達載體。本領域公知在酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)禾口乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis))中表達蛋白的方法。本發明還涉及特異性針對IcsP基因和SigA基因及IcsP2多肽和SigA2多肽的試劑在診斷性測試設計中的用途。在本發明的另一種實施方式中，在非毒力或減毒細菌中克隆和表達所公開的抗原，所述減毒細菌被用作載體，所述載體包含能夠起始mRNA合成的DNA啟動子元件，所述啟動子元件與含有編碼志賀氏菌IcsP和SigA的基因之一或兩者的開放閱讀框可操作地連接。所得的一種或多種蛋白被輸出并在細菌表面和/或周質被組裝。隨后，這樣的非毒力或減毒細菌可以用作口服或粘膜疫苗。在另一種實施方式中，在已裝配有合適啟動子的志賀氏菌非毒力菌株或突變體菌株中過表達IcsP和SigA抗原。隨后，表達IcsP抗原或SigA抗原或表達這兩者的細菌可以用作抗志賀氏菌病的活疫苗。或者，可以用福爾馬林或通過加熱使所述過表達菌株失活，而所得細菌可以用作滅活疫苗。本發明另外的實施方式是用于轉化志賀氏菌種的載體，所述載體導致異源抗原的周質表達。該表達不大可能改變口服后的志賀氏菌的天然組織向性(結腸上皮)或不大可能顯著降低菌株的侵襲性。合適的志賀氏菌種包括宋內志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌和鮑氏志賀氏菌的減毒活疫苗菌株。示例性的轉化的志賀氏菌菌株包括志賀氏菌疫苗菌株，例如弗氏志賀氏菌2a(SC608(3098))、弗氏志賀氏菌2a(SC608(cfaAE))、弗氏志賀氏菌2a(SC608(pCFAI))和弗氏志賀氏菌加(30608(041/1^^))。這些菌株的特征在于在icsA和基因iucA中具有缺失，icsA是使志賀氏菌能夠在宿主上皮細胞的胞內和胞間擴散的基因，而基因iucA在細菌的鐵獲取中發揮作用。這些轉化的志賀氏菌菌株適用于免疫原性組合物，特別是口服或粘膜給藥的疫苗。用作載體系統的其它細菌已有記載，并在本領域中是公知的·出于包括開發活疫苗在內的多種目的，將沙門氏菌和大腸桿菌細菌表面蛋白用作外源抗原表位的載體或媒介(美國專利第5，348，867號，發明人660印1011，George,Francisco，JosephA，Earhart,CharlesF.)0攜帶編碼信號序列的表達盒的乳酸桿菌，其中，所述生物學上的活性多肽與異源羧基末端靶區域連接(W0/2005/012491，PCT/US2004/002460)發明人CHANG，Chia-Hwa,LIU,Xiaowen等人)。細菌表面蛋白表達Smit，John；禾口NinaAgabian；“CloningoftheMajorProteinoftheCaulobactercrescentusPeriodicSurfaceLayer:DetectionandCharacterizationoftheClonedPeptidebyProteinExpressionAssays"(1984)J.Bacteriol.160，1137-1145.美國專利第5，500，353號。重組多肽在宿主細胞中的區隔化。(07^00/00686，美國專利第6，610，517號，發明人WernerLubitz)。蛋白的酵母細胞表面展示及其用途(美國專利第6,423,538號)Wittrup，K.Dane等人)。重組分支細菌、特別是重組牛分支桿菌BCG，其表達編碼目的產物(蛋白或多肽)的異源DNA(美國專利第5，591，632號)0'Donnell,MichaelΑ.等人)。革蘭氏陽性細菌在重組蛋白表達中的用途(美國專利第5,821,088號)Darzins，Aldis等人GianniPozzi等人，"DeliveryandExpressionofaHeterologousAntigenontheSurfaceofStreptococci",InfectionandImmunity(May1992)60:1902-1907·桿菌中的表達和分泌方法(美國專利第5，032，510號)-S.Kovacevic等人本發明還涉及特異性針對IcsP基因和SigA基因及IcsP2多肽和SigA2多肽的試劑在診斷性測試設計中的用途。稱作聚合酶鏈式反應(PCR)的基因擴增技術是本領域公知的，并已將該技術用于志賀氏菌感染的診斷G1)。本發明公開了能夠與ICSP2基因序列和SigA2基因序列結合的特異性引物。所述引物可以用于擴增臨床樣品(例如糞便)中存在的細菌中的icsP基因或SigA基因，可以通過可視化方法、光度計方法、同位素方法或熒光光度計方法檢測所擴增片段。因而，本發明請求保護特異性針對所述IcsP2基因序列和SigA2基因序列的寡核苷酸引物在志賀氏菌和EIEC引起的痢疾的診斷中的用途。本發明還涉及針對SigA2和IcsP2的抗血清的產生。所述抗血清能夠與相應的多肽反應，所述相應的多肽由不同的志賀氏菌種表達。此外，所述抗血清能夠抑制志賀氏菌細菌對HeLa細胞的體外感染，并且在角膜結膜炎模型中能夠使動物免受志賀氏菌所引起的炎癥。本發明還涉及志賀氏菌的IscP2和0多糖抗原的綴合物以及志賀氏菌的SigA2和0多糖抗原的綴合物。病原體細菌表面上的0-特異性多糖被認為既是保護性抗原，也是基本的毒力因子。大多數多糖無法在嬰兒以及免疫系統削弱的成人中引發保護性水平的抗多糖抗體，這可以通過它們與賦予T細胞依賴性質的蛋白的共價連接來克服。該原理導致抗流感嗜血桿菌b(Haemophilusinfluenzaeb)(Hib)疫苗、抗月市炎球菌月市炎(pneumococcalpneumonia)疫苗和抗腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)疫苗的構建。綴合物技術向革蘭氏陰性細菌的0特異性多糖的延伸提供了新一代糖綴合物疫苗。最初，Avery和Goebel在J.Exp.Med.50:531(1929)中以及Goebel在J.Exp.Med.50:469-520(1929)中指出，可以通過將肺炎球菌3型多糖化學結合至載體蛋白來提高它的免疫原性。該原理已被成功應用于提高其它病原體多糖的免疫原性。將多糖共價綴合至蛋白載體的方法為本領域所公知，并包括如下方法Gu,X.等人，〃Synthesis,Characterization,andImmunologicPropertiesofDetoxifiedLipooligosaccharidefromNontypeableHaemophilusinfluenzaConjugatedtoProteins'7,InfectionandImmunity,64(10),(1996)pp.4047-4053.Gupta，R.等人，〃ComparativeImmunogenicityofConjugatesComposedofEscherichiacoli0111O-SpecificPolysaccharide,PreparedbyTreatmentwithAceticAcidorHydrazine,BoundtoTetanusToxoidbyTwoSyntheticSchemes“，InfectionandImmunity，63(8)，(1995),pp.2805-2810.Gupta，R.等人，〃Synthesis,Characterization,andSomeImmunologicalPropertiesofConjugatesComposedoftheDetoxifiedLipopolysaccharideofVibriocholerae01SerotypeInabaBoundtoCholeraToxin“，InfectionandImmunity,60(8)，(1992)，pp.3201—3208·Konadu,Ε.等人，〃InvestigationalVaccineforEscherichiacoli0157:Phase1Studyof0157O-SpecificPolysaccharide-PseudomonasaeruginosaRecombinantExproteinAConjugatesinAdults"，JournalofInfectiousDiseases，177，(1998)，pp.383-387.Konadu,E.等人，”Phase1andPhase2StudiesofSalmonellaentericaSerovarParatyphiAO-SpecificPolysaccharide-TetanusToxoidConjugatesinAdults，Teenagers，and2_to4-YearOldChildreninVietnam”，InfectionandImmunity,68(3)，(2000)，pp.1529-1534.Konadu,Ε.等人，〃Preparation，Characterization,andImmunologicalPropertiesinMiceofEscherichiacoli0157O-SpecificPolysaccharide-ProteinConjugateVaccines“,InfectionandImmunity,62(11),(1994),pp.5048-5054.Robbins,J.等人，"Polysaccharide-ProteinConjugates:ANewGenerationofVaccines",TheJournalofInfectiousDiseases,161,(1990),pp.821-832.Taylor,D.