專利名稱：缺乏功能性ii組莢膜基因簇的大腸埃希氏菌bl21菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及大腸埃希氏菌(fecAericAia coli, E. coli)基因組的操作，改進的非致病性五coli B菌株及其用于生產肽和蛋白質的用途。
背景技術：
細菌已經被用于生產很多商業產品。遺傳工程化的細菌，如五C^i，作為宿主細胞，在實驗室和產業中用于生產生物試劑如肽和核酸的用途在現有技術中是公知的。自然環境中的細菌暴露于很多在標準工業化或實驗室生長正常情況下不會經歷的條件，因此它們的基因組攜帶了大量條件依賴性、壓力誘導的基因，或換言之，非必須的基因，這些基因在這些有機體的工業化或實驗室用途中可能不需要，或者可能甚至是不想要的。細菌病原含有致病因子，例如細胞表面的莢膜多糖，介導細菌及其鄰近環境的相互作用，并且具有一些與其致病性直接相關的功能。五coli中已經發現了超過80個血清學和化學性質上不同類型的多糖莢膜，并且稱為K抗原。這些多糖莢膜分為4組，其中 II組莢膜多糖與流感嗜血桿菌GyaewoMiAz1S influenzae)和腦膜炎奈瑟氏菌(Afei^eria ffiwi/^iiii/M)的莢膜多糖類似。II組莢膜基因簇含有大部分與侵入性疾病相關的莢膜類型，并具有含有三個功能區域的保守的遺傳組織。在Π組基因簇中，區域1和3為保守區域，編碼將多糖從其合成的位點轉運到細胞表面必需的肽，而區域2為血清型特異性，編碼負責生物合成和單個單糖聚合的酶類，包含特定的多糖。區域1含有6個基因kpsFEDUCS, 組織在單個轉錄單元中。區域2為血清型特異性，在II組抗原不同。區域3含有2個基因如j和如S7，組織在單個轉錄單元中[Andreishcheva等人Gene (2006) 384: 113-119]。E. cWi菌株K-12和B為非包膜的細菌，為肽生產通常使用的菌株。五coli K-12基因組已經完全測序，不含任何莢膜基因。已經發現，高產量表達重組肽優選的菌株五 coli B BL21(DE3)，含有一簇編碼II組莢膜多糖的基因，并且認為五coli B的祖先一定已經通過橫向轉移獲得了這些莢膜基因。在含有基因功能形式的菌株中，位于五⑶Iil 膜的K抗原經常與致病性表型相關。已經證明在五coli B BL21中，II組莢膜基因簇的區域2通過插入元件(ISl)失活，阻止抗原產生，而支持野生型莢膜抗原轉運和呈遞的區域 1和3仍然完整[Andreishcheva等人Gene (2006) 384: 113-119]。但是，仍然存在重建功能性II組莢膜基因簇的理論可能性，例如，如果區域2的ISl丟失則II組基因簇就可以重建。或者，如果ISl突變的區域與外源野生型區域2交換，則II組基因簇也可以重建。本發明提供了永久性敲除(KO) II組莢膜基因簇的五coli B BL21 (DE3)菌株， 使該菌株達到其他商品化的重要菌株如五coli K-12同樣的安全等級。
發明內容
本發明涉及具有不可逆失活的II組莢膜基因簇的五coli B BL21菌株。在一個實施方式中，五cWi B BL21菌株特征為具有II組莢膜基因簇的全部或部分缺失。在一個實施方式中，五cWi B BL21菌株特征為具有II組莢膜基因簇的全部缺失。在一個實施方式中，五coli B BL21菌株特征為具有II組莢膜基因簇的部分缺失。在另一個實施方式中，五C^i B BL21菌株特征為在II組莢膜基因簇中具有一個或多個點突變。在另一個實施方式中，五COli菌株特征為具有至少5%的II組莢膜基因簇通過缺失永久性失活。在另一個實施方式中，五coli菌株特征為具有至少25%的II組莢膜基因簇通過缺失永久性失活。在另一個實施方式中，五coli菌株特征為具有至少40%的II組莢膜基因簇通過缺失永久性失活。在另一個實施方式中，五coli菌株特征為具有至少55%的II組莢膜基因簇通過缺失永久性失活。在另一個實施方式中，E. coli菌株特征為具有75%到100%的II組莢膜基因簇通過缺失永久性失活。