專利名稱：用于純化治療蛋白的水性兩相萃取加強的沉淀方法
技術領域：
本發明涉及蛋白純化領域，特別是，涉及從粗多組分混合物中捕獲并純化蛋白的方法。具體地說，本發明涉及水性兩相萃取體系和蛋白沉淀方法的組合用以實現目標分子的生物分離的用途。
背景技術：
單克隆抗體(mAb)當前代表著由全世界各組織制造或研發的最流行的生物藥用產品(參見Jacobi A、Eckermann C和Ambrosius，“生物分離和生物加工(Bios印aration and Bioprocessing) ”，第二版，第2卷，2007, Wiley-VCH, 431頁)。該特定治療市場的高商業需求和由此的價值使得醫藥公司的著重點放在使其相應mAb制造工藝的生產率達到最大、同時控制相關成本。在過去的十年中，隨著哺乳動物細胞培養技術的進展，使典型mAb滴度從十分之幾克/升上升到數十克/升，上游技術研發已經朝向解決該挑戰有一些邁進(參見 Thommes J、Etzel M.，“色譜分離的供選方案(Alternatives to Chromatographic Separations) Biotechnology Progress 2007;23:42-45)。伴隨這些較高產品濃度， 生物反應器技術中的進展意味著公司現在以高達25，000L的體積操作細胞培養工藝(參見Kelley B.，“超大規模單克隆抗體純化常規單元操作的情形(Very Large Scale Monoclonal Antibody Purification :The Case for Conventional Unit Operation)，，， Biotechnology Progress 2008 ；23 =995-1008) 雖然上游操作已有進展，以滿足產品需求增加的挑戰，但是已經指出下游加工(DSP)技術的發展沒有跟上。市售或研發中的大部分mAb產品的下游純化目前基于利用涉及使用蛋白A親和色譜法而構造的加工平臺(參見 Shukla AA, Hubbard B, Tressel Τ, Guhan S, Low D.，“單克隆抗體的下游加工-平臺方法的應用(Downstream processing of monoclonal antibodies-Application of platform approaches)，，，Journal of Chromatography B 848 :28-39 及 Sommerfeld S 和Mrube J.，“生物技術生產的挑戰-單克隆抗體的通用方法和工藝優化(Challenges in biotechnology production-generic processes and process optimisation for monoclonal antibodies)，，，Chemical Engineering and Processing 2005 ；44 1123-1137)。mAb純化對蛋白A使用的強烈依賴已引起參與mAb產品純化的工藝工程師中的某些關注。蛋白A色譜法基于需要被捕獲的產物的質量來確定規模。可使用10，000L發酵罐來以lg/L的濃度培養表達mAb的細胞系，由此產生總共10kg mAb/批料。如果使用相同的發酵罐來以10g/L的濃度培養表達mAb的細胞系，細胞培養物的體積仍為10，000L，但是其中所含的mAb的質量現在將為100kg。因此，蛋白A色譜柱將需要做成用以捕獲IOkg批料的管柱的10倍大(這由于成套設備空間限制而可能是不允許的)，或者作為替代，每批料循環更多次，這將增加工藝時間。因此，色譜法實際上對生物制藥用設施的最大生產率強加了限制。就mAb治療劑的當前市場而言，已經達到這些限制的情況是罕有的(參見Kelley B. “超大規模單克隆抗體純化常規單元操作的情況(Very Large Scale Monoclonal AntibodyPurification :The Case for Conventional Unit Operation)",Biotechnology Progress 2008 ；23 :995-1008)。然而，面對增加的產品需求，一些工程師已經質疑用于mAb純化的當前范例的長期可持續性。各公司現在不斷增加研發渠道中對mAb候選物的投資。即使這些候選物中僅一部分通過臨床試驗，這也仍將導致需要多產物設施、非常快速地操作、可挑戰生產率限制的密集制造活動。另外，發現mAb產物用于除最初預期的那些應用之外的應用。 這可顯著增加對特定mAb的需要，可再次推動成套設備生產率超出其極限。鑒于此，工藝工程師已經開始研究可被稱為供選生物分離技術的技術，其具有提供更高加工容量以及可能提供比填充床色譜法更好的規模經濟的潛力(參見Przybycien, Τ. M. ；Pujar, N. S. ；Steele, L. Μ. “供選的生物分離操作壽命高于填充床色 iH ^去(Alternative bioseparation operations :life beyond packed-bed chromatography) "Current Opinion in Biotechnology 2004，15 (5)，469—478)。兩禾中這類的分離技術為水性兩相萃取(ATPE)和沉淀。它們由于比較低的相關操作成本和易于規模化而引起關注。而且因為兩者都是基于工藝流體的本體混合，這些技術將用工藝物流的體積、而不是其中所含產物的質量來確定規模，而填充床色譜法基于其中所含產物的質量來確定規模。例如，10，000L細胞培養物將需要10，000L沉淀槽，不管細胞培養物產生的mAb 的濃度是lg/L還是10g/L。沉淀工藝的缺點為可實現的純化因子比較低。這不僅是由于(down to)非特異性分離機制，還由于雜質截留在沉淀復合物內的潛力，導致在再溶解之前需要徹底洗滌沉淀物以使產物純度達到最大。工藝穩定性是另一問題，需要篩選寬范圍條件來確定每種新抗體產物的最優操作參數。同樣，也已經發現了水性兩相萃取(ATPE)具有一些缺點。