等X，"Synthesis,Characterization,andClinicalEvaluationofConjugateVaccinesComposedoftheO-SpecificPolysaccharidesofShigelladysenteriaeType1，ShigellaflexneriType2a,andShigellasonnei(Plesiomonasshigelloides)BoundtoBacterialToxoids“，InfectionandImmunity,61,(1993),pp.3678-3687.W0/1999/003871；美國專利4771127；美國專利5866132。在另一種實施方式中，本發明涉及綴合物，其中，志賀氏菌0多糖通過間隔子與IcsP或SigA偶聯，以增強多糖的抗原性和免疫原性，所述綴合物用于誘導對所述蛋白和多糖的免疫應答。在又一種實施方式中，志賀氏菌IcsP和SigA蛋白可以被化學綴合或是志賀氏菌IcsP和SigA蛋白與在例如疫苗中用作免疫原的其它蛋白的基因融合的產物。所述蛋白包括破傷風類毒素、白喉類毒素、霍亂毒素B亞基、大腸桿菌腸毒素B亞基和鞭毛蛋白。所述蛋白為本領域所公知，并如以下出版物所指出的，所述蛋白已經在工業和/或研究中廣泛用于這些目的SJMcKenzie禾口JFHalsey,CholeratoxinBsubunitasacarrierproteintostimulateamucosalimmuneresponse.TheJournalofImmunology,Vol133,Issue41818-1824；S.Shah,R.Raghupathy,0m.Singh,G.P.Talwar禾口k.Sodhi,PriorimmunitytoacarrierenhancesantibodyresponsestohCGinrecipientsofanhCG—carrierconjugatevaccine.Vaccine,Volume17,Issues23-24,1999,3116-3123；LEMOIGNEVincent；R0BREAUGeorges；MAHANAWahib；FlagellinasagoodcarrierandpotentadjuvantforThlresponseStudyofmiceimmuneresponsetothep27(Rv2108)Mycobacteriumtuberculosisantigen.Molecularimmunology2008,vol.45，No.9,2499-2507；CamiloCuadros,FranciscoJ.Lopez-Hernandez,AnaLuciaDominguez,MichaelMcClelland禾口JosephLustgarten.FlagellinFusionProteinsasAdjuvantsorVaccinesInduceSpecificImmuneResponses.InfectionandImmunity,2004年5月，2810-2816，Vol.72，No.5。在又一種實施方式中，本發明涉及綴合物，其中，另一種腸病原性細菌多糖(如傷寒沙門菌(SalmonellaTyphi)Vi多糖或副傷寒沙門菌(SalmonellaParatyphi)多糖)通過間隔子共價偶聯至IcsP或SigA，所述綴合物用于誘導對所述蛋白和多糖的免疫應答，并因而用于針對志賀氏菌病和傷寒(或副傷寒)病的疫苗接種。本發明還提供在動物中產生抗志賀氏菌IcsP2和SigA2的抗體的方法以及用于檢測已知或疑似患有志賀氏菌病的患者中的志賀氏菌的診斷方法中的重組多肽。在免疫接種的小鼠和豚鼠血清中存在的所述抗體還可以在其它動物物種中產生，如馬、山羊、兔、猴、牛、驢、倉鼠。分子生物學和抗體技術(如涉及雜交瘤應用的技術)已使研究人員和臨床工作者能夠獲得可用于普通診斷和臨床程序的高度特異且有效的單克隆抗體資源。可以通過將用IcsP2或SigA2免疫接種的動物的免疫細胞與合適的骨髓瘤細胞進行標準融合，來獲得所述單克隆抗體。更具體地，可以利用本發明的核酸、蛋白或肽分子來開發與志賀氏菌IcsP2或SigA2結合的單克隆抗體或多克隆抗體。為制備本發明的志賀氏菌IcsP2結合抗體或SigA2結合抗體，可以使用通過培養的連續細胞系產生抗體分子的任何技術。例如，可以使用Kohler和Milstein(256Nature495-497(1975))原創的雜交瘤技術。另見美國專禾丨J第4,376,110號；Ausubel等人,Antibodies:aLaboratoryManual,(Harlow&Lane編著，ColdSpringHarborLab.1988)；CurrentProtocolsinImmunology,(Colligan^A編著，GreenePub.Assoc.&WileyInterseienceN.Y.，1992—1996)。如美國專利第6，537，809號所記載的，制備高親和力(affinity)和/或高親合力(avidity)人抗體的另一種有利途徑涉及天然人淋巴細胞的體外抗原致敏(priming)、所得體外抗原致敏的淋巴細胞向免疫受損供體(例如SCID小鼠)的轉移、利用抗原增強免疫受損供體、從所述供體分離分泌人抗體的B細胞(分泌IgG)以及EBV轉化所分離的分泌人抗體的細胞。本發明的抗體包括含有部分人抗體和部分小鼠抗體的嵌合抗體，其中，來自人抗體的恒定區被克隆至來自小鼠的輕鏈和重鏈可變區。在一些情況下，保留70%的人序列。人源化抗體是嵌合抗體，其中，大概90%的人抗體框架被保留，并僅與鼠的互補決定區合并。本發明還涉及完全人源化抗體。可以使用已知技術提供重組的鼠抗體或嵌合鼠-人抗體或人-人抗體，所述抗體與志賀氏菌IcsP2或SigA2氨基酸序列所包含的抗原表位結合。參見，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人編著，WileyInterseience,N.Y.,1987,1992,1993)；Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLab.Press1989)；EP0239400。本發明的抗志賀氏菌IcsP2和SigA2抗體和/或肽可用于免疫測定法，所述免疫測定法檢測或定量樣品中的志賀氏菌IcsP2和SigA2或抗志賀氏菌IcsP2和SigA2抗體。志賀氏菌IcsP2和SigA2的免疫測定法典型地包含在可檢測地標記的、本發明的高親和力(或高親合力)抗志賀氏菌IcsP2或SigA2抗體或多肽存在的情況下，孵育臨床或生物學樣品，所述抗志賀氏菌IcsP2或SigA2抗體或多肽能夠選擇性結合IcsP2特異性抗體或SigA2特異性抗體；檢測樣品中結合的標記的肽或抗體。本領域公知多種臨床測定程序。參見，例如80年代的免疫測定法(Voller等人編著，UniversityPark，1981)。所述樣品包括組織血液、血清和糞便樣品、或在灌腸或口服輕瀉劑溶液后采集自結腸直腸道的液體，并進行如下記載的ELISA分析。因而，可以將抗志賀氏菌IcsP2抗體或SigA2抗體或志賀氏菌IcsP2和SigA2多肽固定至硝化纖維素或別的能夠固定可溶性蛋白的固相支持物。隨后可以用適當緩沖液清洗所述固相支持物，接著用可檢測地標記的志賀氏菌IcsP2和SigA2特異性肽或抗體處理。然后，可以使用所述緩沖液第二次清洗所述固相支持物，以除去未結合的肽或抗體。隨后可以通過已知方法步驟檢測固相支持物上所結合的標記量。“固相支持物”或“載體(carrier)”指能夠結合肽、抗原或抗體的任何支持物。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚氟乙烯(PVDF)、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然纖維素和改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖及磁鐵礦。為達到本發明目的，所述載體的性質可以是一定程度上可溶或不可溶的。只要偶聯的分子能夠與志賀氏菌IcsP2和SigA2或抗志賀氏菌IcsP2或抗志賀氏菌SigA2抗體結合，所述支持物材料可以具有實際上任何可能的結構構型。因而，所述支持物構型可以是球體，如在珠中，或是圓柱體，如在試管內表面或棒的外表面。或者，所述表面可以是扁平的，諸如薄片、培養皿、試驗帶等。例如，支持物可以包括聚苯乙烯珠。本領域技術人員會知曉許多其它的用于結合抗體、肽或抗原的適當載體，或者能夠借助常規試驗來確定。公知的方法步驟能夠確定給定多種的抗志賀氏菌IcsP2和SigA2肽和/或抗體的結合活性。本領域技術人員能夠通過常規試驗確定可行和最優測定條件。對志賀氏菌IcsP2特異性肽和/或抗體或SigA2特異性肽和/或抗體的可檢測地標記可以通過與酶的連接來完成，所述酶用于酶免疫測定法(EIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。所連接的酶與暴露的底物反應，生成可以通過例如分光光度測定手段、熒光光度測定手段或可視手段檢測的化學部分。可用于可檢測地標記本發明的志賀氏菌IcsP2特異性抗體和SigA2特異性抗體的酶包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。通過放射性標記所述志賀氏菌IcsP2特異性抗體和SigA2特異性抗體，有可能利用放射免疫測定法(RIA)來檢測志賀氏菌IcsP2和SigA2。參見Work等人，LABORATORYTECHNIQUES&BIOCHEMISTRYINMOLECULARBIOLOGY(NorthHollandPublishingCo.,N.Y.(1978)。可以通過諸如使用Y計數器或閃爍計數器的手段或借助放射自顯影術來檢測放射性同位素。特別利于本發明目的的同位素是3H、125I、131I、35S、14C和1251。