小兒急性淋巴細胞白血病的治療方法

專利名稱：小兒急性淋巴細胞白血病的治療方法
技術領域：
本發明涉及治療、改善或消除小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)的方法，該方法包含向需要其的小兒ALL患者給予包含⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體構建體的藥物組合物。
背景技術：
對于現在的兒童ALL治療，無事故(event-free)存活率為約75%。所以，復發仍然頻繁。ALL復發處理中的問題是白血病細胞的抗性，和患者在已經接受第一線強化治療之后對第二輪治療的耐受性降低，導致緩解率降低、隨后復發的發病率升高和總體療效下降。強化綜合化療因而是目前誘導第二次完全緩解所必需的。根據各種預后因素，可用單獨的化療和腦照射維持緩解，或者可用干細胞移植的強化治療維持緩解(Henze G，von Stackelberg A,Relapsed acute lymphoblastic leukemia.在Childhood Leukemias，C_H Pui ed. Cambridge Cambridge University Press ；2006，p.473-486)。雖然對患有急性淋巴細胞白血病(ALL)兒童的治療已取得巨大進展(參見，例如 Moricke 等人，Blood 111 (2008)，p. 4477 ；Moghrabi 等人，Bloodl09 (2007)，p. 896)，但是復發性ALL仍然是第四種最常見的小兒惡性腫瘤(Gaynon, Cancer 82(1998)，p. 1387)。 尤其對于在診斷后三年內伴有早期骨髓復發的患者而言，用于這些患者的療法不能令人滿意，并且到目前為止同種異體干細胞移植是唯一已知的治愈方法。雖然移植后供體淋巴細胞輸注(DLI)可通過誘導移植物抗白血病(GvL)效應而誘導少數患者的緩解(Loren等人，BMT 41(2008)，p. 483)，但是造血干細胞移植(HSCT)之后的化療難治性復發與不良預后相關。第二次HSCT可能是一種選擇，已經報道了一些長期存活者。但是，在HSCT之前的疾病狀態對移植后的療效有預測作用，已知患有形態學疾病或MRD水平持續大于10_4個白血病原細胞(leukemic blasts)的患者復發風險很高，且療效很差(Bader等人，J Clin Oncol. 27 (2009)，p. 377-84)。由此可知，第二次HSCT之前的疾病狀態最重要，應盡一切努力獲得另一個緩解期。雖然可使用最近推出的難治性白血病的化療劑(Jeha，Semin Hemato 1. 46 Q009)，76-88)，但是在HSCT之后復發的患者經常患有化療難治性疾病，這些患者對化療相關的毒性非常敏感。對于這些患者，需要用非化療和低毒性策略誘導此類患者的緩解。由于常規小兒ALL療法存在上述缺陷，所以仍需要改進的治療方案。

發明內容
本發明涉及治療、改善或消除小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)的方法，該方法包含向需要其的小兒ALL患者給予包含⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體構建體的藥物組合物。這種使用T細胞結合抗體的免疫學方法首次提供了小兒ALL的非化療性和低毒性療法。最近，I期研究已證明，⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體(blinatumomab)對復發性 ⑶19-陽性B-細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)有顯著的臨床活性，因為已觀察到引人注目的腫瘤部分消退和全部消退(Bargou等人，kience32K2008) :974-7)。
在進一步、仍在進行的臨床試驗中，用所述CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療消除了非移植性MRD-陽性CD19+ALL成人患者的化療難治性白血病細胞。現已在兩個同情性使用(compassionate-use)情況下意外地發現，所述CDWxCD3 雙特異性單鏈抗體不僅適于治療非移植性成人患者的ALL，而且適于治療包括化療和同種異體造血干細胞移植(HSCT)在內的常規ALL療法難以治療的小兒(或兒童)復發性ALL。在此，本發明人報道了⑶1 ⑶3雙特異性抗體對兩名兒童(以下稱為患者1和2) 的有效的抗白血病作用，該兩名兒童是在接受來自匹配的無關(matched unrelated)及半相合(haploidentical)供體的同種異體造血干細胞移植(HSCT)之后，經受化療難治性復發的B-前體急性淋巴細胞白血病(ALL)患者。在用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療之前，患者1已經用同種異體HSCT和多種化療進行預治療。然而，這些常規小兒ALL療法未能成功，致使該患者反復發作，其結果是該患者預后極差。之后，該小兒ALL患者以連續輸注的方式接受15微克/m2/24hr的 CD19xCD3雙特異性單鏈抗體五周。在抗體治療期間，該患者中供體來源的CD8+T-淋巴細胞擴增，但沒有出現任何移植物抗宿主病(GvHD)征象。這種T-細胞擴增與患者白血病原細胞的迅速消除相關，并且在開始抗體治療后10天，在該患者骨髓中未檢測到超出1個細胞 /10000個細胞，即微小殘留病變(MRD)檢測水平的原細胞(母細胞，blasts)。該患者在整個抗體治療中一直是MRD-陰性的。在用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療結束后2周，對該患者進行來自其半相合母親(haploidentical mother)的第二次干細胞移植，并從那之后該患者一直是MRD-陰性的(2009年11月的狀態)。年齡為15歲的患者2在2001年4月被診斷患有費城染色體-陽性和⑶19-陽性B-前體ALL。在化療之后，他在2001年10月接受了來自HLA相合同胞(HLA-identical sibling)(兄弟姐妹)的HSCT。在2002年診斷出骨髓復發并用伊馬替尼(imatinib)和化療獲得另一個緩解期。然后他在2004年10月接受了來自HLA相合無關供體(HLA-identical unrelated donor)的第二次HSCT。在2008年3月，診斷出第二次復發，并用低劑量化療和達沙替尼(Dasatinib)進行治療，因為其對伊馬替尼有抗性。在用氯法拉濱(Clofarabin) 和胞嘧啶/阿拉伯糖苷(Cytosin/Arabinosid)進行另外的化療之后，他獲得分子緩解并接受來自其3/6HLA等位基因不匹配的半相合父親(HLA-allele-mismatched haploidentical father)的第三次同種異體HSCT，并在移植后用達沙替尼治療。由于胃腸道出血和擴張型心肌病，在移植后5個月中斷了達沙替尼。在2009年4月，診斷出中樞神經系統(CNS) 復發，加上CNS中有7x109/L的原細胞且骨髓中有3%的原細胞。該患者然后用尼羅替尼 (Nilotinib)、鞘內化療和以18Gy對CNS分次照射進行治療。這種治療后3個月，該患者的骨髓仍然為1. lxlO—3水平的MRD-陽性，但CNS中無原細胞。外周血嵌合狀態分析揭示供體來源的造血完全來自其半相合父親(haploidentical father)。該患者然后通過連續輸注15μ g/m2/天的單藥劑blinatumomab治療4周，而沒有產生任何副作用。治療結束時的骨髓穿刺顯示完全緩解，骨髓中不可檢測的MRD小于 1 X 10_4。如同患者1，患者2在用blinatumomab治療期間或之后也沒有表現出任何GvHD征象。他目前健康，并在上學。這個數據有力地證明，T-細胞結合的雙特異性抗體可以在不存在GvHD的情況下， 對在同種異體HSCT之后患有復發性和治療難治性B-前體ALL的小兒患者誘導有效的移植物抗白血病(GvL)效應。因此，在本文描述的小兒患者的治療中，優選⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體構建體誘導移植物抗白血病(GvL)效應。另外，該小兒患者對該治療有很好的耐受性。鑒于這點，本發明的方式和方法為小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)，特別是包括化療和 /或同種異體HSCT在內的常規小兒ALL療法難以治療的小兒ALL病例提供了驚人的改進的治療選擇。因此，在本發明的進一步實施例中，本文所采用的T-細胞結合的雙特異性單鏈構建體(抗⑶1 ⑶幻還可以供已經接受(同種異體)造血干細胞移植(HSCT)的小兒患者使用。如本文所說明的，甚至在接受來自匹配的無關(matched unrelated)或半相合供體(haploidentical donor)的HSCT之后復發的小兒患者，和/或化療難以治療的小兒患者也可以利用本文公開的方式和方法成功治療。如本文證明的示例患者通過如本文公開的藥物干預而表現出引人注目的抗白血病反應，并且在不存在任何GvHD (移植物抗宿主病)征象的情況下變成MRD陰性。