已經進行了數次研究，其中針對單克隆抗體的純化來優化水性兩相萃取方法(參見Andrews ΒΑ, Nielsen S, Asenjo JA. “單克隆抗體在水性兩相體系中的分配和純化(Partitioning and purification of monoclonal antibodies in aqueous two-phase systems)”，Bioseparation 1996 ；6 303-313 禾口 Azevedo AM, Rosa PAJ, Ferreira IF, Aires-Barros MR. “人類抗體的水性兩相萃取的優化(Optimisation of aqueous two-phase extraction of human antibodies)，，， Journal of Biotechnology 2007;132:209-217)。這些研究顯示出比較有前途的結果，獲得了高抗體產率，然而，由于ATPE方法所使用的非特異性分離機制而僅得到中度的純化因子。認為與ATPE相關的關鍵工藝參數全部影響工藝物流組分的分配行為。分子是分配到頂部相還是分配到底部相中將由分子的性質(例如電荷、MW和溶解)以及聚合物的性質(例如濃度、MW、疏水性)來決定。體系的理化環境(例如溫度、PH和離子強度)也將影響分配行為。由于各種相互作用因子和在不同操作參數之間需要的用以確保最佳性能的精細平衡，ATPE體系會相對不穩定。該情形還因缺乏有關生物組分在水性兩相體系中分配的基本知識而加重。工藝優化因此需要篩選寬范圍的條件以及采用實驗方法設計。因此，對于新抗體產物，ATPE操作的深入工藝開發不僅是非常必需的努力，也是漫長的努力。這不利地與蛋白A親和色譜法比較，后者表現出高水平的穩定性且僅需要對操作條件進行微調以獲得對于新抗體產物的最佳性能。不同水性兩相體系的分配行為(就相體積比而言)可不僅受體系內相形成組分的選擇及其濃度影響，而且受進料性質影響。產物濃度對于在下游工藝初期使用的任何生物分離技術都是關鍵目標。偏斜相體積比(skewed phase volumn ratio)可不利地影響ATPE 的濃縮功能，因為抗體可分配到高體積相中。近來，已經公開了關于使用沉淀來純化蛋白治療劑的數個專利申請。它們是Coffman 等，“分離方法(Separation Methods)” (US 2007/0066806)；Farhner等，“蛋白的聚電解質沉淀和純化(Polyelectrolyte Precipitation and Purification of Proteins)” (US 2008/0193981)；Ramanan 等，“通過沉淀分離抗體的方法(Method of Isolating Antibodies by Precipitation) ” (WO 2008/100578)；和Moya 等，“蛋白的純化(Purification of Proteins) ” (WO 2008/079302)。雖然所有上述專利申請都涉及單克隆抗體(mAb)的純化，但是差別在于通過其實現該純化的特定路徑。WO 2008/079302和US 2007/0066806都涉及使工藝物流中的雜質、而不是目標抗體沉淀。隨后除去沉淀的雜質，從而純化mAb。WO 2008/100578和US 2008/0193981描述的沉淀法可用以使工藝物流中的目標抗體產物或雜質沉淀。這些申請描述的沉淀法都可用以加工含全細胞的粗發酵肉湯。如果正在沉淀的組分為工藝物流雜質，則WO 2008/100578、US 2008/0193981和WO 2008/079302中所述的方法僅可以該方式使用。US 2007/0066806描述的沉淀法僅可用以沉淀雜質。這些申請描述利用不同沉淀劑的方法。US 2008/0193981描述利用可與目標分子相互作用允許選擇性沉淀的聚電解質的沉淀方法。US 2007/0066806利用當一起處于溶液中時彼此反應以形成不溶性鹽沉淀物的可溶性鹽的組合。這些沉淀物與工藝物流中的雜質結合(在形成期間和形成之后)，允許選擇性沉淀。WO 2008/100578利用對目標分子具有親和力的可溶性聚合物。引入物理化學刺激物(例如溫度、PH、離子強度等的改變)可導致該聚合物從溶液中出來且形成沉淀物，隨其帶出目標分子。WO 2008/079302利用等電沉淀以及作為額外沉淀劑的PEG的組合。該方法也必須在相對低的溫度下進行，以進一步降低目標分子的溶解性。仍然需要更加穩定且對于含有所關注的不同治療蛋白的顯著不同的進料獲得相當的性能的分離技術。發明_既述提供純化蛋白的方法。該方法基于對含有目標蛋白的多組分混合物(即，進料) 進行的聚合物-鹽水性兩相萃取(ATPE)，最終導致產物沉淀，可將所述產物再溶解和傳送以便進一步純化。新的ATPE-沉淀法由兩個離散階段組成。第一正向萃取階段包括將相形成組分 (諸如聚乙二醇(PEG)、磷酸鹽和NaCl)引入進料中，導致形成聚合物-鹽水性兩相體系，其中目標蛋白優先分配到富聚合物相中，而一些雜質移動到富鹽相或以沉淀物形式在兩相之間的界面處收集。在第二反向萃取階段，回收來自正向萃取的富聚合物相且使其與反向萃取緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)接觸，形成第二水性兩相體系且繼而導致目標蛋白從富聚合物相移動出來并以界面沉淀物形式收集。使用過濾器或離心機回收該含產物的沉淀物， 隨后將其再溶解于適當再溶解緩沖液中，以便進一步加工。在將該方法用于從哺乳動物細胞培養上清液中初級捕獲單克隆抗體(mAb)的情況下，在不同的mAb和進料范圍內，發現由該ATPE輔助的沉淀方法得到的產率可與使用蛋白A色譜法得到的產率相當。該方法因此提供從細胞培養上清液中初級捕獲mAb的潛在供選方案。該方法通過整體沉淀方法和二階段(two-stage) ATPE方法克服了與沉淀和ATPE 方法單個相關的缺點。ATPE方法的第一正向萃取階段允許部分純化產物mAb，因為其優先分配到富聚合物相中。對從正向萃取回收的富聚合物相進行的第二反向萃取工藝允許進一步純化，因為雜質分配到頂部相或底部相，而產物mAb在兩相之間的界面處沉淀。純化機制的組合允許產物不僅比通常可用沉淀或ATPE單個得到的產物更純，而且產物可以比可從單獨的典型ATPE工藝中得到的產物濃度更高的形式得到。ATPE和沉淀的組合還產生了更加穩定、對含有不同目標蛋白的顯著不同的進料顯示出相當的性能的分離技術。附圖簡述作為示意，