還有可能利用熒光化合物標記志賀氏菌IcsP2特異性抗體和SigA2特異性抗體。當熒光標記抗體被暴露于適當波長的光時，隨后可通過熒光而檢測到它的存在。最常用的熒光標記化合物是異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺。也可以使用發射熒光的金屬(如125Eu或其它鑭系元素)來可檢測地標記所述志賀氏菌IcsP2特異性抗體和SigA2特異性抗體。可以使用諸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬螯合基團來使這些金屬連接于志賀氏菌IcsP2特異性抗體和SigA2特異性抗體。還可以通過偶聯至化學發光化合物來可檢測地標記所述志賀氏菌IcsP2特異性抗體和SigA2特異性抗體。隨后通過檢測化學反應進程中產生的發光的存在來確定化學發光標記抗體的存在。有用的化學發光標記化合物的實例為魯米諾、異魯米諾、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。同樣地，可以使用生物發光化合物來標記本發明的志賀氏菌IcsP2特異性抗體、部分、片段、多肽或衍生物和SigA2特異性抗體、部分、片段、多肽或衍生物。生物發光是生物系統中發現的化學發光類型，其中，催化蛋白提高了化學發光反應的效率。通過檢測發光的存在而確定生物發光蛋白的存在。重要的用于標記目的的生物發光化合物是熒光素、熒光素酶和水母發光蛋白。可以借助閃爍計數器(例如，如果可檢測的標記是放射性Y輻射體)或借助熒光計(例如，如果所述標記是熒光材料)來實現對志賀氏菌IcsP2特異性抗體、部分、片段、多肽或衍生物和SigA2特異性抗體、部分、片段、多肽或衍生物的檢測。在酶標記的情況下，可以通過使用該酶底物的比色方法來實現檢測。還可以通過底物與類似制備的標準品的酶促反應程度的視覺對比來實現檢測。為達到本發明的目的，借助以上測定法檢測的所述志賀氏菌IcsP2和SigA2可以存在于生物樣品中。可以使用含有志賀氏菌IcsP2或SigA2的任何樣品。例如，所述樣品是生物體液，例如血液、血清、尿液、糞便、組織提取物或勻漿等。然而，本發明不限于僅使用這些樣品的測定法，因為本領域技術人員有可能確定允許使用其它樣品的適當條件。本發明的抗體、片段或衍生物可經改造，以用于又稱作“雙位點”或“三明治”測定法的免疫測量法。在典型的免疫測量法中，一定量的未標記抗體(或抗體片段)與在測試體液中不溶的固體支持物結合，添加一定量的可檢測地標記的可溶性抗體，以允許對固相抗體、抗原和標記抗體間形成的三元復合物進行檢測和/或定量。典型的免疫測量法包括“正向”測定法，其中，結合至固相的抗體首先與測試的樣品接觸，以通過形成二元固相抗體_志賀氏菌IcsP2或SigA2復合物而從所述樣品中提取含志賀氏菌IcsP2的蛋白或SigA2的蛋白。在適當的孵育期后，清洗固體支持物，以除去包含(如有的話)未反應的志賀氏菌IcsP2或SigA2的體液樣品殘余，隨后與含有已知量的標記抗體(作為“報告分子”發揮功能)的溶液接觸。在第二孵育期后，第二次清洗固體支持物，以除去未反應的標記抗體，所述第二孵育期允許標記抗體與借助未標記抗體結合至固體支持物的志賀氏菌IcsP2或SigA2復合。此類正向三明治測定法可用于確定志賀氏菌IcsP2和/或SigA2是否存在，或能夠通過比較標記抗體的量度與含有已知量的志賀氏菌IcsP2和SigA2的標準樣品獲得的量度來使其定量化。Wide記載了所述“雙位點”或“三明治”測定法，RadioimmuneAssayMethods，199-206(Kirkham編著，Livingstone,Edinburgh,1970)。志賀氏菌IcsP2和SigA2還可用的其它類型的“三明治”測定法是所謂的“同時”和“反向”測定法。同時測定法涉及單一孵育步驟，其中，結合至固相支持物的抗體和標記抗體被同時添加至測試樣品中。完成孵育后，清洗固相支持物，以除去體液樣品殘余和未復合的標記抗體。隨后，如常規三明治測定法那樣，確定與固相支持物結合的標記抗體的存在。在“反向”測定法中，采用逐步添加，首先將標記抗體溶液添加至體液樣品中，接著在適當的孵育期后，添加與固相支持物結合的未標記抗體。在第二次孵育后，以常規方式清洗固相，以清除測試樣品殘余和未反應的標記抗體溶液。隨后，如“同時”和“正向”測定法那樣，測定與固相支持物結合的標記抗體。在一種實施方式中，可以使用特異性針對分離抗原表位的本發明的抗體組合，來構建靈敏的三位點免疫放射計量測定法。存在大量與本發明相符的本領域技術內的工具和技術，諸如常用于分子免疫學、細胞免疫學、藥理學和微生物學的那些工具和技術。所述工具和技術詳細記載于例如Sambrook等人(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.第三片反ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor，NewYork；Ausubel等人編著(2005)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSons，Inc.:Hoboken，NJ;Bonifacino等人編著(2005)CurrentProtocolsinCellBiology.JohnWileyandSons，Inc.:Hoboken，NJ;Coligan等人編著(2005)CurrentProtocolsinImmunology,JohnWileyandSons，Inc.:Hoboken，NJ;Coico等人編著(2005)CurrentProtocolsinMicrobiology,JohnWileyandSons,Inc.=HobokeruNJ;Coligan等人編著(2005)CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWileyandSons,Inc.:Hoboken,NJ；以及Enna等人編著(2005)CurrentProtocolsinPharmacology,JohnWileyandSons,Inc.:Hoboken,NJ。本說明書中的縮寫詞對應如下量度單位、技術、性質或化合物“min”表示分鐘，“h”表示小時，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“rnM”表示毫摩爾每升，“M”表示摩爾每升，"mmole"表示毫摩爾，“kb”表示千堿基，“bp”表示堿基對，“IU”表示國際單位。“聚合酶鏈式反應”縮寫成PCR；“反轉錄酶聚合酶鏈式反應”縮寫成RT-PCR；“非翻譯區”縮寫成UTR；“十二烷基硫酸鈉”縮寫成SDS；“高壓液相色譜法”縮寫成HPLC。本文所使用的DNA的“擴增”表示利用聚合酶鏈式反應(PCR)提高DNA序列混合物內特定DNA序列的濃度。關于PCR的說明，參見Saiki等人，Science1988,239:487。“多核苷酸”或“核苷酸序列”是核酸(如DNA和RNA)中的一系列核苷酸堿基(又稱“核苷酸”)，表示任何兩個以上核苷酸的鏈。核苷酸序列通常攜帶遺傳信息，包括細胞機器用以合成蛋白和酶的信息。這些術語包括雙鏈或單鏈的基因組和cDNA、RNA、任何合成的和遺傳操控的多核苷酸、以及正義和反義多核苷酸兩者(雖然本文僅示出正義鏈)。這包括單鏈和雙鏈分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜合體，以及將堿基綴合至氨基酸骨架而形成的“蛋白核酸”(PNA)。這還包括含有修飾堿基(例如硫代尿嘧啶、硫代鳥嘌呤和氟代尿嘧啶)的核酸。本文的核酸可以側翼連接天然調節(表達控制)序列，或可以與異源序列結合，所述異源序列包括啟動子、內部核糖體進入位點(IRES)和其它核糖體結合位點序列、增強子、反應元件、抑制子、信號序列、多聚腺苷酸化序列、內含子、5’非編碼區和3’非編碼區等。還可以通過本領域已知的許多手段來修飾所述核酸。所述修飾的非限制性實例包括甲基化、“加帽”、用類似物替換一個或多個天然存在的核苷酸和核苷酸間修飾，諸如例如具有不帶電的鍵的那些修飾(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰化物、氨基甲酸酯等)和具有帶電的鍵的那些修飾(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可以含有一個或多個另外的共價連接的部分，諸如例如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)、嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)、螯合劑(例如金屬、放射性金屬、鐵、氧化性金屬等)和烷化劑。可以通過形成甲基磷酸三酯或乙基磷酸三酯或烷基磷酰化物鍵而衍生所述多核苷酸。此外，還可以用能夠直接或間接提供可檢測信號的標記來修飾本文的多核苷酸。示例性標記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等。術語“核酸雜交”指兩個單鏈核酸間的反向平行的氫鍵鍵合，其中，A與T(或者，如果是RNA核酸，則為U)配對，C與G配對。在確定的嚴謹條件下，當一個核酸分子的至少一條鏈能與另一個核酸分子的互補堿基形成氫鍵時，核酸分子相互之間是“可雜交的”。雜交的嚴謹性是通過例如以下條件確定的(i)進行雜交和/或清洗的溫度，和(ii)離子強度和(iii)雜交變性劑(如甲酰胺)和清洗溶液的濃度，以及其它參數。雜交要求兩條鏈含有基本互補的序列。然而，取決于雜交的嚴謹性，可以容忍某種程度的錯配。在“低嚴謹性”條件下，可以容忍更大百分比的錯配(即不會阻止反向平行雜合體的形成)。