雖然ALL兒童的存活率在過去幾十年里已顯著提高，但復發性 ALL仍然是治療失敗的主要原因。對于第二次復發的患者，同種異體HSCT是迄今為止唯一的治愈途徑。HSCT的主要抗白血病作用之一是誘導GvL效應。不幸地，GvL的產生通常與 GvHD相關聯，GvHD仍是HSCT之后的發病率和死亡率的主要原因。所以，在不存在GvHD的情況下誘導GvL是集中研究的課題。誘導GvL效應的一個途徑是移植后供體淋巴細胞輸注 (DLI)，其優選用于治療HSCT之后復發的ALL。雖然DLI對治療CML非常有效(Kolb，Blood 76(1990)，2462)，但它對復發性ALL移植后治療的效果較小(Loren, BMT 41(2008),483)并且經常導致GvHD的產生。本發明藥學及醫學方法和方式提供了在不存在GvHD的情況下誘導GvL的新方法。 這種方法是在HSCT之后使用低劑量T-細胞結合的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體在體內激活供體來源的淋巴細胞，該抗體指導T-淋巴細胞對抗該患者的⑶19+ALL原細胞。這種抗體在自體移植的情況下表現出引人注目的抗淋巴瘤活性和抗白血病活性，但在HSCT之后復發的小兒ALL中的活性從未被測試。以下實施例中所描述的兩名小兒患者在接受來自匹配的無關供體或半相合供體的HSCT之后ALL復發，化療難以治療。該患者在開始治療之后表現出引人注目的抗白血病反應，并在不存在任何GvHD征象的情況下變成MRD陰性。 CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的免疫作用不依賴于肽抗原呈遞，最可能的原因是盡管體內供體來源的T-細胞發生大規模擴增，但沒有誘導GvHD。低劑量CD19xCD3雙特異性單鏈抗體足以消除患者中超出MRD檢測水平的ALL原細胞。因而，這種抗體作用的T-細胞結合模式與常規抗體的區別非常大，常規抗體需要大得多的劑量并且由于缺少T-細胞上的Fc受體而無法經其抗體分子的Fc部分與T-細胞結合。經CD19xCD3雙特異性單鏈抗體，高度有效的效應物(效應子，effectoiOT細胞可以對所有ALL原細胞產生細胞毒作用，而不誘導導致GvHD的同種反應性(alloreactivity)免疫應答。在患者1變成MRD陰性之后，本發明人決定對他進行來自半相合供體的第二次同種異體HSCT。到目前(2009年11月)為止，該患者仍然是MRD陰性的。從兩個移植后化療難治性復發的ALL患者中的初步臨床經驗，得出的結論是 ⑶19x^3雙特異性單鏈抗體可以在不產生GvHD的情況下誘導引人注目的完全緩解。因此， 在移植前用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療可以免疫性減輕白血病負荷和治療移植后的復發，所以為后期ALL小兒患者提供了新的治療機會。本發明方法提供了下列主要優勢
1.如以下實施例所證明的，給予CD19xCD3雙特異性單鏈抗體可以用于治療復發性和/或難治性小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)。CD19xCD3雙特異性單鏈抗體不但可以代替常規小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)療法(如化療)治療不符合同種異體干細胞移植條件的小兒患者。而且它還可以用來使符合所述移植條件的小兒ALL患者轉變成MRD陰性狀態。本發明的這個方面是重要的，因為MRD-陰性患者移植之后復發的風險比MRD-陽性患者低。在最好的情況下，用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的小兒ALL療法使得化療和/或HSCT 多余。2.已知患有形態學疾病或MRD水平持續大于10_4個白血病原細胞的患者復發風險很高，且療效很差(Bader 等人，J Clin Oncol. 27(2009)，p. 377-84)。用 CD19xCD3 雙特異性單鏈抗體治療的兒童在開始治療后表現出引人注目的抗白血病反應并在治療期間變為MRD陰性，而不存在任何GvHD征象。本發明的藥學方法和方式因此提供了治療、改善或消除小兒ALL的MRD的治療方法，從而減輕或甚至消除患者復發的風險。同種異體HSCT的治愈潛能(curative potential)取決于移植之前的MRD水平。用⑶Wx⑶3雙特異性單鏈抗體治療可以用于將所述高風險小兒患者轉變成MRD-陰性狀態。因此，難治性兒童ALL的 MRD首次可以通過⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療。3.本發明藥學方法和方式不但表現出有效的抗白血病作用，而且它們的毒性和所引起的不良反應也比包括化療和/或同種異體HSCT在內的常規小兒ALL療法小。到目前為止，在用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療之后未觀察到長期副作用。相比之下， 常規小兒ALL療法侵襲性(aggressive)強，因此與小兒患者相當多的健康風險相關。另外，已報道常規ALL療法之后對兒童的后遺影響(late effect)(參見，例如HudsonMM， Late complications after leukemia therapy. Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge Cambridge University Press ；2006, p. 750-773 ；Schmol1, Hoffken, Possinger :Kompendium Internistische Onkologie, S. 2660ff. ；4.Auflage, Springer Medizin Verlag Heidelberg ；http://www.cancer, gov/cancertopics/pdq/treatment/ lateeffects/HealthProfessional)。實際上，常規小兒ALL治療使用甚至比成人ALL所采用的治療途徑更具侵襲性(aggressive)的治療方案。然而，從約25%的小兒ALL復發率明顯可以看出，甚至這些侵襲性療法也不足以最終治愈所有患者。鑒于此，更令人吃驚的是， 用⑶19x^3雙特異性單鏈抗體治療難治性和/或復發性小兒ALL患者可以使所述患者變為MRD陰性狀態，這為這種高風險患者提供了新的治療機會。用常規小兒ALL療法如化療和/或HSCT無法獲得這種結果。4. ALL亞型(見下文)的所有患者當中，例如，Ph+ALL(bcr/abl)小兒患者具有非常高的復發風險。雖然同種異體HSCT目前被認為是小兒Wi+ALL選擇的治療方法，但是近三分之一的移植患者會復發。另外，如以下更詳細陳述的，用常規或標準ALL療法治療ALL 幼兒(< 12個月)失敗的風險較高，其中具有MLL(t(4;ll))基因重排的那些患者預后最差。以下實施例示出的患者2的結果和上述正在進行的、治療成人(非移植性)ALL患者的臨床試驗所獲得的數據揭示，甚至Wi+ALL(bcr/abl)和帶有MLL基因重排的ALL也可以通過給予⑶19x^3雙特異性單鏈抗體成功地治療。所以，給予⑶19x^3雙特異性單鏈抗體為小兒Ph+ALL或帶有(t(4;ll))易位的ALL，尤其為微小殘留病變(MRD)的小兒ALL患者提供了新的治療方法。這解決了例如由PCR或FACS分析限定的微小殘留病變(MRD)問題。
5.由于其具有很高的細胞毒活性，所以低劑量的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體就足以成功治療小兒ALL，這可以消除甚至骨髓中的白血病細胞。6.用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療的持續時間較常規小兒ALL療法短。常規小兒ALL化療通常需要2 3年，而在以下實施例給出的小兒患者中可以觀察到對⑶1 ⑶3 雙特異性單鏈抗體的非常迅速的反應。而且，該反應持久移植后患者1已保持多于12個月的MRD-陰性；見以下實施例。7.復發的小兒ALL患者經常患有化療難治性疾病，且這些患者對化療相關的毒性非常敏感。對于這些患者，用⑶19x⑶3雙特異性單鏈抗體治療首次提供了誘導此類患者緩解的非化療且毒性較低的策略。8.從上述正在進行的成人患者ALL的臨床試驗中發現，用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療消除了非移植性MRD-陽性CD19+ALL成人患者的化療難治性白血病細胞。然而在這些患者中所使用的細胞毒T-細胞是患者來源的，到目前為止還不存在關于在所使用的T-細胞是供體來源的情形下，在同種異體HSCT后使用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的數據。在此，本發明人首次報道，在不存在GvHD的情況下，對同種異體HSCT之后化療難治性復發的兩個⑶19+ALL小兒患者極強地誘導了 GvL效應，其是通過結合供體來源的T細胞的 ⑶19x^3雙特異性單鏈抗體所誘導的。總之，用⑶19x^3雙特異性單鏈抗體治療為小兒ALL，特別是難治性和/或復發性小J L ALL提供了新的和改進的療法。