圖1-12提到本文所述的本發明用于純化單克隆抗體的用途。圖1示出了用于從哺乳動物細胞培養物中捕獲mAb的以制備或制造規模的 PEG-磷酸鹽正向萃取水性兩相體系的工藝方案。圖2示出了用于從哺乳動物細胞培養物中捕獲mAb的以制備或制造規模的 PEG-磷酸鹽反向萃取水性兩相體系的工藝方案。圖3示出了以制備或制造規模的用于mAb沉淀物回收和再溶解的工藝方案。圖4示出了說明對于以制備或制造規模的該ATPE加強的沉淀方法的可能設備需求的總工藝流程圖。圖5為結合本發明的某些實施方案示出單克隆抗體純化工藝流程的示意圖。該示意圖用來說明從整體生物工藝觀點來看可采用所述方法的方式。圖6示出了施用于含有抗體A且指定為“細胞培養上清液進料A”的細胞培養進料上清液的正向萃取水性兩相體系的頂部相和底部相的蛋白A分析的色譜圖的比較。圖7示出了施用于含有抗體B且指定為“細胞培養上清液進料B”的細胞培養進料上清液的正向萃取水性兩相體系的頂部相和底部相的蛋白A分析的色譜圖的比較。圖8示出了對從細胞培養上清液進料A的正向萃取得到的頂部相進行的反向萃取水性兩相體系的頂部相和底部相的蛋白A分析的色譜圖的比較。圖9示出了對從細胞培養上清液進料B的正向萃取得到的頂部相進行的反向萃取水性兩相體系的頂部相和底部相的色譜圖(類似于圖8)的比較。圖10示出了對含有抗體B的細胞培養上清液進料B進行的正向萃取得到的頂部相和在反向萃取水性兩相體系中形成并從其中回收的再溶解的沉淀物的蛋白A分析的色譜圖的比較。圖11示出了含有抗體B的細胞培養上清液進料B、得自對細胞培養上清液進料B 進行的正向萃取水性兩相體系的頂部相和隨后在反向萃取水性兩相體系中形成的再溶解沉淀物的尺寸排阻色譜的色譜圖的比較。發明詳述定義匯總并定義發明說明書中使用的術語。 術語“目標分子”、“目標蛋白”和“蛋白產物”是指所述方法旨在使其沉淀的蛋白。蛋白包括治療蛋白和抗體。術語“多組分混合物”是指含有多于一種類型的生物或有機分子的任何水性混合物，所述生物或有機分子包括重組蛋白、天然宿主細胞蛋白、DNA、RNA、病毒和脂質。術語“多組分混合物”涵蓋的水性混合物還可含有包括哺乳動物、微生物和酵母的各種類型的未裂解的全細胞。所述術語還涵蓋含有由哺乳動物、微生物和酵母細胞的裂解和/或勻漿產生的細胞片段的水性混合物。術語“多組分混合物”具體涵蓋哺乳動物細胞培養上清液和澄清微生物發酵液。該術語還涵蓋澄清的微生物裂解物和勻漿、血液和血液流分和在本文中已經定義以由該術語具體涵蓋的所有多組分混合物的部分純化的變體。術語“抗體”是指天然存在的完整抗體的任何重組體，例如抗體包括抗原結合可變區以及輕鏈恒定域(CL)和重鏈恒定域。該術語還涵蓋抗體片段或包括抗體片段的分子，所述抗體片段包括但不限于Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv和Fc片段。術語“抗體”具體涵蓋融合蛋白，諸如Fc融合蛋白、肽抗體及其他嵌合抗體。術語“抗體”具體涵蓋單克隆抗體和多克隆抗體二者。術語“細胞培養上清液”是指已經通過例如過濾從其中除去全細胞的細胞培養基。 細胞培養上清液可以是澄清的，但不必為澄清的。就本發明目的而言，細胞培養上清液為多組分混合物的一種形式，其含有所關注的目標蛋白。術語“宿主細胞蛋白”是指除了蛋白產物以外在細胞培養過程期間由所培養的宿主細胞表達的所有蛋白。術語“上述專利”是指US 2007/0066806 (Coffman 等)、US 2008/0193981 (Farhner 等)、WO 2008/100578 (Ramanan 等)禾口 WO 2008/079302 (Moya 等)。術語“水性兩相體系”是指由兩種水基不混溶的水溶液組成的水性混合物。術語“不相容陰離子”是指在與某些聚合物一起處于溶液中時將導致溶液分離，形成兩個離散相富聚合物相和富鹽相的鹽的陰離子。術語“不相容陰離子”涵蓋的陰離子包括kosmotropic陰離子，諸如磷酸鹽(phosphate) (P043_)、檸檬酸鹽(citrate) (C3H5O(COO)33-)和硫酸鹽(sulphate) (S042—)。除非上下文另有清楚規定或另有明確陳述，否則術語“磷酸鹽”是指磷酸的鹽，例如磷酸鈉，而不是磷酸鹽離子(PO43-)。術語“富聚合物相”是指含有最高濃度的聚合物的水性兩相體系的相。術語“富鹽相”是指含有最高濃度的用以形成兩相體系的鹽的不相容陰離子的水性兩相體系的相。術語“頂部相”是指水性兩相體系的低密度相，其集中在底部相以及任何界面沉淀物之上，在使兩相體系在重力影響下沉降或如果沉降例如通過使用離心分離而加速時，可在水性兩相體系中形成所述界面沉淀物。術語“底部相”是指水性兩相體系的高密度相，其集中在頂部相以及任何界面沉淀物之下，在使兩相體系在重力影響下沉降或如果沉降例如通過使用離心分離而加速時，可在水性兩相體系中形成所述界面沉淀物。術語“界面沉淀物”是指當使水性兩相體系在重力影響下沉降或如果沉降例如通過使用離心分離而加速時在水性兩相體系中形成并集中在頂部相和底部相之間的界面處的沉淀物。
純化目標蛋白的方法本文提供的方法是整體兩步ATPE輔助的沉淀方法，其中第一步驟(所謂的正向萃取ATPE步驟)通過使雜質優先分配到兩相體系的富鹽相中以及引起一些雜質沉淀而除去所述雜質，而第二步驟(所謂的反向萃取ATPE步驟)使產物沉淀。該方法為整體的，因為正向萃取步驟之后的工藝物流的條件直接將其準備用于第二反向萃取步驟。在某些實施方案中，目標蛋白可為抗體。所述抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。 抗體也可為IgG抗體，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體。術語抗體還涵蓋抗體片段、嵌合抗體、諸如Fc融合蛋白的融合蛋白和肽抗體(ρ印tibodies)。在其他實施方案中，目標蛋白可為重組蛋白，諸如重組人類生長激素、重組人類胰島素或干擾素。目標蛋白還可為以重組形式或天然形式的酶。在其他實施方案中，目標蛋白還可為血液因子。本文所述的純化方法可施用于任何多組分混合物，其中目的在于使混合物內的蛋白產物與其他組分分離或將其純化，所述蛋白產物可包括但不限于天然宿主細胞蛋白、 DNA、RNA、病毒和脂質。在本發明的一個實施方案中，多組分混合物(即純化工藝的進料)為通過將表達并分泌所關注抗體的哺乳動物細胞在培養基中培養而產生的細胞培養上清液。 細胞培養上清液可通過過濾或離心分離細胞培養液以除去全細胞來得到。純化工藝的進料因此應該優選不含未裂解的全細胞。然而，細胞培養上清液不必是澄清的。可使用含有未裂解的全細胞的進料，條件是ATPE正向萃取體系的組成和條件使抗體產物優先分配到頂部相中，因為在這類體系中全細胞將移動到底部相中。進料還可含有大細胞片段，諸如細胞碎片，其將分配到底部相中或在正向萃取期間在界面處沉淀。