參見MolecularBiologyoftheCell，Alberts等人，第三版，紐約和倫敦GarlandPubl.，1994，Ch.7。典型地，高嚴謹性下兩條鏈的雜交要求序列在其長度的延伸部分具有高度互補性。高嚴謹性條件的實例包括65°C下，在0.5MNaHPO4,7%SDSUmMEDTA中與濾膜結合的DNA雜交，隨后在68°C下，在0.1XSSC/0.1%SDS(其中，1XSSC是0.15MNaCl.O.15M檸檬酸鈉)中清洗，或者對于寡核苷酸分子，在約37°C(對于14個核苷酸長的寡聚物)，在約480C(對于約17個核苷酸長的寡聚物)，在約55°C(對于20個核苷酸長的寡聚物)，及在約60°C(對于23個核苷酸長的寡聚物)，在6XSSC/0.5%焦磷酸鈉中清洗。因而，術語“高嚴謹性雜交”是指溶劑和溫度的組合，其中，只有當兩條鏈的核苷酸序列幾乎完全互補時，兩條鏈才會配對形成“雜交”螺旋(參見MolecularBiologyoftheCell，Alberts等人，第三版，紐約和倫敦GarlandPubl.，1994，Ch.7)。對于兩個序列間發生的雜交，中等或中度嚴謹性條件(如，例如65°C下的2XSSC水溶液；或者，例如，在65°C下，在0.5MNaHPO4,7%SDSUmMEDTA中與濾膜結合的DNA雜交，并在42°C下，在0.2XSSC/0.SDS中清洗)和低嚴謹性條件(如，例如55°C下的2XSSC水溶液)需要相應較低的整體互補性。任何給定的嚴謹性雜交反應的具體溫度和鹽條件取決于靶DNA濃度以及探針的長度及堿基組成，并且通常是在預實驗中憑經驗確定的，而這些都是常規的(參見Southern，J.Mol.Biol.1975；98503；Sambrook等人’MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，vol.2,ch.9.50,CSHLaboratoryPress,1989；Ausubel^AiMM,1989,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.I,GreenPublishingAssociates,Inc.禾口JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,參見p.2.10.3)。本文所使用的術語“標準雜交條件”指允許具有至少75%序列一致性的序列雜交的雜交條件。根據具體的實施方式，較高嚴謹性的雜交條件可以僅允許具有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或至少99%序列一致性的序列的雜、-父。與本發明任何所期望的核酸“雜交”的核酸分子可以具有任何長度。在一種實施方式中，所述核酸分子的長度為至少10個、至少15個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個和至少70個核苷酸。在另一種實施方式中，雜交的核酸分子具有與特定的所期望的核酸大致相同的長度。本文所使用的術語“分離的”表示將參比材料從通常發現它的環境中移出。因而，分離的生物材料可以不含細胞組分(即發現或產生該材料的細胞的組分)。分離的核酸分子包括，例如，PCR產物、分離的mRNA、cDNA或限制性片段。分離的核酸分子還包括，例如，插入質粒、粘粒、人工染色體等中的序列。優選地，將分離的核酸分子從可能發現它的基因組中切斷，更優選地，所述分離的核酸分子不再與非調節序列、非編碼序列、或在基因組內發現該核酸分子時位于其上游或下游的其它基因相連。分離的蛋白可以與其它蛋白或核酸或兩者結合，在細胞內該分離的蛋白與所述其它蛋白或核酸結合，或者如果該分離的蛋白是膜結合蛋白，則與細胞膜結合。“宿主細胞”包括個體細胞或細胞培養物，所述個體細胞或細胞培養物可以是或已是一個或多個載體的受體或用于引入多核苷酸分子的受體。在本發明中，宿主細胞可以是細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞。狀態(state)、病癥(disorder)或狀況(condition)的“治療(treating/treatment)”包括(1)預防或延緩哺乳動物中進展的所述狀態、病癥或狀況的臨床或亞臨床癥狀的出現，所述哺乳動物可能患有或易患所述狀態、病癥或狀況，但尚未經歷或表現出所述狀態、病癥或狀況的臨床或亞臨床癥狀；或(2)抑制所述狀態、病癥或狀況，即停止、減少或減緩所述疾病的進展或其復發(在維持治療的情況下)或其至少一種臨床或亞臨床癥狀；或(3)緩解所述疾病，即引起所述狀態、病癥或狀況或者至少其中一種臨床或亞臨床癥狀的消退。對治療受試者的益處在統計學上是顯著的，或至少是患者或醫師可察覺的。“免疫應答”指在宿主中發生對目的組合物或疫苗的細胞和/或抗體介導的免疫應答。所述應答通常由產生抗體的受試者、B細胞、輔助T細胞和/或細胞毒T細胞構成，所述B細胞、輔助T細胞和/或細胞毒T細胞特異性針對目的組合物或疫苗中所含的一種或多種抗原。所述免疫應答還可以包括調節T細胞，所述調節T細胞的活性超越目的生物體，并可以抑制其它免疫應答或過敏反應。“治療有效量”表示當為對狀態、病癥或狀況進行治療而向哺乳動物給予化合物、佐劑或疫苗組合物時，足以實現所述治療的化合物、佐劑或疫苗組合物的量。所述“治療有效量”會根據以下因素而變化所給予的化合物、細菌或類似物；疾病和其嚴重性；以及待治療哺乳動物的年齡、體重、身體條件和應答性。“預防有效量”指在必要的劑量下和經必要的時間，有效實現所期望的預防結果的量。典型地，由于預防劑量是在疾病前或疾病早期用于受試者，預防有效量會低于治療有效量。雖然有可能將本發明提供的組合物本身用于治療，但是優選將其以藥物制劑的形式進行給藥，例如與根據預計的給藥途徑和標準制藥實踐選擇的適當的藥物賦形劑、稀釋劑或載體的混合物的形式進行給藥。因而，一方面，本發明提供藥物組合物或制劑，所述藥物組合物或制劑包含至少一種活性組合物或其藥學上可接受的衍生物，并聯合藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或載體。就與制劑其它成分的相容性和對其接受者無害而言，所述賦形劑、稀釋劑和/或載體必須是“可接受的”。本發明的組合物能以在人或牲畜藥物使用中的任何方便的給藥方式進行制劑。因此，本發明在其范圍內包括藥物組合物，所述藥物組合物包含本發明的產物，該產物經改造用于人或牲畜藥物。在優選的實施方式中，以液體口服制劑的形式方便地給予所述藥物組合物。盡管對所述制劑的遞送沒有物理上的限制，但優選口服遞送，這是因為它簡單便利，而且口服制劑容易接納另外的混合物，如牛奶、酸奶和嬰兒配方奶粉。其它的口服劑型是本領域所公知的，包括片劑、囊片、膠丸(gelcap)、膠囊劑和醫用食品。例如，可使用濕法、干法或流化床制粒法這些公知的壓片技術制備片劑。借助一種或多種適當的賦形劑、稀釋劑和載體，能以方便的方式利用所述口服制劑。藥學上可接受的賦形劑輔助或使應用于生物活性材料的劑型配制成為可能，藥學上可接受的賦形劑包括稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、著色劑和其它成分。所述藥物組合物中可以提供防腐劑、穩定劑、染料、甚至調味劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、抗壞血酸和對羥基苯甲酸酯。還可以使用抗氧化劑和懸浮劑。如果除發揮賦形劑所期望的功能外，所述賦形劑還是無毒的、攝入時容易忍受并且不干涉生物活性材料吸收的話，該賦形劑就是藥學上可接受的。用于治療性用途的可接受的賦形劑、稀釋劑和載體為制藥領域所公知，并且記載于例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.LippincottWilliams&Wilkins(A.R.Gennaro編著，2005)。可以根據預計的給藥途徑和標準制藥實踐選擇藥物賦形劑、稀釋劑和載體。本文所使用的短語“藥學上可接受的”是指一般認為是生理學上可容忍的分子實體和組合物。“患者”或“受試者”指哺乳動物，包括人和牲畜受試者。根據疾病性質、患者病史、給藥頻率、給藥方式、宿主對藥劑的清除等，佐劑制劑或含有該佐劑的疫苗組合物的劑量會有很大變化。起始劑量可以較大，隨后采用較小的維持劑量。可以每月或每年偶爾給予所述劑量，以維持有效的免疫記憶。術語“載體(carrier)”指與所述化合物一同給予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介。所述藥物載體可以是無菌液體，諸如水和油，包括石油；動物、植物或合成來源的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優選使用水或生理鹽水溶液以及水性的葡萄糖和甘油溶液作為載體，特別是用于可注射溶液的載體。或者，所述載體可以是固體劑型載體，包括但不限于粘合劑(用于壓縮藥丸)、助流劑、包封劑、調味劑和著色劑中的一種或多種。合適的藥物載體記載于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences，，。本發明還包括藥物組合物和疫苗。本發明的藥物組合物和疫苗組合物包括至少一種新型志賀氏菌抗原、一種或多種佐劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。如以上Remington—書所記載的，配制藥物組合物和疫苗的方法為本領域普通技術人員所公知。制劑。本發明的組合物可以包括藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。