在本發明藥學方法和方式的優選實施例中，該小兒或兒童急性淋巴細胞白血病 (ALL)是小兒B系ALL，優選小兒B-前體急性淋巴細胞白血病ALL，更優選小兒祖B細胞 ALL (pro-B ALL)、前B細胞ALL (pre-BALL)、或普通ALL (cALL)。甚至更優選該小兒B-前體 ALL 是普通 ALL (cALL)。絕大多數小兒或兒童ALL病例(>85%)為B前體細胞表型(Schultz等人，Blood 109 (2007) :926-935)。因為本文描述的⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體是針對B細胞關聯的標記CD19，所以所述抗體特別適合用作小兒B-系急性淋巴細胞白血病的治療劑，更優選用作小兒B-前體ALL的治療劑。小兒B-前體ALL可以進一步地再分為小兒祖B細胞ALL、前 B 細胞 ALL 和普通 ALL(cALL)(參見，例如 Behm F. G.，Immunophenotyping.在Childhood Leukemias,C-H Pui ed. Cambridge Cambridge University Press ;2006,ρ· 150-209)。包括小兒B-前體急性淋巴細胞白血病和其它類型的小兒B (細胞)系ALL在內的小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)，及其治療方法綜述在以下文獻中，例如，Pui CH, Cl in Adv Hematol Oncol. 4(2006) :884-6 ；Pui CH，Evans WE, N Engl J Med 354(2006) :166-178 ；Pui CH et al. ，Lancet 371(2008) :1030-1043 ；Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6(2007) 149-165)。關于小兒ALL的進一步信息可以在例如http://www. cancer, gov或http //www. 1 eukemia-1 ymphoma. org 中 戈至Ij0從歷史考慮，1993年兒童腫瘤組(Pediatric Oncology Group)和兒童癌癥組 (Children' s Cancer Group) H H ICfgSEff^Ijf (National Cancer Institute) (Smith M等人，J Clin Oncol 14(1996)，18-24)支持的國際會議上采納了一組常用的風險標準。該NCI標準基于國際接受并可重現的因素年齡、初始白細胞計數(WBC)和診斷時存在的髓外(extramedullar)疾病。為了進一步完善(refine)治療，POG和CCG也都采用了已顯示對患者療效有影響的另外的風險因素(例如，倍數性、原細胞染色體組型(blast karyotype)和早期的形態響應)。在2000年，CCG和POG合并形成兒童腫瘤組(COG)。這種合并允許分析預測急性淋巴細胞白血病(ALL)無事故存活(EFS)的臨床、生物和早期響應數據，從而形成新分類體系和治療原則。從CCG(1988年12月 1995年8月，η = 4986)和 POG (1986年1月 1999年11月，η = 6793)連續登記的11779個初次診斷的B-前體ALL 兒童(1 21. 99歲)中，該研究利用信息化細胞遺傳學數據回顧分析了 6238個患者(CCG， 1182 ；P0G, 5056) (Schultz 等人，Blood 109(2007) :926-935)。定義了四個風險組非常高的風險(VHR;5-年EFS，45%或以下)、較低風險(5-年EFS，至少85% )，以及標準風險和高風險(仍然在美國國家癌癥研究所[NCI]各個風險組中的那些)。VHR標準包括極端的亞二倍體(hypodiploidy)(少于44個染色體)、t (9 ；22)和/或BCR/ABL,以及誘導失敗。 較低風險的患者是攜帶t (12 ；21) (TEL/AML1)或同時發生4、10、17號染色體三體的NCI標準風險。即使治療方式不同，但CCG和POG分析之間還是存在高度的一致性。利用COG風險分類方案，通過COG試驗中的流式細胞儀，基于年齡、白細胞(WBC)計數、細胞遺傳學、14 天的骨髓反應和結束誘導時(end induction)微小殘留病變(MRD)，將B-前體ALL分成較低風險組(27% )、標準風險組(32% )、高風險組(37% )，和非常高的風險組)。目前，基于風險的治療分配(treatment assignment)已用于兒童或小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)。這種方法使歷史上療效良好的兒童可以用溫和療法治療并可以省去更加強化和有毒的治療，同時使歷史上長期存活概率較小的兒童接受可增加其治愈幾率的更加強化的治療。已發現，在診斷時年長兒童和青少年(彡10歲)及幼兒(< 12個月) 的有利療效比1 9歲的兒童小，一般對這些患者采取較具侵襲性的治療(Nachman J，Br JHaematol 130(2005) :166-73)。用⑶Wx⑶3雙特異性單鏈抗體治療目前為此類小兒患者人群，即利用常規ALL療法如化療和/或HSCT治療療效較差的年長兒童和青少年(》10 歲)及幼兒(< 12個月)提供了改進的、毒性較低的療法。ALL兒童的成功治療需要對全身疾病加以控制(例如，骨髓、肝和脾、淋巴結)以及預防或治療髓外疾病，特別是中樞神經系統(CNS)的疾病。診斷時按常規標準，僅3%的患者可檢測到CNS受牽連(彡5WBC/微升，存在淋巴母細胞(lymphoblast cell))。然而，除非針對CNS進行特異性治療，否則50%至70%或更多兒童將最終發展成明顯的CNS白血病。 所以，目前建議所有ALL兒童應當接受全身聯合化療和一些形式的CNS預防。當前，大部分組用鞘內療法和隨后的腦照射，對診斷時記錄的CNS白血病患者(>5WBC/ul，存在原細胞； CNS3)和診斷時帶有T-細胞表型和WBC計數高的那些患者進行治療。因此，用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體的治療優選聯合諸如鞘內療法和/或腦照射的CNS預防實施。ALL兒童的常規或標準治療分為以下幾個階段誘導緩解、鞏固或強化、和維持 (或繼續)治療，其中CNS避難所治療(sanctuary therapy) 一般提供在每個階段。在誘導緩解之后的強化治療階段適用于所有患者。誘導治療和誘導后治療的強度都由基于風險的治療分配和一些類型的早期反應評估所采用的臨床和生物預后因素確定。這種評估可包括7天和/或14天骨髓原細胞百分數、8天外周血原細胞計數，以及在誘導期間或結束時在骨髓和/或外周血中的微小殘留病變測定(Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354(2006) 166-78)。ALL兒童的治療持續時間為2 3年。相比之下，在以下實施例給出的小兒患者中可以觀察到對CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療的非常迅速的反應。另外，患者1到目前為止(2009年11月)仍為MRD陰性，表明獲得了長期的治愈。根據現行標準或常規療法預后不良的患者亞群可能需要不同的治療方式。例如， ALL幼兒治療失敗的風險較高，其中帶有MLL基因重排的那些預后最差(Rubnitz JE等人 Blood 84(1994) 570-3 ；Biondi A 等人，Blood 96(2000) 24-33 ；Pui CH 等人，Lancet 359(2002) :1909-15 ;SilvermanLB 等人Cancer 80(1997) :2285-95)。這些兒童一般用針對幼兒特別設計的方案治療(Silverman等人，(1997)，loc. cit.，Chessells JM等人，J Haematol 117 (2002) :306-14 ；Reaman GH 等人，J Clin Oncol 17(1999) :445-55 ；PietersR 等人，Lancet 370(2007) :240-50)。現行的幼兒方案采用強化治療方法，并可以提供較先前較弱的強化方法有所改進的疾病控制方式，但長期療效和毒性未知(Reaman(1999)，loc. cit. ；Pieters (2007), loc. cit. ； Kosaka Y 等人，Blood 104(2004) :3527-34 ；Hilden JM 等人，Blood 108(2006) :441-51)。利用現行療法，某些ALL兒童(大于1歲)長期緩解的可能性小于50% (例如，t[9;22]費城染色體陽性ALL、亞二倍體患者，和初步誘導失敗的那些)。對于這些疾病，在第一緩解期中考慮來自人白細胞抗原(HLA)-匹配的同胞的同種異體骨髓移植(Snyder DS 等人，Leukemia 13(1999) :2053-8 ；Arico M, et al.，N Engl J Med 342(2000) :998-1006 ；Schrauder A, et al.，J Clin Oncol 24(2006) :5742-9)。