細胞培養上清液的任選澄清化可通過使用例如微濾或深度過濾的任何方便可行的方法實現。本文所述的水性兩相萃取輔助的沉淀純化方法由3個離散階段組成1.正向萃取2.反向萃取3.沉淀物回收和再溶解1.正向萃取第一正向萃取階段包括形成聚合物-鹽水性兩相體系，其中條件是使得目標蛋白 (例如抗體)優選分配到富聚合物相中。兩相體系可通過向進料中加入適當量的相形成組分而形成。相形成組分應包括至少一種水溶性聚合物、具有陰離子的可溶性鹽和另一可溶性鹽，所述陰離子在溶液中與所述聚合物不相容并因此能夠與其形成水性兩相體系，所述另一可溶性鹽用以調節各組分在兩相體系中的分配。水溶性聚合物可選自下列，包括但不限于聚乙二醇(PEG)或環氧乙烷-環氧丙烷(EOPO)。不相容的鹽應含有強烈水合的陰離子，且可選自下列，包括但不限于檸檬酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。分配調節鹽應含有水合程度較低的陰離子且可選自下列，包括但不限于氯化物、碘化物或硝酸鹽。在一個實施方案中，所述聚合物為聚乙二醇(PEG)。所述PEG的分子量可為 1，450Da-6, OOODa，例如1，500Da。不相容的鹽為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉鹽的混合物且分配調節鹽為氯化鈉(NaCl)。在另一實施方案中，聚合物為具有4000Da的分子量的PEG，不相容的鹽為檸檬酸鈉且分配調節鹽為碘化鉀(KI)。在本發明的一個實施方案中，將相形成組分以粉末形式加入進料中。在另一實施方案中，將相形成組分以濃儲備溶液形式加到進料中。在另一實施方案中，一些相形成組分是以粉末形式加入，而其他相形成組分是以濃儲備溶液形式加入。例如，在PEG-磷酸鹽 ATPE體系中，其中NaCl作為分配調節鹽，PEG和磷酸鹽可以濃儲備溶液形式加到進料中，而 NaCl以粉末形式加入。相形成組分應該以如下相對量加入，以導致形成水性兩相體系，進料中的組分在其中表現出所要的分配行為。合適的體系組成可見于Albertsson等進行的透徹研究(參見 Albertsson,P.-A., 1986.細胞顆粒和大分子的分配(Partition of Cell Particles and Macromolecules)，第三版，Wiley, N. Y.)中。本領域的普通技術人員將承認需要優化相形成組分的相對濃度以不僅在正向萃取期間提供所要的分配行為，而且使得產生負責反向萃取工藝的富聚合物相，并在其中沉淀產物蛋白。在一個實施方案中，加入PEG、磷酸鹽和NaCl，以產生12% -20% (w/w)PEG, 9% -19% (w/w)磷酸鹽和4% -12% (w/w)NaCl的最終體系組成。在另一實施方案中，加入 PEG、單堿式磷酸鹽和二堿式磷酸鹽的混合物及NaCl，以產生15% (w/w)PEG、14% (w/w)磷酸鹽和12% (w/w)NaCl的最終體系組成。所加的單堿式磷酸鹽可為磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 或磷酸二氫鉀(KH2PO4)。所用的二堿式磷酸鹽可為磷酸氫二鉀(K2HPO4)或磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)。在確定加到這類體系中的磷酸鹽的量時，磷酸鹽的質量組成不僅應包括磷酸鹽離子的重量，還應包括該鹽的陽離子的重量。例如，在形成最終總質量為30g的體系中，其中磷酸鹽以粉末形式加入，應該加入4. 2g無水磷酸二氫鈉(NaH2PO4)粉末，以得到14% (w/ w)的最終磷酸鹽濃度，雖然磷酸二氫鈉(NaH2PO4)中磷酸鹽(Po/—)的質量分數意味著僅加入了對應約11. (w/w)的P043_濃度的3. 325g磷酸鹽。可使用水合鹽粉末，例如磷酸二氫鈉單水合物(NaH2PO4. H2O),但必須考慮水對質量的貢獻。在加入以濃儲備溶液形式的磷酸鹽時，情況也類似。相形成組分優選應該依次加入，在加入下一組分之前在混合本體流體下使各組分完全溶解(在以粉末形式加入時)和/或分散(在以濃儲備溶液形式加入時)。相形成組分可以任何次序加入。組分可以全部一次性加入，然而，這可能具有不合需要的結果，諸如過度沉淀和較久的鹽和聚合物的溶解和/或分散時間，這是由作為流體粘度增加的結果的不良流體混合引起。相形成組分的溶解/分散可在室溫和壓力下進行，雖然這可以在發現有益于相形成組分的溶解/分散的任何溫度下進行，例如，發現一些聚乙二醇在較低溫度下更易溶。體系pH應比目標蛋白或抗體的pi低至少1個pH單位，以確保目標蛋白帶正電荷。 這不僅保證避免過早沉淀，而且幫助目標蛋白分配到兩相體系的富聚合物相中。在使用單堿式磷酸鹽和二堿式磷酸鹽的混合物的本發明的一個實施方案中，體系 PH可通過改變加入以形成兩相體系的單堿式磷酸鹽和二堿式磷酸鹽的量之間的比率來建立。增加單堿式磷酸鹽的使用量，同時降低二堿式磷酸鹽的加入量將產生較低體系PH，而增加二堿式磷酸鹽的加入量且降低單堿式磷酸鹽的使用量將增加體系的PH。正向萃取體系的 PH可為pH 3. 0-ρΗ 9. 0，雖然優選相對中性的pH，例如pH 5. 0-7. 0，諸如pH 6. 0。在完成相形成組分的溶解和/或分散之后，正向萃取體系應該繼續混合10分鐘-1 小時、例如30分鐘，此后在室溫下培養10分鐘-24小時，例如30分鐘。在完成粉末溶解和/或儲備溶液分散之后的混合期首先使用于各相之間質量傳遞的表面積達到最大，而且