所述組合物包括多種緩沖液成分(例如Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)的稀釋劑、PH的稀釋劑和離子強度的稀釋劑；諸如去垢劑和增溶劑(例如吐溫80、聚山梨醇酯-80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞(Thimersol)、苯甲醇)和膨脹物質(例如乳糖、甘露醇)這些添加劑；將所述材料引入聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸等)制品或引入脂質體。還可以使用透明質酸。參見，例如Remington'sPharmaceuticalSciences,H18片反，(1990,MackPublishingCo.,Easton,PA18042)第1435-1712頁，通過引用將其并入本文。預期用于本文的是口服固體劑型，所述口服固體劑型概括地記載于Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，1990(MackPublishingCo.EastonPA18042)%89章，通過引用將其并入本文。固體劑型包括片劑、膠囊劑、丸劑、錠劑或糖錠、扁囊劑、小丸劑(pellets)、粉劑或顆粒劑。另外，還可以使用脂質體或類蛋白包囊以配制本組合物(如，例如美國專利第4，925，673號所報道的類蛋白微球)。可以使用脂質體包囊，并可以用多種多聚物使脂質體衍生化(例如，美國專利第5，013，556號)。Marshall,K.在=ModernPharmaceutics(G.S.Banker和CT.Rhodes編著)第10章，1979中給出了用于治療的可能的固體劑型的說明，通過引用將其并入本文。通常，所述制劑會包含治療劑以及惰性成分，所述惰性成分能夠抵御胃部環境，并在腸中釋放生物活性材料。預期用于本文的還有用于口服給藥的液體劑型，所述液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、溶液劑、懸浮劑和糖漿劑，所述液體劑型可以含有其它組分，包括惰性稀釋劑；佐劑、潤濕劑、乳化劑和助懸劑；以及甜味劑、調味劑、著色劑和芳香劑(perfumingagents)0對于口服制劑，釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸(jejimem)或回腸)或大腸。本領域技術人員可獲得如下制劑，所述制劑例如借助腸包衣而不會在胃中溶解，但會在十二指腸或腸的其它處釋放該材料。更常見的用作腸包衣的惰性成分的實例為偏苯三酸醋酸纖維素(celluloseacetatetrimellitate(CAT))、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(HPMCP)、HPMCP50,HPMCP55、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)、尤特奇(Eudragit)L30D、Aquateric、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、尤特奇L、尤特奇S和蟲膠。所述包衣可以用作混合膜。包衣或包衣混合物還可以用于片劑，其并非意在提供針對胃的保護。這可以包括糖包衣或使片劑較易吞咽的包衣。膠囊可以由硬殼(諸如明膠)構成以遞送干治療劑(即粉末)；對于液體形式，可以使用軟明膠殼。扁囊劑的殼材料可以是稠淀粉或其它可食性紙。對于丸劑、糖錠、模印片劑或研制片劑(tablettriturate)，可以使用濕塊化技術(moistmassingtechniques)0用于膠囊給藥的材料制劑還可以是粉末、輕壓塞或甚至片劑。所述治療劑可以通過壓縮制備。可以利用惰性材料稀釋或增加治療劑的體積。這些稀釋劑可以包括碳水化合物，尤其是甘露醇、D-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些無機鹽還可以用作填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些可商購的稀釋劑是Fast-Flo、Emdex,STA-Rx1500、Emcompress禾口Avicellο將所述治療劑配制為固體劑型時，可以包含崩解劑。用作崩解劑的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商業崩解劑Explotab、羧甲淀粉鈉、安伯來特(Amberlite)、羧甲基纖維素鈉、超支鏈淀粉(ultramylopectin)、藻酸鈉、明膠、桔皮、酸性羧甲基纖維素、天然海棉和膨潤土都可以使用。崩解劑還可以是不溶的陽離子交換樹脂。粉狀樹膠可以用作崩解劑和用作粘合劑，可以包括如瓊脂、刺梧桐樹膠或黃芪膠的粉狀樹膠。褐藻酸及其鈉鹽也可以用作崩解劑。粘合劑可以用來將所述治療劑保持在一起，從而形成硬的片劑，所述粘合劑包含來自天然產物的物質，諸如阿拉伯樹膠、黃芪膠、淀粉和明膠。其它粘合劑包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙甲基纖維素(HPMC)均可以用于醇溶液中，以粒化所述肽(或衍生物)。制劑中可以包含減摩劑以防止制劑過程中的黏結。潤滑劑可用作肽(或衍生物)和模壁間的層，這些潤滑劑可以包括但不限于硬脂酸(包括其鎂鹽和鈣鹽)、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。還可以使用可溶性潤滑劑，諸如月桂烷硫酸鈉、月桂烷硫酸鎂、多種分子量的聚乙二醇(Carbowax4000和6000)。可添加助流劑，所述助流劑可能提高制劑期間的藥物流動特性并在壓制期間幫助重排。所述助流劑可以包括淀粉、滑石、熱解硅石和水合硅鋁酸鹽。為促進治療劑溶解到水環境中，可以添加表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可以包括陰離子去垢劑，諸如月桂烷硫酸鈉、二辛基硫化琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉。可以使用陽離子去垢劑，陽離子去垢劑可以包括苯扎氯胺或芐索氯銨。制劑中可以含有潛在的非離子去垢劑作為表面活性劑，所述非離子去垢劑是聚桂醇400；聚乙二醇(40)硬脂酸酯’聚氧乙烯(10)氫化蓖麻油、聚氧乙烯(50)氫化蓖麻油、聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油；單硬脂酸甘油酯；聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65和聚山梨醇酯-80；蔗糖脂肪酸酯；甲基纖維素和羧甲基纖維素。所述表面活性劑可以單獨或作為不同比例的混合物而存在于蛋白制劑或衍生物制劑中。控釋口服制劑可用于實施本發明。可以將治療劑并入惰性基質(例如樹膠)內，所述惰性基質通過擴散或浸出機制使治療劑釋放。所述制劑中也可以加入緩慢降解基質。一些腸包衣還具有延遲釋放作用。另一種形式的控釋借助基于Oros治療系統(AlzaCorp.)的方法，即將所述治療劑包封在半透膜中，由于滲透壓作用，所述半透膜允許水進入并通過單個小開口將藥劑推出。可以將其它包衣用于制劑。這些制劑包括可以應用于包衣鍋的多種糖。還可以在膜包衣片劑中提供所述治療劑，用于這種情況的材料被分為兩組。第一組是非腸溶材料，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚維酮和聚乙二醇。第二組由腸溶材料構成，所述腸溶材料通常是鄰苯二甲酸酯。可以使用混合材料以提供最優膜包衣。膜包衣可以在包衣鍋或在流化床中進行，或通過壓縮包衣進行。在一種實施方式中，將本發明所公開的志賀氏菌多肽抗原與藥學上可接受的稀釋劑一起給藥。可以通過注射(皮下、皮內、肌內)或使用粘貼片局部施用至皮膚上來給予這樣的制劑。或者，使用藥學上可接受的媒介，通過粘膜途徑(口服途徑、含服途徑、舌下途徑、滴鼻劑、氣霧劑、直腸途徑)給予所述疫苗。還可以將所述抗原與佐劑混合以增強隨后發生的免疫應答。所述佐劑的實例非限制性地是鋁鹽、ISC0M、基于皂角苷的佐劑、水包油型和油包水型乳狀液、Toll樣受體配體(如胞壁酰二肽)、大腸桿菌LPS、由非甲基化DNA組成的寡核苷酸、多聚I:C、脂磷壁酸、肽聚糖。腸毒素和它們的佐劑活性衍生物，諸如霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素、百日咳毒素、志賀毒素和類似物。用于腸胃外給藥的本發明的制劑包括無菌的水溶液劑或非水溶液劑、懸浮劑或乳劑。非水溶劑或媒介的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油和玉米油)、明膠和可注射有機酯(如油酸乙酯)。所述劑型還可以包含佐劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過例如以下方式對所述藥物組合物滅菌細菌濾器(bacteriaretainingfilter)的過濾、在所述組合物中加入滅菌劑、對所述組合物進行輻照、或加熱所述組合物。還可以在即將使用前用無菌水或其它一些無菌的可注射介質來制備所述藥物組合物。疫苗。就疫苗而言，常觀察到的是，在無佐劑的情況下，單獨利用抗原的初次攻擊將無法引發體液或細胞免疫應答。因而，本發明的疫苗可以包含佐劑，所述佐劑包括但不限于霍亂毒素、具有佐劑性質的片段和突變體或衍生物；大腸桿菌不耐熱腸毒素、具有佐劑性質的片段和突變體或衍生物；水包油型和油包水型乳狀液；Toll樣受體配體(如胞壁酰二肽)；大腸桿菌LPS;由非甲基化DNA組成的寡核苷酸；多聚I:C;脂磷壁酸；肽聚糖。