在另一個實施方式中，五coli菌株特征為具有至少85%的II組莢膜基因簇通過缺失永久性失活。在另一個實施方式中，五coli菌株特征為具有至少95%的II組莢膜基因簇通過缺失永久性失活。在一個實施方式中，30%的II組莢膜基因簇被缺失。在另一個實施方式中，50%的II組莢膜基因簇被缺失。在另一個實施方式中，70%的II組莢膜基因簇被缺失。在另一個實施方式中，80%的II組莢膜基因簇被缺失。在另一個實施方式中，90%的II組莢膜基因簇被缺失。在一個實施方式中，五cWi菌株為五cWi B BL21(DE3)，并且在另一個實施方式中五 coli 菌株為五 coli B {W ,)AdadX Aalr0本發明還涉及生產五coli B菌株的方法，其中II組莢膜基因簇采用包含下列步驟的方法被缺失
a.使用選擇標記替換II組莢膜基因簇，
b.消除選擇標記，并
c.通過PCR分析確認缺失。在一個實施方式中，選擇標記為抗生素抗性基因。在另一個實施方式中，抗生素抗性基因選自氯霉素、四環素、氨芐青霉素、卡那霉素、萬古霉素和紅霉素。在還另一個實施方式中，抗生素抗性基因是氯霉素。本發明還涉及通過在本發明的五coli菌株中引入包含編碼肽的DNA序列的表達載體生產肽的方法。
在一個實施方式中，本發明還涉及生產肽的方法，包括在適當的培養基中，在用于編碼所述肽的DNA表達的條件下，培養根據本發明的五coli B菌株。表達載體所要表達的肽可以是任何能夠在五⑶中表達的肽。這些肽代表性的實例為hGH，胰高血糖素樣肽，白細胞介素、胰島素類似物，野生型脂聯素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、支鏈淀粉和瘦蛋白及其類似物，以及酶類如唾液酸酶、轉谷氨酰胺酶(tfese)、HRV (人類鼻病毒)3C蛋白酶、 煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶及其變體。在一個實施方式中，本發明的五coli菌株含有包含編碼肽的DNA序列的表達載體。在一個實施方式中，所要生產的肽為hGH。在另一個實施方式中，所要生產的肽為FGF-21。在另一個實施方式中，所要生產的肽為支鏈淀粉。在另一個實施方式中，所要生產的肽為瘦蛋白。在另一個實施方式中，所要生產的肽為唾液酸酶。
圖1顯示具有非編碼側翼區的五coli B BL21(DE3)莢膜基因簇的遺傳組織結構 (orgnisation)。BBL21(DE3)莢膜基因簇的開放閱讀框(ORFs)(大箭頭)，轉錄方向(箭頭指向)區域1基因(灰色箭頭)；區域2 ORFs (黑色箭頭)；區域3基因(白色箭頭)；IS1元件 (白色盒子)[Andreishcheva等人Gene (2006) 384: 113-119]。小箭頭表示非編碼左臂 (LA)和右臂(RA)的位置。圖2是II組莢膜基因簇敲除方法的工作流程示意圖a)用抗生素抗性基因替換 II組莢膜基因簇和b)消除抗生素抗性基因。圖3顯示敲除候選的PCR篩選。在敲除候選(但不是其母體菌株(BL或D))中擴增出正確大小的1696bp (LA+部分cat，上圖A1-A3，下圖B1-B3)和1578bp (LA+部分cat，上圖A1-A3，下圖B1-B3)片段表示成功敲除II組基因簇。對于陰性對照，僅母體菌株具有約31Λ的條帶，而II組敲除菌株沒有。BL為BL21 (DE)菌株標準對照，D為 BL21 {mi)AdadXAalr菌株的標準對照。A1-A3為BL21 (DE3)敲除候選的不同的菌落編號， B1-B3 為 BL21 {Wi)AdadXAalr 的敲除候選。圖4為搖瓶中宿主五cWi i 菌株生長比較。所用的符號指下列菌株 , BL21(DE3) ； □，BL21 (DE3)zl (kpsM~kpsF) ； ，BL21(DE3) AdadX Aalr; Δ, BL21 (Μ ,)AdadX AalrA (kpsM-kpsF)。圖5顯示不同五coli B菌株的發酵生長曲線。所用的符號指下列菌株 ，BL21(DE3) ； □，BL21 (DE3)zl (kpsM-kpsF) ；，BL21(DE3) pNNCl-g/ 〇，