然而，僅通過WBC計數、性別和年齡，還不能證明HLA-匹配的同胞供體移植對定義為高風險的患者有益(Ribera JM 等人，J Clin Oncol 25(2007) 16-24) 因為骨髓抑制和全身免疫抑制是白血病及其利用化療的治療方法的預期結果，所以在常規小兒ALL治療期間必須密切監測患者。在白血病治療的所有階段中，對于血液支持以及感染性和其它并發癥的治療，足夠的設施必須是立即可用的。近患者在誘導治療期間死亡，另外的 3%在第一緩解期死于治療相關的并發癥(Christensen MS等人， Br J Haematol131(2005) :50-8)。利用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的治療為小兒ALL，特別為難治性和/或復發性小兒ALL提供了替換的毒性較小的療法。所述治療避免了常規兒童ALL療法如治療失敗、 毒性和長期不利影響的缺陷。所以，它是化療和/或同種異體HSCT的高效但毒性和健康風險較小的替換方式。因此，在本發明藥學方法和方式的另一個實施例中，所述急性淋巴細胞白血病 (ALL)是難治性和/或復發性ALL。該小兒ALL可以是化療或同種異體造血干細胞移植(HSCT)難以治療的，或者化療和同種異體造血干細胞移植(HSCT)均難以治療的。該ALL可以是復發性ALL，或用包括化療和/或同種異體造血干細胞移植(HSCT)在內的常規ALL療法難以治療的復發性ALL。然而，在本發明范圍內，該ALL也可以是初次診斷的ALL。在這種情況下，利用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體的治療可以單獨或聯合HSCT用作首次(第一線)治療。如本文使用的，術語“難治性小兒ALL”是指該小兒ALL對常規或標準小兒ALL療法，如化療和/或HSCT有抗性。目前，小兒ALL的復發率為約25%。換言之常規或標準小兒ALL療法無法最終治愈所有小兒患者。如本文使用的，術語“復發性小兒ALL”是指在小兒患者已進入緩解期之后ALL疾病的征象和癥狀重現。例如，在使用化療和/或HSCT的常規ALL治療之后，小兒ALL患者可進入沒有ALL征象或癥狀的緩解期，保持緩解期幾年，但隨后復發，不得不再次治療ALL。
復發的小兒ALL患者經常患有化療難治性疾病。這些患者對化療相關的毒性非常敏感，這可通過利用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體的治療加以避免。如本文使用的，術語“標準療法”或“常規療法”是指使用化療和/或HSCT的小兒ALL療法。包括小兒B-前體急性淋巴細胞白血病和其它類型的小兒B(細胞)系ALL 在內的小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)，及其治療方式綜述在以下文獻中，如Pui CH, Clin Adv Hematol Oncol. 4(2006) :884-6 ；Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354(2006) 166-178 ；PuiCH et al.，Lancet 371(2008) :1030-1043 ；Pui CH, Jeha S, N at Rev Drug Discov 6(2007) :149-165) ；Henze G,von Stackelberg A,Relapsed acute lymphoblastic leukemia。 在Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge Cambridge University Press ；2006，p. 473-486)。關于小兒ALL的進一步信息也可以在例如http //www. cancer, gov 或 http://www. 1 eukemia-1 ymphoma. org 中找至丨J。根據本發明的術語“雙特異性單鏈抗體”或“單鏈雙特異性抗體”或相關術語表示通過將至少兩個抗體可變區連接在缺乏完整免疫球蛋白中存在的恒定和/或Fc部分(或多個部分)的單個多肽鏈中而產生的抗體構建體。本文提到的雙特異性單鏈抗體作為單體具有功能性，即，細胞毒活性，因此與本領域中描述的僅作為二聚體或多聚體才具有功能性的diabody或tandab有著明顯的區別。本文使用的“接頭(linker) ”連接相同特異性的V 結構域，而本文使用的“間隔物(spacer)”連接不同特異性的V結構域。例如，雙特異性單鏈抗體可以是總共具有兩個抗體可變區例如兩個VH區的構建體，每個可變區均能夠特異地結合到單獨的抗原上，并通過短的(通常少于10個氨基酸)合成多肽間隔物彼此連接， 使得該兩個抗體可變區與插入其中的間隔物以單個的連續多肽鏈形式存在。雙特異性單鏈抗體的另一個實施例可以是具有三個抗體可變區的單個多肽鏈。此處，兩個抗體可變區例如一個VH和一個VL可以組成scFv，其中該兩個抗體可變區經由合成多肽接頭彼此連接，通常對該多肽接頭進行基因設計以便使免疫原性最小化、同時保持對蛋白水解作用最大的抗性。這種scFv能夠特異地結合到特定抗原上，并且連接到此外的抗體可變區例如VH區上， 該抗體可變區能夠結合于與scFv所結合的抗原不同的抗原。雙特異性單鏈抗體的又一個實施例為具有四個抗體可變區的單個多肽鏈。此處，前兩個抗體可變區例如VH區和VL區可以形成一個能夠結合到一個抗原上的scFv，而第二個VH區和VL區可以形成第二個能結合到另一個抗原上的scFv。在單個連續多肽鏈中，一種特異性的單獨抗體可變區可以有利地通過如上文所述的合成多肽接頭隔開，而各個scFv可以有利地通過如上文所述的短肽間隔物隔開。雙特異性單鏈抗體的非限制性實例以及制造它們的方法在以下文獻中給出 WO 99/54440，WO 2004/106381，W02007/068354, Mack, J.Immunol. (1997)，158，3965-70 ； Mack, PNAS, (1995)，92，7021-5 ；Kufer, Cancer Immunol. Immunother.，(1997)，45，193-7 ； Loffler, Blood, (2000),95,6,2098-103 ；Briihl,J.Immunol.，(2001)，166,2420-2426。如本文所使用的，“CD3”表示在T細胞，優選在人T細胞上作為多分子T細胞受體復合體的一部分而表達的抗原，⑶3由五種不同的鏈組成⑶3- ε、⑶3-γ、⑶3- δ、⑶3- η 和⑶3- ζ。⑶3如通過抗⑶3抗體在T細胞上的成簇導致T細胞類似于結合抗原、但不依賴于T細胞亞型克隆特異性的激活。因此，如本文所使用的，術語“CD19xCD3雙特異性單鏈抗體”涉及能夠結合到在T細胞上表達的人CD3復合體上、并能夠誘導靶細胞消除/裂解的 CD3特異性構建體，其中此種靶細胞攜帶/展示與雙特異性單鏈抗體的其它非CD3結合部分結合的抗原。如本領域已知的，CD3復合體與CD3特異結合物(例如根據本發明藥學方式和方法給予的雙特異性單鏈抗體)的結合導致T細胞激活；參見，例如WO 99/54440或WO 2007/068354。因此，適合本發明藥學方式和方法的構建體可以有利地在體內和/或體外消除/裂解靶細胞。相應的靶細胞包含表達腫瘤抗原例如CD19的細胞，該腫瘤抗原通過所述構建體的第二種特異性(即雙特異性單鏈抗體的非CD3結合部分)識別。優選地，所述第二種特異性是已在WO 99/54440、WO 2004/106381或WO 2007/0683 中描述的對人CD19 的特異性。根據這個實施例，雙特異性單鏈抗體的每個抗原特異性部分包含抗體VH區和抗體VL區。這種雙特異性單鏈抗體的有利變體從N末端到C末端為Vl (CD 19) -Vh (CD 19) -Vh (CD3) -Vl (CD3)。在本發明含義內，術語“特異地結合”或相關術語如“特異性”應理解為主要通過以下兩個參數表征定性參數(結合表位，或抗體結合部位)和定量參數(結合親和力，或這個抗體與其結合位置的結合有多強)。抗體結合哪個表位可以有利地通過例如FACS方法、 ELISA、肽-點表位作圖(ρ印tide-spot epitope mapping)或質譜法測定。抗體結合到特定表位上的強度可以有利地通過例如已知的Biacore和/或ELISA法測定。這些技術的聯合使得可以將信號噪聲比(信/噪比)計算為結合特異性的代表量度。在此種信號噪聲比中，該信號代表抗體結合感興趣表位的強度，而該噪聲代表抗體結合其它不同于感興趣表位的非相關表位的強度。將各個感興趣表位的、例如至少為50，但優選大約為80的信號噪聲比作為所評估抗體以特異方式結合感興趣表位、即為"特異結合物"的指標，其
中該信號噪聲比例如通過Biacore、ELISA或FACS測定。術語“結合到/與......相互