10確保在各組分在富聚合物相和富鹽相之間的分配方面達到平衡。培養期在重力下讓相分離。根據進料的復雜性、沉淀物的存在、由此兩相體系的所得粘度，可以此方式實現完全相分離。在一個實施方案中，其中本發明用以從細胞培養上清液中純化抗體產物，細胞培養上清液的復雜性將意味著該可能性是不太可能的，這歸因于由正向萃取期間進料組分沉淀而引起的體系粘度增加。作為替代，完全相分離和富聚合物相的回收可使用例如離心分離的任何方便可行的方法實現。在正向萃取期間形成的任何沉淀物將沉降(可能需要一些幫助，例如使用離心分離)在頂部相和底部相之間的界面處。該沉淀物將主要由雜質構成且含有可忽略量的目標蛋白，因而其不需要回收。在正向萃取中，鹽析作用和靜電相互作用之間的組合將導致目標蛋白優選分配到富聚合物相中。目標蛋白的分配系數(頂部相濃度/底部相濃度)(指定為K)將在5至大于100之間，例如K = 50。在本發明的一個實施方案中，正向萃取工藝可在單一攪拌容器中進行。可將多組分混合物(例如細胞培養上清液)放在攪拌容器中，向該容器中直接且依次加入相形成組分粉末形式的PEG、磷酸鹽和NaCl。該容器的內含物可被混合，直到所有相形成組分都已完全溶解。可進行進一步混合，以確保達到平衡且發生組分的完全分配。本領域的普通技術人員將承認需要優化混合工藝，以使在攪拌容器內的混合時間減至最少。混合工藝的優化將需要尤其考慮諸如攪拌器設計、容器尺寸和擋板存在的因素。接下來，正向萃取工藝的混合階段一旦完成，即可停止攪拌容器的攪拌，且讓內含物在重力影響下沉降。根據水性兩相體系的粘度和容許用于培養期的時間，可以此方式實現完全相分離。倘若如此，可排出容器內含物的底部部分以從體系中除去底部相，在容器中僅留下頂部相和在正向萃取工藝期間可能已經形成的任何沉淀物。如果底部相對應于富聚合物相，則其可使用諸如過濾和離心分離的任何方便可行的方法澄清化，以除去從正向萃取工藝帶出的任何沉淀物，之后將其傳送到反向萃取工藝。或者，頂部相可為富聚合物相， 因此為含產物相。在這種情況下，頂部相可使用例如過濾和離心分離的任何方便可行的方法回收。該實施方案例示于圖1中。如果在重力下僅有部分相分離，則從容器中可排出僅一小部分底部相。剩余部分的底部相以及在正向萃取工藝期間可能已經形成的任何沉淀物必須使用例如離心分離的任何方便可行的方法從富聚合物頂部相中除去。隨后可將回收的富聚合物的含目標蛋白的頂部相傳送到反向萃取工藝中。2.反向萃取反向萃取步驟是在正向萃取之后進行(圖2)。將來自正向萃取的富聚合物相回收并使其與反向萃取緩沖液接觸。反向萃取緩沖液可為含有具有與正向萃取體系中所用聚合物不相容陰離子的鹽的濃鹽溶液。陰離子不必與正向萃取體系中使用的陰離子相同。在一個實施方案中，反向萃取緩沖液為具有10% (w/w)磷酸鹽-40% (w/w)磷酸鹽、例如21% (w/w)磷酸鹽的濃度的磷酸鹽溶液。反向萃取緩沖液使用單堿式磷酸鹽和二堿式磷酸鹽二者的組合制備。所用的單堿式磷酸鹽可為磷酸二氫鈉(NaH2PO4)或磷酸二氫鉀(KH2PO4)。所用的二堿式磷酸鹽可為磷酸氫二鉀(K2HPO4)或磷酸氫二鈉(Na2HPO4)t5可以改變所加的單堿式磷酸鹽與二堿式磷酸鹽之比以控制反向萃取緩沖液的PH。增加單堿式磷酸鹽的使用量，同時降低二堿式磷酸鹽的加入量將產生較低體系PH，而增加二堿式磷酸鹽的加入量且降低單堿式磷酸鹽的使用量將增加體系的PH。反向萃取緩沖液應具有3. 0-9. 0的PH，雖然優選相對中性的pH，例如pH 5. 0-7. 0，諸如pH 6。在另一實施方案中，反向萃取緩沖液為具有10% (w/w)檸檬酸鹽-40% (w/w)檸檬酸鹽、例如30%檸檬酸鹽的濃度的檸檬酸鹽溶液。該檸檬酸鹽反向萃取緩沖液可使用檸檬酸鈉鹽制備。反向萃取緩沖液應與來自正向萃取的富聚合物相混合以形成新的水性兩相體系。 反向萃取緩沖液的加入體積應為來自正向萃取的富聚合物相體積的1-2倍。例如，應將 IOmL反向萃取緩沖液加到IOmL富聚合物相中，或將15mL反向萃取緩沖液加到IOmL富聚合物相中，或將20mL反向萃取緩沖液加到IOmL頂部相中。本領域的普通技術人員將承認需要優化反向萃取緩沖液的濃度以及來自正向萃取的富聚合物相與反向萃取緩沖液之間的體積比二者。反向萃取兩相體系應混合5分鐘-30分鐘，例如10分鐘。可使水性兩相體系在室溫下培養5分鐘-60分鐘，例如10分鐘。混合期使用于相之間質量傳遞的表面積達到最大，而且確保在組分在富聚合物相和富鹽相之間的分配方面達到平衡。培養期在重力下讓相分離。在該反向萃取工藝期間將發生沉淀，其將沉降(可能需要一些幫助，例如使用離心分離)在頂部相和底部相之間的界面處。該沉淀物將含有大部分目標蛋白。在反向萃取體系的頂部相和底部相中將存在可忽略量的目標蛋白。在一個實施方案中，反向萃取工藝可在單一攪拌容器中進行。在使來自正向萃取的富聚合物相澄清以除去可能已經存在的任何沉淀物之后，富聚合物相可放在攪拌槽中， 將反向萃取緩沖液直接加到攪拌槽中。隨后可將反向萃取水性兩相體系混合以確保達到平衡且發生組分的完全分配。本領域的普通技術人員將承認需要優化混合工藝，以使在攪拌容器內的混合時間減至最少。混合工藝的優化將需要尤其考慮諸如攪拌器的設計、容器尺寸和擋板存在的因素。另外，因為目標蛋白在工藝的該階段期間形成沉淀物，所以混合工藝的優化必須考慮需要保持沉淀物的完整性以及目標產物的質量。混合一旦完成，則可停止攪拌容器的攪拌，且讓內含物在重力影響下部分沉降。此時容器將含有含大部分雜質的頂部相和底部相和含大部分產物蛋白的界面沉淀物。下一階段將回收在該反向萃取工藝期間形成的沉淀物。該實施方案例示于圖2中。3.沉淀物回收和再溶解在反向萃取工藝期間形成的沉淀物可通過例如微濾或離心分離的任何方便可行的方法回收。本領域技術人員將承認需要根據所用方法優化沉淀物回收工藝。例如，使用過濾將需要優化膜表面積和膜通量，以使膜結垢的速率減至最小且使工藝生產率達到最大。 使用離心分離將需要優化以使沉淀物的脫水達到最大，同時使沉淀物壓實減至最低，這可降低再懸浮的容易度。無論如何，將需要在所要工藝性質之間進行權衡。在回收之后，沉淀物隨后還可使用合適的緩沖液洗滌，以從反向萃取兩相體系中除去任何殘余液體。該洗滌步驟是任選的，但可通過使過量體積的洗滌緩沖液與回收的沉淀物接觸且使用例如過濾、離心分離或簡單傾析的任何方便可行的方法除去洗滌緩沖液來完成。隨后可將沉淀物再懸浮于合適的緩沖液中。再懸浮緩沖液的選擇將取決于許多因素， 諸如純化的目標蛋白的特征以及在本文所述的純化方法之后使用的生物分離技術的需求。 再懸浮緩沖液的PH應為3. 0-9. 0。例如，再懸浮緩沖液可為pH 3. 4的60mM檸檬酸鈉。產物蛋白沉淀物的再懸浮應在反向萃取工藝期間在初始形成的20小時內進行。優選再懸浮工藝應在初始沉淀物形成之后的6小時或更短時間內進行。例如，沉淀物的再懸浮應在反向萃取工藝期間在形成之后的1小時內進行。在再溶解之后，可將含產物的溶液調節到合適pH和離子強度，將其過濾以保持無菌并放置儲存。例如，當將PH 3.4的60mM檸檬酸鈉緩沖液用于再懸浮時，含所得產物的溶液可使用0. IM氫氧化鈉(NaOH)滴定到更加中性的pH，諸如pH 5. 0，之后使用0. 22微米過濾器過濾以除去任何潛在的細菌或病毒污染物。該無菌過濾溶液隨后可在4°C下儲存以便隨后使用和/或進一步純化。在一個實施方案中，其中產物為抗體，將來自反向萃取工藝的沉淀物回收在微濾器的表面上。