BL21 (DE3)zl (kpsM-kpsF)/^Μ^Υ-黽。圖6顯示不同誘導時間hGH表達的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE):a)A. coli B BL21 (DE3) /pNNC-lg 中的表達和 coli B BL21 (DE3)zl (kpsM-kpsF) /pNNCl-g 中的表達。在a)和b)中，泳道1-3表示不同濃度的hGH:分別為5yg、2. 5yg和1.25yg。泳道 4表示誘導前的hGH表達，泳道5-14表示1-10小時不同誘導時間每小時的hGH的表達。所有的樣品都相對同樣的上樣OD進行標準化。
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圖7顯示了誘導hGH表達前后不同五coli B菌株的生長。所用的符號指下列菌株BL21(DE3)zli/ai/i21a/r/pNNCl-lh; □ WJlXAdadXAalrA (kpsM~kpsF)/pNNCl-lh； Δ, BL21(DE3)zli/ao^zla/r/pNNCl-lh 誘導的； ，BL21眾 pNNCl-lh誘導的。圖8顯示SDS-PAGE分析的不同誘導時間的hGH表達a) Ε. coli B BL21 (M^)AdadXAalr /pNNCl-lh; b) Ε. coli B BL21 {W ,)AdadXAalrA (kpsM~kpsF) / pNNCl-lh。在a)和b)中，泳道1-3顯示不同濃度的hGH的表達，分別為5 μ g，2. 5 μ g禾口 1. 25 μ g。泳道4表示誘導前的hGH表達，泳道5-13表示1_9小時的不同誘導時間每小時的hGH的表達。所有的樣品都相對同樣的上樣OD進行標準化。圖9顯示在FDM1-2培養基中高細胞密度發酵中五coli B BL21 (M^)AdadXAalrA (kpsM-kpsF) /pNNCla. 23 的生長曲線。當細胞密度達到 70 OD600 時， 加入終濃度為0. 2mM的IPTG，誘導hGH突變體MEAE_hGH(LlOlC)的表達，并在25°C繼續培養。8小時誘導后最終細胞密度達到大約100 OD6tltl。圖10顯示高細胞密度發酵期間MEAE-hGH (LlOlC)的表達。泳道1 標記；泳道2_4 作為標準品的純化的hGH，濃度分別為5、2. 5,1. 25 yg ；泳道5_13 分別誘導0、1、2、3、4、5、 6、7和8小時后，不同時間間隔取樣的樣品。箭頭表示目標蛋白MEAE-hGH(LlOlC)。圖 11 顯示五 coli B BL21(DE3)zl 眾中表達產脲節桿菌 UriAro^cier rea/acie/^)唾液酸酶的發酵樣品的SDS-PAGE分析。泳道1 標記；泳道2 誘導前，勻漿； 泳道3 誘導后，勻漿；泳道4 最終樣品，勻漿；泳道5 誘導前，不溶組分；泳道6 誘導后， 不溶組分；泳道7 最終樣品，不溶組分；泳道8 誘導前，可溶組分；泳道9 誘導后，可溶組分；泳道10 最終樣品，可溶組分；泳道11-12 唾液酸酶標準品(150和300mg/l)。所有樣品IOX稀釋。圖12顯示來源于智人GXsa^ieas)的FGF21、支鏈淀粉和瘦蛋白在￡ coli B BL21 DE3 和五 coli B BL21 Ε3Α (kpsM-kpsF)中的表達。泳道 1 標記；泳道 3-8 :BL21 DE3 中的表達；泳道9-14 :BL21 Ε3Α (kpsM-kpsF)中的表達；泳道3和9 未誘導；泳道4和10 誘導的FGF21 ；泳道5和11 未誘導；泳道6和12 誘導的支鏈淀粉；泳道7和13 未誘導； 泳道8和14 誘導的瘦蛋白。