作用”也涉及由人靶分子或其部分的兩個或甚至更多區域組成的構象表位、結構表位或非連續表位。構象表位由兩個或多個從一級序列中分離的不連續氨基酸序列限定，其中當多肽折疊成天然蛋白質時該不連續氨基酸序聚集在分子表面上(Sela，(1969) Science 166， 1365和Laver，(1990)Cell 61,553-6) 0術語“非連續表位”表示由多肽鏈間隔部分的殘基組裝成的非線性表位。當該多肽鏈折疊成三維結構時，這些殘基聚集在分子表面上從而構成構象/結構表位。如本文使用的術語“治療”在廣義上表示旨在減輕疾病的醫學方法或應用。在本發明的情況下，給予如本文描述的(制備用于給予小兒ALL患者的)CD19xCD3雙特異性單鏈抗體是為了治療、改善或消除小兒ALL疾病。如本文使用的術語“改善”與改進是同義詞。如果小兒ALL患者病況得到改善，則該患者明顯變好——她或他的臨床病況有一些改進。例如，如果可以使ALL疾病穩定，即 ALL疾病不再發展，則該ALL患者病況可以有所改進。這個疾病階段也稱為病情穩定。改善還可以是小兒ALL患者的MRD狀態的改進。例如，在用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療之前，可在該小兒ALL患者的每IO4個骨髓細胞中檢測到100個白血病細胞。由于用⑶1 ⑶3 雙特異性單鏈抗體進行治療，在這個示例情況下每IO4個骨髓細胞中的白血病細胞數目可減少到10個白血病細胞或甚至更少的白血病細胞(例如，少于1個白血病細胞)。如本文使用的術語“消除”表示從小兒ALL患者身體內除去白血病細胞。如以下實施例所示，給予CD19xCD3雙特異性單鏈抗體可以將MRD陽性急性淋巴細胞白血病(ALL) 轉變成MRD陰性狀態，即，未檢測到MRD的狀態(< 10_4，即，每IO4個骨髓細胞中可檢測到少于1個的白血病細胞)。在這種情況下，達到完全分子緩解。
如本文使用的術語“給予(或給藥)”表示向個體，即人類小兒患者，給予治療有效劑量的前述⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體(優選SEQ IDN0. 1中示出的抗體)。“治療有效量”表示對給予其的對象產生效果，即足以殺滅急性淋巴細胞白血病細胞的劑量。優選地， CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的給予劑量消除了該小兒患者身體內的所有急性淋巴細胞白血病細胞，形成如本文限定的MRD-陰性ALL狀態。確切劑量依賴于治療目的，并且可通過本領域技術人員利用已知技術確定。主治醫生和臨床因素決定給藥方案。如醫學領域所熟知的，任一個小兒患者的劑量都取決于許多因素，包括小兒患者尺寸、身體表面積、年齡、體重、待給予的特定化合物、性別、給予時間和給予途徑、總體健康狀態以及其它同時給予的藥物。典型的劑量可以例如設定在本發明方法和方式的實施方式，以及所附實施例列出的范圍內；但是，尤其是考慮前述因素，設計了低于或高于這個示例范圍的劑量。術語“連續輸注”指的是允許在一段時間內持久進行的輸注，即沒有中斷。“連續輸注”指的是持久給予的輸注。因此，在本發明上下文中，術語“持久的”和“連續的”用作同義詞。在本發明的含義內，例如術語“通過連續輸注給予(至少)4周”等表示下列情形， 即在本發明藥學方式和方法所需的整個持續時間內，以持續、恒定的方式向小兒患者身體連續給予根據本發明藥學方式和方法中使用的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體(至少)4周的時間。⑶Wx⑶3雙特異性單鏈抗體的連續給予方案更詳細地描述在WO 2007/0683M中。 避免中斷CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的導入，也就是說除了補充供給所給予的CD19xCD3 雙特異性單鏈抗體或必要的醫學干預等之外，在本發明藥學方式和方法所需的整個給予持續時間內不因為其它原因出現或顯著出現下列轉變，所述轉變為從正向小兒患者身體給予這個抗體的狀態轉變為不再向小兒患者身體給予這個抗體的狀態。就此種必需的補充導致所給予抗體的導入短暫中止而言，此種給予在本發明的藥學方式和方法含義內仍應理解為 “不中斷的”或“持久的”。在大部分情況中，此種再給予的持續時間一般如此短，以致于未向小兒患者身體導入抗體的時間相比按照根據本發明藥學方式和方法的整個給予方案計劃的時間是非常小而趨于零的。根據本發明，一個治療周期可以理解為向該ALL患者連續輸注CD19xCD3雙特異性單鏈抗體(至少)4周時間，在此之后是2周無治療間隔期。如本文使用的術語“至少”表示該連續輸注也可以進行長于4周的時間，例如5、6、7、或8周或甚至更長，在此之后是2周無治療間隔期。可能有這樣的情況，即在(至少)4周連續給予(或一個治療周期)之后對受治療小兒患者(或多個小兒患者)進行MRD分期時，可以獲得最低或部分的響應，但無法獲得MRD陰性。在此種情況下，該連續給予可以延長另外的一、二、 三、四、五或甚至多達十個治療周期，以便獲得更好的治療結果，例如，完全血液響應或甚至完全分子響應。優選地，所述完全分子響應是MRD陰性(如以下限定的)，其降低了該ALL 疾病反復出現的風險。例如，已發現，小兒ALL患者在同種異體HSCT之前的MRD-陰性或低 MRD 水平降低了復發風險(BaderP，et al.，J Clin Oncol 27(2009) :377-384)。如以下實施例所示，MRD陰性可以通過用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療小兒ALL患者獲得。所以，在本發明藥學方法和方式的一個實施方式中，一個或多個治療周期之后將進行同種異體HSCT，在該治療周期中將⑶19x^3雙特異性單鏈抗體連續給予小兒ALL患者。換言之在這個優選的實施方式中，本發明方法在同種異體干細胞移植(HSCT)之前進行，以便將MRD陽性ALL轉變成MRD陰性狀態。這樣，顯著降低了復發風險。
在本發明方法的另一個實施方式中，該方法在同種異體造血干細胞移植(HSCT) 之后進行。該移植步驟之后可以是用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療的一個或進一步的治療周期(或多個治療周期)。在患者已接受化療和HSCT的復發性小兒ALL的情況下，這個實施方式是重要的。由于這些常規療法的失敗，該疾病可能復發，且現已通過給予所述抗體而治愈。另外，利用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的治療可在HSCT之后作為鞏固療法使用， 以便避免ALL疾病的再次復發。以下實施例也提供了在同種異體HSCT之后使用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體的數據，其中結合的T細胞是供體來源的。可以觀察到通過用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療， 在不存在移植物抗宿主病(GvHD)的情況下對同種異體造血HSCT之后化療難治性復發的兩個⑶19+ALL患者強有力地誘導的移植物抗白血病(GvL)效應。所以，在本發明藥學方法和方式的另一個優選實施方式中，該小兒ALL患者在她/他已接受同種異體HSCT之后，可以用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療。在最好的情況下，設計了，CD19xCD3雙特異性單鏈抗體可以代替諸如化療和/或同種異體造血干細胞移植(HSCT)的常規小兒ALL療法治療小兒ALL患者。如以下實施例所示，用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)患者可以將該患者身體內的急性淋巴細胞白血病細胞消除到檢測限以下。優選地，向ALL小兒患者單獨地給予⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體或者聯合同種異體HSCT給予其的主要治療目的在于將MRD-陽性狀態轉變成MRD-陰性狀態，使患者如本文以下限定的無白血病生存。如本文所證明，在⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體已經連續給予五周(患者1) 或四周(患者2)的第一治療周期之后，MRD-陽性小兒ALL患者轉變成MRD陰性。在該治療周期之后將對患者1進行單倍型HSCT。截至2009年11月，該患者仍然處于MRD-陰性完全緩解，即無腫瘤狀態中。根據本發明的藥學方式和方法連續不中斷地給予⑶19x^3雙特異性單鏈抗體一段較長的時間，使該實施例所述有利的T細胞激活能夠在足夠長的時間內發揮其作用從而有利地清除身體內的所有急性淋巴細胞白血病細胞。因為不中斷地給予雙特異性單鏈抗體的速率維持在低水平上，所以治療劑的使用可以持續較長時間，而不具有對患者產生有害副作用的風險。如本文使用的⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體，有利地制備成向診斷患有急性淋巴細胞白血病(ALL)的人類小兒患者給予的藥物組合物形式。所述ALL可以是初次診斷的 ALL、化療和/或同種異體造血干細胞移植(HSCT)難以治療的ALL、復發性ALL或者化療和 /或同種異體造血干細胞移植(HSCT)難以治療的復發性ALL。在本發明藥學方法和方式的優選實施方式中，所述小兒急性淋巴細胞白血病 (ALL)是小兒B-系急性淋巴細胞白血病(ALL)，優選小兒B-前體急性淋巴細胞白血病。絕大多數小兒ALL病例(>85%)為B前體細胞表型。