腸毒素和它們的佐劑活性衍生物，諸如霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素、百日咳毒素、志賀毒素和類似物。可以使用其它佐劑，諸如完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂角苷、礦物凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(諸如溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳狀液、鑰孔嘁血藍蛋白(keyholelimpethemocyanins)和可能的有用的人的佐劑，諸如N-乙酰基-胞壁酰基-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙胺酸_2-(1'-2'-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。佐劑可以作為緩釋抗原的組織庫，還可以作為非特異性增強免疫應答的淋巴系統活化劑(Hood等人，Immunology，第二版，1984，Benjamin/Cummings=MenloPark，California，p.384)。當疫苗計劃用于人受試者時，所述佐劑應當是藥學上可接受的。給藥。所述藥物組合物或疫苗可以用于口服(固體或液體)、腸胃外(肌內、腹膜內、靜脈內(IV)或皮下注射)、經皮(被動地或使用離子電泳或電穿孔)、經粘膜(鼻、陰道、直腸或舌下的)給藥，或吸入給藥途徑，或使用可生物蝕解的嵌入物，所述藥物組合物或疫苗可制劑成適于各種給藥途徑的劑型。在一種優選的實施方式中，通過肺遞送進行所述組合物或疫苗的給藥。所述組合物或疫苗在吸入時被遞送至哺乳動物的肺，并穿過肺上皮內層到達血流(參見，例如Adjei等人，PharmaceuticalResearch1990；7:565_569；Adjei等人’Int.J.Pharmaceutics1990；63135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人，J.CardiovascularPharmacology1989；13(sup5)143-146(內皮素_1)；Hubbard等人，(1989)AnnalsofInternalMedicine,Vol.Ill,pp.206-212(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，J.Clin.Invest.1989；84:1145-1146(α-1-蛋白酶)；0swein等人，“AerosolizationofProteins",1990；ProceedingsofSymposiumonRespiratoryDrugDeliveryIIKeystone,Colorado(重組人生長激素)；Debs等人，J.Immunol.1988；140:3482_3488(干擾素-γ和腫瘤壞死因子α)；和Platz等人的美國專利第5，284，656號(粒細胞集落刺激因子)。Wong等人的美國專利第5，451，569號記載了用于全身作用的肺部遞送藥物的方法和組合物。另見Licalsi等人的U.S.6，651，655。預期用于實施本發明的是設計用于治療性產品的肺部遞送的多種機械裝置，包括但不限于噴霧器、計量劑量吸入器和藥粉吸入器，其均為本領域技術人員所熟悉。適于實施本發明的可商購裝置的一些具體實例是Ultravent噴霧器(MallinckrodtInc.，St.Louis,MO)；AcornII(MarquestMedicalProducts,Englewood,CO)；^Rf^^計量劑量吸入器(GlaxoInc.，ResearchTrianglePark,NC)；和Spinhaler藥粉吸入器(FisonsCorp.,Bedford,MA)0所有這類裝置都需要使用適于治療劑分配的制劑。典型地，各制劑都特異針對所用裝置的類型，并且除常見的可用于治療的稀釋劑、佐劑、表面活性劑和/或載體之外，可包含適當的推進劑材料的使用。另外，脂質體、微膠囊或微球、包合物或其它類型的載體的使用也在預期中。用于計量劑量吸入器裝置的制劑通常會包含細碎粉末，所述細碎粉末含有借助表面活性劑懸浮于推進劑中的治療劑。所述推進劑可以是用于該目的的任何常規材料，諸如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。適當的表面活性劑包括三油酸山梨酯和大豆卵磷脂。還可將油酸用作表面活性劑。用于自藥粉吸入器裝置分配的制劑會包含含有治療劑的細碎干粉，并且還可以包含膨脹劑，諸如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露醇，所述膨脹劑的量促進粉末從所述裝置分散，例如為所述制劑重量的50%-90%。為最有效地遞送至遠端肺，治療劑應最有利地以微粒形式制備，所述微粒形式的粒徑小于10mm(或微米)、最優選0.5mm-5mm。治療劑的鼻或其它粘膜遞送也在預期中。鼻遞送允許在將組合物給予鼻內之后，直接進入血液，而無需該產品在肺中沉積。用于鼻遞送的制劑包括將葡聚糖或環葡聚糖和皂角苷用作佐劑的制劑。本發明的組合物或疫苗可以與一種或多種另外的活性成分、藥物組合物或疫苗聯合給藥。本發明的治療劑可以對動物給藥、優選為哺乳動物、最優選為人。MM按照本領域建立完善的方法學，隨后使用小動物模型(例如小鼠或大鼠)在臨床前研究中確定在體外測試中表現良好的本發明的化合物和組合物的有效劑量和毒性。在所述小動物模型中，已發現志賀氏菌抗原、多肽、藥物或疫苗組合物是治療有效的，并且在所述小動物模型中，能夠通過針對人臨床試驗提出的相同途徑來給予這些藥物。用于本發明的制劑或劑型無需含有本文公開的治療有效量的組分，因為所述治療有效量可以通過給予多個所述制劑或劑型來實現。對于用于本發明方法的任何藥物組合物，可以由動物模型初步估計治療有效劑量。由動物系統獲得的劑量-應答曲線隨后被用于確定人最初臨床研究的測試劑量。在各組合物的安全性測定中，給藥劑量和頻率應達到或超過預期用于臨床試驗的劑量和頻率。如本文所述，確定本發明組合物中組分的劑量，以確保連續或間歇給予的劑量不會超過考慮了試驗動物中的結果和患者個體情況后確定的量。具體劑量自然依劑量步驟、患者或受試動物的情況(如年齡、體重、性別、敏感性)、喂食、劑量期、聯用的藥物和疾病嚴重性而變化。某些條件下的適當劑量和給藥次數可以通過基于上述指標的測試來確定，但可以根據標準的臨床技術，依照醫師的判斷和各患者情況(年齡、全身情況、癥狀嚴重性、性別等)來改良并最終確定。可以通過實驗動物的標準藥學步驟、例如通過確定LD5Q(導致50%群體死亡的劑量)和ED5tl(在50%群體中治療有效的劑量)確定本發明組合物的毒性和療效。療效和毒性作用間的劑量比是治療指標，它可以表示為ED5tAD5tl的比例。優選顯示出較高治療指標的組合物。動物研究中得到的數據可用于配制人用的一系列劑量。優選地，人的治療有效劑量在一系列循環濃度范圍內，所述循環濃度范圍包括基本無毒或無毒的ED5tlt5該劑量可以依所用劑型和給藥途徑而在該范圍內變化。理想地，應每日使用單一劑量的每種藥物。下面記載了實施例1-14所用的材料和方法。材料和方法志賀氏菌SigA2和Icsp2多肽的克隆、表達和純化如上所述(37)，可獲得所述蛋白抗原的DNA序列。從基因庫登錄號[GenbankAE014073]獲得弗氏志賀氏菌2a菌株2457T的SigADNA序列。從基因庫登錄號[GenbankAL391753]獲得弗氏志賀氏菌5a菌株M90T的icsP的DNA序列。不同種的志賀氏菌間的核苷酸一致性和氨基酸序列同源性超過99%。將DNA片段插入可商購的大腸桿菌過表達質粒pET21d(Novagen，Gibbstown,NJ,USA)，并根據制造商的說明，使用TALON金屬親和樹脂(Clontech,MountainView,CA,USA)進行純化。引物當IcsP2片段來自弗氏志賀氏菌2a2457T菌株時，用IcsP2引物組CCGGAATTCGGAGTGAAAACGGGGGGAGC和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAATACTTGCACTATTTTT講行擴增。利用EcoRI和XhoI消化擴增片段(序列編號1，390bp，加下劃線的序列)(如圖12所示，方框內的序列)。用SigA2引物組CCCGGGGAATTCGGGAAAAAGCCTTCAATAAAA和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTGAAACTACTTTCGCCTG擴增弗氏志賀氏菌2a2457T菌株的SigA2片段。利用EcoRI和XhoI消化擴增片段(序列編號3，795bp，加下劃線的序列)(如圖13所示，方框內的序列)。將所擴增的IcsP2片段和SigA2片段插入pET21d的EcoRI和XhoI位點，利用測序來驗證重組DNA。用各重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen,Gibbstown,NJ,USA)細菌，在37°C下通過培養基中的0.5mMIPTG(異丙基-β_D_硫代半乳糖苷)誘導蛋白過表達。收集過表達各片段的大腸桿菌BL21(DE3)，在6M尿素存在的情況下，通過凍/融后再超聲將其破碎。以12，000Xg的速度對大腸桿菌提取物進行離心處理，并將上清液上樣至利用IX結合緩沖液20mMTrisClpH7.9,500mMNaCl，5mM咪唑和6M尿素進行過預平衡的TALON樹脂柱(3ml)。用20ml的IX結合緩沖液和30ml的IX清洗緩沖液(20mMTrisClpH7.9,500mMNaCl，15mM咪唑和6M尿素)清洗柱，再用IX洗脫緩沖液(20mMTrisClpH7.9,500mMNaCl，250mM咪唑)將蛋白洗脫。