反向萃取水性兩相體系以合適流速泵送通過0. 22微米過濾器。含抗體的沉淀物捕獲在濾膜表面上，而頂部相和底部相通過進入濾液。所述膜任選可用合適緩沖液洗滌以除去任何殘留頂部相和底部相。隨后可將膜用再溶解緩沖液、例如PH 3. 4的60mM檸檬酸鈉洗滌，以使沉淀物再溶解，使抗體出現在濾液中，隨后可將其收集在儲存容器中。隨后可將該濾液傳送以便進一步加工。本領域的普通技術人員將承認需要優化沉淀物再溶解， 以使抗體產物的濃度達到最大，使抗體產率達到最大以及使緩沖液消耗減至最低。這將尤其包括優化穿過膜和跨膜表面的流體流動以及再溶解緩沖液經膜再循環的次數。收集的濾液隨后可例如保持在PH 3. 4下，以進行病毒滅活，之后使用0. IM氫氧化鈉滴定到至多pH 5. 0或6. 0。該調節的產物池隨后可經再次過濾以確保并保持無菌性，之后在4°C下儲存，以便隨后使用和/或進一步純化。該實施方案示于圖3中。圖4匯集圖1-3所示的實施方案，且示出了在制備或制造規模下該ATPE加強的沉淀工藝的整個工藝流程圖和設備需求。將需要總共3個混合容器，以進行正向萃取、反向萃取和最后的病毒滅活(如果需要)。用以進行正向萃取的第一容器也可用以進行病毒滅活， 條件是可及時進行就地清洗(CIP)和就地殺菌(SIP)程序。在這種情況下，總工藝可僅使用兩個混合容器進行。將需要離心或過濾單元以從正向萃取回收頂部相，以及隨后最后需要過濾單元以回收并再溶解沉淀物以及用于病毒去除。還可使用離心來回收含產物的沉淀物，隨后將其轉移到混合容器以便再溶解。在本發明的一個實施方案中，整個方法可替代蛋白A親和色譜法使用用于抗體的初級捕獲。隨后可將再溶解的沉淀物用于單元操作，該單元操作通常在mAb純化工藝中在蛋白A親和色譜法之后隨后見到。例如，再溶解的沉淀物可以結合和洗脫方式在填充有例如CaptoTMS的陽離子交換色譜柱上操作。隨后可將來自陽離子交換步驟的含抗體洗脫液與經收集的含抗體流以流經模式施用到填充有例如Capto Q的陰離子交換柱。在另一實施方案中，可將含抗體的再溶解的沉淀物以流經模式施用到填充有例如 Capto adhere的多模色譜柱。隨后可將流經的含抗體流與經收集的含抗體流以流經模式施用到填充有例如Capto Q的陰離子交換柱。這些實施方案在圖5中共同示出。應注意本發明的所有實施方案都可以任何規模使用。例如，本發明可用于大規模抗體生產，其中抗體從數以萬計升的細胞培養上清液中純化。在另一實施例中，本發明可以小得多的規模、例如以實驗臺規模操作使用，其中抗體從數升或更少的細胞培養上清液中純化。
實施例
以下實施例用來說明本發明的實施方案。這些實施例是用來說明本發明人已經發現適用于實踐本發明的技術。因此，詳述了這些實施例，以提供給本領域的普通技術人員可執行本發明的方法的方式的完全公開和描述。以下實施例僅用來示例且可在不偏離本發明的范圍的情況下對本文所述的條件進行改變、改進或變更。實施例1使用ATPE輔助的沉淀進行MAb的初級捕獲和純化中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養上清液通過培養來自從Polymim Scientific (Vienna, Austria)得到的細胞系的細胞由 GE Healthcare Biosciences (Uppsala, Sweden)內部產生。細胞培養上清液通過收集細胞培養物、接著離心分離并深度過濾以除去未裂解的全細胞來得到。發現細胞培養上清液含有滴度小于Ig/ L的單克隆抗體人類IgG抗體，表示為抗體A。該上清液通過使用超濾濃縮約10倍，得到 4. 5g/L的最終mAb濃度。該細胞培養上清液使用0. 22微米微濾器無菌過濾，之后儲存在 4°C下，隨后進行ATPE輔助的沉淀工藝。從Sigma-Aldrich得到粉末形式的分子量為1500-6000的聚乙二醇(PEG)以及三 (羥甲基)氨基甲烷和3-溴丙基三甲基溴化銨。磷酸二氫鈉單水合物(NaH2PO4. H2O)、磷酸氫二鉀三水合物(K2HPO4. 3H20)、檸檬酸單水合物(C6H8O7. H2O)、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)和氫氧化鈉(NaOH)也以粉末形式得到且從Merck Chemicals Ltd (Nottingham, UK)購得。氯化鈉(NaCl)從 VWR International he 得到。水性兩相萃取I. |H 向萃取30g ATPE 正向萃取體系通過將適當量的 PEG 1500、K2HPO4. 3H20、NaH2PO4. H2O 和 NaCl粉末直接加到細胞培養上清液進料中以得到15% PEG 1500、14 %磷酸鹽和12% NaCl的最終體系組成來產生。更具體地講，將4. 50g PEG 1500、2. 44g K2HPO4. 3Η20、2· 66g NaH2PO4. H2O和3. 60g NaCl加到17. 7mL細胞培養上清液中以形成ATPE正向萃取體系。體系在50mL !^alcon管(BD Biosciences)中形成，體系混合通過將i^alcon管置于搖擺平臺式震蕩器(在GE Healthcare定制)上實現。依次加入粉末，其中首先加入NaCl、 接著加入PEG 1500，最后加入K2HPO4. 3H20和Na&P04. H2O0加入單堿式磷酸鹽和二堿式磷酸鹽，以得到所要體系磷酸鹽質量百分數，而體系的PH通過改變單堿式鹽和二堿式鹽的加入質量之比來控制。在這種情況下，單堿式磷酸鹽和二堿式磷酸鹽的加入量之間的實際比率產生PH為6. 0的正向萃取體系。在粉末添加之間允許有足夠的時間，以確保在引入下一組分之前先前加入的組分完全溶解。粉末通常在約10分鐘之后完全溶解。在加入磷酸鹽之后觀察到沉淀。在加入所有粉末并使其溶解之后，將體系進一步混合60分鐘，之后讓其在重力下沉降30分鐘以進行相分離。僅實現了部分相分離，這可能歸因于水性兩相體系中的沉淀物影響底部富鹽相的沉降速度。使用Eppendorf 5810R(Eppendorf, Hamburg, Germany)離心機將體系以3000rpm離心分離30分鐘以實現完全相分離。在離心分離之后，觀察到正向萃取體系由3個離散相組成，一個相沉降在另一相之上頂部富聚合物相、界面沉淀物和底部富鹽相。隨后小心分離頂部相和底部相并測定體積。取得樣品并分析以測定各相中抗體的濃度。圖6為從該分析中得到的結果的實例。其表示施用于含有抗體A且指定為“細胞培