已經提出數個B-細胞系的ALL分類(參見，例如，Schultz等人，Bloodl09 (2007) =926-935) 0為了相對于患者復發風險調節治療強度，目前利用實驗室和臨床參數患者年齡、性別、疾病出現(disease presentation)時的白細胞計數(CBC)、以及特殊細胞遺傳學異常存在與否，將B前體ALL患者分為“低”、“標準”、“高”或“非常高”的風險組。幫助限定這些風險組的頻繁地反復出現的遺傳異常例如包括:t(12 ；21) [TEL-AML1] ；t(l ；19 ；) [E2A-PBX] ；t(4 ；11) [AF4-MLL] ；t(9 ；22) [BCR-ABL]； 超二倍體(或4、10和17號染色體三體)、以及亞二倍體；參見例如khultz等人、Bader等人，loc. Cit。利用從各個研究中獲得的數據，已開發并實施的分類系統為COG AALL03B1 (急性淋巴細胞白血病的分類)(Raetz 等人，Personalized Med. 2 (2005)，349-361 ；Schultz 等人，Blood 109(2007) =926-935) 0因為本文描述的CDWxCD3雙特異性單鏈抗體是針對與B 細胞關聯的標記CD19的抗體，所以所述抗體特別適合用作小兒B-系急性淋巴細胞白血病的治療劑，優選用作小兒B-前體ALL的治療劑。小兒B-前體ALL可以進一步地再分為小兒祖B細胞ALL、前B細胞ALL和普通ALL (cALL)。如以下實施例所示，用根據本發明的方法對任何治療方式都難以治療并因此有致命傾向的普通ALL的7歲患者1進行治療，不但獲得完全血液緩解，而且獲得完全分子緩解。換言之在用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療之后，在這個患者中不再能檢測到微小殘留病變。特別優選地，該小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)是B-前體ALL，更優選cALL。重要地，⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體不僅可以殺滅具有TCR或免疫球蛋白重排的ALL細胞，而且可以殺滅具有各種其它細胞遺傳學異常的ALL 細胞例如，已發現在以下實施例中描述的患者2以及成人ALL患者中，所述抗體可以治療以免疫球蛋白或TCR重排、t(4 ；11)易位或bcr/abl融合轉錄物0 +)為特征的ALL。特別地，拖+ALL和帶有易位的ALL被報道極難通過常規ALL療法治療，但可以通過 ⑶19x⑶3雙特異性單鏈抗體成功地治療。上述數據表明，⑶19x⑶3雙特異性單鏈抗體可以治療各種形式的 ALL，包括例如以 t (12 ；21) [TEL-AML1] ；t(l ；19 ；) [E2A-PBX] ；t(4 ；11) [AF4-MLL] ；t(9 ；22) [BCR-ABL]；超二倍體(或4、10和17號染色體三體)、亞二倍體以及免疫球蛋白或TCR重排為特征的ALL ；也參見表1。小兒ALL的診斷基于該細胞的形態學、細胞化學和免疫學特征進行，這些特征包
染色的骨髓涂片上的淋巴母細胞形態、末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)陽性染色、髓過氧物酶陰性染色，以及2個或更多B-細胞前體淋巴分化抗原的細胞表面表達° 免疫分型例如由 Behm F. G. (Immunophenotyping,在Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge =Cambridge University Press ；2006，p. 150-209)描述，并可通過例如間接免疫熒光法、免疫組織化學和/或流式細胞術進行。如本文所使用的，術語“患者”是指人患者。本文提到的術語“小兒ALL”或“小兒 ALL患者”表示年齡為1個月 18歲的兒童。所指出的年齡應理解為該兒童在診斷ALL疾病時的年齡。兒童可以更具體地再分為幼兒(1 12個月齡)、年齡為1 9歲的年幼兒童，以及年長兒童和青少年(彡10 18歲)。如本文所使用的，限定為“X Y”的時間間隔與限定為“在X和Y之間”的時間間隔等同。這兩個時間間隔都具體地包括上限和下限。 這是指，例如“1個月 18歲”的時間間隔包括“1個月”和“18歲”。優選地，根據本發明待治療的患者最大為18歲(包括年齡為18歲的患者)。如以下實施例所示，患者1在7歲時用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療，他在2 歲時診斷出ALL。患者1在15歲時用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療，他在2001年診斷出 ALL。上面的定義原則上適用于術語“小兒急性淋巴細胞白血病(ALL) ”、“兒童ALL”等。 例如，小兒或兒童ALL應理解為對年齡在1個月(包括1個月)和18歲(包括18歲)之間的小兒患者診斷出的ALL。
雖然如本文使用的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體可以單獨給予，但優選在藥學上可接受的載體中給予。合適的藥物載體的實例在本領域中是熟知的，并包括磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、脂質體、各種類型的濕潤劑、無菌溶液等。包含此種載體的組合物可以根據熟知的常規方法配制。這些藥物組合物可以合適的劑量給予小兒患者。給藥方案由主治醫生和臨床因素決定。如醫學領域所熟知的，任一小兒患者的劑量都取決于許多因素，包括患者尺寸、身體表面積、年齡、體重、待給予的特定化合物、性另U、給予時間和給予途徑、總體健康狀況以及其它同時給予的藥物。腸胃外給予的制劑包括無菌水性或非水溶液，或懸浮液。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇和可注射有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、水溶液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質。腸胃外媒劑(vehicles)包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer' s) 右旋糖、右旋糖和氯化鈉，或者乳酸化林格氏液。靜脈內媒劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑(如基于林格氏右旋糖的那些)等。還可以存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。另外，該組合物可以包括蛋白質類載體，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，其優選為人源的。還設計了，該組合物除了包含蛋白質類雙特異性單鏈抗體之外，還包括進一步的生物活性劑，這取決于該藥物組合物的預期用途。此種藥劑可以是作為細胞抑制劑(cytostatica)的藥劑、預防高尿酸血癥(hyperurikemia)的藥劑、抑制免疫反應的藥劑(例如，糖皮質激素，Π(506)、作用于循環系統的藥物和/或諸如T-細胞共刺激分子或本領域已知的細胞因子等藥劑。例如，用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的治療可以聯合諸如CNS預防、皮質激素和/或別嘌呤醇的鞘內化療進行。優選地，將如本文限定的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體配制在緩沖液、穩定劑和表面活性劑中。該緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。該穩定劑可以是氨基酸(或多種氨基酸)和/或糖。該表面活性劑可以是清潔劑、 PEG等。更優選地，將如本文限定的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體配制在檸檬酸鹽、賴氨酸、 海藻糖和吐溫80中。作為本發明藥物組合物的稀釋劑，優選等滲鹽水和吐溫80。優選地，在本發明藥學方法和方式中，所制備的藥物組合物用于給予診斷為患有急性淋巴細胞白血病(ALL)的人類小兒患者。可根據針對各個病種確立的標準方法監測CD19xCD3雙特異性單鏈抗體療法成功與否對于B細胞ALL治療，可以使用熒光激活細胞分選(FACS)、骨髓穿刺和各種白血病的具體臨床化學參數以及本領域中已知所確立的其它標準方法。本文描述了微小殘留病變 (MRD)狀態的測定方法和方式。⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體的細胞毒活性可以通過本領域已知的方法和例如WO 99/54440, WO 2004/106381、WO 2007/068354 中給出的方法檢測。在本發明藥學方法和方式的優選實施方式中，小兒患者(或多個小兒患者)的 B-前體ALL是復發性和/或難治性的。利用現行的兒童ALL治療方式，無事故存活率為約75%。所以盡管進行毒性和健康風險治療，仍有25%的患者會復發。ALL復發處理中的問題是白血病細胞的抗性，以及小兒患者在已接受第一線強化治療之后對第二輪治療的耐受性降低，導致緩解率降低以及隨后復發的發病率增大和總體療效下降。