如上所述，還亞克隆了IcsP的另一個片段(引物組CCCGGGGAATTCACCACTAACTATCCACTTTT和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACTGTAACGACTCTCTTGGTA)。icsP和SigA基因破壞突變體菌株(弗氏志賀氏菌2a2457T本底)的構建使用等位基因交換法(17)單獨構建icsP和SigA基因破壞突變體菌株。簡言之，利用用于icsA片段的引物Ics5Tr/Ics3Tr(5'-GGCTCTAGAACCACTAACTATCCACTT-3‘/5'-GCCGAATTCCCAGCTCTGGTCGGTCCA-3‘)和用于sigA片段的引物Sig5Tr/Sig3Tr(5‘-GGCTCTAGAGAACTGACCCGGAAAGTTAGT-3‘/5'-GCCGAATTCGTACGCACCTCCTAATGA-3‘)，擴增icsP和sigA的內部300ntDNA片段(核苷酸61-360)。將所述片段插入自殺質粒PSW23.oriT。將重組質粒pSWicsPTr和pSEsigATr用于轉化大腸桿菌菌株BW19610(pir+AmpsCmr)。從BW19610中純化各質粒，用于轉化大腸桿菌SMlOλpir(pir+Tra+AmpsCmr)ο將大腸桿菌SMlOλpir與弗氏志賀氏菌2a2457T接合，并在剛果紅/鏈霉素/氯霉素平板上分離耐氯霉素弗氏志賀氏菌。在各敲除菌株中，將毒力質粒和基因組上的基因分為2種片段，3’末端片段和360個核苷酸的5’末端片段。通過PCR和測序驗證突變體菌株上各基因的破壞。將各菌株用于攻擊免疫接種過的小鼠。如上所述，使用如下引物組，還純化了SigA蛋白的三種其它片段=SigAl片段弓丨物組:CCCGGGGAATTCGGTATGGCGAAACAGCATTTGC和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCTTGTTTTTTACCATCCA(利用EcoRI和XhoI的824bp片段)，SigA3片段引物組CCGGGGAAGCTTGACCCCTACAGAAAATAATA和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGCCATTGGTGTCACGCA(利用HindIII和XhoI的822bp片段)，以及SigA4片段引物組CCCGGGGAATTCGGGATAAAAAACATGAGCTGG和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAAAGAGTAACGGAAGTTGG(利用EcoRI和XhoI的702bp片段)。如上所述，過表達并純化這些片段。SigAl片段顯示出免疫原性但未表現出保護作用，而SigA3和SigA4片段沒有在小鼠中引發抗體應答。所有引物均購自Genotech，大田，韓國。細菌菌株弗氏志賀氏菌2a菌株2457T和弗氏志賀氏菌5a菌株M90T由PhilippeSansonettiffInstitutPasteur,巴黎，法國提供。鮑氏志賀氏菌(IB8295)血清型1從2002年在巴基斯坦采集的志賀氏菌病患者獲得(IVI采集)。宋內志賀氏菌(IB4200)從G.B.Nair博士(NiCED,印度)于2004年在印度采集的志賀氏菌病患者獲得。痢疾志賀氏菌血清型1由D.Kopecko博士(FDA，Bethesda,MD,USA)提供。動物免疫接種在國際疫苗研究所(theInternationalVaccineInstitute)的動物看護中心(首爾)，依據國際準則，在無特定病原體的條件下飼養所有動物，國際疫苗研究所動物實驗倫理委員會批準了本文所述的全部實驗。為達到本發明目的，將免疫佐劑定義為“與特定疫苗抗原聯用時，能夠發揮促進、延長或加強抗原特異性免疫應答作用的任何物質”(TheUseofConventionalImmunologicAdjuvantsinDNAVaccinePreparations,ShinSasaki禾口KenjiOkuda；D.B.Lowrie禾口R.G.Whalen(編者)，DNAVaccines:MethodsandProtocols,HumanaPress,2000.ISBN978-0-89603-580-5)以及“用以幫助增強對疫苗的免疫應答從而只需要較少疫苗的物質”(佐劑的定義，國家癌癥研究所；www.cancer.gov/templates/db_alpha.aspx？CdrID=43987)。與抗原共給藥時，霍亂毒素、含有未甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG0DN)和鋁鹽為已知佐劑。通過多種途徑給予蛋白抗原，免疫接種5-6周齡雌性Balb/c小鼠。劑量對于各免疫接種，在等滲的、無熱原磷酸鹽緩沖液PH7.4(PBS)中，將25μg劑量的蛋白抗原與佐劑混合。所述佐劑由霍亂毒素(CT)(每劑量3-5微克(yg))、CpG0DN(每劑量4yg)或氫氧化鋁(alum)組成。腹膜內給藥通過總體積0.2ml的PBS的腹膜內注射，給予25μg的蛋白抗原，并給予或不給予佐劑。對小鼠免疫接種3次，以2周為間隔。鼻內給藥將25yg蛋白抗原與3yg霍亂毒素(CT)混合，并通過各鼻孔以50微升的總體積(每鼻孔約25微升)給藥。2周和4周后，在相同條件下對小鼠再次免疫接種。直腸給藥將100μg蛋白抗原與CT(5微克)混合，用插入肛門直腸口的移液管，以0.2毫升的終體積給藥。免疫接種豚鼠3次，各免疫接種間間隔2周。志賀氏菌病的動物模型小鼠肺炎模型將50微升PBS中的2XIO7CFU弗氏志賀氏菌2a菌株2457T接種到免疫接種的小鼠鼻孔內。每日監視動物，持續10天。另外，將弗氏志賀氏菌5a菌株M90T和痢疾志賀氏菌1菌株用于攻擊實驗。豚鼠角膜結膜炎模型在以CT作為佐劑的志賀氏菌蛋白抗原的3次連續免疫接種中的最后一次的一周后，麻醉豚鼠，并在豚鼠的眼結膜囊中滴注lX105cfu/20y1的弗氏志賀氏菌2a菌株2457T。每日監視眼周癥狀，持續4_5天。為了與全身性免疫比較，通過腹膜內途徑給予50μg的蛋白和3μg的CT三次，以兩周為間隔，并且在所述最后一次免疫接種一周后，攻擊免疫接種的豚鼠。豚鼠結腸炎模型用最近開發的腸志賀氏菌病模型(30)來評價本發明公開的新志賀氏菌常見蛋白抗原的保護性功效。簡言之，如Shim，Suzuki,Chang等人(30)所記載的，通過肛門直腸口滴注，對5周齡豚鼠給予弗氏志賀氏菌2a2457T(IXIO9CFU)或弗氏志賀氏菌5a菌株M90T。每日檢查動物的痢疾癥狀(腹瀉、里急后重(tenesmus))，隨后通過過量的戊巴比妥處死動物，此后對結腸組織樣本進行組織學分析。對志賀氏菌常見蛋白抗原的全身免疫應答和粘膜免疫應答的測量生物體液采集在第一次免疫接種一周前、此后在每次免疫接種一周后，采集血清和分泌物(唾液、陰道洗液和直腸洗液)。器官提取物的制備和細胞懸液的分離最后一次免疫接種一周后，用戊巴比妥麻醉小鼠，腹膜內注射0.2ml鹽水中的125i.u.肝素(SIGMA，MO,USA)。直接從心臟抽血，并通過斷頸法處死小鼠。將15ml含有肝素(lOi.u./ml)的PBS注射進心臟右心室對小鼠進行灌注，直至肺膨脹并變得清晰。使用膠原酶A(0.5mg/ml)(Roche)，在添加DNase1(0.lmg/ml)(Roche)的RPMI培養基(GibcoEurope,U.K.)中，將細切的肺片于37°C消化30min，并通過細胞濾網的過濾收集單細胞懸液。通過將器官擠壓通過尼龍篩，獲得來自脾的單細胞懸液。利用氯化銨的處理除去所有懸液中的紅細胞，清洗所有懸液，將其重懸于含有5%FBS的RPMI培養基中，并將其儲于冰上，直至借助如下所述ELISP0T測定法對其進行測定(30分鐘內)。為制備無細胞的器官提取物，使用PERFEXT技術(34)。從灌注動物切除肺，并將其切成小片(2_3mm厚)，并在37°C下，在含有肝素的PBS中持續攪拌地孵育30分鐘而進一步灌注。通過離心(500rpm，3分鐘)使所述小片粒化，并重懸于提取緩沖液中，所述提取緩沖液由TritonX100、PMSF和蛋白酶抑制劑組成(34)。在液氮中速凍樣品，并將其儲存在-70°C。使用前，室溫融化樣品并離心(2000rpm，5分鐘)。收集上清液，并借助如下所述的ELISA方法測定其特異性的抗體活性。抗體ELISA(酶聯免疫吸附測定法)通過標準固相酶聯免疫吸附測定法(ELISA)評估血清、分泌物和組織PERFEXT提取物中針對志賀氏菌常見蛋白抗原的抗體的水平。使用每一種蛋白包被聚苯乙烯96孔板(NUNC，丹麥)的各個孔(每mlPBS1微克；每孔0.1ml；環境溫度下過夜孵育)，利用處于含0.05%吐溫20的PBS中的5%(體積/體積)脫脂乳，將孔封閉(每孔0.2ml;環境溫度下30分鐘)，并用PBS-吐溫清洗3次。在環境溫度下，在含5%脫脂乳的PBS-吐溫溶液中，將樣品的2倍連續稀釋物在包被抗原的孔中孵育2小時，并且用PBS-吐溫將板清洗三次以移除未結合的抗體。接下來，向各孔中添加0.Iml含有適當稀釋(1/5000)的辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgA或IgG抗體(SouthernBiotechnology,Birmingham,AL,USA)的PBS-吐溫。隨后用PBS清洗板三次，并在添加生色酶底物后，監測酶結合活性。通過添加50μ1的0.5ΝH2SO4終止顯色，并用ELISA讀出器進行分光光度法(0.D450)測定。數據表示為幾何平均抗體效價，該效價被定義為產生等于或高于添加的對照(無樣品)的吸光率數值的樣品的最高稀釋度的倒數。