具體實施例方式本發明涉及具有不可逆失活的II組莢膜基因簇的五coli B BL21菌株，其提供了生產肽的永久性安全的菌株。野生型或任何其他五coli B BL21(DE3)菌株的II組莢膜基因簇的損傷或失活， 可以通過任何適當的技術包括缺失整個基因簇或其部分缺失或通過基因簇中一個或多個點突變來實現。相比在工業上通常使用的菌株例如五coli K-12，本發明的五coli菌株優點在于提供更耐久的(robust)和高產量的生產肽的方法。本發明使用的五cWi B BL21(DE3)可以是如TO2008/025744中所述的雙敲除 (2XK0)菌株。此五coli B BL21(DE3)菌株缺失了 Wr和山說兩個基因，這兩個基因均編碼D，L-丙氨酸消旋酶。不向生長培養基中加入D-丙氨酸或質粒上不存在消旋酶之一(可以提供必需的D-丙氨酸)，此雙敲除菌株就不能生長。此2XKO的D-丙氨酸營養缺陷型五 coli菌株，本說明書中稱為五coli B BL21(DE3) ΔWrAifeiZT,能夠進行非抗生素的選擇操作來保持細胞中的質粒。在本發明的一個實施方式中，野生型五coli B BL21(DE3)或五coli B BL21(DE3) t,alrt,dadX菌株的II組莢膜基因簇內一個或多個基因被缺失。Studier和 Moffat [J. Mol. Biol. (1986)遲113-130]，以及 Studier 等[Methods in Enzymology (1990) 185:60-89]描述了五 co/i 菌株 B BL21 (DE3)，可以從 Mratagene 和 Novagen 得到。在本發明的一個實施方式中，野生型五coli B BL21(DE3)菌株的II組莢膜基因簇內一個或多個基因被缺失。在本發明的另一個實施方式中，五coli B BL21(DE3) Aah Δ /Ζ菌株的II組莢膜基因簇內一個或多個基因被缺失。在另一個實施方式中，II組莢膜基因簇中缺失基因所選擇的基因或多個基因是那些負責潛在病原性的基因。整個161Λ的II組莢膜基因的缺失提供了防止致病性莢膜表型潛在的重建。圖1顯示莢膜菌株的II組莢膜基因簇中涉及的基因，包括區域1基因 kpsFEDUCS，^M2 0RF1-4和區域故/？^和如·^。這些基因的任何一個或其組合都可以被缺失。II組莢膜基因簇的完全缺失意味著3個區域的缺失，即」(kpsM-kpsF)。所獲得的五 coli B 菌株為五 coli B BL21 (DE3)」眾禾口五 coli B BL21(DE3) Kalr KdadX Δ (kpsM-kpsF) 0在一個實施方式中，本發明涉及除了插入元件(ISl)之外，任何足以使II組基因簇失活的修飾。細菌是單倍體有機體，即它們僅有一個染色體，因此僅從環境中獲得新的DNA例如通過轉化時才發生重組。并且，細菌不容易被線性DNA轉化，例如因為細胞內的外切核酸酶會降解線性DNA。但是，易重組的突變體缺少重組復合體的外切核酸酶，能夠被線性DNA 轉化。重組酶為催化天然重組反應的酶類，已經證明λ Red相比其他重組系統顯示出增強的重組率。缺失本發明菌株的II組莢膜基因簇的方法可以基于Datsenko和Warmer開發的Red-介導的重組技術K2000) PNAS 97(12) 6640-6645]或其他傳統方法。圖2顯示了如何缺失本發明菌株的161Λ的II組莢膜基因簇的示意圖。在一個實施方式中，方法的第一步是通過PCR，通過使用具有核酸同源性延伸或同源性區域的引物 RA和LA(參見圖1)，產生用選擇標記替換161Λ的II組莢膜基因簇。這通過在這些側翼同源延伸中進行Red介導的重組來實現。選擇后，本方法的第二步是通過使用表達FLP重組酶的輔助質粒消除選擇標記，所述重組酶作用于選擇標記側翼的直接重復的FRT (FLP識別目標)位點。Red和FLP輔助質粒通過在37°C生長后消除(cured)，因為它們是溫度敏感的復制子。第三步包括用PCR分析驗證缺失。細菌轉化可以稱為通過吸收DNA帶來的穩定的遺傳變化，感受態指能夠吸收外源 DNA的狀態。一些細菌在實驗室條件下天然地能夠吸收DNA，這些菌種攜帶負責使DNA通過細胞膜或多層膜的機制的基因集合，而其他細菌必須通過實驗室操作被誘導，在所述實驗室操作中使用自然界通常不發生的條件使細胞被動地變得可通透DNA。