于是，強化綜合化療是誘導第二次完全緩解所必需的(Henze G，von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia.在Childhood Leukemias, C-H Puied. Cambridge Cambridge University Press ；2006, p. 473-486)。如本文使用的術語“化療和/或同種異體干細胞移植難以治療的”是指小兒ALL患者對這些療法有抗性，因而在常規ALL治療后復發。還可以設計，在用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療之后復發的小兒患者接受一個或多個利用所述抗體的進一步的治療周期，以便使受治療兒童MRD變成陰性。所述患者然后可以例如接受第二次同種異體HSCT。如以下實施例所示，本發明藥學方法和方式特別適于治療對常規ALL療法有抗性的小兒患者。盡管所示小兒患者已用化療和同種異體干細胞移植進行大量地預治療，但該患者多次復發。所以該患者預后極差。然而，在用⑶19x⑶3雙特異性單鏈抗體治療之后， 該患者為MRD陰性，即，表現出完全分子緩解。換言之該治療將小兒患者身體內的急性淋巴細胞白血病細胞消除到檢測限以下。最重要地，已清除了該小兒患者骨髓中的白血病細胞。在本發明藥學方法和方式的優選實施方式中，就MRD而言，小兒患者(或多個小兒患者)的急性淋巴細胞白血病(ALL)是化療和/或同種異體HSCT難以治療的。換言之小兒ALL患者的MRD對化療和/或同種異體HSCT有抗性。可以預期本發明藥學方式和方法還適用于治療初次診斷的小兒ALL，因為它提供了諸如化療和/或同種異體HSCT的常規小兒ALL治療方案的替換方式。在進一步優選的實施方式中，所述急性淋巴細胞白血病(ALL)在診斷后三年內復發，優選在診斷后兩年內復發，甚至更優選在診斷后一年內復發。優選地，所述復發是骨髓復發。如本文使用的術語“化療”表示用于治療小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)的化療。化療是為小兒ALL選擇的初步治療(參見例如Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6(2007) :149-165 ；Schmiegelow K, Gustaffson G. Acute lymphoblastic leukemia。在 Cancer in Children :Clinical Management. Voute PA, Barret A, Stevens MCG, Caron HN(eds). London, UK, Oxford University Press,2005, p. 138-170 ；Schmol1, Hbffken, Possinger, loc. cit.)。大多數小兒ALL患者最終要接受聯合的不同治療。在治療小兒 ALL時，由于腫瘤細胞呈全身性分布，所以不存在手術選擇。一般地，小兒ALL的細胞毒化療以各種聯合方式聯合多種抗白血病藥物。小兒ALL的化療由三個階段組成緩解誘導、 強化治療和維持治療。化療也適合于保護中樞神經系統不受白血病損害。緩解誘導的目的在于迅速地殺滅大多數腫瘤細胞并使該小兒患者進入完全血液緩解期。這定義為骨髓中存在的白血病原細胞少于5% (如通過光學顯微術測定)。例如，可以單獨或組合使用氯法拉濱(Clofarabine)、環磷酰胺(Cyclophosphamide)、VP16、安吖啶(Amsacrine)JSW 松(Prednisone)、美法侖(Melphalan)、或阿糖胞苷(Cytarabine)誘導緩解。強化治療使用大劑量的靜脈內多種藥物化療從而進一步減輕腫瘤負荷。典型的強化方案以不同的組合使用給予的長春新堿(vincristine)、環磷酰胺、阿糖胞苷、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊甙(etoposide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)或巰基嘌呤(mercaptopurine)作為阻斷劑 (blocks)。因為ALL細胞有時透入中樞神經系統(CNS)，所以大多方案都包括將化療藥物遞送到CNS流體中，通常稱為鞘內化療。一些腫瘤中心通過奧馬耶貯器(Ommaya reservoir) (通過手術放入頭皮下并用于將藥物遞送到CNS流體中和用來提取各種測試用CNS流體的裝置)遞送藥物。其它腫瘤中心根據測試和治療遞送的需要進行多點腰椎穿刺。鞘內甲氨蝶呤或阿糖胞苷通常用于這個目的。維持治療的目的在于殺滅任何未被緩解誘導和強化方案殺滅的殘留細胞。雖然此類細胞數目很少，但是若不根除它們將導致復發。為了這個目的，可以每日口服巰基嘌呤、每周口服一次甲氨嘌呤、每月靜脈內注射一次5天療程的長春新堿。維持治療的時間對于男孩是3年，而對于女孩和成人是2年。神經系統復發可通過鞘內給予氫化可的松(hydrocortisone)、甲氨嘌呤和阿糖胞苷來治療。因為化療方案可能是長期的強化治療(intensive and protracted)(在 GMALL UKALL、HyperCVAD 或 CALGB 方案的情況下通常約為2年，在COG方案的情況下對于男性約為3年)，所以許多患者將靜脈內導管插入到大靜脈中(稱為中樞神經系統導管或Hickman線)、或Portacath(錐形管(cone-shaped port)，其具有通過手術植入通常接近鎖骨的皮膚下的硅樹脂探頭 (silicone nose))。然而，化療仍然是高毒性方法，特別是對于小兒患者。患者在初步治療之后可能會經受ALL復發，和/或在治療之后變得難以用化療治療。化療難以治療的小兒ALL患者預后非常差。特別地，僅用化療治療的Wi+ALL小兒患者或帶有易位的ALL小兒患者預后差。因為本發明方法能夠使小兒ALL患者MRD變成陰性，所以它對化療和/或同種異體HSCT難以治療的ALL患者的治療特別有用。鑒于這點，如本文使用的術語“化療和/或同種異體HSCT難以治療的”表示急性淋巴細胞白血病細胞對化療和/或同種異體HSCT有抗性。如本文使用的術語“同種異體造血干細胞移植(HSCT) ”表示涉及造血干細胞 (HSC)移植的同種異體造血干細胞移植(HSCT)或骨髓移植，其是血液學和腫瘤學領域中的醫學方法。它最經常對血液或骨髓疾病患者，或特定類型的癌癥患者，如ALL患者進行。大多數HSCT接受者是可從以大劑量化療或全身照射治療中受益的白血病(例如 ALL)患者。對ALL兒童的同種異體HSCT描述在，例如khrauder A，等人(Bone Marrow Transplantation 41(2008) :Suppl2S71_74)中。然而，同種異體干細胞移植仍然是有風險的步驟，特別是對于小兒患者。如本文使用的術語“符合同種異體造血干細胞移植(HSCT)條件的”是指同種異體干細胞移植是小兒ALL患者所需要的療法。在小兒ALL患者符合同種異體干細胞移植條件的這種情況下，可以設想以下的兩種情形。第一，在本發明藥學方法和方式的一個實施方式中，可給予CD19xCD3雙特異性單鏈抗體(單獨地或優選以藥物組合物形式)以代替符合移植條件的小兒ALL患者作為常規療法的同種異體干細胞移植。所以本發明方法可以使小兒 ALL患者避免與同種異體HSCT相關的健康風險。另外，接受移植的小兒ALL患者當中，通常有約30%患者在移植之后復發。所以本發明方法可用來治療這些患者。在替換實施方式中，可以在向小兒ALL患者連續輸注⑶19x^3雙特異性單鏈抗體之后進行同種異體干細胞移植。在這個實施方式中，可通過給予包含CD19xCD3雙特異性單鏈抗體構建體的藥物組合物將符合移植條件的小兒ALL患者轉變成MRD陰性狀態，之后才讓他們接受移植。這樣，本發明方法可用來消除MRD，這使得MRD-陽性患者移植治療的復發風險降低。以下實施例描述了小兒患者(患者1)，該患者首先在用⑶19x^3雙特異性單鏈抗體治療后轉變成MRD陰性狀態，然后接受了同種異體移植。至今(2009年11月)，這個小兒患者仍然為MRD陰性。如本文使用的術語“不符合同種異體造血干細胞移植(HSCT)條件的”是指這些小兒患者，由于例如醫學原因，對于這些患者而言同種異體干細胞移植不是可選擇的ALL治療方法。也有可能發生的是，沒有可供同種異體干細胞移植用的合適供體。因此，在一個實施方式中，不符合或不再符合同種異體HSCT條件的小兒患者的急性淋巴細胞白血病(ALL)是化療和/或同種異體HSCT難以治療的。例如，小兒患者可能處在如此差的臨床病況下，以致由于醫學原因而無法進行同種異體干細胞移植。以下實施例所示患者1由于其健康狀態差而在用⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體治療之前已不符合同種異體干細胞移植條件。在此種情況下，用CD19xCD3雙特異性單鏈抗體的治療提供了小兒ALL的新治療途徑。到目前為止，對于化療難以治療和不符合同種異體HSCT條件的小兒患者而言ALL 意味著死刑。本發明方法首次為這種小兒患者群體提供了療法，因為它消除了微小殘留病變(MRD)，否則MRD將導致復發并最終使所述患者死亡。在本發明藥學方法和方式的范圍內，可以向已接受單獨的或與同種異體干細胞移植聯合的化療，并在此后復發的小兒ALL患者給予CD19xCD3雙特異性單鏈抗體構建體。