ELISP0T測定法借助酶聯免疫斑點(ELISP0T)測定法(4)，測定產生志賀氏菌蛋白抗原的特異性抗體的細胞頻率。為進行比較，使用時確定了產生霍亂毒素(CT)的抗體的細胞頻率。簡言之，將PBS稀釋的IOyg霍亂毒素、50μgsigA2和IOOygsigA2蛋白加入硝化纖維素鋪底的96孔HA板(Millipore，Bedford,USA)的各孔中。4°C過夜孵育后，使用PBS清洗每一個孔，并用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI培養基(GIBCOjK)將其封閉。在含有FBS的RPMI培養基中，以連續2倍稀釋(起始于每孔800，000個單核細胞)孵育來自免疫接種小鼠的肺和脾細胞懸液。37°C下孵育4小時后，用PBS將各孔清洗5次，再用含有0.05%吐溫20的PBS清洗各孔5次，隨后在室溫下將其暴露于0.ImlPBS-吐溫1小時，所述PBS-吐溫含有辣根過氧化物酶綴合的小鼠IgG或小鼠IgA的山羊抗體(11000稀釋)。在用PBS-吐溫清洗3次并用PBS清洗4次后，將孔暴露于顯色底物10-20分鐘，直至出現斑點。隨后用流動的自來水清洗板并干燥。接著使用立體顯微鏡對斑點計數。數據表示為校正至1百萬個細胞的斑點形成細胞(SFC)的數量。實施例1用IcsP2粘膜免疫接種保護的小鼠免受弗氏志賀氏菌2a誘導的肺炎如上所述，通過鼻內途徑，使用連同CT一起提供的IcsP2對小鼠進行免疫接種。利用致死劑量的弗氏志賀氏菌2a菌株2457T攻擊動物。圖1的結果表明，受IcsP蛋白免疫接種保護的動物免受使用弗氏志賀氏菌2a的肺攻擊。根據圖1所示結果，活的減毒弗氏志賀氏菌疫苗菌株(SC602)的鼻內給藥也保護小鼠免受攻擊。實施例2利用IcsP2的粘膜免疫接種保護小鼠免受弗氏志賀氏菌不同血清型誘導的肺炎如上所述，通過鼻內途徑，使用連同CT一起提供的IcsP2免疫接種小鼠。利用致死劑量的弗氏志賀氏菌5a菌株Μ90Τ(50μ1中含2X107CFU)攻擊動物。圖2的結果表明，IcsP蛋白的免疫接種保護動物免受使用弗氏志賀氏菌5a的肺攻擊。相反，活的減毒弗氏志賀氏菌2a菌株(SC602)的鼻內給藥無法保護小鼠免受屬于不同(5a)血清型的志賀氏菌菌株的攻擊(如圖2實心方塊總結的結果所示)。實施例3利用IcsP2的粘膜免疫接種保護小鼠免受痢疾志賀氏菌誘導的肺炎如上所述，通過鼻內途徑，使用連同CT一起提供的IcsP2免疫接種小鼠。利用致死劑量的1型痢疾志賀氏菌(菌株由D.Kopecko博士提供，FDA，Bethesda，MD，USA)攻擊動物。圖3所示的結果證明，當已利用IcsP2免疫接種動物時，所述動物得到保護而免受另一志賀氏菌種(即1型痢疾志賀氏菌)的攻擊。相反，弗氏志賀氏菌2a的活的減毒菌株SC602無法保護小鼠免受使用1型痢疾志賀氏菌的致死肺攻擊。根據以上實驗，可以得出結論，IcsP2不僅提供針對不同血清型的弗氏志賀氏菌的粘膜感染的保護，還提供針對諸如痢疾志賀氏菌的不同種志賀氏菌所造成的感染的保護。實施例4利用SigA2的粘膜免疫接種抵抗弗氏志賀氏菌2a(2457T)的攻擊，但不抵抗弗氏志賀氏菌5a(M90T)的攻擊已知SigA蛋白僅僅存在于弗氏志賀氏菌2a，而不存在于弗氏志賀氏菌的其它血清型中(1)。使用致死劑量的弗氏志賀氏菌2a(2457T，實心圓)和弗氏志賀氏菌5a(M90T，實心方塊)攻擊利用SigA2蛋白免疫接種的小鼠。利用2457T攻擊的小鼠表現出80%的存活率，而利用弗氏志賀氏菌攻擊的小鼠死于細菌誘導的肺炎。利用PBS免疫接種的小鼠顯示兩種菌株2457T(圖4中的空心圓)和Μ90Τ(圖4中的空心方塊)引起了100%死亡。實施例5利用IcsP2的免疫接種提供抵抗實驗性角膜結膜炎的保護如上所述，使用IcsP2免疫接種的豚鼠和對照(使用PBS偽(sham)免疫接種)。在3次連續免疫中最后一次的一周后攻擊動物，所述連續免疫利用1XIO5集落形成單位的毒力弗氏志賀氏菌2a2457T，通過鼻內或腹膜內途徑給予IcsP2和CT佐劑。隨后，在攻擊24小時和48小時時，檢查豚鼠的眼部炎癥(角膜結膜炎)的跡象和強度。沒有可檢測到的炎癥的動物被認為是受保護的。由下表1可見，40%-50%的鼻內或腹膜內途徑給藥的IcsP2免疫接種的動物受保護而免于志賀氏菌誘導的角膜結膜炎，但是對照動物(用PBS處理)均表現出角膜結膜炎。表權利要求1.用于使哺乳動物針對志賀氏菌產生免疫的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含對引發針對志賀氏菌的免疫應答有效量的志賀氏菌蛋白IcsP2蛋白或SigA2蛋白以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。2.用于使哺乳動物針對志賀氏菌產生免疫的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含對引發針對志賀氏菌的免疫應答有效量的志賀氏菌蛋白IcsP2蛋白以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。3.如權利要求2所述的疫苗，其中，所述IcsP2蛋白與載體蛋白化學綴合。4.用于使哺乳動物針對志賀氏菌產生免疫的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含對引發針對志賀氏菌的免疫應答有效量的志賀氏菌蛋白SigA2蛋白以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。5.如權利要求2所述的疫苗，其中，所述IcsP2蛋白是編碼IcsP2序列和載體蛋白序列的多核苷酸的基因融合產物。6.如權利要求5所述的疫苗，其中，所述SigA2蛋白與載體蛋白化學綴合。7.如權利要求5所述的疫苗，其中，所述SigA2蛋白是載體和所述SigA2蛋白的基因形式的產物。8.如權利要求3、5、6或7所述的疫苗，其中，所述載體蛋白選自于由破傷風類毒素、白喉類毒素、霍亂毒素B亞基、大腸桿菌腸毒素B亞基和鞭毛蛋白組成的組。9.如權利要求1-8中任一項所述的疫苗組合物，所述疫苗組合物還包含佐劑。10.如權利要求5所述的疫苗組合物，所述疫苗組合物還包含佐劑，其中，所述佐劑是乳狀液的油相，所述乳狀液選自于由油包水乳狀液和雙油乳狀液組成的組。11.分離的多肽，所述多肽包含如序列編號2所示的氨基酸序列。12.分離的多肽，所述多肽包含如序列編號4所示的氨基酸序列。13.分離的核酸序列，所述核酸序列編碼權利要求11所述的多肽。14.分離的核酸序列，所述核酸序列編碼權利要求12所述的多肽。15.分離的核酸序列，所述核酸序列編碼權利要求13或14所述的多肽。16.包含權利要求13、14或15所述的核酸序列的載體。17.如權利要求16所述的載體，所述載體選自于由細菌載體、病毒載體、噬菌體、酵母載體、病毒樣顆粒和質粒DNA組成的組。18.用權利要求15或16所述的載體轉化的宿主細胞。19.產生志賀氏菌IcsP2多肽和SigA2多肽的方法，所述方法包括在適于蛋白表達的條件下，培養權利要求18所述的宿主細胞，并收集所述多肽。20.包含a)志賀氏菌IcsP2和SigA2和b)佐劑的免疫原性組合物，其中，聯用的a)和b)的量有效地引發針對志賀氏菌的免疫應答。21.治療患有或易患志賀氏菌引起的病原性感染的哺乳動物的方法，所述方法包括給予有效量的權利要求1-7中任一項所述的疫苗組合物。22.如權利要求21所述的方法，其中，所述疫苗組合物的有效量在約10微克至約2毫克的范圍內。23.調節哺乳動物免疫應答的方法，所述方法包括給予有效量的權利要求1-7中任一項所述的任一種疫苗組合物。24.如權利要求22所述的方法，其中，所述疫苗組合物的有效量在約10微克至約2毫克的范圍內。25.與權利要求6所述的志賀氏菌IcsP2多肽特異結合的抗體。26.與權利要求7所述的SigA2多肽特異結合的抗體。27.如權利要求25或沈所述的抗體，其中，所述抗體還包含標記，所述標記選自于由酶、熒光染料、凝集素、碳水化合物、生物素、親和素、放射性同位素、毒素和重金屬組成的組。28.含有多糖的綴合物分子，所述多糖由志賀氏菌細菌的0抗原構成，且所述多糖共價結合到志賀氏菌IcsP2蛋白或SigA2蛋白。29.含有糖類的綴合物分子，所述糖類由志賀氏菌細菌的0抗原構成，且所述多糖共價結合到權利要求11或12所述的多肽。30.用于使有需要的哺乳動物針對志賀氏菌病產生免疫的疫苗，所述疫苗包含權利要求觀或四所述的綴合物分子。31.含有多糖的綴合物分子，所述多糖來自與志賀氏菌屬無關的細菌，且所述多糖共價結合到志賀氏菌IcsP2蛋白或SigA2蛋白。32.含有多糖的綴合物分子，所述多糖來自與志賀氏菌屬無關的細菌，且所述多糖共價結合到權利要求11或12所述的多肽。33.含有多糖的綴合物分子，其中，所述多糖來自與志賀氏菌屬無關的細菌，并且是脂多糖。34.用于使有需要的哺乳動物針對志賀氏菌病和表達權利要求31或32所述多糖的病原體引起的疾病產生免疫的疫苗，所述疫苗包含權利要求28或四所述的綴合物分子。全文摘要本發明涉及來自志賀氏菌的蛋白抗原IcsP2和SigA2，所述蛋白抗原IcsP2和SigA2在眾多志賀氏菌類型和種中很常見，在作為疫苗給藥時，能夠防止志賀氏菌病或其它腸道感染。另外，本發明涉及在志賀氏菌種和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)中常見的抗原。本發明還涉及針對這些抗原產生的抗體的用途及DNA探針在診斷志賀氏菌和EIEC感染中的用途。文檔編號C07K14/25GK102257000SQ200980151537公開日2011年11月23日申請日期2009年10月21日優先權日2008年10月21日發明者塞西爾·切爾金斯基,金東旭申請人:國際疫苗研究所