在存在二價陽離子， 例如Ca2+ (在CaCl2中)的條件下制備冷卻的(chilling)細胞，使細胞壁變得可以通透質粒DNA。細胞在冰上與DNA共同孵育，然后短暫熱激(例如42°C，30-120秒)，使DNA進入細胞，這是現有技術中公知的方法[Sambrook等人，A Laboratory Manual (1989) CSH]。電轉化是在細菌(及其他)細胞上打孔的另一個方法，其通過用kV范圍電場短暫電擊這些細胞來進行。質粒DNA可以通過這些孔進入細胞。該方法可以用于大的質粒DNA。天然的膜修復機制將在電擊后快速關閉這些孔。為了維持并在細胞內穩定保持，質粒DNA分子必須含有復制起始點，使其在細胞內獨立于染色體進行復制。當使用任何本說明書描述的基因失活方法時，II組基因簇的部分或全部的任何靶向失活都通過選擇標記檢測，從而可以鑒定并分離被修飾的五coli B BL21菌株克隆。選擇標記可以是任何適當的標記基因，例如抗生素抗性基因或營養缺陷型標記。適當的抗生素抗性基因為氯霉素、四環素、氨芐青霉素、卡那霉素、萬古霉素和紅霉素、或者內酰胺類、氨基糖苷類、糖肽類或大環內酯類抗生素的任何其他代表。本說明書使用的術語“克隆”需要制造DNA序列的多個同樣的拷貝。然后將目標 DNA序列插入克隆載體。因為此載體來源于自我復制的病毒、質粒或高等有機體細胞，當適當大小的DNA插入后，“目標和載體DNA片段隨即連接”并產生重組的DNA分子。重組的DNA 分子隨后導入細菌菌株(通常為五⑶7i)，在轉化后產生多個同樣的拷貝。轉化是細菌進行的DNA吸收機制。但是，在單個細菌細胞內僅一個具有特定復制起始點的重組DNA分子能夠確立，因此每個克隆僅含有一個DNA插入。本說明書所使用的術語“基因組”或“遺傳組成”指整個遺傳物質，包括結構性和功能性，其是可遺傳的和/或可轉移的，并且包含在鑒定的細胞或微生物中。微生物的基因組(遺傳組成)從而理解為包括染色體DNA和染色體外DNA (例如，質粒、R因子等)。本說明書所使用的術語“約”意味著在所述的數值的合理范圍內，例如加或減10%。本說明書所使用的術語“敲除”指遺傳工程化的細菌菌株，其中一個或多個基因被缺失或失活(被從機體中“敲除”)。敲除有機體通常用作研究已經被測序但功能未知的基因功能的模型。敲除技術可以用于從感興趣的有機體中移除不希望和/或潛在致病性的基因。本說明書所使用的術語“基因簇”意思是一組遺傳上或功能上偶聯的兩個或多個基因。因為來自于共同祖先的群體傾向于具有相同基因簇的變體，因此它們可以用于回溯最近的進化歷史。術語“母本菌株，，可以是任何基因組減少的菌株來源的細菌菌株。根據本發明的母本菌株的代表性例子包括但不限于五cWi菌株例如B或C，或與其基因組序列基本相同的菌株。本說明書所使用的術語在給定的細菌宿主細胞中產生的肽的“水平”或“量”可以指根據所選擇的生產方法對細胞培養基中存在或可檢測的肽的定量測量。例如，如果所選擇的肽的生產方法造成肽在細胞自身內的累積，則所產生的肽的水平或量將為在細胞自身內存在的肽的定量測量。如果肽生產方法包括肽的分泌，則所產生的肽的水平將為生長培養基中存在的肽的定量測量。本說明書所使用的術語肽的“產量”指基本上純的肽的定量的量，其中肽被回收和 /或純化，基本上不含有宿主菌株相關的天然肽。為了確定細菌宿主細胞例如五coli B BL21菌株產生的定量的“產量”或“量”，可以使用常規的肽特異性的方法，例如免疫測定、高效液相色譜(HPLC)、酶活、分光光度計技術、SDS-PAGE等。本說明書所使用的術語“表達對照序列”指引導與其可操作連接的核酸的轉錄的啟動子或轉錄因子結合位點的陣列。雙鏈核酸所使用的術語“游離末端”可以指帶有平游離末端或粘性游離末端的線性的核酸或其組合。本說明書所使用的術語“基因”指包含編碼多肽或其前體的核酸序列的核酸(例如，DNA或RNA)。多肽可以由全長編碼序列編碼或通過編碼序列的任何部分編碼，只要保留全長或片段的所期望的活性或功能性質(例如酶活、配體結合、信號轉導、抗原性等)。術語還包括位于臨近5’和3’末端上的編碼區的序列，其有助于基因轉錄成全長mRNA。術語 “基因”包含基因的cDNA和染色體形式。