在另一個優選實施方式中，本發明方法用于治療、改善或消除急性淋巴細胞白血病(ALL)小兒患者的微小殘留病變(MRD)。如本文使用的術語“微小殘留病變(MRD) ”是指在例如用化療治療之后，當利用標準試驗如顯微術無法在骨髓中找到白血病細胞時使用的術語。但是，需利用更靈敏的試驗如流式細胞術(基于FACS的方法)或聚合酶鏈反應(PCR)，以發現該小兒ALL患者骨髓中殘留有白血病細胞的證據。更具體地，所存在的白血病細胞數少于細胞學檢測限(5%白血病細胞)被定義為微小殘留病變(MRD)。如果未檢測到MRD ( < ΙΟ"4,即每IO4個骨髓細胞中可檢測到的白血病細胞少于1個)，則達到完全分子緩解(MRD陰性或MRD陰性狀態)。 如本文定義的“MRD陽性狀態”表示通過PCR或FACS測得的信號高于檢測限或定量閾值 (quantitative threshold)。如本文定義的“MRD陰性狀態”表示低于通過PCR或FACS測得的檢測限和/或定量閾值。兒童ALL微小殘留病變量化的預后價值已描述在例如Bader 等人(J. Clin. Oncol. 27(2009) :377-384)或 Eckert 等人(Lancet 358(2001) :1239-41) 中。該MRD狀態可以通過PCR或FACS分析測得，因為本文所述單獨細胞遺傳學異常和/或免疫球蛋白基因重排或T-細胞受體(TCR)重排可被定量檢測。例如，PCR分析可以檢測融合轉錄物如bcr/abl或易位以及單獨克隆性免疫球蛋白(IgH)和/或T-細胞受體基因(TCR)重排。如以下實施例所證明的，在用本文描述的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體治療后，可以消除小兒ALL患者身體內的所有急性淋巴細胞白血病細胞，以便可以獲得完全分子緩解 (即，MRD陰性狀態)。小兒和成人急性淋巴細胞白血病患者惡性腫瘤細胞中反復出現的染色體異常是該疾病的標志(Harrison and Foroni，Rev. Clin. Exp. Hematol. 6 Q002)，91-113)。經常表示潛在分子一致性(consistent)病變的特定畸變可能有助于診斷或甚至可以確定診斷以及決定最佳療法。在兒童ALL中，已識別到許多良好的和高風險的細胞遺傳學亞群，該亞群經常用于將患者分為特定治療組(Pui and Evans, N. Engl. J. Med. 354 (2006), 166-178) 在成人ALL中，細胞遺傳學在患者管理中的作用主要集中于費城(Ph)染色體的存在上， 費城染色體通常由t(9 ;22) (q34;qll.2)形成并導致BCR-ABL融合O^tderl等人，Blood 91 (1998)，3995-4019)。雖然在成人中Wi+ALL的總體發病率近似為25%，但它與年齡相關且在55歲以上的患者當中該發病率已上升到高于50% (Appelbaum, American Society of Clinical Oncology 2005 education book. Alexandria :ASC0, 2005 :528-532) 與急性淋巴細胞白血病(ALL)中特定分子遺傳學異常相關的其它細胞遺傳學易位在表1中給出，并也描述在Schultz等人或Bader等人，loc. Cit中。表1
權利要求
1.一種用于治療、改善或消除小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)的方法，所述方法包括向需要其的小兒ALL患者給予包含⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體構建體的藥物組合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)是小兒 B-系急性淋巴細胞白血病(ALL)，優選小兒B-前體急性淋巴細胞白血病ALL，更優選小兒祖 B細胞ALL、前B細胞ALL或普通ALL (cALL)。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述急性淋巴細胞白血病(ALL)是難治性和 /或復發性ALL。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述急性淋巴細胞白血病(ALL)是復發性ALL， 優選為在診斷后3年內復發的ALL。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中，所述方法用于治療、改善或消除小兒ALL患者的微小殘留病變(MRD)。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述小兒ALL患者在完全血液緩解期為MRD-陽性。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其中，所述方法將MRD陽性ALL轉變成MRD陰性狀態。
8.根據權利要求5至7中任一項所述的方法，其中，MRD通過定量檢測至少一種細胞遺傳學異常或重排來測量，所述細胞遺傳學異常或重排選自以下組成的組中t(12 ；21)[TEL-AML1]； t(l ；19 ；) [E2A-PBX]； t(4 ；11) [AF4-MLL]； t(9 ；22) [BCR-ABL]；超二倍體或4、10和17號染色體的三體；亞二倍體；免疫球蛋白基因重排；和 T-細胞受體(TCI )重排。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述小兒ALL患者顯示高于檢測限的細胞遺傳學異常的信號，和/或至少一種靈敏度> ΙΟ"4通過重排的標記。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中，相應可變重鏈區(VH)和相應可變輕鏈區(VL)在所述CD19xCD3雙特異性單鏈抗體構建體中從N-末端至C-末端以VL(CD19 )-VH (CD19) -VH (CD； ) -VL (CD； )的順序排列。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述CD19xCD3雙特異性單鏈抗體構建體包含 SEQ ID NO. 1中給出的氨基酸序列，或與SEQ IDN0. 1具有至少90%、優選至少95%同一性的氨基酸序列。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中，包含⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體構建體的所述藥物組合物將通過連續輸注給藥至少4周，在此之后是2周的無治療間隔期。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，在確定MRD陰性狀態之后，所述給藥重復至少 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 次。
14.根據權利要求12或13所述的方法，其中，所述方法在同種異體干細胞移植(HSCT)之前，將MRD陽性ALL轉變成MRD陰性狀態。
15.根據權利要求12或13所述的方法，其中，所述方法在同種異體干細胞移植(HSCT)之后。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，CD19xCD3雙特異性單鏈抗體構建體誘導移植物抗白血病(GvL)效應。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的方法，其中，按每平米患者身體表面積 10 μ g 100 μ g的每日劑量，給予所述⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體構建體。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，按每平米患者身體表面積15μ g 30 μ g的每日劑量，給予所述CD19xCD3雙特異性單鏈抗體構建體。
19.根據權利要求1至18中任一項所述的方法，其中，所述方法是用于根據急性淋巴細胞白血病的C0GAALL03B1分類具有高復發風險的小兒ALL患者。
20.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述患者是不符合同種異體干細胞移植條件的患者。
21.一種用于治療、改善或消除小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)的⑶1 ⑶3雙特異性單鏈抗體構建體。
全文摘要
本發明涉及用于治療、改善或消除小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)的方法，該方法包括向需要其的小兒ALL患者給予包含CD19xCD3雙特異性單鏈抗體構建體的藥物組合物。
文檔編號C07K16/46GK102209729SQ200980144400
公開日2011年10月5日 申請日期2009年11月6日 優先權日2008年11月7日
發明者格哈德·祖格邁爾 申請人:米克羅麥特股份公司