14養上清液進料A”的細胞培養上清液進料的正向萃取水性兩相體系的頂部相和底部相的蛋白A分析(使用Mabklect SuRe ImL Hi Trap 柱)的色譜圖的比較。還包括了該進料的蛋白A分析的色譜圖，以便比較。抗體A為單克隆抗體IgG。峰1(在總色譜圖中柱保留為約1.5-2mL)對應于樣品中存在的未結合的UV28tl吸收雜質(adsorbing impurities)。峰 2 (在總色譜圖中保留為約7. 5mL)對應于結合抗體Α。圖6中所示的色譜圖表明大量抗體 A分配到正向萃取體系的頂部相中，底部相中存在幾乎沒有到沒有抗體。基于峰積分的質量平衡顯示大于100的分配系數。質量平衡還顯示在頂部相中大于100%的產率。這表明 PEG的存在在某些方面影響抗體的UV吸收性質(PEG的空白體系顯示在UV28tlnm下無吸光)。 由于這個原因，難以準確測定在正向萃取期間形成的界面沉淀物的MAb含量。圖7示出類似于圖6中所示色譜圖的比較，只是用不同進料，這次為含抗體B的 CHO細胞培養進料上清液且指定為“細胞培養物上清液進料B”。包括該進料的蛋白A分析的色譜圖，以便比較。抗體B也為單克隆IgG。正如圖6中所示的結果，圖7示出大量抗體 B分配到正向萃取體系的頂部相中，底部相中幾乎沒有到沒有抗體。基于峰積分的質量平衡顯示約70的分配系數。此外，質量平衡顯示頂部相中大于100%的產率，顯然歸因于PEG 的存在影響抗體的UV吸收性質。II.反向萃取反向萃取通過從正向萃取體系中取得頂部相并加入反向萃取緩沖液以產生新的兩相體系來進行。所利用的反向萃取緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液，使用經加入以得到21% (w/w)的磷酸鹽濃度且以一定比率得到6. 0的pH的K2HPO4. 3H20和NaH2PO4. H2O制備。反向萃取體系在50mL i^lcon管中形成，其中將反向萃取緩沖液加到從正向萃取回收的頂部相中，體積比(頂部相底部相)為1 2。反向萃取體系以與正向萃取體系相同的方式使用搖擺式平臺混合約10分鐘。在混合工藝期間觀察到沉淀。隨后讓反向萃取體系在重力下沉降15分鐘，之后使用Eppendorf 5810R(Eppendorf，Hamburg, Germany) 離心機將其以3000rpm離心分離以確保完全相分離。在離心分離之后，觀察到反向萃取體系由3個離散相組成，一個相沉降在另一相之上頂部富聚合物相、界面沉淀物和底部富鹽相。取得頂部相和底部相的樣品以便分析。圖8和圖9示出從得自反向萃取體系的頂部相和底部相的蛋白A親和色譜分析得到的色譜圖。圖8示出對從細胞培養上清液進料A的正向萃取得到的頂部相進行的反向萃取水性兩相體系的頂部相和底部相的蛋白A分析的色譜圖的比較。還包括得自對含有抗體A的CHO細胞培養上清液A的正向萃取的頂部相的蛋白A分析的色譜圖，以便比較。峰1(在總色譜圖中柱保留為約1.5-2mL)對應于樣品中存在的未結合的UV28tl吸收雜質。峰2(在總色譜圖中保留為約7.5mL)對應于結合抗體A。抗體 A在頂部相和底部相中的低濃度表明大部分抗體收集在發現是在反向萃取期間形成的界面沉淀物中。基于頂部相和底部相中和來自正向萃取的頂部相中存在的抗體濃度，計算表明沉淀物中抗體產率為85-90%。使用峰積分的質量平衡也表明該沉淀物含有低雜質含量。圖9示出對從細胞培養上清液進料B的正向萃取得到的頂部相進行的反向萃取水性兩相體系的頂部相和底部相的色譜圖(類似于圖8)的比較。還包括得自對含有抗體B 的CHO細胞培養上清液B的正向萃取的頂部相的蛋白A分析的色譜圖，以便比較。計算表明沉淀物中抗體產率為85-90%。使用峰積分的質量平衡也表明該沉淀物含有低雜質含量。沉淀物回收和再溶解
反向萃取體系的頂部相和底部相使用移液器(VWR International he.)小心移出，在i^lcon管中僅留下沉淀物。將pH 3. 4的60mM檸檬酸鈉緩沖液置于具有沉淀物的 !^alcon管中且使用RX3旋轉混合器(VELP Scientifica, Italy)混合。在以此方式混合時， 沉淀物幾乎即時再溶解。沉淀物再溶解在室溫下進行。該再溶解程序是在反向萃取工藝期間在初始沉淀物形成的1小時內進行。在再溶解之后，將含抗體的樣品在室溫下培養60分鐘以便進行病毒滅活。隨后使用0. IM NaOH緩慢滴定樣品至PH 5.0。隨后使用蛋白A色譜法分析樣品的抗體含量。圖 10示出從該分析得到的結果的實例。具體地講，其示出對含有抗體B的細胞培養上清液進料B進行的正向萃取得到的頂部相的蛋白A分析的色譜圖和在反向萃取水性兩相體系中形成并從其中回收的再溶解的沉淀物的蛋白A分析的色譜圖的比較。還包括含抗體B的CHO 細胞培養進料上清液且指定為“細胞培養上清液進料B”的色譜圖，以便比較。峰1 (在總色譜圖中柱保留為約1.5-2mL)對應于樣品中存在的未結合的UV28tl吸收雜質。峰2(在總色譜圖中保留為約7. 5mL)對應于結合抗體B。圖10示出MAb純度隨著其在正向萃取期間移動到頂部相且隨后在反向萃取期間移動到沉淀物而增加。MAb在再溶解的沉淀物樣品中的低濃度歸因于在該特定實驗中使用過量的再溶解緩沖液。峰的相對高度表明該ATPE加強的沉淀方法提供顯著純化水平。在整個ATPE加強的沉淀工藝中的產物質量和聚集物含量的分析使用尺寸排阻色譜進行。例如，圖11示出含有抗體B的細胞培養上清液進料B、得自對細胞培養上清液進料 B進行的正向萃取水性兩相體系的頂部相和隨后在反向萃取水性兩相體系中形成并從其中回收的再溶解沉淀物的尺寸排阻色譜分析(使用Superdex 20010/30柱)的色譜圖的比較。發現初始進料具有約16%的聚集物含量。最終再溶解的沉淀物中聚集物含量經計算為約20%。這可與使用蛋白A作為初級捕獲步驟通常得到的含量相當。尺寸排阻分析進一步表明使用該當前工藝實現的顯著純化水平。本文提到的所有專利、專利公開和其他發表的文獻在此通過引用全文結合到本文中，引用的程度就如同已單個地及具體地將各文獻通過引用結合到本文中一般。雖然描述了本發明的優選的說明性實施方案，但是本領域技術人員應理解本發明可不同于所述實施方案來實踐，提供這些實施方案是出于舉例說明的目的而不是為了限制。本發明僅受隨后的權利要求書限制。引用的參考文獻專利和專利申請Coffman 等，“分離方法(S 印 aration Methods)” (US 2007/0066806)Farhner等，“蛋白的聚電解質沉淀和純化(Polyelectrolyte Precipitation and Purification of Proteins)” (US 2008/0193981)Ramanan 等，“通過沉淀分離抗體的方法(Method of Isolating Antibodies by Precipitation)” (WO 2008/100578)Moya 等，“蛋白的純化(Purification of Proteins) " (WO 2008/079302)其他出版物1. Albertsson，P.-人.，1986.細胞顆粒和大分子的分配(Partition of Cell Particles and Macromolecules),第三版，Wiley, N. Y。