基因的染色體形式或克隆可以包含被所定義的非編碼序列(例如內含子)打斷的編碼區域。當用于指將核酸加入菌株時，術語“導入”或“被導入”意思是在菌株內核酸可以整合到菌株的染色體或包含在載體上，例如質粒。本說明書所使用的術語“開放閱讀框”或“0RF”指不含終止子的遺傳序列。術語“肽”、“多肽”或“蛋白”在本說明書中可以互換使用，意思是無論天然還是重組的肽、多肽和蛋白，及其片段、衍生物、同源物、變體和融合蛋白等。II組敲除菌株的生長在搖瓶中和高密度發酵罐中評價，并與其母本菌株比較。實驗顯示在每種菌株背景下，II組基因敲除不影響細胞生長。將含有多個肽的表達載體轉化到II組缺失的菌株中用于在高密度發酵罐中進行表達測試。在一個實施方式中，在本發明￡ cWi B菌株中生產的肽可以選自但不限于hGH、 胰高血糖素樣肽、白細胞介素、胰島素類似物、野生型脂聯素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、支鏈淀粉和瘦蛋白及其類似物。酶類例如唾液酸酶、轉谷氨酰胺酶(tfese)、HRV (人類鼻病毒)3C蛋白酶、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶及其變體，以及任何其他肽或其表達系統可以在 E. coli中操作的肽。本發明還涉及制備如上所述人類的肽的方法。通常，將克隆的野生型肽的核酸序列修飾成編碼所期望的蛋白。然后將該修飾的序列插入表達載體，之后轉化或轉染到宿主細胞中。可操作的表達系統一般包括Mudier和Moffat [J. Mol. Biol. (1986) 189:113-130]以及 Studier 等人[Methods in Enzymology (1990) 185:60-89]描述的常規的基因表達成分。宿主細胞中要生產的肽可以作為融合肽合成，分泌到培養基中或進入周質空間， 以游離形式產生在細胞質內，或累積在細胞內小體內，例如包涵體。肽的純化類似地包括使用上述常規的、公開可獲得的方法，其再次通過常規技術改造后用于感興趣的肽。本發明適合生產任何類型的肽。在一個實施方式中，選擇在II組敲除的五cWi B BL21宿主細胞中生產的肽為人生長激素(hGH)，以及在一個實施方式中，人生長激素(hGH)如EP217814中描述從前體肽生產，EP217814描述了如何從hGH前體制備hGH。在進一步的實施方式中，生長激素為MEAE (SEQ ID 16)-hGH(LlOlC)，其為hGH類似物的前體，其中hGH分子中第101位亮氨酸被半胱氨酸替換。在另一個實施方式中，胰高血糖素樣肽為GLP-1、GLP_1和/或其衍生物。
本說明書所使用的術語“胰高血糖素樣肽”意思是胰高血糖素家族的肽、各種胰高血糖素樣肽的抑制劑(exendin)及其類似物。胰高血糖素家族的肽由前胰高血糖素基因編碼并包含三個高度同源的小肽，即胰高血糖素(1-29)、GLP-I (1-37)和GLP-2 (1-33)。 Exendin是在蜥蜴中表達的肽，類似于GLP-I是促胰島素的。Exendin的實例為exendin-3 禾口 exendin-4。本說明書所使用的術語“胰高血糖素樣肽類似物”指修飾的胰高血糖素樣肽，其中胰高血糖素樣肽的一個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基替換，和/或其中一個或多個氨基酸殘基從胰高血糖素樣肽中缺失，和/或其中一個或多個氨基酸殘基被添加到胰高血糖素樣肽。這種氨基酸殘基的增加或缺失可以在肽的任何位置發生。實驗部分