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權利要求
1.從多組分混合物中回收并純化蛋白的方法，所述方法包括a.向所述多組分混合物中加入包括聚合物、含不相容陰離子的鹽和分配調節鹽的相形成組分；b.混合并完全溶解上述相形成組分以形成正向萃取水性兩相體系；c.回收富聚合物相；d.使所述富聚合物相與反向萃取緩沖液接觸以形成包括含所述蛋白的界面沉淀物的反向萃取水性兩相體系；e.從所述兩相體系中回收所述界面沉淀物；和f.任選地使所述沉淀物再懸浮在再懸浮緩沖液中。
2.權利要求1的方法，其中所述聚合物選自聚乙二醇(PEG)和環氧乙烷-環氧丙烷 (EOPO)，所述不相容陰離子選自強烈水合的陰離子，包括磷酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽，且所述分配調節鹽選自不太強水合的陰離子，包括NaCl和碘化鉀(KI)。
3.權利要求2的方法，其中所用聚合物為聚乙二醇(PEG)，所述不相容陰離子為磷酸鹽且所述分配調節鹽為NaCl。
4.權利要求3的方法，其中在所述兩相體系中PEG的濃度為12%-20% (w/w)，磷酸鹽的濃度為9^-19% (w/w)且在所述正向萃取水性兩相體系中NaCl的濃度為4^-12% (w/W) O
5.權利要求4的方法，其中在所述正向萃取體系中PEG的濃度為15%(w/w)，磷酸鹽的濃度為14% (w/w)且NaCl的濃度為12% (w/w) 0
6.權利要求3的方法，其中加入進料中的PEG的分子量為1，450Da-6,OOODa，諸如分子量為 1，500Da。
7.權利要求3的方法，其中所述磷酸鹽以單堿式磷酸鹽和二堿式磷酸鹽的混合物的形式加入。
8.權利要求7的方法，其中所述單堿式磷酸鹽選自磷酸二氫鈉和磷酸二氫鉀，且所述二堿式磷酸鹽選自磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀。
9.權利要求1的方法，步驟(a)，其中將所述相形成組分以粉末形式加入所述進料中。
10.權利要求1的方法，其中所述正向萃取水性兩相體系的pH為3.0-9. 0，諸如體系pH 為 6. 0。
11.權利要求1的方法，其中在完成相形成組分的溶解之后，將所述正向萃取體系培養 10分鐘-24小時，諸如30分鐘。
12.權利要求1的方法，其中包括病毒的一些雜質收集在在正向萃取或分配到所述正向萃取體系的富鹽相中期間形成的沉淀物中。
13.權利要求1的方法，其中步驟(c)的富聚合物相通過以下方式回收a.重力沉降所述兩相體系，讓其完全相分離；接著b.排出有或沒有任何界面沉淀物的底部相或抽吸頂部相。
14.權利要求1的方法，其中步驟(c)的富聚合物相通過以下方式回收a.離心分離所述兩相體系；接著b.除去底部相和任何界面沉淀物或抽吸頂部相。
15.權利要求1的方法，其中所述反向萃取緩沖液為濃鹽溶液。
16.權利要求15的方法，其中構成所述反向萃取緩沖液的鹽的陰離子選自檸檬酸鹽、 磷酸鹽和硫酸鹽。
17.權利要求16的方法，其中所述反向萃取緩沖液為濃度為10%(w/w)-40% (w/w)的磷酸鹽溶液。
18.權利要求17的方法，其中所述反向萃取緩沖液的pH為3.0-9. 0，諸如pH為6. 0。
19.權利要求1的方法，其中與來自所述正向萃取的富聚合物相接觸的反向萃取緩沖液的體積為來自所述正向萃取的富聚合物相體積的1-2倍。
20.權利要求1的方法，其中在混合之后，將所述反向萃取水性兩相體系培養5分鐘-15分鐘，諸如10分鐘。
21.權利要求1的方法，其中在所述反向萃取期間形成的沉淀物通過以下方式回收并再懸浮a.過濾反向萃取體系；b.在膜表面上捕獲沉淀物；和c.用再懸浮緩沖液沖洗膜以使抗體沉淀物再懸浮并收集濾液。
22.權利要求21的方法，其中所述再懸浮緩沖液跨越并穿過所述膜再循環以實現沉淀物再溶解。
23.權利要求1的方法，其中在反向萃取期間形成的沉淀物通過以下方式回收并再溶解a.離心分離反向萃取水性兩相體系；b.除去液體頂部相和底部相；和c.使沉淀物再懸浮在再懸浮緩沖液中。
24.權利要求1的方法，其中所述再懸浮緩沖液的pH為3.0-9. 0。
25.權利要求23的方法，其中所述再懸浮緩沖液含有在pH3.4下的60!111檸檬酸鈉。
26.權利要求1的方法，其中所述方法在室溫和大氣壓力下進行。
27.權利要求1的方法，其中所述沉淀物的回收和再懸浮在反向萃取工藝期間形成的 20小時內、諸如6小時內或1小時內進行。
28.權利要求1的方法，其中所述蛋白為單克隆抗體。
29.權利要求1的方法，其中所述多組分混合物為不澄清的細胞培養物或細胞培養物上清液。
全文摘要
本發明涉及水性兩相萃取(ATPE)加強的沉淀方法，其可用來從粗多組分混合物中回收以及部分純化包括單克隆抗體的治療蛋白。所述方法包括形成正向萃取PEG-磷酸鹽ATPE體系，其中目標產物優先分配到富聚合物相中。第二ATPE反向萃取體系隨后通過將來自所述正向萃取的富聚合物相引入富新磷酸鹽相中而形成，這引起產物在兩相之間的界面處沉淀。隨后將該沉淀物回收并再溶解在合適的緩沖液中且可將其傳送以便進一步純化。
文檔編號C07K1/30GK102224160SQ200980147780
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月18日 優先權日2008年11月25日
發明者K·拉基, N·J·蒂特臣納-胡克, R·特蘭 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司