對于菌株的甘油原種(Stock)的制備，將單克隆轉移到含有2ml具有適當抗生素的LB 培養基的12ml測試管中，在37°C下生長，并以220rpm振蕩2小時。對于發酵接種物的制備，來自于甘油原種的細胞在加入和不加入氨芐青霉素的LB 平板上劃線。過夜的細胞用LB培養基洗滌并接種到含IOOml每種發酵復合培養基具有適當的抗生素濃度的500ml搖瓶中，并在37°C下生長，并以220rpm振蕩3_4小時。然后將細胞接種到反應器中，至濃度大約0.5 OD6000在51生物反應器內在有氧條件下進行發酵，發酵復合培養基初始體積為2. 51，并含有適當的抗生素。在零時間點，向反應器內接種至0D_大約0.5。用5N NHjPH2SO4保持 PH在7. 0，并在發酵期間，以6ml/min的恒定空氣流速使空氣通過培養物。溫度保持37°C。 通過保持溶氧水平直至飽和A的20%對攪拌進行級聯控制。進行分批補料試驗來比較II組缺失菌株與其母本菌株在高密度發酵罐內的生長和肽表達情況。發酵罐加入添加27g/l甘油的復合培養基。在零時間點，向發酵罐內接種至0. 5的0D·。當基礎甘油被消耗時，在補料步驟(increasing steps)中連續加入甘油和酵母提取物，通過溶氧增加指示甘油的消耗。從發酵罐中收集用于測定OD6tltl和蛋白表達的樣品并用分光光度計和SDS-PAGE進行分析。在細菌中誘導蛋白表達是公知的現有技術。在本發明中，蛋白表達的誘導通過加入異丙基-β-D -硫代半乳糖苷(IPTG)來進行。在本發明的某些實施方式中使用的質粒和菌株分別列舉在表1和2中。使用 Sambrook等人[A Laboratory Manual (1989) CSH]描述的標準分子生物學技術進行質粒的構建。表1實施例中使用的質粒
權利要求
1.一種大腸埃希氏菌(及COli )B BL21菌株，其特征在于具有不可逆失活的II組莢膜基因簇。
2.根據權利要求1的大腸埃希氏菌BBL21菌株，其特征在于具有II組莢膜基因簇的全部或部分缺失。
3.根據權利要求1的大腸埃希氏菌BBL21菌株，其特征在于具有II組莢膜基因簇的全部缺失。
4.根據任一前述權利要求的大腸埃希氏菌BBL21菌株，其中所述大腸埃希氏菌為大腸埃希氏菌B BL21 (DE3)。
5.根據權利要求1-3任一項的大腸埃希氏菌菌株，其中所述大腸埃希氏菌為大腸埃希氏菌 B BL21
6.根據任一前述權利要求的大腸埃希氏菌BBL21菌株，其中所述菌株進一步包含具有插入的編碼肽的DNA序列的表達載體。
7.根據任一前述權利要求的大腸埃希氏菌BBL21菌株，其中所述肽選自hGH、胰高血糖素樣肽、白細胞介素、胰島素類似物、野生型脂聯素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、支鏈淀粉和瘦蛋白及其類似物以及酶類，如唾液酸酶、轉谷氨酰胺酶(tfese)、HRV (人類鼻病毒)3C 蛋白酶、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶及其變體。
8.—種生產根據任一前述權利要求的大腸埃希氏菌B菌株的方法，其中所述II組莢膜基因簇采用包含下列步驟的方法被刪除a.使用選擇標記替換II組莢膜基因簇，b.消除所述選擇標記，并c.通過PCR分析確認刪除。
9.根據權利要求8的生產大腸埃希氏菌B菌株的方法，其中所述選擇標記為抗生素抗性基因。
10.根據權利要求9的生產大腸埃希氏菌B菌株的方法，其中所述抗生素抗性基因選自氯霉素、四環素、氨芐青霉素、卡那霉素、萬古霉素和紅霉素。
11.根據權利要求9的生產大腸埃希氏菌B菌株的方法，其中所述抗生素為氯霉素。
12.—種生產肽的方法，其包括在適當的培養基中培養根據權利要求1-7任一項的大腸埃希氏菌B菌株，然后通過公知技術分離并純化表達的肽。
13.根據權利要求12的方法，其中所述肽為hGH。
14.根據權利要求12的方法，其中所述肽為FGF-21。
15.根據權利要求12的方法，其中所述肽為支鏈淀粉。
全文摘要
本發明涉及含有II組莢膜基因簇缺失的新的非致病性大腸埃希氏菌(E.coli)BBL21菌株，及其用于生產肽的用途。
文檔編號C07K14/61GK102209725SQ200980144718
公開日2011年10月5日 申請日期2009年11月10日 優先權日2008年11月10日
發明者H·F·韋爾迪克, J·蘇, J·鄧, X·趙, Y·劉 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司